CN106566882A

CN106566882A - 一种检测脑膜炎和脑炎的装置和方法

Info

Publication number: CN106566882A
Application number: CN201610952465.6A
Authority: CN
Inventors: 杨星; A.赫默特; M.沃恩; J.克劳德; M.罗加切瓦
Original assignee: Bai Aofaer Diagnoses Co Ltd
Current assignee: Bai Aofaer Diagnoses Co Ltd; Biofire Diagnostics LLC
Priority date: 2016-11-02
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2017-04-19

Abstract

本发明涉及一种使用多重巢式PCR检测脑膜炎和脑炎的试剂盒，所述试剂盒包括第一片层和第二片层；第一片层和第二片层之间的泡；顶表面连接至所述片层的储存器；其位于第一片层和第二片层之间的孔；连接所述泡、储存器和孔的通道；荧光染料；和用于检测以下一种或多种微生物的PCR引物；其中所述试剂盒在加入样品后处于密封状态。

Description

一种检测脑膜炎和脑炎的装置和方法

技术领域

本发明涉及检测脑膜炎和脑炎的装置和方法，具体地说涉及一种使用多重巢式PCR检测脑膜炎和脑炎的装置和方法。

背景技术

中枢神经系统(CNS)感染是造成脑和/或脑周边脑膜组织的炎症症状(即脑膜炎、脑炎、脑膜脑炎，本文中统称为ME)的原因。感染性ME可由多种病原体引起，其中包括细菌、病毒、真菌和原生动物。在美国，细菌性脑膜炎的病例已减少，由1998-1999年的每100,000人群中2例减少到2006-2007的每100,000中1.38例，主要是由于引入了流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌的疫苗。然而，这些感染的发病率和致死率仍然很高。约15％的病例是致死的，而许多其它病例导致终生残疾，例如肢缺损、视听缺陷、癫痫和学习和记忆能力的改变。病毒性脑膜炎(也称为无菌性脑膜炎)和病毒性脑膜炎更加普遍，已导致美国1988-1999年期间每年约有55000人住院治疗。与这些住院治疗有关的医疗费用每年高于6亿5千万美元。尽管许多病毒性中枢神经系统感染有自限性，一些病毒在缺乏有效的抗病毒治疗时仍然有致命性(例如单纯性疱疹病毒脑炎的致死率高于70％)，它们的感染会随后导致生理和认知缺陷。

早期有效的ME治疗对于减少发病率和致死率非常关键，然而，由于目前诊断方法实施的困难和耗时，确定感染的病原学原因依然是一个重大的挑战。这些病原体时常会有不易察觉的临床表现，脑脊液化学和细胞学检测可能无法显示出诊断异常，尤其在感染的早期和某些人群中(如新生儿)。培养是鉴别脑脊液细菌的标准方法，它需要24-48小时的周转时间(TAT)，良好操作也需要专门技能。尽管病毒培养仍然在一些机构中操作，PCR仍然是从脑脊液中鉴别病毒的标准方法。目前在美国有两项美国食品药品管理局(FDA)批准的分子检测(用于检测肠病毒的CepheidEV和用于检测1型和2型疱疹病毒的CepheidEV)。各种其它病毒通过开放系统的实验室研发的PCR实验检测，但这些实验在技术上很复杂而且很容易感染。病毒PCR的运行周期为小于24小时至2周不等，取决于该实验在室内进行或被送往标准参考实验室。病毒PCR检测在不同设备中也存在误差。

除了改善患者的结局，在ME中更加及时地鉴别病原体还有几项其他的好处：

●由于快速鉴别ME病原体，抗菌的管理工作将得到改进。由于细菌脑膜炎的性质严重，一旦发现疑似细菌，经常采用广谱抗感染的经验抗菌疗法。不恰当或不充分的治疗将导致发病率和致死率，以及严重后遗症的增加，以及耐药性的提升。

●快速诊断辅助感染控制实施。飞沫预防措施，包括隔离或病人的集中放置，以阻止脑膜炎双球菌的传播。更早地鉴别脑膜炎将使得适当的感染控制措施得以更快实施。此外，更早地鉴别将提供更及时的社区爆发的通知。

●额外诊断检测和住院治疗时间的减少会导致费用的节省。多项研究证明了费用的节省，住院时长的减少以及更少地接受不必要的抗生素的治疗，这与脑脊液中病原体(尤其是肠病毒)的早期鉴别的分子检测相关联。(在Nolte等，Clin.Infect.Dis.43，1463-1467(2006)中记载)

在最近几年中，聚合酶链反应(PCR)已经变成一种用于快速诊断传染原的选择性方法。PCR是一种诊断传染病的快速、灵敏且特殊的工具。利用PCR作为诊断的主要方法的挑战是在某些病理标本中存在各种可能的病原微生物和低水平的微生物。运行大量的PCR化验时常是不恰实际的，如果对于各种可能的病原微生物各进行一次PCR化验，其大多数预计是阴性的。当致病菌核酸的浓度很低时，问题更严重，并且需要大量样本以收集足够的反应模板。在某些情况下可能没有足够的样本针对所有可能的病原体进行化验。一种解决方法是运行多重PCR，其中样本在单个反应中同时针对多个目标进行检测。虽然已经证明多重PCR在某些系统中是有价值的，但是存在的相关缺点是高水平多重反应的稳定性和对于多个产物进行明确分析的困难。为解决这些问题，可进行巢式PCR，在第一阶段产物中嵌套第二阶段反应以提高稳定性和特异性。然而，现有方法和仪器进行第二阶段所需的实验操作需要熟练的技术人员，可能耗费大量金钱、时间和人工，并且可能导致污染或其它问题。

因此，需要一种多重、快速、灵敏而特异的对ME的分子诊断方法，这对于公众健康和医疗的整体改善有巨大的潜力。

发明内容

本发明提供了一种使用多重巢式PCR检测脑膜炎和脑炎的装置，即基于平台的、用于检测脑膜炎和脑炎的试剂盒。平台结合了自动样品制备、核酸提取和基于PCR的多个独立目标检测，可从单一未处理样本进行，并在一小时内完成。它结合了巢式PCR和多重PCR(在此称为多重巢式PCR)以及DNA熔解曲线分析，以同时检测和区分多种病原体。因为样本操作和反应在一个封闭的试剂盒内进行，实验室污染的风险较低。

在本发明的一个方面，提供了一种用于检测脑膜炎和/或脑炎的试剂盒，所述试剂盒包括：

外表面的第一片层和第二片层；

一个或多个泡(blister)，其位于第一片层和第二片层之间；

一个或多个储存器(reservior)，其顶表面连接至所述片层；

一个或多个孔(well)，其位于第一片层和第二片层之间并与所述泡和/或储存器流体连通；

连接所述泡、储存器和孔的通道，所述通道使得试剂盒的液体可在泡、储存器和孔之间流动；

荧光染料，所述荧光染料可与dsDNA结合而产生荧光信号，从而可产生探针/靶标双链体的解链曲线；和

用于检测一种或多种脑膜炎和/或脑炎微生物的第二阶段多重PCR引物；

其中所述试剂盒在加入样品后处于密封状态。

在本发明的一个方面，本发明试剂盒中所述泡之一中包括选自以下的一种或多种：瓷珠、二氧化硅磁珠和第一阶段多重PCR引物。

在本发明的一个方面，本发明试剂盒中所述瓷珠位于泡522中，和/或冻干颗粒形式的所述二氧化硅磁珠位于泡546中，和/或冻干颗粒形式的所述第一阶段多重PCR引物位于泡564中。

在本发明的一个方面，本发明试剂盒中用于检测不同微生物的所述第二阶段PCR引物分别位于不同的所述孔中。

在本发明的一个方面，本发明试剂盒的第二阶段PCR引物用于检测选自以下的一种或多种微生物：大肠杆菌K1、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、巨细胞病毒(CMV)、肠病毒(EV)、EB病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒2(HSV-2)、人疱疹病毒6(HHV-6)、人副肠孤病毒(HPeV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、新型隐球菌/格特隐球菌。

在本发明的一个方面，本发明试剂盒中所述第二阶段多重PCR引物各自具有多个重复，每个重复位于不相邻的孔中。在本发明的一个方面，相邻的孔中检测的微生物具有不同的解链曲线。

在本发明的一个方面，本发明试剂盒中所述储存器中分别包括选自以下的一种或多种：对照、洗涤缓冲液、核酸洗脱缓冲液、逆转录/第一阶段PCR主混合物、稀释缓冲液、第二阶段PCR预混合物。

附图概述

图1描述了本发明的试剂盒。其中，图1A描述了试剂盒的外观，其中在左侧注入口注入了模拟样品，在右侧注入口注入了水合液。图1B描述了试剂盒的泡，和泡之间热密封收口的通道。试剂盒中的储存器与片层(以及其间的泡和通道等)通常相互成直角；此处为清楚起见已被平坦化。图1C显示了泡、通道和孔阵列的功能区的示意图。

图2是将试剂盒装入仪器的图。

图3是第二阶段PCR混合物进入孔阵列的示意图。试剂盒的各层被分离以显示液体流入阵列各孔(图中未按比例绘制)。除阵列本身外，实际的所有层都是透明的。第二阶段PCR引物在制造时被点样到阵列各孔中并空气干燥。箭头显示PCR主混合物(不含引物)通过通道进孔入阵列。

图4是本发明试剂盒的各部分的详细描述。

具体实施方式

本文所使用的范围在本文中可表述为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。术语“约”在本文中用于指近似、在其区域内、大致或约。当术语“约”与数字范围结合使用时，其通过扩展所列数字值上面和下面的界限修饰该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于修饰数值在所述值上和下达5％的差异。当表述这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至其它特定值。相似地，当值通过使用先词“约”表述为近似值时，将理解为该特定值形成另一个实施方案。将进一步理解的是，每个范围的端点相对于其它端点均显著，并且独立于其它端点。

本文所使用的词语“或”意指特定列表中的任何一个成员，并且还包括该列表中成员的任何组合。

“样品”意指如本文所述进行测定的动物；动物的组织或器官；细胞(受试者体内、直接从受试者获取或维持培养的细胞或来自培养的细胞系的细胞)；细胞裂解物(或裂解物级分)或细胞提取物；包含源自细胞、细胞物质或病毒物质的一种或多种分子(例如多肽或核酸)的溶液；或包含非-天然存在的核酸的溶液。样品还可为包含细胞、细胞组分或核酸的任何体液或排泄物(例如，但不限于，血液、尿液、粪便、唾液、眼泪、胆汁、脑脊液)。

本文所使用的短语“核酸”指能够与互补核酸通过Watson-Crick碱基-配对杂交的天然存在或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论DNA或RNA或DNA-RNA杂合物、单链或双链、有义或反义。本发明核酸还可包括核苷酸类似物(例如，BrdU)和非-磷酸二酯核苷酸间连接(例如，肽核酸PNA或硫二酯连接)。特别地，核酸可包括但不限于DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。

“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指可与包含互补序列的第二个DNA或RNA分子(“靶”)碱基-配对的定义序列的单链DNA或RNA分子。所得杂合物的稳定性取决于长度、GC含量和发生碱基配对的程度。碱基-配对的程度受参数例如探针与靶分子之间的互补性程度和杂交条件的严格性程度影响。杂交严格程度受参数例如温度、盐浓度和有机分子例如甲酰胺的浓度影响，通过本领域技术人员所已知的方法确定。探针、引物和寡核苷酸可通过本领域技术人员所熟知的方法放射性、荧光或非放射性地可检测标记。dsDNA结合染料可用于检测dsDNA。应理解的是“引物”特别地配置为通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以或可以不被如此配置。

“dsDNA结合染料”意指与单链DNA结合或在溶液中游离时相比，与双链DNA结合时所发出荧光不同的染料，通常发出荧光更强。当提及dsDNA结合染料时，应理解为本文中可使用任何合适的染料，一些非限制性的说明性染料在美国专利号7,387,887中描述，该专利通过引用结合到本文中。本领域已知其它可用于检测核酸扩增和熔解的信号产生物质，例如酶、抗体等。

″特异性杂交″意指探针、引物或寡核苷酸在高度严格的条件下识别基本上互补的核酸(例如，样品核酸)并与之物理上相互作用(即，碱基-配对)，并且基本上不与其它核酸碱基配对。

高度严格的条件″意指允许杂交与使用至少40个核苷酸长的DNA探针在包含0.5MNaHP04pH7.2、7％SDS、1mMEDTA和1％BSA(FractionV)的缓冲液中于温度65℃下或在包含48％甲酰胺、4.8XSSC、0.2MTris-ClpH7.6、1XDenhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和0.1％SDS的缓冲液中于温度42℃下所获的杂交相当的条件。其它用于高度严格杂交例如用于PCR、Northern、Southern或原位杂交、DNA测序等的条件为分子生物学领域的技术人员所熟知。

当PCR为本文实施例中所使用的扩增方法时，应理解为任何使用引物的扩增方法均可为合适的。此种合适的程序包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、级联滚环扩增(CRCA)、环介导的DNA等温扩增(LAMP)、等温和嵌合引物-起始的核酸扩增(ICAN)、基于靶的解旋酶依赖性扩增(HDA)、转录介导的扩增(TMA)等。因此，当使用术语PCR时，应理解为包括其它可选的扩增方法。对于无不连续循环的扩增方法，可使用在循环或Cp中进行测量的反应时间，并且在本文所述实施方案中加入额外的PCR循环时可加入额外的反应时间。应理解的是方案可能需要相应调整。

新出现的技术，例如多重PCR或MALDI-TOF，能够迅速检测影响人类健康的许多细菌和病毒病原体。通过同时筛查多种病原体，这些技术通过减少诊断所需的实验室检验次数节约了时间和金钱。迅速、广谱而特异性的检测的一个难题是并非所有的病原体以相同的滴度存在。例如，在阳性血液培养物中革兰氏阴性细菌通常生长至较高的滴度，而酵母菌生长较缓慢，并且生长至较低滴度。潜在的检测背景环境生物使此问题进一步复杂。空气、土壤、灰尘和人类均为细菌生物携带者。此外，检验试剂盒本身可包含痕量核酸，即使该检验试剂盒及其内含物已经灭菌。同样，培养生物的生长培养基常常包含无活性生物，其不影响培养，但可产生PCR假阳性。若将系统均匀地设计为增加灵敏度以检测低滴度病原体，可能会从背景生物中产生频繁的假阳性。或者，若降低系统灵敏度以避免检测背景生物，可能会错过低滴度生物，导致假阴性检测。两步多重PCR方案使得能够检测宽范围的滴度，但此宽范围检测可能使其难以区分真阳性和少数环境污染物。通过逐一调整每个测定检测前进行的PCR循环数目，在与较高滴度靶生物相同的多重PCR反应中可容易地检测低滴度靶标，同时使来自背景污染物、交叉反应性(在高度多重反应中可能成为问题)和其它无关扩增的假阳性判定最小化。

图1和图4显示了说明性的试剂盒510。试剂盒510具有细胞溶解区域520、核酸制备区域540、第一级扩增区域560和第二级扩增区域580，以及储存器区590。包含核酸的样本通过靠近储存器的样本注射端口引进试剂盒510中。试剂盒510包括各种尺寸的各通道和泡，并且布置为使得样本流过系统。样本穿过各区域，并进行相应的处理。样本处理发生在各泡中。提供各通道用于使样本在处理区域中和处理区域之间移动，而提供其它通道将液体和试剂传送至样本或从样本中除去这种液体和试剂。例如，通过压力，例如气动压力而使试剂盒510中的液体在泡之间移动，如下所述，但可设想其它使材料在容器中移动的方法。

虽然可使用其它容器，但例如，试剂盒510外表面的片层由双层柔性塑料膜或其它柔性材料例如聚脂、聚乙烯对苯二甲酸酯(PET)、聚碳酸酯、聚丙烯、有机玻璃和其混合物形成。片层可通过本领域中已知的任何工艺来制成，包括挤压、等离子体沉积和叠片。还可使用金属箔或带有铝叠片的塑料。可密封在一起，以形成泡和通道的其它材料在本领域中是已知的。如果使用塑料膜，那么作为本发明的一个示例，塑料膜制成的各片层可通过热密封而结合在一起。优选地，材料具有低的核酸结合力。

对于采用萤光监测的实施例，对荧光具有低吸收性的塑料膜是优选的。这种材料可通过尝试不同的塑料、不同的塑化剂和复合比以及不同的膜厚度来确定。对于带有铝或其它箔叠片的塑料，可使有待荧光检测装置读取的部分没有箔。例如，如果在试剂盒510的第二级扩增区域580的泡582中监测荧光，那么将使泡582处的一个或两个层没有箔。例如，在PCR中，由约0.1219mm厚的聚脂(Mylar，Dupont，WilmingtonDE)和0.025-0.076mm厚的聚丙烯膜组成的膜叠片工作性能很好。例如，试剂盒510由能够透射约80％-90％入射光的透明材料制成。

在说明性的实施例中，通过在泡和通道上应用压力，例如气动压力，从而使试剂、样品等在泡之间移动。因此，在采用气动压力的实施例中，例如，容器材料是足够柔性的，以容许气动压力具有所需的效果。术语″柔性″这里用于描述材料的物理特征，在本文中被限定为可易于通过该处使用的气动压力水平而产生变形，而不会破裂、破坏、裂开等。举例说来，薄的塑料片，例如Saran^TM包装和包，以及薄的金属箔，都是柔性的。然而，即使在采用气动压力的实施例中，只是泡和通道的某些区域需要是柔性的。此外，泡和通道只有一个侧部需要是柔性的，只要泡和通道可易于变形即可。试剂盒510的其它区域可由刚性材料制成，或者可用刚性材料加强。

例如，塑料膜用于试剂盒510。金属片，例如铝，或其它合适的材料可被铣削或切割以产生具有凸出表面图案的模具。当配合到气压机(例如威斯康星州的米尔顿的JanesvilleTool公司的A-5302-PDS)中时，例如，在195℃的操作温度下进行调整时，气压机类似印刷机一样工作，仅在模具接触膜的地方熔化塑料膜的密封表面。在形成试剂盒510时，可将各种成分，例如PCR引物(例如点样到膜上并进行干燥)、结合抗原的衬底、磁珠和瓷珠等密封在各泡的内部。在密封之前，可将用于样本处理的试剂共同地或单独地点样到膜上。在一个实施例中，核苷酸三磷酸盐(NTP)与聚合酶和引物分开来点样到膜上，基本上消除聚合酶的活性，直到反应被含水样本水化。如果含水样本在水合之前已经被加热，那么这创造用于真正热起动PCR的条件，并减少或消除对于昂贵的化学热起动成分的需求。

例如，储存器区590包括储存器515a至515l。例如，试剂可在储存器区590中冷冻干燥并在使用前再水化。泡522、544、546、548、564和566可包括瓷珠、二氧化硅磁珠和第一阶段多重PCR引物中的一种或多种。例如，瓷珠位于泡522中。例如，二氧化硅磁珠是冻干颗粒形式的，位于泡546中。例如，第一阶段多重PCR引物是冻干颗粒形式的，位于泡564中。

如图所示，用于第二阶段PCR的高密度阵列581可包括102个第二阶段孔582。第二阶段PCR阵列可由0.5毫米厚的黑色聚碳酸酯塑料制造。1μL容量的102个孔都位于阵列内部(图1B的l和图3)。层压膜热封到每个孔的背部，96孔阵列被放置在压电微阵列仪(Nano-Plotter NP2.1e，GeSiM，Groβerkmannsdorf，德国)的床上的托板上。使用标准GeSiM Nano-Tip将第二阶段PCR引物组分配到该阵列的各孔中。用于检测不同微生物的第二阶段PCR引物可分别点样到不同的所述孔中。点样后，用含有匹配阵列各孔的开口的层压膜的第二层将阵列密封(图2)，然后使用压敏粘合剂膜附着到试剂盒的外表面的片层(图1中l)。然而，应理解的是该实施方案仅为说明性的。

参照图4，将水注入储存器区590中临近储存器515l的第二个注射口(未示出)，经由储存器区590中提供的通道(未示出)分布，从而使各试剂吸水，其中每种试剂预先以干燥形式在储存器515b至515l处提供。这些试剂说明性地可包括冷冻干燥的PCR试剂、DNA提取试剂、洗涤溶液、免疫测定试剂或其它化学实体。例如，试剂用于核酸提取、第一阶段多重PCR、多重反应的稀释和第二阶段PCR试剂的制备，以及对照反应。类似地，将包含待检验样品(100y1)和裂解缓冲液(200y1)的300y1混合物注入储存器区590中储存器515a附近的注射口(未示出)，样品混合物被吸入储存器515a中。在图4所示的实施方案中，所有需要被注入的为一个注射口的样品溶液和另一个注射口的水。注入后，可将两个注射口密封，使得试剂盒在加入样品后处于密封状态。

本发明试剂盒的储存器还可包括冻干的酿酒酵母作为阳性对照。例如，阳性对照可包括在储存器515a或储存器515b中，从而与样品一同经历核酸提取等步骤，用于指示本发明的试剂盒是否正常工作。

注入后，样品从储存器515a经由通道514移动至泡522。泡522中具有瓷珠，并且可配置为使用FilmArray仪器内提供的回转叶片或桨通过撞击来涡旋。一旦细胞被充分裂解，样品通过通道538、泡544和通道543移动至泡546，样品在该处与核酸结合性磁珠混合。让混合物孵育适当长的时间，例如约10秒至10分钟。位于FilmArray仪器内临近泡546的可缩回磁体从溶液中捕获磁珠，在泡546内部表面形成沉淀。然后将液体移出泡546，通过泡544回到泡522，泡522现在用作废物容器。储存器515c-515e中的一种或多种洗涤缓冲液经由泡544和通道543移动至泡546。任选地，缩回磁体，通过从泡544和546经由通道543来回移动来洗涤磁珠。磁珠一经洗涤后，通过激活磁体将其重新捕获入泡546，然后将洗涤溶液移至泡522。该过程可按需要重复，以从核酸结合性磁珠上洗涤除去裂解缓冲液和样品碎片。

洗涤后，将存储在储存器515f的洗脱缓冲液移至泡548，并缩回磁体。使该溶液经由通道552在泡546和548之间循环，打碎泡546内的磁珠沉淀，使捕获的核酸从小珠解离并进入溶液中。再次激活磁体，捕获泡546中的磁珠，洗脱的核酸溶液移至泡548中。

来自储存器515g的第一阶段PCR主混合物在泡548中与核酸样品混合。任选地，通过在548和564之间经由通道553驱动混合物将其混合。若干个混合循环后，将溶液装在泡564中，并进行第一阶段多重PCR。泡564中提供了第一阶段PCR引物，每种靶生物至少一组引物。若存在RNA靶标，可在第一阶段多重PCR之前或与其同时进行逆转录步骤，用于逆转录步骤的混合物也可在泡564中提供。FilmArray仪器中第一阶段多重PCR的温度循环可例如进行15-20个循环，然而其它水平的扩增可能为合乎需要的，取决于具体应用的需求。

第一阶段PCR进行所需数目的循环后，可驱动大部分样品回到泡548，仅剩余小量留在泡564中，并从储存器515i加入第二阶段PCR预混合物进行稀释。或者，可将稀释缓冲液从515i移至泡566，然后通过使液体在泡564和566之间来回移动与泡564中的扩增样品混合。若需要，可使用储存器515j和515k的稀释缓冲液重复稀释若干次，然后将第二阶段PCR预混合物从储存器515h加入一些或所有稀释的扩增样品中。应理解的是，可通过改变稀释步骤数目或通过改变与稀释缓冲液或第二阶段PCR预混合物混合前丢弃的样品百分比调整稀释水平。第二阶段PCR预混合物包含用于扩增的组分，例如聚合酶、dNTP和合适的缓冲液，然而其它组分也可以是合适的，特别是对于非PCR扩增方法。若需要，可将样品与第二阶段PCR预混合物的混合物在泡564中预热，然后移至第二阶段孔582进行第二阶段扩增。该预热可避免第二阶段PCR混合物中对热启动组分(抗体、化学品或其它)的需要。

例如，第二阶段PCR预混合物可不包括引物对，而102个第二阶段孔582的每个中均预先载有特异性PCR引物对。若需要，第二阶段PCR预混合物可缺少其它反应组分，这些组分也可预装在第二阶段孔582中。每个引物对可与第一阶段PCR引物对相似或相同，或可嵌套在第一阶段引物对中。样品从泡564移至第二阶段孔582使PCR反应混合物完整。一旦孔阵列581被装满，各个第二阶段反应可通过本领域已知的任何手段被密封于其各自的第二阶段的孔中。说明性的填充和密封高密度孔阵列581而无交叉污染的方式在美国专利申请号2010-0056383中讨论。例如，高密度孔阵列581的孔582中的各个反应可用一个或多个Peltier装置同时进行热循环，然而本领域也已知其它用于热循环的手段。

在本发明的一个实施方案中，第二阶段多重PCR引物例如用于检测选自以下的一种或多种微生物：大肠杆菌K1、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、巨细胞病毒、肠病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人疱疹病毒6、人副肠孤病毒、水痘带状疱疹病毒、新型隐球菌/格特隐球菌。这些PCR引物各自具有多个重复，每个重复位于不相邻的582孔中。优选地，相邻的孔中检测的微生物具有不同的解链曲线。

第二阶段PCR预混合物可包含具有下式的dsDNA结合染料

以产生指示扩增的信号。然而，应理解的是该染料仅为说明性的，并且可使用其它信号，包括本领域已知的其它dsDNA结合染料和荧光、放射性、化学发光法、酶等标记的探针。

FilmArray仪器程序可设计为基于PCR后的解链曲线进行每个第二阶段反应的阳性或阴性判定。对于阳性判定，解链曲线必须在预定义的温度范围内产生解链峰(一阶导数极大值或负一阶导数极大值)。应理解的是该判定每个第二阶段反应的方法仅为说明性的，也可使用实时扩增数据或通过本领域已知的其它方法进行判定。

以下通过示例性实施例来说明本发明。

实施例1.

收集前瞻性残留脑脊液样本

满足如下合格标准的残留预期脑脊液样本可收集用于研究：

-受试者之前未入组过该研究

-样本是根据医生安排进行ME细菌培养，从标准护理检测遗留下来的残余CSF

-样本经LP采集

-样本少于或等于7天(FilmArray ME Panel检测或≤-70℃下存档，必须在7天内完成采集)

-样本量至少为0.5mL

-样本未经过离心分离

对于利用剩余CSF样本，在每个研究中心从机构审查委员会(IRB)获得放弃知情同意要求。研究中每个收集的残留样本都被分配一个研究编号(SCN)。使用SCN，将用于FilmArray检测和参比PCR检测的样本等份去识别化并向申办者提供精选的临床数据。SCN都被记录在一个钥匙中，此钥匙把每一SCN关联到病人标识信息以允许收集受试者的人口统计信息、住院治疗状态和其他的医学信息(见如下)，临床医生检测要求和结果以及临床医生指令下的最终脑脊液培养结果。特定中心的人员限制获得此钥匙，他们无法鉴别研究样本，而且没有FilmArray结果的知识。

此外，该受试者的免疫状态，在早于样本收集的24小时内实施的抗微生物疗法和最终的临床诊断都被记录用于满足如下标准：

-样本在革兰染色的ME病原体、培养、PCR参比、临床医生指令的病原体检测或FilmArray中为阳性

-脑脊液葡萄糖、蛋白质和白细胞计数显示细菌感染(即：葡萄糖≤45mg/dL，蛋白质≥100mg/dL，WBC≥5个细胞/μL)

免疫状态根据《2013年美国感染疾病协会指南》作如下确定和分类。

1.联合原发性免疫缺陷疾病(例如：重度联合免疫缺陷疾病)

2.接受癌症化疗

3.实体器官移植或因排斥反应接受增强免疫抑制后2个月内

4.人免疫缺陷病毒(HIV)感染，且成人和青少年CD4 T淋巴细胞计数＜200个细胞/mm3，婴幼儿＜15％

5.接受每日皮质类固醇治疗，泼尼松剂量≥20mm(或体重小于＜10的患者＞2mg/kg/天)或等同持续≥14天

6.接受某些生物免疫调节剂，即，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体阻滞剂或利妥昔单抗

7.校正胎龄不足40周的早产儿

8.不足30日龄的足月儿

9.其他(包含描述)

样本等分

制备脑脊液样本的等分，用于去识别化后的检测。由于研究入组的样本量非常低，只可能准备1等份的量用于FilmArray ME Panel检测(250μL，够一次检测使用)，2等份用于许多样本的参比检测(每等份125μL，每份够用于一次提纯)。若有额外的量，可再准备3等份用于参比检测(总共5等份)。用于FilmArray检测的等份或者新鲜状态进行检测(I类)，或者在提供样本的实验室于≤-70℃存档(II类)用于日后检测。FilmArray ME Panel的最终供研究用(IUO)版本可用之前，在入组的最初阶段(2月至7月)采集II类样本；详见10.2章节。所有FilmArray检测在研究中心进行。用于参比PCR检测的等份立刻冷冻且每周运送至BioFire。任何自脑脊液培养回收的分离株在甘油中冷冻并且每周向BioFire运送一次。

参比方法检测

参比检测包括细菌分析物的脑脊液培养(由提供样本的实验室操作)和PCR检测后进行双向测序(由BioFire操作)，如表5所示。

表5.用于评估FilmArray ME Panel性能的参考/参比方法

ME疾病的细菌原因在临床实验室通过使用脑脊液培养进行常规鉴别。为了护理标准，由医生安排在源实验室对所有样本进行现场细菌分析物的脑脊液培养。任何分离的微生物都要被储存以备差异性分析或需要额外的物种(例如，16S测序)。

冷冻的脑脊液等份(每等份至少2试管125μL的量)每周一次运送至BioFire用于参比PCR检测。PCR检测由BioFire的员工以设盲方式操作，样本只标有受试者的SCN，员工无法访问FilmArray的结果。检测靶标总结在下表2中提供。

检测由两项每种分析物经过充分确认的PCR试验组成，紧接着是双向测序(旨在给出至少200bp的序列信息)。只要有可能，针对不同的基因(或同一基因的不同区域)进行参比PCR试验后对其进行FilmArray ME Panel试验。

对于EV、HPeV和一个VZV试验，使用一个交替的目标是不可能的，原因是适合PCR检测的保守的病毒基因组区域有限。在这些病例中，用于参比分析的引物序列区与用于FilmArray ME Panel试验的引物序列不同。

用于该项研究的所有试验由BioFire设计，因为提供用于测序的合适扩增子长度或质量的公开试验资料无法找到。此外，所有的试验都是巢式，以匹配FilmArray检测的灵敏度。巢式也促进了试验的多重性，这种手段是非常必要的，因为要检测所有的分析物，而用于检测的样本量非常有限：提纯100μL的脑脊液标本会得到100μL的核酸，其中15μL用于4个多重的PCR1反应的其中一个，从而覆盖所有的分析物(表1)。设计多重试验，在不同的PCR1反应中进行复制试验，从而可以通过错配试验检测出和解决任何交叉感染事件。各PCR1反应后的混合物用作模板，以使用合适的PCR2试验进行检测。

表1.参比多重PCR1

确认试验证明几乎所有检测的检测限(LoD)均在FilmArray检测的10倍范围内，这被认为是“灵敏度等值”(见表2的总结)。对于HPeV病毒，两个参比检测都比FilmArray检测灵敏。

带有潜在阳性扩增产物的PCR平板直接运送至Macrogen(www.macrogen.com；Rockville，MD)进行ExoSAP清理和测序。每个检测的阳性结果被认为对于特定分析物是阳性的。

表2.FilmArray检测和参比PCR检测

实施例2

此外，还在验证期间进行测试与已公布检测的等效性。这项测试包括制备微生物的连续稀释液，加入到3种不同的阴性CSF背景，因而该CSF的背景在微生物的滴度稀释时保持不变。然后，分装每份样本，并且使用已发表的检测法和与同一核酸提取液平行的参比检测法进行检测。已发表的检测引物、探针(如适用)和反应条件在与BioFire检测法相同的热循环仪上使用。在大部分情况下，已发表检测法的灵敏度是等同于或低于BioFire确认检测法，证明BioFire设计的参比检测法具有高度灵敏度。

表3.参比检测与已公布检测法间等效性测试总结

尽管本发明已经参考优选的实施方案进行了详细描述，但存在如所附权利要求书中描述和定义的本发明范围和精神内的变更和修饰。

Claims

1.一种用于检测脑膜炎和/或脑炎的试剂盒，所述试剂盒包括：

外表面的第一片层和第二片层；

一个或多个泡，其位于第一片层和第二片层之间；

一个或多个储存器，其顶表面连接至所述片层；

一个或多个孔，其位于第一片层和第二片层之间并与所述泡和/或储存器流体连通；

用于检测一种或多种膜炎和/或脑炎微生物的第二阶段多重PCR引物；

其中所述试剂盒在加入样品后处于密封状态。

2.权利要求1的试剂盒，其中所述泡之一中包括选自以下的一种或多种：瓷珠、二氧化硅磁珠和第一阶段多重PCR引物。

3.权利要求2的试剂盒，其中所述瓷珠位于泡522中，和/或冻干颗粒形式的所述二氧化硅磁珠位于泡546中，和/或冻干颗粒形式的所述第一阶段多重PCR引物位于泡564中。

4.权利要求1的试剂盒，其中用于检测不同微生物的所述第二阶段PCR引物分别位于不同的所述孔中。

5.权利要求1的试剂盒，其中所述第二阶段多重PCR引物是用于检测选自以下的一种或多种微生物：大肠杆菌K1、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、巨细胞病毒、肠病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人疱疹病毒6、人副肠孤病毒、水痘带状疱疹病毒、新型隐球菌/格特隐球菌。

6.权利要求1的试剂盒，其中所述第二阶段多重PCR引物各自具有多个重复，每个重复位于不相邻的孔中；并且相邻的孔中检测的微生物具有不同的解链曲线。

7.权利要求1的试剂盒，其中所述储存器中分别包括选自以下的一种或多种：对照、洗涤缓冲液、核酸洗脱缓冲液、逆转录/第一阶段PCR主混合物、稀释缓冲液、第二阶段PCR预混合物。