CN104372111A - FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法 - Google Patents

FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104372111A
CN104372111A CN201410755445.0A CN201410755445A CN104372111A CN 104372111 A CN104372111 A CN 104372111A CN 201410755445 A CN201410755445 A CN 201410755445A CN 104372111 A CN104372111 A CN 104372111A
Authority
CN
China
Prior art keywords
asia
type
universal
foot
mouth disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410755445.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104372111B (zh
Inventor
闫若潜
吴志明
安春霞
张健
崔沛
谢彩华
王淑娟
王东方
陈涛
马震原
刘琨
刘先敏
李茂龙
韩庆斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Original Assignee
HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION filed Critical HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority to CN201410755445.0A priority Critical patent/CN104372111B/zh
Publication of CN104372111A publication Critical patent/CN104372111A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104372111B publication Critical patent/CN104372111B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒（FMDV）通用型和Asia 1型二重TaqManMGB荧光定量RT-PCR检测方法。该方法包括引物设计、总RNA制备、反转录、通用型和Asia 1型标准品的制备、二重FQ-PCR反应、结果判定等步骤。本发明所提供的检测方法可实现一个反应同时对两种病毒进行快速鉴别检测，可在1h～2h内完成，具有时间短、反应迅速、特异性强、敏感度高、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别分型检测口蹄疫病毒的要求，因而在口蹄疫病毒检测鉴别技术领域具有较好的应用价值。

Description

FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法
技术领域
本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒（FMDV）通用型和Asia 1型二重TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法。 
背景技术
口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD) 是由口蹄疫病毒( Foot and Mouth Disease Virus， FMDV)引起的以偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病，我国规定为一类动物疫病。
口蹄疫病毒能使多种动物患病，主要侵害偶蹄兽，以牛最易感，其次是猪，再次为绵羊、山羊和骆驼等动物。口蹄疫传播速度快，范围广，呈蔓延式、跳跃式发展，一般呈地方流行性，也可形成周期性大流行。自然状态下，数个感染性病毒颗粒即可引起牲畜发病，疫区发病率可达50～100％，幼畜死亡率较高，其他成年动物则较低。牲畜感染口蹄疫后，会造成牲畜休食量下降，机体抵抗力和免疫力降低，容易继发其他病毒性疾病和细菌性疾病，从而造成感染动物的生产性能严重下降。随着我国规模养殖业的不断发展，口蹄疫传播速度越来越快，范围也在不断扩大，加之流行毒株血清型的不断改变，使得口蹄疫控制难度不断加大。目前，我国每年均花费大量人力、物力和财力进行防控，但该病每年仍然时有发生。
口蹄疫病毒有7个血清型， O型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3 型、Asia 1型(亚洲Ⅰ型)，从口蹄疫参考实验室对疫情通报统计，O 型的流行最为广泛（世界范围内），其次为AsiaⅠ和A 型，C 型和南非3型非常罕见，通常只在特定区域流行。目前我国已有猪、牛感染O 型和Asia 1型口蹄疫的病例，且 AsiaⅠ型口蹄疫流行呈上升趋势，给我国养殖业带来巨大危害。
快速、准确的诊断是控制口蹄疫疫情蔓延和追踪疫源的重要环节。它可使一线防疫人员在疫情暴发时对现场做出正确的诊断，及时确定病原、切断传播途径、采取有效的防范措施。目前已有的Asia 1型口蹄疫用液相阻断ELISA方法只能评价该血清型抗体水平。RT-PCR诊断方法具有快速、特异、敏感等优点已在疫病病原学诊断中得到广泛应用，成为动物疫病病原学快速诊断方法之一。尽管国内已有研究者建立了针对O型、A型与Asia 1型的单一血清型口蹄疫RT-PCR诊断方法，但不能同时对口蹄疫检测和分型，因而存在继续改进的空间。 
发明内容
本发明目的在于提供一种口蹄疫病毒通用型和Asia 1型二重TaqMan MGB 荧光定量RT-PCR检检测方法，该方法在对口蹄疫病原进行快速检测同时，可以同时进行分型诊断，便于有针对性的采取防控措施。
本发明针对口蹄疫病毒通用型和Asia 1型，设计了共同的反转录引物，同时设计了两对特异性的PCR引物和两条特异性的TaqMan MGB探针，建立了一种口蹄疫病毒通用型和Asia 1型二重TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法，同时优化了反应体系组分、反应条件。采用本发明，经过一个PCR反应能即可同时对口蹄疫病原进行检测及Asia 1型分型鉴定，具有较好的便捷性特点，对于临床上口蹄疫病毒通用型及Asia 1型快速鉴别诊断具有较好的实用价值。下面对本发明的技术方案进行详细说明。
一种口蹄疫病毒（FMDV）通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法，包括以下步骤：
（1）引物设计
经大量比对GenBank中口蹄疫病毒通用型和Asia 1型全基因序列，选择口蹄疫病毒通用型和Asia 1型高度保守的2B基因为模板，设计了共用的反转录引物P0，根据FMDV VP1保守基因序列设计通用的特异性引物对（P1/P2）及荧光探针Probe-P5，根据Asia 1型特异性VP1基因序列设计特异性引物对（P3/P4）及荧光探针Probe-P6，引物序列如下所示：
引物P0：5'-cgggaaacgcatgagcagta-3'，
引物P1：5'-cggcctctcatccaacaga -3'，
引物P2：5'-attttccttcaggcgcttga -3'，
引物P3：5'-aagagcacccaaacccttga-3'，
引物P4：5'-gccccgaccagtgtgtgt-3'，
探针Probe-P5：5'-FAM-tcatttgtgaaacgcg -MGB-3' ，
探针Probe- P6：5'-NED- ctcatgcagatcccct -MGB -3'；
（2）总RNA制备
以口蹄疫Asia 1型灭活疫苗为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，与含有口蹄疫病毒的待检样品同时采用Trizol法提取总RNA，具体操作如下：
分别取阳性对照、阴性对照及待检样品各200 μL 于1.5 ml离心管中，再加入600 μL的Trizol于涡旋器震荡2～3 min，加入200 μL氯仿，4℃，12000 rpm离心10 min后，取上清转入另1.5 mL离心管中，加等量异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μL DEPC水溶解沉淀，取10 μL用于反转录，其余－20℃保存；
（3）反转录
对步骤（2）中提取的总RNA进行反转录，反转录反应体系如下：
5×M-MLV缓冲液，4 μL；
dNTPs，2.5 mmol/L、4 μL；
M-MLV反转录酶，0.5 μL； 
RNA酶抑制剂，0.5 μL；
P0引物，20μmol/L、1 μL； 
总体积10 μL；
步骤（2）中的制备的口蹄疫病毒RNA，10 μL； 
37℃水浴1 h或置于PCR仪中37℃反应1 h，反应结束后，70℃，15 min 灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或－20℃冻存备用；
（4）通用型和Asia 1型标准品的制备
将口蹄疫Asia 1型灭活疫苗用常规RT-PCR方法分别扩增通用型和Asia 1型，并将阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，构建pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型重组质粒；
将筛选的阳性重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司采用T7和SP6引物进行测序；
将测序正确的通用型和Asia 1型重组阳性质粒应用分光光度计测定并计算其OD260和OD280值及OD260 /OD280值，重复数次（一般为5次），确定质粒DNA的浓度和纯度，－20℃保存备用； 
（5）通用型和Asia 1型二重FQ-PCR反应
以步骤（4）所得pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型重组质粒分别稀释至终浓度1.0×105拷贝/μL作为检测模板，进行二重FQ-PCR，其中口蹄疫病毒通用型和Asia 1型上、下游引物P1/P2、P3/P4的浓度均为20μmol/L，Probe-P5 和Probe-P6的浓度均为10μmol/L，反应体系中各成分及体积如下：
P1/P2、P3/P4，各0.5 μL； 
Probe-P5，1 μL；
Probe-P6，1.2 μL；
dNTPs，2.5 mmol/L、2 μL，
10×Ex Taq 缓冲液，2.5 μL，
Ex Taq酶，5U/μL ，0.25 μL，
步骤（3）中反转录产物，4 μL； 
去离子水补至 25 μL；
反应条件为：94℃ 5 min后，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环；
（6）结果判定
阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整；
在“FAM/NONE”和“NED/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无，阳性对照的Ct值应≤32.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；
在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤32.0，而且出现两条特定的扩增曲线，判定为阳性，表明样品中存在口蹄疫Asia 1型病毒；Ct值＞35.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性，表明样品中无口蹄疫病毒；35.0≥Ct值＞32.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，结果为阴性者判定为阴性；对可疑样品重新试验，结果再为可疑者应重新采集该动物样品重新试验；
在检测结果成立的前提下，若在“FAM/NONE” 标记模式下样品Ct值≤32.0，而且出现特定的扩增曲线，在“NED/NONE”标记模式下样品Ct值＞35.0或无，且无特定的扩增曲线，判定为通用阳性，表明样品中存在口蹄疫病毒，但非Asia 1型病毒。
本发明所述的通用型/Asia 1型二重TaqMan MGB FQ-PCR检测方法可实现一个反应同时对两种病毒进行快速鉴别检测，可在1 h～2 h内完成，具有时间短、反应迅速、特异性强、敏感度高、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别分型检测口蹄疫病毒的要求，因而在口蹄疫病毒检测鉴别技术领域具有较好的应用价值。
附图说明
图1：通用型/Asia 1型二重FQ-PCR扩增曲线；图注说明：1为FAM探针通用型扩增曲线， 2为NED探针Asia 1型扩增曲线，3，4为阴性对照；
图2：通用型/Asia 1型二重FQ-PCR检测通用型敏感性扩增曲线；图注说明：自左到右1～8为分别对应的质粒浓度1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100 拷贝/μL；9为阴性对照；
图3：通用型/Asia 1型二重FQ-PCR检测通用型标准曲线；
图4：通用型/Asia 1型二重FQ-PCR检测Asia 1型敏感性扩增曲线：图注说明：自左到右1～8为分别对应的质粒浓度1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝/μL；9为阴性对照；
图5：通用型/Asia 1型二重FQ-PCR检测Asia 1型标准曲线；
图6：通用型/Asia 1型二重FQ-PCR检测其他病毒特异性扩增曲线；图注说明：1：FMDV通用型扩增曲线；2：FMDV Asia 1型扩增曲线；3-14：SVDV、BVDV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV2；15、16：阴性对照；
图7：通用型/Asia 1型二重FQ-PCR方法重复性和稳定性试验结果图；图注说明：A1-A3、A4-A6、A7-A9分别对应的质粒浓度为1.0×105、1.0×104、1.0×103拷贝/μL的通用型扩增曲线，B1-B3、B4-B6、B7-B9分别对应的质粒浓度为1.0×105、1.0×104、1.0×103拷贝/μL的Asia 1型扩增曲线。10、11：阴性对照；
图8：通用型/Asia 1型二重FQ-PCR方法对10份疑似样品检测结果图；图注说明：1和2为阳性对照扩增曲线，3-9为通用型检测阳性，10-13为Asia 1型检测阳性，其余为阴性对照及阴性样品。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
介绍具体实施例前，对本发明所用到的主要仪器设备、试剂产品介绍如下。
毒株
口蹄疫Asia 1型灭活疫苗购自中农威特生物科技股份有限公司；其他对照病毒由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存，需要说明的是，这些对照病毒可从公开渠道从其他途径或者本单位获得。
仪器和试剂
荧光PCR仪，美国ABI公司产品，型号ABI7000；
PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；
凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司产品；
恒温水浴震荡器(HZQ-Q)，哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；
台式高速冷冻离心机，美国Heraeus公司产品；
Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收试剂盒等均购自宝生物工程（大连）有限公司，pGEM-T Easy载体、JM109感受态细胞购自Promega公司。
实施例
本发明所提供的口蹄疫病毒（FMDV）通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法，包括以下步骤：
（1）引物设计
经大量比对GenBank中口蹄疫病毒通用型和Asia 1型全基因序列，选择口蹄疫病毒通用型和Asia 1型高度保守的2B基因为模板，设计了通用型和Asia 1型共用的反转录引物P0，根据FMDV VP1保守基因序列设计通用的特异性引物对（P1/P2）及荧光探针Probe-P5，根据Asia 1型特异性VP1基因序列设计特异性引物对（P3/P4）及荧光探针Probe-P6，引物及探针序列如下所示：
引物P0：5'-cgggaaacgcatgagcagta-3'，
引物P1：5'-cggcctctcatccaacaga -3'，
引物P2：5'-attttccttcaggcgcttga -3'，
引物P3：5'-aagagcacccaaacccttga-3'，
引物P4：5'-gccccgaccagtgtgtgt-3'，
探针Probe-P5：5'-FAM-tcatttgtgaaacgcg -MGB-3' ，
探针Probe- P6：5'-NED- ctcatgcagatcccct -MGB -3'；
引物及探针序列由宝生物工程（大连）有限公司合成提供。
（2）总RNA制备
以口蹄疫Asia 1型灭活疫苗为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，与含有口蹄疫病毒的O/P液、水泡皮、水泡液待检样品同时采用Trizol法提取总RNA，具体操作如下：
分别取阳性对照、阴性对照及待检样品各200 μL 于1.5 mL离心管中，再加入600 μL的Trizol于涡旋器震荡2～3 min，加入200 μL氯仿，4℃，12000 rpm离心10 min后，取上清转入另1.5 ml离心管中，加等量异丙醇沉淀， 75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μL DEPC水溶解沉淀，取10 μL用于反转录，其余－20℃保存。
（3）反转录
对步骤（2）中提取的总RNA进行反转录，反转录反应体系如下：
5×M-MLV缓冲液，4 μL；
2.5 mmol/L dNTPs ，4 μL；
M-MLV反转录酶，0.5 μL；
RNA酶抑制剂，0.5 μL；
P0引物，1 μL；
总体积10 μL ；
步骤（2）中的制备的口蹄疫病毒RNA，10 μL；
37℃水浴1 h或置于PCR仪中37℃反应1 h，反应结束后，70℃，15 min 灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或－20℃冻存备用。
（4）通用型和Asia 1型标准品的制备
将口蹄疫Asia 1型灭活疫苗用常规RT-PCR方法分别扩增通用型和Asia 1型，并将阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体并转化至DH5α感受态细胞中，利用蓝白斑筛选挑选出重组菌，将挑选出来的菌进行培养、鉴定，将菌液鉴定和酶切鉴定阳性的重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司采用T7和SP6引物进行测序。
将测序正确的通用型和Asia 1型重组阳性质粒应用分光光度计测定并计算其OD260和OD280值及OD260 /OD280值，共重复5次取平均值，确定质粒DNA的浓度和纯度，－20℃保存备用；
测定结果为：
pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型重组质粒标准品OD260平均值分别为3.541和3.462，OD280平均值分别为1.932和1.896，OD260/ OD280平均值分别为1.832和1.826；参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型重组质粒DNA溶液的浓度分别为7.05×1010拷贝/μL和7.14×1010拷贝/μL，－20℃保存备用。  
（5）通用型和Asia 1型二重FQ-PCR反应
以步骤（4）所得的pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型重组质粒分别稀释至终浓度1.0×105拷贝/μL作为检测模板，反应体系中P1/P2、P3/P4引物对的体积分别用0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 μL，Probe-P5、Probe-P6探针体积分别用0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1和1.2 μL，荧光PCR仪采用矩阵法筛选不同体积浓度的通用型/Asia 1型引物和探针组合，筛选出针对通用型/Asia 1型的二重FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件，优化的反应体系如下，扩增曲线如图1所示；
口蹄疫病毒通用型和Asia 1型上、下游引物P1/P2、P3/P4各0.5μL，终浓度均为0.4 μmol/L，
Probe-P5，1μL，终浓度为0.4 μmol/L，
Probe-P6，1.2μL，终浓度为0.48 μmol/L，
dNTPs，2.5 mmol/L、2 μL，
10×Ex Taq 缓冲液，2.5 μL，
Ex Taq酶，5U/μL 、0.25 μL，
步骤（3）中反转录产物，2 μL，
去离子水补至 25 μL；
反应条件为：94℃ 5 min后，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。
（6）结果判定
阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整；
在“FAM/NONE”和“NED/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无，阳性对照的Ct值应≤32.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；
在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤32.0，而且出现两条特定的扩增曲线，判定为阳性，表明样品中存在口蹄疫Asia 1型病毒；Ct值＞35.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性，表明样品中无口蹄疫病毒；35.0≥Ct值＞32.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，结果为阴性者判定为阴性；对可疑样品重新试验，结果再为可疑者应重新采集该动物样品重新试验；
在检测结果成立的前提下，若在“FAM/NONE” 标记模式下样品Ct值≤32.0，而且出现特定的扩增曲线，在“NED/NONE” 标记模式下样品Ct值＞35.0或无，且无特定的扩增曲线，判定为通用阳性，表明样品中存在口蹄疫病毒，但非Asia 1型病毒。
方法验证
为检验本发明所提供的口蹄疫病毒（FMDV）通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法的准确性和可靠性，发明人从多个方面进行了验证，简要介绍如下。
敏感性试验和标准曲线的建立
将步骤（4）所得的pGEM-T-通用型 和pGEM-T-Asia 1型重组质粒分别作10倍系列稀释，两种质粒1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为1.0×107～1.0×100 拷贝/μL，共8个稀释度，按步骤（5）优化的FQ-PCR反应条件进行通用型/Asia 1型二重FQ-PCR敏感性试验。
以pGEM-T-通用型 和pGEM-T-Asia 1型重组质粒起始模板数的对数为X轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立二重FQ-PCR方法的标准曲线。
敏感性扩增曲线和标准曲线如图2~图5所示。
二重FQ-PCR检测FMDV 通用型和Asia 1型最低检出限均为1.0×101 拷贝/μL。
由敏感性检测结果建立通用型标准曲线，相关系数为0.998，斜率为－3.39，截距为35.7，从而可以得出拷贝数（X）与Ct值之间的线性关系表达式：Ct=－3.39×log拷贝数+35.7；
由敏感性检测结果建立Asia 1型标准曲线，相关系数0.999，斜率为－3.19，截距为37.1，从而可以得出拷贝数（X）与Ct值之间的线性关系表达式：Ct=－3.19×log拷贝数+37.1。
根据仪器读取的Ct值代入表达式就可算出通用型和Asia 1型的初始拷贝数。例如：仪器读取的通用型Ct值为25.31，将该值代入通用型线性关系表达式：Ct=－3.39×log拷贝数+35.7中为，25.31=－3.39×log拷贝数+35.7，经计算该样品中通用型初始拷贝数为1.15×103拷贝/μL。
特异性试验
按步骤（2）、步骤（3）方法对猪水疱病病毒（SVDV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）提取RNA并反转录，同时设口蹄疫Asia 1型灭活疫苗为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，按步骤（5）优化的FQ-PCR反应条件进行FQ-PCR扩增以验证该方法的特异性。
结果如图6所示，结果表明：阳性对照Ct值分别为19.2和22.3，且出现特定的扩增曲线；但正常BHK-21细胞培养物、猪水疱病病毒（SVDV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）等均未出现特定的扩增曲线。
稳定性和重复性试验  
分别将3个浓度的10倍系列稀释的pGEM-T-通用型 和pGEM-T-Asia 1型重组质粒等量混合物（每种质粒终浓度1.0×105～1.0×103）按照步骤（5）优化的FQ-PCR反应条件进行FQ-PCR扩增，每个系列设定3个重复，以验证该方法的稳定性和重复性。结果如图7所示。
重复性试验结果表明，浓度为1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL的3个浓度的pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型重组质粒等量混合物3次试验结果均为阳性，经计算及统计分析，pGEM-T-通用型质粒标准品的最终实际测得值分别为1.001×105，0..998×104，1.002×103 拷贝/μL，pGEM-T-Asia 1型质粒标准品的最终实际测得值分别为，0.998.001×105，0..997×104，1.001×103 拷贝/μL，表明此方法具有良好的稳定性和重复性。
应用试验
依据建立的通用型/Asia 1型二重FQ-PCR检测方法，配制检测试剂，以口蹄疫Asia 1型灭活疫苗为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，对中国农科院兰州兽医研究所实验室保存的10份临床样品进行检测，该10份样品为经过RT-PCR检测方法和病毒分离鉴定方法检测已知结果的样品，将本研究方法检测结果与已知结果进行比较。
对10份临床样品进行通用型/Asia 1型二重FQ-PCR检测，结果如图8所示。结果表明，口蹄疫病毒通用型样品4份、口蹄疫病毒Asia 1型和通用型同时样品3份，阴性无感染样品3份。此检测结果与兰州兽医研究所检测结果符合率为100%，而本方法较RT-PCR方法和病毒分离鉴定方法更加灵敏、快捷、污染少，因而更适合于临床应用。 

Claims (2)

1.一种口蹄疫病毒通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）引物设计
引物包括共用的反转录引物P0，口蹄疫病毒通用型的特异性引物对P1/P2及荧光探针Probe-P5，口蹄疫病毒Asia 1型特异性引物对P3/P4及荧光探针Probe-P6，引物序列如下所示：
引物P0：5'-cgggaaacgcatgagcagta-3'，
引物P1：5'-cggcctctcatccaacaga -3'，
引物P2：5'-attttccttcaggcgcttga -3'，
引物P3：5'-aagagcacccaaacccttga-3'，
引物P4：5'-gccccgaccagtgtgtgt-3'，
探针Probe-P5：5'-FAM-tcatttgtgaaacgcg -MGB-3' ，
探针Probe- P6：5'-NED- ctcatgcagatcccct -MGB -3'；
（2）总RNA制备
以口蹄疫Asia 1型灭活疫苗为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，与含有口蹄疫病毒的待检样品同时采用Trizol法提取总RNA；
（3）反转录
对步骤（2）中提取的总RNA进行反转录，反转录产物－20℃冻存备用；
（4）通用型和Asia 1型标准品的制备
将口蹄疫Asia 1型灭活疫苗用常规RT-PCR方法分别扩增通用型和Asia 1型，并将阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中；确定测序正确的通用型和Asia 1型重组阳性质粒的浓度和纯度，－20℃保存备用； 
（5）通用型和Asia 1型二重FQ-PCR反应 
以步骤（4）所得的pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型阳性重组质粒作为检测模板，进行二重FQ-PCR；
（6）结果判定
在“FAM/NONE”和“NED/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无，阳性对照的Ct值应≤32.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；
在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤32.0，而且出现两条特定的扩增曲线，判定为阳性，表明样品中存在口蹄疫Asia 1型病毒；Ct值＞35.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性，表明样品中无口蹄疫病毒；35.0≥Ct值＞32.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，结果为阴性者判定为阴性；对可疑样品重新试验，结果再为可疑者应重新采集该动物样品重新试验；
在检测结果成立的前提下，若在“FAM/NONE” 标记模式下样品Ct值≤32.0，而且出现特定的扩增曲线，在“NED/NONE” 标记模式下样品Ct值＞35.0或无，且无特定的扩增曲线，判定为通用阳性，表明样品中存在口蹄疫病毒，但非Asia 1型病毒。
2.如权利要求1所述口蹄疫病毒通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法，其特征在于，步骤（5）中检测模板pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型阳性重组质粒浓度为1.0×105拷贝/μL，FQ-PCR反应体系及反应条件为：
P1/P2、P3/P4，浓度均为20μmol/L，各0.5 μL；
Probe-P5，20μmol/L、1 μL；
Probe-P6，20μmol/L、1.2 μL；
dNTPs，2.5 mmol/L、2 μL，
10×Ex Taq 缓冲液，2.5 μL，
Ex Taq酶，5U/μL，0.25 μL，
步骤（3）中反转录产物，4 μL； 
去离子水补至 25 μL；
反应条件为：94℃ 5 min后，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。
CN201410755445.0A 2014-12-11 2014-12-11 FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法 Active CN104372111B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410755445.0A CN104372111B (zh) 2014-12-11 2014-12-11 FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410755445.0A CN104372111B (zh) 2014-12-11 2014-12-11 FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104372111A true CN104372111A (zh) 2015-02-25
CN104372111B CN104372111B (zh) 2017-03-01

Family

ID=52551302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410755445.0A Active CN104372111B (zh) 2014-12-11 2014-12-11 FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104372111B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112558A (zh) * 2015-08-06 2015-12-02 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒
CN107326100A (zh) * 2017-07-17 2017-11-07 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量pcr检测试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101724711A (zh) * 2008-10-30 2010-06-09 中国检验检疫科学研究院 用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光pcr引物和探针
CN103224995A (zh) * 2013-04-10 2013-07-31 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒强弱毒的纳米pcr检测试剂盒及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101724711A (zh) * 2008-10-30 2010-06-09 中国检验检疫科学研究院 用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光pcr引物和探针
CN103224995A (zh) * 2013-04-10 2013-07-31 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒强弱毒的纳米pcr检测试剂盒及其应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112558A (zh) * 2015-08-06 2015-12-02 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒
CN105112558B (zh) * 2015-08-06 2018-02-06 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒
CN107326100A (zh) * 2017-07-17 2017-11-07 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量pcr检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN104372111B (zh) 2017-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102230029B (zh) 口蹄疫病毒O型、A型与Asia 1型三重RT-PCR检测试剂及其检测方法
CN105567871A (zh) 快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-rpa检测试剂盒及其用途
CN104561374A (zh) 鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株和野毒株的检测试剂与方法
CN103789451B (zh) 一种检测柯萨奇病毒a6、a10型的荧光定量试剂盒
CN107326100A (zh) 口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN104561368B (zh) 六种猪病毒多重实时荧光定量pcr快速诊断试剂盒
CN108504778B (zh) 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用
CN105525040A (zh) 快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途
CN103627816A (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN106435023B (zh) 一种检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途
CN105349707A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN105112558A (zh) 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒
CN103725793A (zh) 检测prrsv的多重荧光定量rt-pcr方法及其应用
CN104450970A (zh) 用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及方法
CN105603127A (zh) 一种鉴别NADC30-like PRRSV的PCR检测试剂盒
CN102071256A (zh) 猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法
CN105907890A (zh) 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法
CN103725794A (zh) 检测prrsv的荧光定量rt-pcr引物、探针及其方法
Qi et al. Development and application of a TaqMan-based real-time PCR method for the detection of the ASFV MGF505-7R gene
CN101724712B (zh) 动物虫媒病多重rt-pcr鉴别检测试剂及制备方法和应用
CN104372111A (zh) FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法
CN103789450A (zh) 一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒
CN104404170B (zh) 口蹄疫病毒通用、a型二重实时荧光定量pcr检测引物及探针
CN103805717B (zh) 一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用
CN103215389B (zh) 猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法rt-pcr诊断试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant