CN103981285A - 一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法 - Google Patents

一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA；(3)检测：进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有牛病毒性腹泻病毒。本发明还公开了特异性引物(如SEQIDNO.3～8所示)以及试剂盒(由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成)。本发明的方法，既可用于牛病毒性腹泻病毒气溶胶样本的分型检测，也可用于临床血液、奶样、组织等样本的检测，具有广泛的应用前景。

Description

一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，属于生物技术领域。
背景技术
牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)引起的传染病，呈地方性流行。本病可通过接触及气溶胶等方式传播，病牛及隐性感染牛的呼吸道、眼分泌物、乳汁及粪便等排泄物均含有病毒，在封闭式牛群中可呈暴发式流行，给畜牧业生产和相关商业领域造成巨大的经济损失。
BVDV是单股正链RNA病毒，有囊膜，基因组由5’端非翻译区(5’NTR)，一个长的开放阅读框，编码病毒的结构蛋白，包括病毒的衣壳蛋白和囊膜蛋白(Erns、E1和E2)和非结构蛋白，和3’端非翻译区(3’NTR)组成。根据BVDV基因组5’端非翻译区(5’NTR)序列不同，把BVDV分为牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1)和牛病毒性腹泻病毒II型(BVDV-2)。BVDV流行株的基因分型在流行病学研究、疫苗研制乃至疫病的控制和消灭等方面都具有重要的意义。
实时荧光定量RT-PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、荧光技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点，仪器自动分析，效率高、无后续处理，克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了实验时间、简化了实验操作。
气溶胶是由悬浮于气体介质中的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系，其粒径一般为0.001-100μm。空气生物气溶胶研究主要集中在动物舍环境气载细菌、真菌及其毒素、内毒素等的检测，而病毒气溶胶浓度低、难以收集，样品处理以及病毒的鉴定等方面比其他微生物的研究方法及步骤更加复杂，影响因素多，对病毒气溶胶的研究不够深人。迄今为止，还没有应用SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术检测鉴别牛病毒性腹泻病毒气溶胶样品的研究报道。本研究应用荧光RT-PCR对收集到的奶牛场不同环境中空气样品中牛病毒性腹泻病毒进行检测，操作简便、快速，特异性强，灵敏度高，结果可靠。
发明内容
针对上述现有技术，一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，可同时对气溶胶样本中牛病毒性腹泻病毒不同基因型进行鉴别诊断。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，步骤如下：
(1)采集气溶胶样本；
进一步地，采集气溶胶样本的方法为：采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；
(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA；
进一步地，提取RNA和cDNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在4℃下12000r/min离心30min，取上清液1mL，应用病毒RNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取病毒的总RNA；将RNA提取物溶解于50μLRNAase-free水中，按照FermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行RT-PCR反应，得到cDNA；
(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：
所述试剂盒由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH2O组成；所述的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR试剂盒为PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)试剂盒(购自大连宝生物)。采用SYBRGreenⅠ荧光染料的方法，要比Taqman探针方法简便，价格相对较低。
所述牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1由序列为SEQIDNO.9所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。
所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对；
所述通用型检测引物对的序列如下：
上游引物RT-F为5′-TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3′(如SEQIDNO.3所示)；
下游引物RT-R为5'-CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3'(如SEQIDNO.4所示)。
所述牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的序列如下：
牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对：
上游引物RT-1-F为5′-TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3′(如SEQIDNO.5所示)；
下游引物RT-1-R为为5′-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3′(如SEQIDNO.6所示)；
牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对：
上游引物RT-2-F为5′-AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3′(如SEQIDNO.7所示)；
下游引物RT-2-R为5′-GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3′(如SEQIDNO.8所示)。
扩增反应体系为20μL：2×SYBRPremixExTaqII10μL，模板2μL，上游引物和下游引物各0.5μL，RNaseFreeddH2O7μL。所述的定量引物对中，上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度均为0.25μmol/L。
反应条件为：预变性95℃30s，然后按照95℃变性5s、65℃退火延伸30s，进行40个循环；溶解曲线为95℃5s、65℃60s、95℃Continuous；最后50℃30s结束反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；
(5)判断：当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒；
当所用特异性引物为牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对时，若对应于牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒I型；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒I型；
若对应于牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型。
本发明的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，既可用于牛病毒性腹泻病毒气溶胶样本的分型检测，也可用于临床血液、奶样、组织等样本的检测，对牛病毒性腹泻病毒的流行与传播进行实时监测，为相关的基础研究提供技术支持，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：牛病毒性腹泻病毒所有基因型SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测的标准曲线，图中各点对应为5.2×108-1.0×100拷贝数/μL。
图2：牛病毒性腹泻病毒所有基因型SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测的溶解曲线，其中，空白对照以等量RNaseFreeddH2O代替模板，其他模板为标准阳性质粒分别为1.0×108-1.0×101拷贝数/μL。
图3：牛病毒性腹泻病毒所有基因型SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测的特异性曲线，其中，1：牛病毒性腹泻病毒；2：牛副流感3型病毒(BPIV-3)；3：牛肠道病毒(BEV)；4：牛冠状病毒(BcoV)；5：牛轮状病毒(BRV)；6：ddH2O。
图4：牛病毒性腹泻病毒所有基因型SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法的灵敏度检测结果，其中，1：5.2×108拷贝数/μL；2：5.2×107拷贝数/μL；3：5.2×106拷贝数/μL；4：5.2×105拷贝数/μL；5：5.2×104拷贝数/μL；6：5.2×103拷贝数/μL；7：5.2×102拷贝数/μL；8：5.2×101拷贝数/μL；9：5.2×100拷贝数/μL；10：空白对照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。
图5：牛病毒性腹泻病毒所有基因型SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测的重复性曲线，其中，1：5.2×108拷贝数/μL；2：5.2×107拷贝数/μL；3：5.2×106拷贝数/μL；4：5.2×105拷贝数/μL；5：5.2×104拷贝数/μL；6：空白对照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。
图6：SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法分型检测的溶解曲线，空白对照以等量RNaseFreeddH2O代替模板，其他模板为标准阳性质粒分别为1.0×108-1.0×101拷贝数/μL。
图7：气溶胶样本所有基因型检测曲线，其中，1：5.2×106拷贝数/μL标准阳性质粒对照；2：气溶胶样本1；3：气溶胶样本2；4：气溶胶样本3；5：气溶胶样本4；6：气溶胶样本5；7：气溶胶样本6；8：气溶胶样本7；9：气溶胶样本8；10：气溶胶样本9；11：气溶胶样本10；12：空白对照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。
图8：气溶胶样本分型检测，其中，阳性对照是5.2×106拷贝数/μL质粒为模板，空白对照以等量RNaseFreeddH2O代替模板，其他模板为气溶胶样本1-4。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用一些材料和试剂如下：
MS-1型多功能微生物采样器(青岛众瑞智能仪器有限公司)；480Ⅱ荧光定量PCR仪(罗氏公司)；琼脂糖凝胶回收试剂盒(目录号：DP209)和高纯度质粒小提中量试剂盒(目录号：DP107)购自天跟生化科技(北京)有限公司；RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(目录号：K1622)购自Fermentas公司；pEASY-T3载体试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司；病毒基因组RNA提取试剂盒(CodeNo.：9766)、PremixExTaqTMII(TIiRNaseHPlus)试剂盒(CodeNo.：RR820A)、LATaq(CodeNo.：RR02MA)、TaKaRaTaq(CodeNo.：R001A)、DNAMarker，IPTG，X-gal均购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1引物的设计与合成
根据GeneBank中牛病毒性腹泻病毒5’-UTR基因(GenBank:AF091605.1，)保守序列，应用PrimerPremier5.0设计全长扩增引物B-F、B-R(表1，序列1和序列2，如SEQIDNO.1、2所示)，用于阳性标准质粒的构建；采用PrimerExpress3.0软件，设计一对特异性引物RT-F、RT-R(表1，序列3和序列4，如SEQIDNO.3、4所示)，用于通用型牛病毒性腹泻病毒检测。分别根据GeneBank中不同型牛病毒性腹泻病毒序列，采用PrimerExpress3.0软件，分别设计I型牛病毒性腹泻病毒和Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒特异性鉴别检测引物(表1，序列5-8，如SEQIDNO.5、6、7、8所示)。
表1引物寡核苷酸序列
实施例2牛病毒性腹泻病毒通用型SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
(一)SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的确定
1、待测样本的制备
取牛病毒性腹泻病毒、牛副流感3型病毒、牛肠道病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒的细胞培养毒200μL，参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取RNA，按照FermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行RT-PCR反应。
2、标准品的制备
以步骤1得到的牛病毒性腹泻病毒的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL：10×LAPCRBufferII(Mg2+Plus)5μL、2.5mMdNTPMixture8μL、LATaq0.5μL(5U/μL)、模板2μL，10μmol/L的B-F和B-R基因全长上下游引物各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性3min，然后进入94℃30s，55℃30s，72℃40s，共进行31个循环；72℃延伸10min，最后停止于4℃。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体，蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果与序列表中的SEQIDNO.9所示的序列进行比对，正确的重组质粒为阳性，将其命名为pEAST-T3-B1。
将pEAST-T3-B1质粒作为阳性标准品，用核酸蛋白分析仪(NanoPhotometerTMP300)测定质粒浓度，按照下述公式计算出每μL质粒中的DNA拷贝数，结果拷贝数为5.2×1010拷贝/μL，将该质粒作为标准品。
质粒拷贝数(拷贝/mL)＝计算方法：(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(质粒浓度g/ml)/(MWg/mol)，其中：[平均分子量(MWg/mol)：dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；ssDNA＝(碱基数)×(330道尔顿/碱基)；ssRNA＝(碱基数)×(340道尔顿/碱基)]。
3、SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR的扩增条件的确立
设立引物终浓度梯度为0.2-1.0mol/L，以确定反应的最佳引物浓度；设立温度梯度为59-68℃，根据PCR扩增结果，选取最佳退火温度。以Ct最小值、荧光最高值、熔解曲线显示只有单特异峰为标准，分别对退火温度、引物浓度、循环条件进行优化(接下来的步骤4中的各项参数即为优化结果)。
4、标准曲线的确定和溶解曲线分析
荧光定量RT-PCR标准曲线的确定，对质粒pEAST-T3-B1进行定量，然后按10倍进行稀释至100-108拷贝数/μL，将稀释的拷贝数作为模板进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR扩增，建立标准曲线。扩增反应体系为20μL：2×SYBRPremixExTaqII10μL，质粒pEAST-T3-B12μL，浓度为10μmol/L的上游引物和下游引物(表1中的各引物对)各0.25μL，RNaseFreeddH2O补足20μL。同时设置空白对照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。然后进行标准曲线的扩增，反应程序如下：
预变性95℃    30秒钟  (升温速率 4.4℃/秒)1cycle。
PCR分析模式：定量分析。
95℃  5秒钟  (升温速率 4.4℃/秒)；65℃  30秒钟  (升温速率 2.2℃/秒，AcquisitionMode:Single)；40cycles。
融解分析模式：融解曲线。
95℃  5秒钟  (升温速率 4.4℃/秒)；60℃  1分钟  (升温速率 2.2℃/秒)；95℃(升温速率0.11℃/秒,Acquisition Mode:Continuous,Acquisitions:5per℃)；1cycle。
降温：50℃30秒钟(升温速率2.2℃/秒)；1cycle。
标准曲线如图1所示，从图中可以看出，各点在一直线上，即表明标准曲线好。
溶解曲线如图2所示，从图中可以看出，溶解曲线只有单一的峰出现，表明只扩增出阳性峰，没有引物二聚体或其它非阳性峰出现，为特异性扩增。
(二)SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR的特异性试验
按照上述步骤建立的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法进行特异性试验，以牛病毒性腹泻病毒(C24V株)cDNA以及对照的牛副流感3型病毒cDNA、牛肠道病毒cDNA、牛冠状病毒cDNA、牛轮状病毒cDNA以及ddH2O为阴性对照。
在530nm激发光下检测牛病毒性腹泻病毒的特异性的结果如图3所示，从图中可以看出，1有相应病毒的特异性荧光曲线，而2～6均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物扩增牛病毒性腹泻病毒特异性好，与其它检测毒株无交叉反应。因此，用位于5’-UTR基因上的上游引物和下游引物建立的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于检测未知样本是否有牛病毒性腹泻病毒核酸的存在。
(三)SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR的灵敏度试验
以10倍系列稀释液上述制备的pEASY-T3-B1质粒，得到拷贝数为5.2×108-5.2×100拷贝/μL的系列稀释液，将含有不同的质粒拷贝数的稀释液作为模板，同时设置一等量RNaseFreeddH2O代替模板的空白对照进行SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增。其中，SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR采用上述优化后的反应体系和反应条件；SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR检测，在530nm激发光下的结果，如图4所示，牛病毒性腹泻病毒的检测5.2×100拷贝/μL仍有较好的荧光曲线，表明SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法对牛病毒性腹泻病毒具有较高的灵敏度。
(四)SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR的重复性试验
按照上述步骤(三)中建立的SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR方法，选取5个不同浓度的上述步骤二中制备的pEASY-T3-B1质粒DNA作为模板(同时设置以等量RNaseFreeddH2O代替模板的空白对照)，每个模板浓度做3个重复，通过计算Ct值的标准差(S)和变异系数(CV)来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性；另选取一个浓度的pEASY-T3-B1质粒DNA作为模板，进行荧光PCR扩增，间隔7d重复一次，共进行3次重复，然后计算Ct值的变异系数(CV)，验证荧光定量RT-PCR的批间重复性，结果如图5所示，同一浓度所得的S型曲线相似，实际所得的Ct值基本相同，变异很小，表明所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR方法具有良好的重复性。
实施例3牛病毒性腹泻病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR分型检测方法的建立
1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR牛病毒性腹泻病毒基因分型检测扩增条件的确立
根据SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR牛病毒性腹泻病毒通用型检测扩增条件的步骤，优化不同基因型牛病毒性腹泻病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR反应的最佳引物浓度、退火温度及循环条件等。确定上游引物和下游引物在反应体系中的最佳终浓度均为0.25μmol/L，最佳退火温度为65℃。
2、标准曲线的确定和溶解曲线分析
按照实施例2中步骤4荧光定量RT-PCR标准曲线和溶解曲线的分析方法，对不同基因型的标准曲线和溶解曲线进行分析。溶解曲线如图6所示，从图中可以看出，两种分型引物溶解曲线只有单一的峰出现，表明只扩增出阳性峰，没有引物二聚体或其它非阳性峰出现，为特异性扩增。
实施例4气溶胶样本的检测
1.气溶胶样品采集
选择奶牛场的不同区域(奶牛舍、运动场、挤奶厅等)，应用MS-Ⅰ型空气微生物采样箱，通过国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，Porton采样器采集空气样品。首先安装三脚架，采样器放置高度为距地面1.5m，然后将10mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)注入Proton采样器，同时滴加一滴橄榄油，放入三脚固定支架内固定。将Porton冲击式稳流器的一端接到主机入气口上，另一端用橡胶管连接到Proton采样器的出气口上。采样流量为12.5L/min，采样时间为20min。采样结束后将采样器内的采集液收集到15mL离心管保存用于检测。
2.模板cDNA制备
气溶胶吸收液4℃，12000r/min离心30min，取1mL上清，参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取气溶胶样本中的RNA，将所有RNA溶于50μL试剂盒自带的RNAaseFree水中，-70℃存储备用。按照FermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行RT-PCR反应。
3.临床气溶胶样本的所有基因型检测
待测样本为山东省不同地区奶牛养殖场不同地点收集的气溶胶样本共计10份，分别制备这些气溶胶样本的牛病毒性腹泻病毒cDNA。以制备的气溶胶样本的基因组cDNA分别作为模板，按照实施例2中步骤4中建立的SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR方法进行检测。若在530nm激发光下的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有牛病毒性腹泻病毒；若反应结果为一条直线，测待测样本中没有牛病毒性腹泻病毒。经测定，在530nm激发光下，4份检测样本中出现S型曲线，6份样本出现直线扩增，表明4份气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒，如图7所示。
4.临床气溶胶样本的分型检测
将上述4份检测含有牛病毒性腹泻病毒的气溶胶样本，进一步应用病毒基因分型引物RT-1-F/RT-1-R、RT-2-F/RT-2-R进行检测，经测定，牛病毒性腹泻气溶胶样品中有4份均为I型牛病毒性腹泻病毒阳性，采集的气溶胶样本中未检测到Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒，如图8所示。

Claims (10)

1.一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)采集气溶胶样本；
(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA；
(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：
所述试剂盒由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成；
所述牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1由序列为SEQIDNO.9所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；
所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对；
所述通用型检测引物对的序列如下：
上游引物RT-F为5′-TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3′；
下游引物RT-R为5'-CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3'；
所述牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的序列如下：
牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对：
上游引物RT-1-F为5′-TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3′；
下游引物RT-1-R为为5′-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3′；
牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对：
上游引物RT-2-F为5′-AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3′；
下游引物RT-2-R为5′-GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3′；
(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；
(5)判断：当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒；
当所用特异性引物为牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对时，若对应于牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒I型；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒I型；
若对应于牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型。
2.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为：采用全玻璃液体冲击式采样器，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本。
3.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，提取RNA和cDNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在4℃下12000r/min离心30min，取上清液1mL，应用病毒RNA试剂盒提取病毒的总RNA；将RNA提取物溶解于50μLRNAase-free水中，按照FermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行RT-PCR反应，得到cDNA。
4.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR的扩增反应体系为20μL：2×SYBRPremixExTaqII10μL，模板2μL，上游引物和下游引物各0.5μL，RNaseFreeddH2O7μL。所述的定量引物对中，上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度均为0.25μmol/L。
5.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，PCR的反应条件为：预变性95℃30s，然后按照95℃变性5s、65℃退火延伸30s，进行40个循环；溶解曲线为95℃5s、65℃60s、95℃Continuous；最后50℃30s结束反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
6.用于检测牛病毒性腹泻病毒的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对；
所述通用型检测引物对的序列如下：
上游引物RT-F为5′-TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3′；
下游引物RT-R为5'-CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3'；
所述牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的序列如下：
牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对：
上游引物RT-1-F为5′-TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3′；
下游引物RT-1-R为为5′-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3′；
牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对：
上游引物RT-2-F为5′-AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3′；
下游引物RT-2-R为5′-GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3′。
7.权利要求6所述的特异性引物在制备检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒中的应用。
8.权利要求6所述的特异性引物在检测牛病毒性腹泻病毒中的应用。
9.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成；
所述牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1由序列为SEQIDNO.9所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；
所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对；
所述通用型检测引物对的序列如下：
上游引物RT-F为5′-TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3′；
下游引物RT-R为5'-CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3'；
所述牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的序列如下：
牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对：
上游引物RT-1-F为5′-TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3′；
下游引物RT-1-R为为5′-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3′；
牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对：
上游引物RT-2-F为5′-AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3′；
下游引物RT-2-R为5′-GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3′。
10.权利要求9所述的试剂盒在检测牛病毒性腹泻病毒中的应用。
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