CN102373298A - CSFV、PRRSV、PCV2与SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型多重SYBR Green I实时荧光PCR引物及其检测方法，CSFV引物的序列如下：上游引物P1：5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；下游引物P2：5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′；PRRSV引物的序列如下：上游引物P3：5′-AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3′；下游引物P4：5′-CCACAGTGTAACTTATCCTC-3′；PCV2引物的序列如下：上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′；SIV H9亚型引物的序列如下：上游引物P7：5′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；下游引物P8：5′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′。本发明分别设计扩增CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型的特异性引物，通过四重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法，能够同时检测CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型。有较好的特异性、重复性和敏感性，为CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型的检测提供了一种新的方法，可作为规模化猪场CSFV、PRRSV、PCV2和SIVH9亚型的净化检测方法，建立无CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型的猪群。

Description

CSFV、PRRSV、PCV2与SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法。 

背景技术

猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)都能够不同程度的导致妊娠引起种猪不育，即公猪睾丸肿胀，精液质量下降，失去种用能力；母猪表现为不发情，返情，不孕；妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等，给养猪业造成了巨大的经济损失。SIV能引起人兽共患病的发生和传播，威胁人类安全。对这类传染病的有效控制是保证人类公共安全和养猪业健康发展的关键因素之一。 

目前，国内外对以上三种病毒已经有大量的相关研究，建立了病毒分离、ELISA检测方法、免疫组化法、免疫荧光法等方法，以及以分子生物学为基础的检测方法，如PCR、套式PCR和竞争PCR等。但这些方法都存在这样那样的缺点：病毒分离耗时、原位杂交操作繁琐等，PCR虽然有较高的特异性和敏感性，但容易出现假阴性结果，而且不能定量，往往漏检隐性感染的动物，造成疾病的蔓延。TaqMan探针方法能够定量，但成本较高，不利于推广。临床上，这几种病毒经常混合感染，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，对仪器的操作要求较高，所需时间长，亟需一种操作简单、快速的检测、准确率高的鉴别诊断方法。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型这几种病毒常常以混合感染的形式出现，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，提供一种CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法。 

本发明的技术方案是：CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型多重SYBR Green I实时荧光PCR引物： 

CSFV引物的序列如下： 

上游引物P1：5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′； 

下游引物P2：5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′； 

PRRSV引物的序列如下： 

上游引物P3：5′-AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3′； 

下游引物P4：5′-CCACAGTGTAACTTATCCTC-3′； 

PCV2引物的序列如下： 

上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′； 

下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′； 

SIV H9亚型引物的序列如下： 

上游引物P7：5′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′； 

下游引物P8：5′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′。 

所述引物检测CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份： 

所述反应条件为：95℃预变性60s；进入循环，95℃变性15s；58℃退火20s；72℃延伸20s，40个循环，反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/sec递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。 

本发明的有益效果是：本发明分别设计扩增CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型的特异性引物，通过四重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法，能够同时检测CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型。利用TM值来区分不同的核酸片段，核酸片段的TM值主要与GC含量、序列长度和结构有关(Ririe K M et al，1997)。CSFV的扩增片段基因序列长252bp，其TM值在89℃左右；PRRSV的扩增片段基因序列长208bp，其TM值在86.5℃左右；PCV2扩增片段长171bp，TM值在85℃以下；SIV H9亚型的扩增片段为209bp，GC含量相对最高，TM值达到92℃以上，CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型的TM值可以很好的区分。 

在本发明中，CSFV扩增片段的TM值、PCV2扩增片段的TM值和PRV扩增片段的TM值会在一定的温度范围变动，CSFV的TM值变化范围为89.2-89.5℃，PRRSV的TM值变化范围为 86.6-86.8℃，PCV2的TM值变化范围为84.5-84.7℃，SIV H9亚型的TM值变化范围为92.2-92.3℃，4种病毒的TM值相差较大，借此可以利用熔解曲线的4个特异性的峰对这4种病毒进行鉴别与诊断。 

本发明的敏感性表明，CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型同时检出的极限拷贝数分别为173拷贝/μL，196拷贝/μL，203拷贝/μL，211拷贝/μL。本发明的特异性试验结果良好，只出现4个特异性的峰值，重复性试验具有很好的稳定性并且本试验的最大优势在于能够同时检测CSFV、SIV H9亚型、PCV2和PRRSV 4种DNA病毒，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别与诊断。 

本发明建立了检测CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型多重SYBR Green I荧光定量PCR方法，具有较好的特异性、重复性和敏感性，为CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型的检测提供了一种新的方法，可作为规模化猪场CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型的净化检测方法，建立无CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型的猪群，同时也为CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型感染的分子流行病学调查，研究CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型分子发病机理，CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型早期诊断，诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。 

附图说明

图1是CSFV部分基因质粒PCR鉴定结果，M.DL 2000Marker，1.阴性对照，2.目的片段； 

图2是PRRSV部分基因质粒PCR鉴定结果，M.DL 2000Marker，1.阴性对照，2.目的片段； 

图3是PCV2部分基因质粒PCR鉴定结果，M.DL 2000Marker，1.阴性对照，2.目的片段； 

图4是SIV H9亚型部分基因质粒PCR鉴定结果； 

图5是复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应溶解曲线分析； 

图6是多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应特异性试验熔解曲线分析；

图7是复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应同浓度重复性试验熔解曲线分析； 

图8是不同浓度重复性试验熔解曲线分析； 

图9是不同浓度重复性试验熔解曲线分析； 

图10是不同浓度重复性试验熔解曲线分析。 

具体实施方式

CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型多重SYBR Green I实时荧光PCR引物： 

CSFV引物的序列如下： 

上游引物P1：5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′； 

下游引物P2：5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′； 

PRRSV引物的序列如下： 

上游引物P3：5′-AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3′； 

下游引物P4：5′-CCACAGTGTAACTTATCCTC-3′； 

PCV2引物的序列如下： 

上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′； 

下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′； 

SIV H9亚型引物的序列如下： 

上游引物P7：5′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′； 

下游引物P8：5′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′。 

所述引物检测CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份，

所述反应条件为：95℃预变性60s；进入循环，95℃变性15s；58℃退火20s；72℃延伸20s，40个循环，反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/sec递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。 

具体实验操作如下： 

1材料与方法 

1.1材料 

1.1.1毒株、菌株 

PRV、PPV标准毒株购自中国兽药监察所；CSFV、SIV H9亚型、PRRSV、PCV2购自河南省动物性食品安全重点实验室；DH5α感受态细胞购自宝生物工程有限公司。 

1.1.2常用溶液及培养基 

LB液体培养基；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)贮存液，100mg/mL；IPTG液，浓度为100mg/mL；X-gal，浓度为20mg/mL，保存于棕色瓶内或用铝箔包裹的瓶内，以上溶液均贮存于-20℃备用。 

1.1.3主要仪器及试剂 

紫外凝胶成像系统购自美国ALPHA INNOTECH公司；Agilent Mx3005P型实时定量PCR扩增仪购自美国安捷伦Stratagene公司、PTC-200型PCR仪购自美国MJ公司等。 

SYBR Premix Ex Taq^TM II、EX TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000均购自大连宝生物工程有限公司；Protein K购自华美生物工程公司；T4 DNA连接酶、PGEM-T Easy质粒载体均购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物公司；RNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物技术有限公司；反转录试剂盒购自美国MBI公司。 

1.2方法 

1.2.1引物的设计和合成 

以GenBank公布PRRSV ORF7基因为参照序列(GQ183803)，SIV(EF055887)H9基因序列，PCV2ORF2基因为参照序列(AF027217)，CSFV 5′端保守序列用Primer Premier 6.0生物软件分别设计一对特异性引物，引物的序列如表1所示。 

表1 荧光PCR引物序列 

1.2.2PCV2、PRV、PPV DNA的提取 

传统的蛋白酶K提取方法：取已经检测过的含有这三种病毒的组织，剪碎、加适量的PBS研磨，取450μL研磨后的组织液，加入等体积样品裂解缓冲液[0.02mol/L Tris HCl(PH 7.5)，0.03mol/L EDTA，1％SDS]，混匀，再加入蛋白酶K(终浓度为200μg/m L)，55℃水浴1h，然后加入等体积的平衡酚，混匀，12000r/min离心5min。取上清，经酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)再次抽提后用2倍体积的异丙醇沉淀，-20℃放置30min，12000r/min离心5min，70％乙醇洗涤2次，干燥，加入25μL超纯水溶解，贮存于-20℃备用。 

1.2.3CSFV、PRRSV、SIV H9亚型cDNA的制备 

取已经检测过的含有这三种病毒的组织，剪碎、加适量的PBS研磨，取450μL研磨后的组织液，然后按试剂盒说明提取和反转录。 

1.2.4质粒模板标准品的制备 

以提取的PCV2DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA和SIV H9亚型cDNA为模板，用优化的条件扩增基因片段。在50μL反应体系中分别依次加入：EX TaqDNA聚合酶28μL，引物浓度P1/P3/P5/P7、P2/P4/P6/P8为0.5μm/L，模板1μL，最后用双蒸水补至50μL，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：95℃预变性5min后，进人循环95℃30s，58℃30s，72℃20s，30个循环后，72℃延伸10min，4℃结束反应。2.0％琼脂糖凝胶电泳。 

将扩增出目的片段按胶回收试剂盒回收，按照载体连接试剂盒将目的片段与pGEM-TEasy载体相连接，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性菌落，进行菌液PCR鉴定后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。经测序验证的阳性质粒作为模板标准品，分别命名为pGEM-CSFV、pGEM-PRRSV、pGEM-PCV2和pGEM-H9。 

1.2.5CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系条件的优化 

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系如下： 

在25μL体系中加入以下成份： 

反应条件为：95℃1min；95℃10s，58℃15s，72℃15s，共进行40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至95℃20min，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。 

1.2.5.1引物浓度的优化 

分别以50pmol/μL的引物浓度0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL、0.9μL进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应，以选取扩增该病毒的最佳引物浓度。添加时取相等体积的引物量。 

1.2.5.2退火温度的优化 

四重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR分别以53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃的退火温度进行反应，以确定最佳的退火温度。 

1.2.5.3SYBR 

Premix Ex Taq浓度的优化 

本发明中SYBR 

Premix Ex Taq的浓度是5U/μL，反应体系SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR总体积是固定，通过改变SYBR Premix Ex Taq的添加量来筛选荧光定量PCR反应体系中SYBR 

Premix Ex Taq的最佳浓度。分别以10μL、11.5μL、13μL、14.5μL、16μL、17.5μL的量进行筛选。 

1.2.6特异性检验 

按照SYBR Green Ⅰ荧光定量反应体系，分别加入CSFV、PRRSV、SIV H9亚型细胞毒cDNA(约20ng)，PCV2、PPV、PRV细胞毒DNA 1μL(约20ng)，同时设阴性对照，验证其特异性。 

1.2.7重复性检验 

选取CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型同一浓度的质粒标准品进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应重复性试验，反应重复三次；将不同浓度的质粒标准品进行复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应重复性试验，反应重复三次；通过每种病毒的TM值和溶解曲线的分析，验证CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的稳定性。 

1.2.8荧光定量PCR敏感性测定 

分别将CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型的重组质粒测OD₂₆₀值，计算出每微升的拷贝数，然后进行10倍梯度稀释，以此作为模板进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应，进而确定复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应检测每种病毒的敏感性。 

1.2.9疑似CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型病料样品检测及与常规PCR检测方法的比较 

取采自河南省内多个地市猪场的疑似CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型感染的病料进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和检测，以证实该方法的实用性。 

2结果 

2.1常规PCR质粒扩增结果 

如图1-4CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亚型部分基因质粒PCR鉴定结果所示，分别扩增出了与预计大小相一致的252bp、208bp、171bp和209bp的片段。pGEM-CSFV、pGEM-PRRSV、pGEM-PCV2和pGEM-H9经EcoR Ⅰ酶切鉴定，得到产物与预期的条带一致。测序与国内流行的毒株相比，核苷酸同源性在100％、99.8％、100％、98.7％以上。 

测得提取的CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型质粒DNA浓度分别为：pGEM-CSFV质量浓度＝18.8μg/mL，pGEM-PRRSV质量浓度＝34.9μg/mL，pGEM-PCV2质量浓度＝19.9μg/mL，pGEM-H9质量浓度＝52.7μg/mL。经计算，pGEM-CSFV质粒浓度为1.38×10¹¹拷贝/mL，pGEM-PRRSV质粒浓度为2.01×10¹⁰拷贝/mL，pGEM-PCV2质粒浓度为2.19×10¹¹ 拷贝/mL，pGEM-H9质粒浓度为2.96×10¹⁰拷贝/mL。 

2.2CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型四重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化结果 

2.1.1引物浓度优化结果 

CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型引物均采用50pmoL/μL 0.5μL的量在25μL体系中进行反应，能够产生特异性的单一峰值，阴性对照无特异性峰值产生。CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应的最佳引物浓度均为0.5μL50pmoL/μL。 

2.1.2退火温度优化结果 

CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型在退火温度58℃时，均产生了特异性的峰值。CSFVTM值分别为89.2℃，89.2℃，89.2℃；PRRSV TM值分别为86.6℃，86.6℃，86.6℃；PCV2TM值分别为84.5℃，84.6℃，84.6℃；SIV TM值分别为91.9℃，91.7℃，92.2℃；阴性对照均无特异性峰值产生。CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型四重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应的最佳退火温度为58℃。 

2.1.3SYBR 

Premix Ex Taq浓度的优化结果 

CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型四重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应中SYBR 

Premix Ex Taq添加量在16.5μL时，四者均可产生特异性的峰值，阴性对照无特异性峰值产生。 

2.2复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系的确定 

通过各个反应条件的优化，最终确定了CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型多重SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应体系，在25μL体系中加入以下成份： 

该反应的循环参数最终确定为：95℃预变性60s，95℃15s；58℃20s；72℃20s，40个循环。反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/sec递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。 

2.4CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型四重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线及CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型TM值的确定 

按照CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件，以 CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型的重组质粒为模板，进行PCR反应，经软件Agilent Mx3005P分析后得到熔解曲线(图5)，从图中可以看出两个特异性的峰值所对应的温度即为CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型的TM值。通过多个批次试验数据的收集整理后，最终确定了CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型四种病毒的TM值，分别为：CSFV 89.2-89.3℃，PRRSV86.3-86.7℃，PCV284.5-84.7℃，SIV H9亚型91.9-92.3℃，阴性对照则无峰值产生。 

2.5多重复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR特异性检验结果 

从CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR特异性试验结果(图6)可以看出，对照组中PRV、PPV及阴性对照均无特异性峰值产生。只有试验组中的CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型复合荧光PCR产生了特异性的四个峰值。CSFV TM值为89.3℃，PRRSV TM值为86.7℃，PCV2 TM值为84.7℃，SIV H9亚型TM值为91.9℃。 

2.6多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果 

2.6.1同一浓度的CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型四重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果 

三次重复性试验中，各个病毒的TM值都较为稳定。对照组中CSFV、PRRSV、PCV2、SIVH9亚型及阴性对照均无特异性峰值产生(如表2，图7)。同浓度的CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型四重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应具有很好的稳定性。 

表2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR的同一浓度重复性试验分析 

2.6.2不同浓度的CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果 

在不同浓度重复性试验中，这几种病毒的TM值都较为稳定。对照组中PPV、PRV及阴性对照都没有特异性峰值产生(如表3，图8-10)。不同浓度的CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应同样具有很好的稳定性。 

表3 多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR的不同浓度重复性试验分析 

2.7CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR敏感性试验验 

pGEM-CSFV、pGEM-PRRSV、pGEM-PCV2和pGEM-H9四种质粒的浓度分别为18.8μg/mL、34.9μg/mL、19.9μg/mL、52.7μg/mL；取等体积的两种质粒混匀后，进行10倍梯度稀释，以此作为模板进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应。CSFV重组质粒的敏感性可以达到173拷贝/μL，PRRSV重组质粒的敏感性可以达到196拷贝/μL。PCV2重组质粒的敏感性可以达到203拷贝/μL，SIV H9亚型重组质粒的敏感性可以达到211拷贝/μL。 

2.8四重荧光定量real-time PCR与常规PCR检测比较 

将疑似患CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型仔猪组织病料33头份(编号为1-33)，阴性对照2头份(编号为34、35)，提取DNA或cDNA，分别进行PCR和real-time PCR检测，如表4所示，在33份病料中，常规PCR检出18份CSFV阳性病料，检出率为54.5％；16份PRRSV阳性病料，检出率为48.5％；17份PCV2阳性病料，检出率为51.5％；16份SIV H9亚型阳性病料，检出率为48.5％；四重荧光定量PCR同样能够检测出常规PCR所检出的阳性病料，二者吻合率达100％；四重荧光定量PCR中，CSFV检出27份阳性病料，检出率为81.8％，比常规PCR的检出率高27.3％；PRRSV检出25份阳性病料，检出率为75.8％，比常规PCR的检出率高27.3％；PCV2检出25份阳性病料，检出率为75.8％，比常规PCR的检出率高24.3％；SIV H9亚型检出21份阳性病料，检出率为63.6％，比常规PCR的检出率高15.1％.real-time PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。 

表4 CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亚型复合荧光定量PCR方法与常规PCR方法比较 

Claims (2)

1.CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型多重SYBR Green I实时荧光PCR引物，其特征在于：

CSFV引物的序列如下：

上游引物P1：5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；

下游引物P2：5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′；

PRRSV引物的序列如下：

上游引物P3：5′-AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3′；

下游引物P4：5′-CCACAGTGTAACTTATCCTC-3′；

PCV2引物的序列如下：

上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；

下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′；

SIV H9亚型引物的序列如下：

上游引物P7：5′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；

下游引物P8：5′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′。

2.利用权利要求1所述引物检测CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亚型的多重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于：

所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

所述反应条件为：95℃预变性60s；进入循环，95℃变性15s；58℃退火20s；72℃延伸20s，40个循环，反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/sec递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。

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