KR102033293B1

KR102033293B1 - 콩과작물 3종 바이러스 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102033293B1
Application number: KR1020170142320A
Authority: KR
Inventors: 이수헌; 박충열; 민현근; 이주현
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2019-10-17
Also published as: KR20190047928A

Abstract

본 발명은 콩과작물 바이러스 진단용 프라이머에 관한 것으로써, 더욱 자세하게는 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 조성물, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 키트 및 콩과작물 바이러스 다중 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 콩과작물 바이러스 다중 진단 방법을 이용하면, 낮은 농도의 샘플에서도 콩과작물 바이러스의 정확하고 신속한 다중 진단이 가능한 바, 국내 콩과작물에서 발생하는 바이러스 병에 관한 스크리닝과 피해현황 분석 및 저항성 품종 개발에 기여할 수 있다.

Description

콩과작물 3종 바이러스 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 및 이의 용도{Primer set for simultaneous detection of three viruses on leguminous crop and use thereof}

본 발명은 콩과작물 바이러스 진단용 프라이머에 관한 것으로써, 더욱 자세하게는 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 조성물, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 키트 및 콩과작물 바이러스 다중 진단 방법에 관한 것이다.

농업적으로 중요한 작물의 대부분은 식물 바이러스 또는 비로이드 (viroid) 감염에 의해 수확량 감소 및 품질저하가 나타나고, 이로 인해 심각한 경제적 손실이 발생하게 된다. 식물 바이러스에 의한 병은 곰팡이 또는 세균에 의한 병과는 다르게 농약을 살포하여 예방하거나 치료하는 것이 불가능하다. 따라서, 식물체나 종자의 바이러스 감염 여부에 대한 정밀하고 신속한 진단은 재배 작물의 바이러스 감염에 의한 피해를 사전에 방지하고, 바이러스 병 관리를 위한 선결요건이다.

바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 이 중 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능한 방법이다. 혈청학적 방법 중 효소 결합 면역흡수 검정법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)은 가장 일반적으로 사용하여온 진단 방법이나 PCR 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비 특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다. 또한, 검역 현장에서는 하나의 검사 시료에 대해 다양한 병원체의 진단을 수행해야하므로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사 비용이 소요된다.

따라서 현재 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법을 가장 일반적으로 사용되고 있다. 병원체의 PCR 진단을 위한 프라이머의 개발에 있어 중요한 점은, 첫째 바이러스 종 내에 존재하는 모든 계통 및 분리주를 검출 할 수 있어야 한다는 것이다. 이를 위하여 검출 대상 바이러스 종의 모든 계통 및 분리주에 있어서 공통되는 염기서열을 대상으로 프라이머를 설계하여야 한다. 둘째, 상이한 종 간에는 특이성이 있어야 한다는 것이다. 이를 위하여 검출 대상 바이러스 종과 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열에는 반응하지 않는 프라이머를 설계하여야 한다.

그러나, 상기와 같은 프라이머의 경우, 일반적으로 개별 바이러스에 대한 단편적 진단만이 가능한 프라이머이기 때문에, 다수의 바이러스에 감염된 작물을 진단하는데 문제가 있었다. 또한, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 진단에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이적 프라이머의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한국등록특허 제1491810호에는 콩모자이크괴저바이러스 진단용 프라이머가 개시되어 있고, 한국공개특허 제1250388호에는 콩에서 발생하는 바이러스 중 콩모자이크바이러스, 알팔파모자이크바이러스, 콩위축바이러스, 콩황화얼룩모자이크바이러스 및 땅콩위축바이러스 진단용 프라이머가 개시되어 있다. 그러나, 토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV), 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)를 진단할 수 있는 프라이머와 이들의 조합으로 이루어진 다중 진단용 프라이머에 관해서는 보고된 바 없다. 또한 상기 문헌들에 기재된 바이러스는 모두 콩에서 검출된 바이러스이며, 콩 이외에 콩과작물 내 상이한 종류의 작물에서 관찰되는 바이러스를 다중으로 진단할 수 있는 프라이머의 조합에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명의 발명자들은 콩과작물에서 발생하는 바이러스 병의 다중 진단을 위한 프라이머를 연구하던 중, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 콩과작물 바이러스 다중 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 콩과작물 바이러스 다중 진단용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 콩과작물 바이러스 다중 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 37 및 38로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 콩과작물 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

또한 본 발명은 a) 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍 및 b) 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 19 및 20로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

또한 본 발명은 a) 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍 및 b) 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 37 및 38로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

또한 본 발명은 a) 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍 및 b) 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 37 및 38로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

또한 본 발명은 a) 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍, b) 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 19 및 20로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍 및 c) 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 37 및 38로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 콩과작물 바이러스 다중 진단용 조성물을 포함하는, 콩과작물 바이러스 다중 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 a) 시료로부터 DNA를 얻는 단계; b) 상기 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용하여 상기 a) 단계에서 얻어진 DNA를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 콩과작물 바이러스 다중 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 콩과작물 바이러스 다중 진단 방법을 이용하면, 낮은 농도의 샘플에서도 콩과작물 바이러스의 정확하고 신속한 다중 진단이 가능한 바, 국내 콩과작물에서 발생하는 바이러스 병에 관한 스크리닝과 피해현황 분석 및 저항성 품종 개발에 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV) 종 특이적 프라이머 위치 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV) 종 특이적 프라이머 위치 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV) 종 특이적 프라이머 위치 모식도를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV) 종 특이적 진단용 프라이머 5세트의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV) 종 특이적 진단용 프라이머 5세트의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)에 종 특이적 프라이머 9세트의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV) 종 특이적 진단용 프라이머와 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV) 종 특이적 진단용 프라이머 조합을 이용한 duplex-PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV) 종 특이적 진단용 프라이머, 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV) 종 특이적 진단용 프라이머 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV) 종 특이적 진단용 프라이머 조합을 이용한 multiplex-PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 세트 20의 검출한계 확인을 위한 10배 단계별 희석 후 monoplex-PCR 반응 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 세트 20의 검출한계 확인을 위한 10배 단계별 희석 후 duplex-PCR 반응 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 세트 20의 검출한계 확인을 위한 10배 단계별 희석 후 multiplex-PCR 반응 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 세트 20의 monoplex-PCR, duplex-PCR 및 multiplex-PCR 반응을 종합한 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 세트 21의 검출한계 확인을 위한 10배 단계별 희석 후 monoplex-PCR 반응 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 세트 21의 검출한계 확인을 위한 10배 단계별 희석 후 duplex-PCR 반응 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 세트 21의 검출한계 확인을 위한 10배 단계별 희석 후 multiplex-PCR 반응 전기영동 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 37 및 38로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 콩과작물 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 바이러스는 토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV), 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다.

상기 a) 군의 프라이머 쌍은 토끼풀황화잎맥바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, b) 군의 프라이머 쌍은 땅콩모틀바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.

상기 a) 군의 프라이머 쌍은 땅콩모틀바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, b) 군의 프라이머 쌍은 토마토반점위조바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.

상기 a) 군의 프라이머 쌍은 토끼풀황화잎맥바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, b) 군의 프라이머 쌍은 토마토반점위조바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.

상기 a) 군의 프라이머 쌍은 토끼풀황화잎맥바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, b) 군의 프라이머 쌍은 땅콩모틀바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, c) 군의 프라이머 쌍은 토마토반점위조바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 9 및 10; 서열번호 15 및 16; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

상기 서열번호 9 및 10 의 프라이머 쌍은 토끼풀황화잎맥바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, 서열번호 15 및 16 의 프라이머 쌍은 땅콩모틀바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, 서열번호 31 및 32 의 프라이머 쌍은 토마토반점위조바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다. 또한 상기 서열번호 9 및 10; 서열번호 15 및 16; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하게 되면, 각 바이러스에 대한 종 특이적인 다중 진단이 가능하며 낮은 농도의 샘플에서도 바이러스를 정확하게 진단할 수 있다.

또한 상기 프라이머 세트는 서열번호 9 및 10; 서열번호 19 및 20; 및 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

상기 서열번호 9 및 10 의 프라이머 쌍은 토끼풀황화잎맥바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, 서열번호 19 및 20 의 프라이머 쌍은 땅콩모틀바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, 서열번호 29 및 30 의 프라이머 쌍은 토마토반점위조바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다. 또한 상기 서열번호 9 및 10; 서열번호 19 및 20; 및 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하게 되면, 각 바이러스에 대한 종 특이적인 다중 진단이 가능하다.

본 발명의 프라이머 세트에 포함되는 상기 서열번호 5 내지 38 에 기재된 염기서열은 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 내지 38 의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg²⁺의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.

상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.

본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명의 콩과작물 바이러스 진단용 프라이머 세트 또는 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용하게 되면, 다수의 바이러스, 바람직하게는 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스에 감염된 작물을 진단할 수 있으며 종 특이적으로 바이러스를 진단할 수 있다.

상기 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합 효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.

상기 키트는 상술한 콩과작물 바이러스 다중 진단용 조성물 이외에도 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소 (polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제 (sequenase) 등을 포함할 수 있다.

상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

상기 콩과작물은 콩, 팥, 땅콩, 완두콩, 강낭콩, 녹두 및 동부로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 본 발명의 콩과작물은 콩 또는 팥일 수 있다.

상기 바이러스는 토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV), 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV) 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 b) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 듀플렉스 중합효소연쇄반응(duplex Polymerase Chain Reaction, duplex PCR), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 본 발명의 증폭은 중합효소연쇄반응, 듀플렉스 중합효소연쇄반응, 다중 중합효소연쇄반응 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법일 수 있다.

상기 c) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 본 발명의 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동 방법을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 콩과작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용한 콩과작물 바이러스 다중 진단 방법에 따르면, 콩과작물 내 상이한 종류의 작물에서 관찰되는 바이러스를 다중으로 진단할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 전체 RNA 추출 및 First-strand complementary DNA (FS cDNA) 합성

실시예 1-1. 전체 RNA 의 추출

전체 RNA 의 추출을 위한 시료로 토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV; NCBI GenBank Accession No. KF975894)에 감염된 콩 식물체 잎 조직, 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV; NCBI GenBank Accession No. LC201922)에 감염된 팥 식물체 잎 조직 및 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)에 감염된 팥 식물체 잎 조직을 사용하였다.

상기 3종의 시료를 이용하여, 시판 중인 Easy-spin™ 전체 RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Daejeon, Korea)를 통해 제조사의 매뉴얼에 따라 전체 RNA를 추출하였다.

실시예 1-2. First-strand complementary DNA (FS cDNA) 합성

상기 실시예 1-1 에서 추출한 전체 RNA 에서 First-strand complementary DNA (FS cDNA)를 합성하고자 RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 효소와 RN25 랜덤 프라이머(NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN)를 이용하였고, 판매사의 매뉴얼에 따라 First-strand complementary DNA (FS cDNA)를 합성하였다.

실시예 2. 종 특이적 프라이머 설계

실시예 2-1. 토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV)의 종 특이적 프라이머 설계

토끼풀황화잎맥바이러스(Clover yellow vein virus, ClYVV)의 종 특이적 프라이머를 설계하기 위해서 우선, NCBI GenBank로부터 기 보고된 토끼풀황화잎맥바이러스 세 개의 분리주(NCBI GenBank Accession No. NC002600, KF977830, AF023848)의 전체 염기서열을 다운로드 하였다. 다운로드 한 전체 염기서열은 DNAMAN ver 7.0 software를 이용하여 서열 정렬을 하였고, 보존영역(conserved domain)에서 프라이머를 설계하였다.

또한, 토끼풀황화잎맥바이러스가 속해 있는 Potyvirus 속(genus) 134종의 바이러스 게놈 시퀀스 정보를 NCBI GenBank로부터 다운로드 받은 후, DNAMAN ver 7.0 software를 이용하여 서열 정렬을 하였고, 비보존영역(non-conserved domain)에서 5쌍의 프라이머를 설계하여 표 1에 나타내었다.

또한, 상기와 같이 설계한 토끼풀황화잎맥바이러스의 종 특이적 프라이머의 위치 모식도를 도 1에 나타내었다.

세트 번호	서열번호	프라이머 명칭	서열 (5'→3')	위치^a	길이 (mer)	크기(b.p)
1	서열번호1	ClYVV-F2	CCAGTACTCATATCGAGGCT	294-313	20	561
1	서열번호2	ClYVV-R5	GCCGCACATCAACCGAGC	837-854	18	561
2	서열번호3	ClYVV-F10	GTCTCATGGCAAGCATCGC	861-879	19	486
2	서열번호4	ClYVV-R7	GGAGAGTCATTGCCTGGCT	1328-1346	19	486
3	서열번호5	ClYVV-F15	GACAGGGCAGGTGATACAG	2479-2497	19	556
3	서열번호6	ClYVV-R15	GGAATACTTTGCCCGCTGC	3016-3034	19	556
4	서열번호7	ClYVV-F28	GTGCTTCAAACACAGCATGC	5361-5380	20	740
4	서열번호8	ClYVV-R26	TGGTCTCTTGAGGTATAAGTG	6080-6100	21	740
5	서열번호9	ClYVV-F32	GCGCGGAATGAGGATATTGA	6275-6294	20	447
5	서열번호10	ClYVV-R29	ATTGGCTGACTGCACTCTTG	6702-6721	20	447

실시예 2-2. 땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV)의 종 특이적 프라이머 설계

땅콩모틀바이러스(Peanut mottle virus, PeMoV)의 종 특이적 프라이머를 설계하기 위해서 우선, NCBI GenBank로부터 기보고된 땅콩모틀바이러스 두 개의 분리주(NCBI GenBank Accession No. NC003536, AB011819)의 전체 염기서열을 다운로드 하였다. 다운로드 한 전체 염기서열은 DNAMAN ver 7.0 software를 이용하여 서열 정렬을 하였고, 보존영역(conserved domain)에서 프라이머를 설계하였다.

또한, 땅콩모틀바이러스가 속해 있는 Potyvirus 속(genus) 134종의 바이러스 게놈 시퀀스 정보를 NCBI GenBank로부터 다운로드 받은 후, DNAMAN ver 7.0 software를 이용하여 서열 정렬을 하였고, 비보존영역(non-conserved domain)에서 5쌍의 프라이머를 설계하여 표 2에 나타내었다.

또한, 상기와 같이 설계한 땅콩모틀바이러스의 종 특이적 프라이머의 위치 모식도를 도 2에 나타내었다.

세트 번호	서열번호	프라이머 명칭	서열 (5'→3')	위치^a	길이 (mer)	크기(b.p)
6	서열번호11	PeMoV-F4	GGCAACACCCACGCCAAG	260-277	18	652
6	서열번호12	PeMoV-R7	CTCCCTGACCTTCCGACC	894-911	18	652
7	서열번호13	PeMoV-F15	AGAACACCCTTCAGATGGGA	978-997	20	389
7	서열번호14	PeMoV-R12	GCGTGCTGCTGCCTCATG	1349-1366	18	389
8	서열번호15	PeMoV-F20	GAGTCAGTTGAGAGGTTACC	1890-1909	20	599
8	서열번호16	PeMoV-R15	CGCATTCGTCTTGCATGCG	2470-2488	19	599
9	서열번호17	PeMoV-F23	TTCTCGAGGCGAGCGCGA	2994-3011	18	342
9	서열번호18	PeMoV-R19	CATGATCACCATCGCTTGCT	3316-3335	20	342
10	서열번호19	PeMoV-F30	GCTTCATTGCTTGGGTATGG	5520-5539	20	560
10	서열번호20	PeMoV-R26	TCTGCTATGCTCTGCGCAC	6061-6079	19	560

실시예 2-3. 토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)의 종 특이적 프라이머 설계

토마토반점위조바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)의 종 특이적 프라이머를 설계하기 위해서 우선, NCBI GenBank로부터 기보고된 토마토반점위조바이러스 세 개의 분리주(NCBI GenBank Accession No. JF960235, KT717693, KP008134)의 S-segment 전체 염기서열을 다운로드 하였다. 다운로드 한 전체 염기서열은 DNAMAN ver 7.0 software를 이용하여 서열 정렬을 하였고, 보존영역(conserved domain)에서 프라이머를 설계하였다.

또한, 토마토반점위조바이러스가 속해 있는 Orthotospovirus 속(genus) 11종의 바이러스 게놈 시퀀스 정보를 NCBI GenBank로부터 다운로드 받은 후, DNAMAN ver 7.0 software를 이용하여 서열 정렬을 하였고, 비보존영역(non-conserved domain)에서 9쌍의 프라이머를 설계하여 표 3에 나타내었다.

또한, 상기와 같이 설계한 토마토반점위조바이러스의 종 특이적 프라이머의 위치 모식도를 도 3에 나타내었다.

세트 번호	서열번호	프라이머 명칭	서열 (5'→3')	위치^a	길이(mer)	크기(b.p)
11	서열번호21	TSWV-S-F130	TTCAGTCTGGGGATCAACTG	130-149	20	622
11	서열번호22	TSWV-S-R751	CAGAGATTTCACTGCAAGAG	732-751	20	622
12	서열번호23	TSWV-S-F367	CTCTGTTCTGGCACTATCTG	367-386	20	385
12	서열번호24	TSWV-S-R751	CAGAGATTTCACTGCAAGAG	732-751	20	385
13	서열번호25	TSWV-S-F1737	CGAAAGGGACAATTTTGGCCA	1737-1757	21	603
13	서열번호26	TSWV-S-R2339	TGATCAGTGTTGTCTTGGCT	2320-2339	20	603
14	서열번호27	TSWV-S-F2135	CTTCCTTTAGCATTAGGATTGC	2135-2156	22	205
14	서열번호28	TSWV-S-R2339	TGATCAGTGTTGTCTTGGCT	2320-2339	20	205
15	서열번호29	TSWV-S-F2135	CTTCCTTTAGCATTAGGATTGC	2135-2156	22	682
15	서열번호30	TSWV-S-R2816	CTAAGGTTAAGCTCACTAACTG	2796-2816	21	682
16	서열번호31	TSWV-S-F130	TTCAGTCTGGGGATCAACTG	130-149	20	947
16	서열번호32	TSWV-S-R1076	GAACAATGTTGTAAGGCTCC	1057-1076	20	947
17	서열번호33	TSWV-S-F367	CTCTGTTCTGGCACTATCTG	367-386	20	709
17	서열번호34	TSWV-S-R1076	GAACAATGTTGTAAGGCTCC	1057-1076	20	709
18	서열번호35	TSWV-S-F1737	CGAAAGGGACAATTTTGGCCA	1737-1757	21	811
18	서열번호36	TSWV-S-R2548	GACCTTCAGAAGGTTGATAG	2529-2548	20	811
19	서열번호37	TSWV-S-F2135	CTTCCTTTAGCATTAGGATTGC	2135-2156	22	413
19	서열번호38	TSWV-S-R2548	GACCTTCAGAAGGTTGATAG	2529-2548	20	413

실시예 3. 콩과작물 3종 바이러스의 다중 진단용 프라이머 세트의 설계

실시예 3-1. 중합효소 연쇄 반응(poymerase chain reaction, PCR) 을 통한 프라이머의 효용성 확인

설계한 프라이머의 효용성을 확인하기 위해 우선, 상기 실시예 2에서 설계한 프라이머의 합성을 네오프로브(대전광역시 소재)에서 진행하였다. 또한, 상기 실시예 1-2 에서 합성한 cDNA 를 주형 가닥으로 하여 중합효소 연쇄 반응(poymerase chain reaction, PCR) 반응을 실시하였다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)은 Prime Taq™ Premix (2×) (Genet Bio, Cheonan, Korea)를 이용하여 수행하였으며, PCR 반응을 위한 조성물로 template cDNA 1 μL 와 상기 실시예 2에서 설계한 각각의 프라이머 1 μL (10 pmol/μL), 그리고 탈이온수 7 μL 를 Prime Taq Premix(2×) 10 μL 와 함께 사용하였다. PCR 반응 조건으로는, 95 ℃ 에서 10 분간 Initial denaturation 을 실시하고, 95 ℃ 에서 30 초간 Denaturation 후 55 ℃ 에서 30 초간 Annealing 및 72 ℃ 에서 1 분간 Extension 하는 반응을 35 사이클 수행하였으며, 72 ℃ 에서 5분간 Final Extension 을 실시하였다. 그 후, 증폭된 PCR 산물 5 ul를 브롬화 에티듐(ethidium bromide, EtBr)이 첨가된 1.0 % 아가로즈 겔에 로딩하여, 120 V에서 35 분 동안 전기영동 하였고, UV illuminator 에서 양성반응유무를 확인하였다.

실시예 3-2. Monoplex-PCR 반응

설계한 프라이머가 타깃 바이러스를 진단할 수 있는지 확인하기 위해서 상기 실시예 3-1 과 같은 PCR 조건으로 Monoplex-PCR 를 실시하였고 이의 전기영동 결과는 도 4 내지 도 6에 나타내었다.

도 4는 토끼풀황화잎맥바이러스(CITVV)의 결과이며, 도 4에서 볼 수 있듯이, 표 1의 토끼풀황화잎맥바이러스(CITVV) 종 특이성 프라이머 5 세트에 대해서 모두 양성반응이 나온 것을 확인할 수 있었다. 도 4에서 Lane 1, 2, 3, 4 및 5는 각각 표 1의 세트 1(ClYVV-F2/R5, 561 bp), 세트 2(ClYVV-F10/R7, 486 bp), 세트 3(ClYVV-F15/R15, 556 bp), 세트 4(ClYVV-F28/R26, 740 bp) 및 세트 5(ClYVV-F32/R29, 447 bp)의 전기영동 결과를 나타낸다.

도 5는 땅콩모틀바이러스(PeMoV)의 결과이며, 도 5에서 볼 수 있듯이, 표 2의 땅콩모틀바이러스(PeMoV) 종 특이성 프라이머 5 세트에 대해서 모두 양성반응이 나온 것을 확인할 수 있었다. 도 5에서 Lane 1, 2, 3, 4 및 5는 각각 표 2의 세트 6(PeMoV-F4/R7, 652 bp), 세트 7(PeMoV-F15/R12, 389 bp), 세트 8(PeMoV-F20/R15, 599 bp), 세트 9(PeMoV-F23/R19, 342 bp) 및 세트 10(PeMoV-F30/R26, 560 bp)의 전기영동 결과를 나타낸다.

한편, 도 6은 토마토반점위조바이러스(TSWV)의 결과이며, 도 6에서 볼 수 있듯이, 표 3의 토마토반점위조바이러스(TSWV) 종 특이성 프라이머 9 세트 중 세트 13 및 세트 18에 해당하는 Lane 3 및 8을 제외한 나머지 7 세트에 대해서만 양성반응이 나온 것을 확인할 수 있었다. 도 6에서 Lane 1, 2, 4, 5, 6, 7 및 9는 각각 표 3의 세트 11(TSWV-S-F130/R751, 622 bp), 세트 12(TSWV-S-F130/R751, 385 bp), 세트 14(TSWV-S-F130/R751, 205 bp), 세트 15(TSWV-S-F130/R751, 682 bp), 세트 16(TSWV-S-F130/R751, 947 bp), 세트 17(TSWV-S-F130/R751, 709 bp), 세트 19(TSWV-S-F130/R751, 413 bp)의 전기영동 결과를 나타낸다.

실시예 3-3. Duplex-PCR 반응

설계한 프라이머를 2종 이상의 바이러스 검출을 위한 다중 진단법에 이용이 가능한 지 알아보기 위해서, 상기 실시예 3-1 과 같은 PCR 조건으로, 토끼풀황화잎맥바이러스 종 특이성 프라이머 세트 및 땅콩모틀바이러스 종 특이성 프라이머 세트를 이용하여 Duplex-PCR 를 실시하였다.

또한, Duplex-PCR의 경우, 위에서 설계한 프라이머 중에서 다중 진단법으로 이용 가능한 예상산물의 크기를 고려하여, 일부를 선별하여 반응을 수행하였다. 토끼풀황화잎맥바이러스 종 특이성 프라이머의 경우 세트 1 내지 세트 5 중에서 세트 3(ClYVV-F15/R15, 556 bp), 세트 4(ClYVV-F28/R26, 740 bp) 및 세트 5(ClYVV-F32/R29, 447 bp)를 선별하였다.

한편, 땅콩모틀바이러스 종 특이성 프라이머의 경우 세트 6 내지 세트 10 중에서 세트 6(PeMoV-F4/R7, 652 bp), 세트 7(PeMoV-F15/R12, 389 bp), 세트 8(PeMoV-F20/R15, 599 bp) 및 세트 10(PeMoV-F30/R26, 560 bp)를 선별하였다.

상기와 같이 선별된 토끼풀황화잎맥바이러스 종 특이성 프라이머 3세트(세트 3, 4 및 5)와 땅콩모틀바이러스 종 특이성 프라이머 4세트(세트 6, 7, 8 및 10)를 이용하여 각각의 세트를 조합시킨 12개의 조합을 구성하였으며 각 조합별 duplex-PCR 전기영동을 수행한 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에서의 결과를 토대로 Lane 2, 11, 및 12 에 이용된 것과 같은, 2종 이상의 바이러스 검출을 위한 다중 진단법에 이용할 수 있는 프라이머 세트 조합을 선별하였다. 최종적으로 선별된 도 7의 Lane 2 는 세트 2 및 세트 7 의 조합(ClYVV-F15/R15, 556 bp 및 PeMoV-F15/R12, 389 bp), Lane 11 은 세트 5 및 세트 8 의 조합(ClYVV-F32/R29, 447 bp 및 PeMoV-F20/R15, 599 bp), Lane 12 는 세트 5 및 세트 10 의 조합(ClYVV-F32/R29, 447 bp 및 PeMoV-F30/R26, 560 bp)을 나타낸다.

실시예 3-4. Multiplex-PCR 반응

설계한 프라이머를 3종 이상의 바이러스 검출을 위한 다중 진단법에 이용이 가능한 지 알아보기 위해서, 상기 실시예 3-1 과 같은 PCR 조건으로, 상기 실시예 3-3 에서 선별한 토끼풀황화잎맥바이러스 종 특이성 프라이머 세트 및 땅콩모틀바이러스 종 특이성 프라이머 세트 조합(도 7 Lane 2, 11, 12번 조합)과, 토마토반점위조바이러스 종 특이성 프라이머 중 상기 실시예 3-2 에서 실시한 Monoplex-PCR 양성반응으로 선별한 7 세트를 혼합하여 Multiplex-PCR 를 실시하였다.

즉, 선별된 토끼풀황화잎맥바이러스 종 특이성 프라이머 세트 및 땅콩모틀바이러스 종 특이성 프라이머 세트 조합 3개(도 7 Lane 2, 11, 12번 조합)와 토마토반점위조바이러스 종 특이성 프라이머 7세트(세트 11, 12, 14, 15, 16, 17 및 19)를 이용하여 21개 조합을 구성하였으며 각 조합별 테스트를 수행하였고 이들의 multiplex-PCR 전기영동 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에서의 결과를 토대로 Lane 12 및 18 에 이용된 것과 같은, 3종 이상의 바이러스 검출을 위한 다중 진단법에 이용할 수 있는 조합 2개(세트 20 및 21)를 선별하였고 그 결과를 표 4에 나타내었다. 최종적으로 선별된 도 8의 Lane 12 는 세트 20 으로써, 세트 5, 8 및 16 의 조합(ClYVV-F32/R29, 447 bp + PeMoV-F20/R15, 599 bp + TSWV-S-F130/R1076, 947 bp), Lane 18 은 세트 21 로써, 세트 5, 10 및 15 의 조합(ClYVV-F32/R29, 447 bp + PeMoV-F30/R26, 560 bp + TSWV-S-F2135/R2816, 682 bp)을 나타낸다.

세트 번호	타깃 바이러스	서열번호	프라이머 명칭	서열 (5'→3')	크기(b.p)
20	토끼풀황화잎맥바이러스	9	ClYVV-F32	GCGCGGAATGAGGATATTGA	447
	토끼풀황화잎맥바이러스	10	ClYVV-R29	ATTGGCTGACTGCACTCTTG	447
	땅콩모틀바이러스	15	PeMoV-F20	GAGTCAGTTGAGAGGTTACC	599
	땅콩모틀바이러스	16	PeMoV-R15	CGCATTCGTCTTGCATGCG	599
	토마토반점위조바이러스	31	TSWV-S-F130	TTCAGTCTGGGGATCAACTG	947
	토마토반점위조바이러스	32	TSWV-S-R1076	GAACAATGTTGTAAGGCTCC	947
21	토끼풀황화잎맥바이러스	9	ClYVV-F32	GCGCGGAATGAGGATATTGA	447
	토끼풀황화잎맥바이러스	10	ClYVV-R29	ATTGGCTGACTGCACTCTTG	447
	땅콩모틀바이러스	19	PeMoV-F30	GCTTCATTGCTTGGGTATGG	560
	땅콩모틀바이러스	20	PeMoV-R26	TCTGCTATGCTCTGCGCAC	560
	토마토반점위조바이러스	29	TSWV-S-F2135	CTTCCTTTAGCATTAGGATTGC	682
	토마토반점위조바이러스	30	TSWV-S-R2816	CTAAGGTTAAGCTCACTAAGG	682

실시예 4. 콩과작물 3종 바이러스 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 세트 20 의 검출한계 확인

상기 실시예 3 을 통해 최종 선발된 프라이머 세트 중 하나인 세트 20 의 검출한계를 확인하기 위하여, 주형으로 사용된 cDNA에 대하여 10배 단계별 희석을 한 후 Monoplex-PCR, duplex-PCR, Multiplex-PCR을 통하여 반응을 수행하였다.

실시예 4-1. Monoplex-PCR 반응

우선, 최종 선발된 세트 20 의 프라이머 세트에 포함된 각각의 프라이머의 검출한계를 알아보기 위해 Monoplex-PCR 를 실시하였으며, 그 결과는 도 9 에 나타내었다. 도 9에서 각 Lane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 은 각각 10⁰배 희석, 10¹배 희석, 10²배 희석, 10³배 희석, 10⁴배 희석, 10⁵배 희석, 10⁶배 희석 및 10⁷배 희석을 나타낸다.

도 9 에 나타난 바와 같이, 세트 20 의 Monoplex-PCR 에서의 검출한계를 확인한 결과, 토끼풀황화잎맥바이러스(ClYVV) 및 땅콩모틀바이러스(PeMoV)에서는 10¹까지는 양성반응이 뚜렷이 관찰되었고, 토마토반점위조바이러스(TSWV)의 경우 10³까지 양성반응이 확인됨을 알 수 있었다.

실시예 4-2. Duplex-PCR 반응

다음으로, 최종 선발된 세트 20 에 의해 2 종 이상의 바이러스가 검출될 수 있는지 알아보기 위해, 세트 20 내 각각의 프라이머를 타깃 바이러스 기준으로 두 가지씩 조합하여, 이들의 검출한계를 알아보기 위해 Duplex-PCR 를 실시하였으며, 그 결과는 도 10 에 나타내었다. 도 10에서 각 Lane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 은 각각 10⁰배 희석, 10¹배 희석, 10²배 희석, 10³배 희석, 10⁴배 희석, 10⁵배 희석, 10⁶배 희석 및 10⁷배 희석을 나타낸다.

도 10 에 나타난 바와 같이, Duplex-PCR에서 검출한계를 확인한 결과, 토끼풀황화잎맥바이러스(ClYVV) 및 땅콩모틀바이러스(PeMoV) 조합의 경우 10¹까지, 토끼풀황화잎맥바이러스(ClYVV) 및 토마토반점위조바이러스(TSWV) 조합의 경우 10³, 땅콩모틀바이러스(PeMoV) 및 토마토반점위조바이러스(TSWV) 조합의 경우 10²까지 양성반응이 확인되었다.

실시예 4-3. Multiplex-PCR 반응

다음으로, 최종 선발된 세트 20 에 의해 3 종 이상의 바이러스가 검출될 수 있는지 알아보기 위해 세트 20 의 프라이머를 대상으로, 이들의 검출한계를 알아보기 위해 Multiplex-PCR 를 실시하였으며, 그 결과는 도 11 에 나타내었다. 도 11에서 각 Lane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 은 각각 10⁰배 희석, 10¹배 희석, 10²배 희석, 10³배 희석, 10⁴배 희석, 10⁵배 희석, 10⁶배 희석 및 10⁷배 희석을 나타낸다.

도 11 에 나타난 바와 같이, Multiplex-PCR 에서 세트 20 의 검출한계를 확인한 결과 10²까지 양성반응을 나타내어, 낮은 농도의 샘플을 이용할 때에도 3종의 바이러스를 정확하게 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.

또한, 상기에서 확인한 결과를 종합하여 도 12 에 나타내었고, 이를 통해 최종 선발된 세트 20 의 경우, 3종의 타깃 바이러스에 대한 모든 조합에서 정확하고 신속하게 다중 진단이 가능함을 확인할 수 있었다. 도 12에서 Lane 1은 토끼풀황화잎맥바이러스, Lane 2은 땅콩모틀바이러스, Lane 3은 토마토반점위조바이러스, Lane 4는 토끼풀황화잎맥바이러스와 땅콩모틀바이러스의 조합, Lane 5는 토끼풀황화잎맥바이러스와 토마토반점위조바이러스의 조합, Lane 6은 땅콩모틀바이러스와 토마토반점위조바이러스의 조합, Lane 7은 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 조합의 실험 결과를 나타낸다.

실시예 5. 콩과작물 3종 바이러스 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 세트 21 의 검출한계 확인

상기 실시예 3 을 통해 최종 선발된 프라이머 세트 중 하나인 세트 21 의 검출한계를 확인하기 위하여, 주형으로 사용된 cDNA에 대하여 10배 단계별 희석을 한 후 Monoplex-PCR, duplex-PCR, Multiplex-PCR을 통하여 반응을 수행하였다.

실시예 5-1. Monoplex-PCR 반응

우선, 최종 선발된 세트 21 의 프라이머 세트에 포함된 각각의 프라이머의 검출한계를 알아보기 위해 Monoplex-PCR 를 실시하였으며, 그 결과는 도 13 에 나타내었다. 도 13에서 각 Lane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 은 각각 10⁰배 희석, 10¹배 희석, 10²배 희석, 10³배 희석, 10⁴배 희석, 10⁵배 희석, 10⁶배 희석 및 10⁷배 희석을 나타낸다.

도 13 에 나타난 바와 같이, 세트 21 의 Monoplex-PCR 에서의 검출한계를 확인한 결과, 토끼풀황화잎맥바이러스(ClYVV)의 경우 10¹, 땅콩모틀바이러스(PeMoV)에서는 10², 토마토반점위조바이러스(TSWV)의 경우 10³까지 양성반응이 확인됨을 알 수 있었다.

실시예 5-2. Duplex-PCR 반응

다음으로, 최종 선발된 세트 21 에 의해 2 종 이상의 바이러스가 검출될 수 있는지 알아보기 위해, 세트 21 내 각각의 프라이머를 타깃 바이러스 기준으로 두 가지씩 조합하여, 이들의 검출한계를 알아보기 위해 Duplex-PCR 를 실시하였으며, 그 결과는 도 14 에 나타내었다. 도 14에서 각 Lane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 은 각각 10⁰배 희석, 10¹배 희석, 10²배 희석, 10³배 희석, 10⁴배 희석, 10⁵배 희석, 10⁶배 희석 및 10⁷배 희석을 나타낸다.

도 14 에 나타난 바와 같이, Duplex-PCR에서 검출한계를 확인한 결과, 토끼풀황화잎맥바이러스(ClYVV) 및 땅콩모틀바이러스(PeMoV) 조합의 경우 10²까지, 토끼풀황화잎맥바이러스(ClYVV) 및 토마토반점위조바이러스(TSWV) 조합의 경우 10¹까지, 땅콩모틀바이러스(PeMoV) 및 토마토반점위조바이러스(TSWV) 조합 모두에서 10³까지 양성반응이 확인되었다.

실시예 5-3. Multiplex-PCR 반응

다음으로, 최종 선발된 세트 21 에 의해 3 종 이상의 바이러스가 검출될 수 있는지 알아보기 위해, 세트 21 의 프라이머를 대상으로, 이들의 검출한계를 알아보기 위해 Multiplex-PCR 를 실시하였으며, 그 결과는 도 15 에 나타내었다. 도 15에서 각 Lane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 은 각각 10⁰배 희석, 10¹배 희석, 10²배 희석, 10³배 희석, 10⁴배 희석, 10⁵배 희석, 10⁶배 희석 및 10⁷배 희석을 나타낸다.

도 15 에 나타난 바와 같이, Multiplex-PCR 에서 세트 21 의 검출한계를 확인한 결과, 10⁰까지 양성반응을 확인할 수 있었다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for simultaneous detection of three viruses on leguminous crop and use thereof <130> KNU1.301P <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 1 ccagtactca tatcgaggct 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 2 gccgcacatc aaccgagc 18 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 3 gtctcatggc aagcatcgc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 4 ggagagtcat tgcctggct 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 5 gacagggcag gtgatacag 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 6 ggaatacttt gcccgctgc 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 7 gtgcttcaaa cacagcatgc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 8 tggtctcttg aggtataagt g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 9 gcgcggaatg aggatattga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Clover yellow vein virus(ClYVV) <400> 10 attggctgac tgcactcttg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 11 ggcaacaccc acgccaag 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 12 ctccctgacc ttccgacc 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 13 agaacaccct tcagatggga 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 14 gcgtgctgct gcctcatg 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 15 gagtcagttg agaggttacc 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 16 cgcattcgtc ttgcatgcg 19 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 17 ttctcgaggc gagcgcga 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 18 catgatcacc atcgcttgct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 19 gcttcattgc ttgggtatgg 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Peanut mottle virus(PeMoV) <400> 20 tctgctatgc tctgcgcac 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 21 ttcagtctgg ggatcaactg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 22 cagagatttc actgcaagag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 23 ctctgttctg gcactatctg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 24 cagagatttc actgcaagag 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 25 cgaaagggac aattttggcc a 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 26 tgatcagtgt tgtcttggct 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 27 cttcctttag cattaggatt gc 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 28 tgatcagtgt tgtcttggct 20 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 29 cttcctttag cattaggatt gc 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 30 ctaaggttaa gctcactaac tg 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 31 ttcagtctgg ggatcaactg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 32 gaacaatgtt gtaaggctcc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 33 ctctgttctg gcactatctg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 34 gaacaatgtt gtaaggctcc 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 35 cgaaagggac aattttggcc a 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 36 gaccttcaga aggttgatag 20 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 37 cttcctttag cattaggatt gc 22 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Tomato spotted wilt virus(TSWV) <400> 38 gaccttcaga aggttgatag 20

Claims

a) 서열번호 5 및 6로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 토끼풀황화잎맥바이러스 진단용 프라이머 쌍;
b) 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 19 및 20으로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 땅콩모틀바이러스 진단용 프라이머 쌍; 및
c) 서열번호 21 및 22으로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 23 및 24로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 27 및 28로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 29 및 30로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 33 및 34로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 37 및 38로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 토마토반점위조바이러스 진단용 프라이머 쌍;을 포함하는 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단용 프라이머 세트.
제 1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 9 및 10; 서열번호 15 및 16; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는, 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단용 프라이머 세트.
제 1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 9 및 10; 서열번호 19 및 20; 및 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는, 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단용 프라이머 세트.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단용 프라이머 세트를 포함하는, 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단용 조성물.
제 4항에 따른 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단용 조성물을 포함하는, 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단용 키트.
a) 시료로부터 DNA를 얻는 단계;
b) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용하여 상기 a) 단계에서 얻어진 DNA를 증폭하는 단계; 및
c) 상기 b)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단 방법.
제 6항에 있어서,
상기 시료는 콩과작물인 것을 특징으로 하는, 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단 방법.
제 7항에 있어서,
상기 콩과작물은 콩, 팥, 땅콩, 완두콩, 강낭콩, 녹두 및 동부로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단 방법.
제 6항에 있어서,
상기 b) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 듀플렉스 중합효소연쇄반응(duplex Polymerase Chain Reaction, duplex PCR), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loopmediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단 방법.
제 6항에 있어서,
상기 c) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 토끼풀황화잎맥바이러스, 땅콩모틀바이러스 및 토마토반점위조바이러스 진단 방법.
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