CN104846117A

CN104846117A - 一种肠道病毒多重rt-pcr试剂盒

Info

Publication number: CN104846117A
Application number: CN201510183378.4A
Authority: CN
Inventors: 刘为勇; 王涛
Original assignee: Chuan Rui Bio Tech Ltd Hubei
Current assignee: Chuan Rui Bio Tech Ltd Hubei
Priority date: 2015-04-18
Filing date: 2015-04-18
Publication date: 2015-08-19

Abstract

一种肠道病毒多重RT-PCR试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、5xRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、随机引物、三对特异性引物、多重10xPCR Buffer、Taq酶；本试剂盒依据肠道病毒基因保守序列5’端非编码区设计通用引物：F1：5’-ACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’，F2：5’-GATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’；依据EV71病毒VP1基因保守序列设计引物；依据CA16病毒VP1基因保守序列设计引物。本发明测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高。

Description

一种肠道病毒多重RT-PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR试剂盒，尤其涉及一种肠道病毒多重RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链锁反应）试剂盒。

背景技术

手足口病(Hand，foot and mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，个别重症患儿如果病情发展快，导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A 16型（Cox A16）和肠道病毒71型（EV 71）最为常见。

我国自1981年在上海始见本病，往后湖北、广东等十几个省市均有报道手足口病例的报道。1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发流行，5～10月间发生了7000余病例，经过2年散发流行后，1986年又出现暴发，在托儿所和幼儿园2次暴发的发病率分别达2.3％和1.9％。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV 71病毒，1998年EV 71感染在我国台湾省引发大量手足口病和疱疹性咽峡炎，在6月和10月两波流行中，共监测到129 106病例，重症病人405例，死亡78例，大多为5岁以下的儿童，并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血。近几年，在大陆内地以及亚洲一些其他国家地区，如越南、马来西亚等国家，手足口病又一次大爆发，保守估计有病例几万余例，死亡率达到几百甚至上千例，所以此时迫切的需要一种快速准确的检测方法来检测肠道病毒，以助于流行病学调查和医院系统对儿童病情的快速诊治。

直到最近，从儿童咽拭子和排泄物样品中分离肠道病毒，再利用特异性的抗原检测方法来对分离的病毒进行血清型的鉴定是现今对肠道病毒的一种主要诊断方法。如今，PCR技术日渐成熟，足可以代替以前鉴定肠道病毒的检测方法，如多重RT-PCR技术，能及时迅速准确检测出多种肠道病毒，如EV71和CA16等，在大量临床样本检测中拥有快速准确高效的特性，具有巨大的市场潜能。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种肠道病毒多重RT-PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

肠道病毒多重RT-PCR试剂盒（简称试剂盒）

本试剂盒是在对肠道病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物，利用PCR技术对肠道病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物存在下，在PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对肠道病毒的检测。

具体地说，本试剂盒包括M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、5xRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、随机引物、三对特异性引物、多重10xPCR Buffer、Taq酶；

① 依据肠道病毒基因保守序列5’端非编码区设计通用引物：

F1：5’-ACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’ 22bp，

F2：5’-GATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’ 21bp；

依据EV71病毒VP1基因保守序列设计引物：

EV71F：5’-AGARAGYTCTATAGGRGAYAG-3’ 21bp，

EV71R：5’-GGAGGGAGRTCTATCTCYCC-3’ 20bp；

依据CA16病毒VP1基因保守序列设计引物：

CA16F：5’-AAGGGTAATGGARTGTGGTGAY-3’ 22bp，

CA16R：5’-GTGTGTGTTGAACCATCACTC-3’ 21bp；

其中：R=A或G，Y=C或T；

② 阳性对照：

连接有设计肠道病毒、EV71、CA16引物的基因保守序列的pGBKT-7克隆载体；

③阴性对照：

RNase Free H₂O；

④5×RT-PCR Buffer配制：

Tris-HCl 250mM

KCl 375mM

MgCl₂15mM

DTT 50mM

dNTP 10mM

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑤多重10×PCR Buffer配制：

Tris-HCl 100mM

KCl 500mM

MgCl₂25mM

dNTP 2mM

Nonidet P40 0.8％

配置混合后于冰箱-20℃保存。

试剂盒的使用方法

①病毒核酸的提取：

A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；

在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

B、取30μl 蛋白酶放入1.5ml离心管中；

C、将标本（如咽拭子等）取200μl加入此管中，充分混匀；

D、再在每管分别加入200μl 漂洗液（含30μg/ml carrier RNA），混匀振荡30s，70℃温育10min；

E、加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

F、将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

G、滤柱中加入500μl 缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl 缓冲液2，12000rpm，离心1min，重复步骤⑧一次；

I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃ 15min以干燥滤膜；

J、将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12 000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

②逆转录PCR扩增（每份50ul体系）

取30ul提取的核酸作为RT-PCR反应模板，同时加入20ul RT-PCR反应液至PCR管中进行RT-PCR扩增。

a）RT-PCR反应液的配制：

5XRT-PCR Buffer 10ul

RNA酶抑制剂（25U/ul） 1ul

M-MLV逆转录酶（200U/ul） 2ul

随机引物 1ul

RNase Free H₂O 6ul

反应液体积： 20 ul

b）RT-PCR 反应程序：

37℃ 60min

70℃ 10min

End

c）检测

本发明使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR仪进行检测。

d）结果

RT-PCR后得到病毒核酸的cDNA片段。

③多重PCR扩增（每份25ul体系）

取5ul反转录成的cDNA作为模板，同时加入20ul PCR反应液至PCR管中进行多重PCR扩增。

a）多重PCR反应液的配制：

多重10xPCR Buffer 13ul

EV71F/R（20mM）各 0.5 ul

CA16F/R（20mM）各 0.5 ul

F1/F2 （20mM）各 0.5 ul

Taq酶(2.5U/ul) 2ul

RNase Free H₂O 2ul

反应液体积： 20ul

b）多重PCR 反应程序：

94℃ 5min

95℃ 30s

57℃ 30s

72℃ 1min

Go to ,35 cycles

72℃ 5min

c）检测：

本发明使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR仪进行检测。

d）结果判断：

所得到的DNA产物，使用2％的琼脂糖凝胶跑电泳，使用照胶仪来分析检测。

如泳道中无条带显示则为阴性，有条带显示为阳性；

如泳道只有一条带显示为440bp为其它肠道病毒非EV71和CA16肠道病毒；

如泳道有两条带显示，其中一条显示为440bp，另外一条为264bp，结果则为EV71病毒；

如泳道有两条带显示，其中一条显示为440bp，另外一条为550bp，结果则为CA16病毒；

如泳道有三条带显示，其中一条显示为440bp，一条为550bp，一条为264bp，结果则为EV71和CA16共感染。

本发明具有下列优点和积极效果：

①测时间周期短、检测效率高；

②检测病毒特异性高，准确率高；

③能进行病毒定性分析；

④检测灵敏度比免疫学检测方法灵敏度高；

⑤操作简单、易于推广；

⑥实验结果重复性好。

具体实施方式：

一、实施例1---肠道病毒多重RT-PCR试剂盒

检测疑似肠道病毒感染患者咽拭子标本12份，各取标本液200μl进行病毒核酸提取。

1、试剂盒的组成：

本试剂盒包括M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、5xRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、随机引物、三对特异性引物、多重10xPCR Buffer、Taq酶；

2、肠道病毒上、下游引物序列设计依据病毒基因序列5’端非编码区而设计：

上游序列F1：5’-ACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’22bp

下游序列F2：5’-GATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’ 21bp

EV71上、下游引物序列设计依据病毒VP1基因序列而设计：

上游序列EV71F：5’-AGARAGYTCTATAGGRGAYAG-3’21bp

下游序列EV71R：5’-GGAGGGAGRTCTATCTCYCC-3’ 20bp

CA16上、下游引物序列设计依据病毒VP1基因序列而设计：

上游序列CA16F：5’-AAGGGTAATGGARTGTGGTGAY-3’22bp

下游序列CA16R：5’-GTGTGTGTTGAACCATCACTC-3’21bp

其中：R=A或G，Y=C或T；

3、5×RT-PCR Buffer配制：

Tris-HCl 250mM

KCl 375mM

MgCl₂15mM

DTT 50mM

dNTP 10mM

配置混合后于冰箱-20℃保存；

4、多重10×PCR Buffer配制：

Tris-HCl 100mM

KCl 500mM

MgCl₂25mM

dNTP 2mM

Nonidet P40 0.8％

配置混合后于冰箱-20℃保存。

5、病毒核酸的提取：

① 首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA。

② 取30μl 蛋白酶放入1.5ml离心管中。

③ 将标本（如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等）取200μl加入此管中，充分混匀。

④再在每管分别加入200μl 漂洗液（含30μg/ml carrier RNA），混匀振荡30s，70℃温育10min。

⑤ 加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min。

⑥ 将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液。

⑦ 滤柱中加入500μl 缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。

⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl 缓冲液2，12000rpm，离心1min。重复步骤⑧一次。

⑨ 将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃ 15min以干燥滤膜。

⑩ 将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12 000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

6、逆转录PCR扩增（每份50ul体系）

a）RT-PCR反应液的配制：

5xRT-PCR Buffer 10ul

RNA酶抑制剂（25U/ul） 1ul

M-MLV逆转录酶（200U/ul） 2ul

随机引物 1ul

RNase Free H₂O 6ul

反应液体积： 20 ul

b）RT-PCR 反应程序：

37℃ 60min

70℃ 10min

End

c）检测

本发明使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR仪进行检测。

d）结果

RT-PCR后得到病毒核酸的cDNA片段。

7、多重PCR扩增（每份25ul体系）

a）多重PCR反应液的配制：

多重10xPCR Buffer 13ul

EV71F/R（20mM）各 0.5 ul

CA16F/R（20mM）各 0.5 ul

F1/F2 （20mM）各 0.5 ul

Taq酶(2.5U/ul) 2ul

RNase Free H₂O 2ul

反应液体积： 20ul

b）多重PCR 反应程序：

94℃ 5min

95℃ 30s

57℃ 30s

72℃ 1min

Go to 2,35 cycles

72℃ 5min

c）检测：

本发明使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR仪进行检测。

d）结果判断：

胶块6个泳道有目的条带且其中有一条带为440bp，即可判断12份标本中有6份检测显示为阳性，其余6份为阴性；

胶块有2个泳道只有一条带显示为440bp，则判断为其它肠道病毒非EV71和CA16肠道病毒；

胶块有3个泳道有两条带显示，其中一条显示为440bp，另外一条为264bp，则判断为EV71病毒；其中一条显示为440bp，另外一条为550bp，则判断为CA16病毒；

胶块有1个泳道有三条带显示，其中一条显示为440bp，一条为550bp，一条为264bp，则判断为EV71和CA16共感染。

最终，12份疑似肠道病毒感染患者咽拭子标本中检出肠道病毒阳性6例，其中EV71型2例，CA16型阳性1例，EV71、CA16共感染1例，检出率100％。

二、实施例2

用上述方法对另外20份疑似肠道病毒感染患者疱疹液标本进行检测，其中检出肠道病毒阳性8例，其中EV71型3例，CA16型阳性1例，EV71、CA16共感染1例，检出率100％。

序列表

<110> 湖北创瑞生物科技有限公司

<120> 肠道病毒多重RT-PCR试剂盒

<140>

<141>

<160> 6

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>肠道病毒通用上游引物

<400>

5’-ACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’。

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213>肠道病毒通用下游引物

<400>

5’-GATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’。

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> EV71上游引物

<400>

5’-AGARAGYTCTATAGGRGAYAG-3’。

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> EV71下游引物

<400>

5’-GGAGGGAGRTCTATCTCYCC-3’。

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> CA16上游引物

<400>

5’-AAGGGTAATGGARTGTGGTGAY-3’。

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> CA16下游引物

<400>

5’-GTGTGTGTTGAACCATCACTC-3’。

Claims

1.一种肠道病毒多重RT-PCR试剂盒，其特征在于：

依据肠道病毒基因保守序列5’端非编码区设计通用引物：

F1：5’-ACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’ 22bp，

F2：5’-GATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’ 21bp；

依据EV71病毒VP1基因保守序列设计引物：

EV71F：5’-AGARAGYTCTATAGGRGAYAG-3’ 21bp，

EV71R：5’-GGAGGGAGRTCTATCTCYCC-3’ 20bp；

依据CA16病毒VP1基因保守序列设计引物：

CA16F：5’-AAGGGTAATGGARTGTGGTGAY-3’ 22bp，

CA16R：5’-GTGTGTGTTGAACCATCACTC-3’ 21bp；

其中：R=A或G，Y=C或T；

阳性对照：

③阴性对照：

RNase Free H₂O；

④5×RT-PCR Buffer配制：

Tris-HCl 250mM

KCl 375mM

MgCl₂15mM

DTT 50mM

dNTP 10mM

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑤多重10×PCR Buffer配制：

Tris-HCl 100mM

KCl 500mM

MgCl₂25mM

dNTP 2mM

Nonidet P40 0.8％

配置混合后于冰箱-20℃保存。