CN103667533A - 一种人呼吸道博卡病毒半巢式pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法 - Google Patents

一种人呼吸道博卡病毒半巢式pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人呼吸道博卡病毒半巢式PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。该试剂盒包括：1)病毒保护液，其成份为青霉素200U/ml、链霉素200U/ml、两性霉素B200U/ml和BSA0.125％；2)病毒裂解液，其成份为10mmol Tris-HCl、1mmol EDTA、15mmol NaCl和0.5％SDS，pH为8.0，溶剂为水；3)扩增引物，扩增引物为NS1545F、NS1962R和NS1835R。本发明对人呼吸道博卡病毒不仅检出率高，而且不用提取病毒基因组DNA，同时也不需应用荧光定量PCR技术进行检测，降低了临床患者博卡病毒的检测成本，提高了检测效率。

Description

一种人呼吸道博卡病毒半巢式PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种人呼吸道博卡病毒半巢式PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
背景技术
博卡病毒(Bocavirus)，是细小病毒科细小病毒亚科的一个属，博卡病毒于20世纪60年代初首次在动物上发现，2005年8月，瑞典科学家运用分子病毒筛查方法，首次在儿童呼吸道分泌物中发现了一种新型的人类细小病毒，他们将这种病毒命名为人类博卡病毒。博卡病毒通过空气传播容易使婴幼儿罹患肺炎、支气管炎和支气管肺炎等疾病。
早期对博卡病毒的检测采用大规模分子病毒筛查的方法，这种方法是基于宿主DNA的提取、随机PCR扩增、大规模测序及生物信息学等技术，对下呼吸道感染患者鼻咽分泌物进行检测，其阳性检出率为3.1％。随着PCR及荧光定量PCR技术的发展，临床呼吸系统疾病患者鼻咽分泌物样本博卡病毒的检出率也从1.5上升到21.3％。但是，由于患者检测样本中博卡病毒的数量较低，应用传统PCR技术进行检测势必会导致假阴性的出现，从而导致低检出率。与传统的PCR相比，荧光定量PCR具有高检测率及高敏感性，但是需要相关的设备和制备特殊的探针，其高昂的价格限制了其在临床上的广泛应用。另外，普通PCR及荧光定量PCR均需要在检测之前进行病毒基因组的提取等繁琐的准备工作，这些都给患者样本博卡病毒的检测造成困难和错误判断，有关博卡病毒的检测目前没有统一鉴定的试剂盒，同时尚未有相关的研究报道。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测人呼吸道博卡病毒中存在的不足，提供了一种人呼吸道博卡病毒半巢式PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种人呼吸道博卡病毒半巢式PCR检测试剂盒，包括：1)病毒保护液，其成份为青霉素200U／ml、链霉素200U／ml、两性霉素B200U／ml和BSA0.125％；2)病毒裂解液，其成份为10mmol Tris-HCl、1mmol EDTA、15mmol NaCl和0.5％SDS，pH为8.0，溶剂为水；3)扩增引物，扩增引物为NS1545F：5-TATGGCCAAGGCAATCGTCCAAG-3、NS1962R：5-CAGAGTACAGTCGTACTCATTC-3和NS1835R：5-GCCGCGTGAACATGAGAAACAGA-3。
所述的人呼吸道博卡病毒半巢式PCR检测试剂盒的非诊断性检测方法，是提取患者的呼吸道分泌物，然后加入等体积的病毒保护液，混匀；取80μl病毒保护液稀释的样本加入20μl病毒裂解液，吹打混匀；100℃水浴5分钟，10000rcf离心5分钟，收集上清液，进行半巢式PCR扩增，扩增结束，将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束，在凝胶成像系统观察扩增产物。
所述的半巢式PCR扩增步骤为：1)第一轮扩增，取3μl病毒裂解上清液作为扩增模板，扩增引物为NS1545F和NS1962R；引物的最终浓度为400nM，dNTPs0.2mM，5U DNA聚合酶；扩增条件为95℃5分钟后，95℃30秒，56℃35秒，72℃40秒，共35循环，最后72℃延伸10分钟；2)第二轮扩增，取第一轮扩增产物2μl作为扩增模板；扩增引物为NS1545F和NS1835R；引物的最终浓度为400nM，dNTPs0.2mM，5U DNA聚合酶；扩增条件为：扩增条件为：95℃，5分钟后，依次95℃30秒，58℃35秒，72℃40秒，共35循环，最后72℃延伸10分钟。
本发明对人呼吸道博卡病毒不仅检出率高，而且不用提取病毒基因组DNA，同时也不需应用荧光定量PCR技术进行检测，降低了临床患者博卡病毒的检测成本，提高了检测效率。
附图说明
图1为普通PCR敏感性和特异性分析。
图2为半巢式PCR敏感性和特异性分析。
图3为临床样本的普通PCR及半巢式PCR检测分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例
以宁夏医科大学总医院儿科和儿科重症室(Pediatric Intensive Care Unit，PICU)病房在2011年11月-2013年5月因急性呼吸道感染住院的202例患儿为对象。收集患儿在入院24小时内留取的下呼吸道分泌物。方法：采用一次性无菌吸痰管，经鼻腔或口腔插入7～8cm至咽部以下，负压吸取深部1～2ml下呼吸道分泌物。加入等量的病毒保护液(青霉素200U／ml、链霉素200U／ml、两性霉素B200U／ml和BSA0.125％)1-2ml，混匀，部分保存于-80℃低温冰箱储备，部分直接加入裂解液进行处理。
取80μl经病毒保护液处理的样本，加入20μl病毒裂解液(10mmol Tris-HCl、1mmolEDTA、15mmol NaCl和0.5％SDS，pH为8.0，溶剂为水)，吹打混匀；100℃水浴5分钟，10000rcf离心5分钟，收集上清液，作为普通PCR扩增模板和半巢式PCR第一阶段扩增的模板。
第一步，普通PCR扩增：取3μl病毒裂解上清液作为PCR扩增模板，总反应体系为25μl。采用NS1545F和NS1835R作为扩增引物，引物的最终浓度为400nM，dNTPs0.2mM，5U DNA聚合酶。扩增条件为：95℃，5分钟后，依次95℃30秒，8℃35秒，72℃40秒，共30循环，最后72℃延伸10分钟。
配制1.5％的琼脂糖凝胶(内含EB染液)，120V电压电泳1小时左右，在凝胶成像系统观察扩增片段大小，目的片段为290bp。
第二步，半巢式PCR扩增：取3μl病毒裂解上清液作为扩增模板，以NS1545F和NS1962R引物作为半巢式PCR第一轮的扩增引物。扩增条件为：95℃，5分钟后，依次95℃30秒，56℃35秒，72℃40秒，共35循环，最后72℃延伸10分钟。取第一轮PCR的扩增产物2μl进行第二次扩增，扩增引物采用NS1545F和NS1835R。扩增的引物浓度、其他成分的浓度，扩增的循环参数等各方面同普通PCR。电泳凝胶图见图3，(A)202例下呼吸道分泌物首先进行普通PCR扩增，扩增引物为NS1545F和NS1835R。P1-P7代表扩增得到的7份阳性样本；N1，N2，N3分别代表3个不同的阴性样本；(-)，阴性对照。(B)剩余195例样本进行半巢式PCR扩增。P1-P10代表再次获得的不同阳性样本代表；N1-N4代表不同的阴性样本代表；M，DNA Marker；C，阳性质粒对照；(-)，阴性对照。
202例临床样本首先通过普通PCR检测方法，经凝胶电泳发现有7例样本在预期位置(290bp)出现明显的单一扩增条带，阳性样本的检测率为3.4％。随后对剩余样本再次采用半巢式PCR方法进行检测，同样在相应的预期位置，又得到41例阳性扩增条带，加之第一轮的7例阳性，总共HBoV阳性样本的检测率达到23.76％。结果分析表明：半巢式PCR明显增加了阳性检测效率，从3.4％提高到23.76％。(见表1)
表1采用传统PCR和半巢式PCR对HBoV的检测效率对比
PCR类型 样本总数 阳性样本 阴性样本 效率(％)
普通PCR 202 7 195 3.4
半巢式PCR 202 41 161 20.3
几乎近基因组全长的HBoV质粒pBB-HBoV用于灵敏性与特异性分析。原始储备质粒的拷贝数为6×1013拷贝／毫升。按10倍进行稀释进行，从6×1013到6×102拷贝／毫升。取2μl质粒稀释液作为PCR扩增模板，PCR产物大小为290bp，进行凝胶电泳观察。如图1所示，A1-A11分别代表不同的稀释浓度，从6×1013到6×102拷贝／毫升。M，DNA Marker；N，阴性对照。
HBoV质粒稀释度从6×104到6×100拷贝／毫升。首先2μl稀释质粒作为模板，进行第一轮PCR扩增。随后取第一轮PCR产物2μl作为模板，进行第二轮的PCR扩增，扩增引物、条件及其它影响因素同普通PCR条件。结果如图2所示，B1-B5代表不同质粒稀释度，从6×104到6×100拷贝数／毫升。M，DNA Marker；N，阴性对照。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种人呼吸道博卡病毒半巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1)病毒保护液，其成份为青霉素200U／ml、链霉素200U／ml、两性霉素B200U／ml和BSA0.125％；2)病毒裂解液，其成份为10mmol Tris-HCl、1mmol EDTA、15mmolNaCl和0.5％SDS，pH为8.0，溶剂为水；3)扩增引物，扩增引物为NS1545F：5-TATGGCCAAGGCAATCGTCCAAG-3、NS1962R：5-CAGAGTACAGTCGTACTCATTC-3和NS1835R：5-GCCGCGTGAACATGAGAAACAGA-3。
2.根据权利要求1所述的人呼吸道博卡病毒半巢式PCR检测试剂盒的非诊断性检测方法，其特征是，提取患者的呼吸道分泌物，然后加入等体积的病毒保护液，混匀；取80μl病毒保护液稀释的样本加入20μl病毒裂解液，吹打混匀；100℃水浴5分钟，10000rcf离心5分钟，收集上清液，进行半巢式PCR扩增，扩增结束，将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束，在凝胶成像系统观察扩增产物。
3.根据权利要求2所述的非诊断性检测方法，其特征是，半巢式PCR扩增步骤为：1)第一轮扩增，取3μl病毒裂解上清液作为扩增模板，扩增引物为NS1545F和NS1962R；引物的最终浓度为400nM，dNTPs0.2mM，5U DNA聚合酶；扩增条件为95℃5分钟后，95℃30秒，56℃35秒，72℃40秒，共35循环，最后72℃延伸10分钟；2)第二轮扩增，取第一轮扩增产物2μl作为扩增模板；扩增引物为NS1545F和NS1835R；引物的最终浓度为400nM，dNTPs0.2mM，5U DNA聚合酶；扩增条件为：扩增条件为：95℃，5分钟后，依次95℃30秒，58℃35秒，72℃40秒，共35循环，最后72℃延伸10分钟。
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