CN103981261B - 一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：采用特异性引物和试剂盒进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有布鲁氏杆菌。本发明还公开了特异性引物(如SEQIDNO.3～9所示)以及试剂盒(由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成)。本发明的方法既可用于养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。

Description

一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法

技术领域

本发明涉及一种检测及鉴别诊断养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，属于生物检测领域。

背景技术

气溶胶(aerosol)是指悬浮在气体中的固体和/或液体微粒与气体载体共同组成的多相体系。根据微粒的成分可以划分为生物气溶胶和化学气溶胶。在气溶胶的体系中，把具有生命的气溶胶粒子和活性粒子以及由有生命活性的机体所释放到空气中的各种质粒统称为生物气溶胶，又称为微生物气溶胶，主要分为细菌气溶胶、病毒气溶胶和真菌气溶胶等，与人类及动物的健康密切相关。养殖场环境中的微生物气溶胶的分布可造成以呼吸道传播性的传染病的暴发与流行，给畜牧业生产和人类健康带来严重危害，尤其是当前集约化、高密度养殖环境下更容易形成微生物气溶胶性的疾病流行。因此，通过监测养殖场环境中气溶胶微生物，可以有效地预警预测传染病的暴发流行。

布鲁氏杆菌病(Brucellosis，也称布氏杆菌病)是由布鲁氏杆菌属细菌引起的人、畜共患的常见传染病。布鲁氏杆菌属于兼性胞内寄生的革兰氏阴性短小杆菌，无鞭毛，不形成芽孢，有荚膜，是在严格厌氧条件下不生长的需氧菌，其外膜蛋白、脂多糖等成分是决定其感染力的主要因素。在家畜中以牛种布鲁氏杆菌(B.abortus)、羊种布鲁氏杆菌(B.melitensis)和猪种布鲁氏杆菌(B.suis)最常发生，且可由牛、羊、猪传染给人。本病广泛分布于世界各地，每年4～8月为本病的高发季节，与牛羊繁殖、流产及牛羊肉的消费有关，高危人群是牛羊的饲养、屠宰、兽医、畜产品加工等从业人员。我国目前在人、畜间仍有发生，给畜牧业和人类的健康带来严重的危害。

现有技术中，实验室检测布鲁氏杆菌病原的方法主要有细菌染色、分离培养和核酸检测，核酸检测主要是常规PCR法。目前，尚无常规PCR方法检测养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的研究。

SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR可以利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线检测目的基因并进行定量分析，同时结合溶解曲线Tm差异进行鉴别诊断的技术。该技术具有敏感性高、特异性强，重复性好等优点；此外操作简便、价格低廉、结果直观，在临床检测和对疾病进程的研究上具有很高的实用价值。目前，还没有应用SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR技术开展养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的研究报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法。本发明通过采集养殖场不同环境中布鲁氏杆菌气溶胶样本，提取布鲁氏杆菌基因组DNA，应用SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测布鲁氏杆菌属细菌，同时根据溶解曲线Tm值的不同对气溶胶中牛种布鲁氏杆菌、羊种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌进行鉴别诊断。利用本方法可以对养殖场环境中的布鲁氏杆菌气溶胶流行与传播进行实时监测，为养殖场布鲁氏杆菌的防控提供技术支持，也可以开展布鲁氏杆菌病的流行病学调查，为布鲁氏杆菌病的科学防控提供理论支撑。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，步骤如下：

(1)采集气溶胶样本；

进一步地，采集气溶胶样本的方法为：采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；

(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；

进一步地，提取基因组总DNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在室温下12000r/min离心5min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取总DNA；

(3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：

所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH₂O组成；

所述pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDNO.10所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术；

所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对；

所述通用型检测引物对的序列如下：

VirB10-2-F：5′-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3′，如SEQIDNO.3所示；

VirB10-2-R：5′-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3′，如SEQIDNO.4所示。

所述布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下：

牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：

Abortus-F：5′-GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3′，如SEQIDNO.5所示；

Abortus-R：5′-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3′，如SEQIDNO.6所示；

羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：

Melitensis-F：5′-AACAAGCGGCACCCCTAAAA-3′，如SEQIDNO.7所示；

Melitensis-R：5′-CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3′，如SEQIDNO.8所示；

猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：

Suis-F：5′-CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3′，如SEQIDNO.8所示；

Suis-R：5′-ACCGGAACATGCAAATGAC-3′，如SEQIDNO.9所示。

扩增体系为：20μL的扩增体系，包括2×SYBRPremixExTaqII10μL，模板2μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各0.5μL，RNaseFreeddH₂O7μL。

扩增条件为：预变性95℃30s，然后按照95℃变性5s、62℃退火延伸30s进行40个循环，每个循环结束后采集荧光信号；溶解曲线的条件为95℃10s、65℃60s，升温至95℃，最后50℃30s反应结束。

(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；

(5)判断：当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有布鲁氏杆菌；

当所用特异性引物为布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对时，若对应于牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛种布鲁氏杆菌；

若对应于羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有羊种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有羊种布鲁氏杆菌；

若对应于猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有猪种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有猪种布鲁氏杆菌。

布鲁氏杆菌四型分泌系统(TypeIVsecretionsystems，T4SS)是布鲁氏杆菌重要的致病力因子，它由VirB1……VirB12十二个蛋白组成，其中VirB10蛋白为跨膜通道的组成成分，是T4SS的核心结构组份，是主要的功能蛋白，本申请的发明人通过实验研究发现，其在布鲁氏杆菌属中高度保守，可作为布鲁氏杆菌属检测的靶基因。发明人还发现，布鲁氏杆菌IS711(InsertionSequence711)插入序列在不同的种布鲁氏杆菌基因组中高度保守，并且在拷贝数上存在差异，因此，本发明将牛种布鲁氏杆菌种特异性上游引物定位在IS711插入序列的上游基因alkB上，羊种的特异性上游引物定位在IS711插入序列的上游基因BMEI1162上，猪种上游引物定位在IS711插入序列的3′末端，下游引物定位在BSS2_I1621基因座前100的核苷酸位点，根据PCR扩增片段大小，即可以鉴别检测牛种布鲁氏菌生物1、2和4型，羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌生物1型。

本发明的检测及鉴别诊断养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，对养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌而言，能检测到的最低量为12.8个拷贝/μL。本发明的方法既可用于养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。本发明的方法可用于养殖场环境中临床样本的直接检测，也可用于科学研究等非疾病的诊断。

附图说明

图1：牛种、羊种和猪种布鲁氏杆菌VirB10基因序列比对图；应用DNAStar7.1中MegAlign软件的ClustalWMethd分析获得。

图2：布鲁氏菌通用型SYBRGreenⅠ实时定量PCR检测标准曲线，图中1-8的模板分别对应为标准阳性质粒1.28×10⁸-1.28×10¹拷贝数/μL。

图3：布鲁氏菌通用型SYBRGreenⅠ实时定量PCR检测溶解曲线，模板同图2，水平直线为阴性对照，模板为ddH₂O。

图4：布鲁氏菌通用型SYBRGreenⅠ实时定量检测PCR特异性曲线，其中1-3的模板分别为牛种布鲁氏杆菌A19株、羊种布鲁氏杆菌M5-90株、猪种布鲁氏杆菌S2株；4-11分别为：大肠杆菌(DH5α)、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、结核杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌；12为阴性对照。

图5：布鲁氏菌通用型SYBRGreenⅠ实时定量PCR灵敏度曲线，图中1-8的模板分别对应为标准阳性质粒1.28×10⁸-1.28×10¹拷贝数/μL。

图6：布鲁氏菌通用型SYBRGreenⅠ实时定量PCR重复性曲线，模板同图5，每个模板同时进行3个重复。

图7：布鲁氏菌通用型SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法检测养殖场布鲁氏杆菌属气溶胶样本扩增曲线。其中各曲线模板，1：阳性标准质粒pEASY-Y3-VirB101.28×10⁶拷贝数/μL,2：阳性标准质粒pEASY-Y3-VirB101.28×10⁴拷贝数/μL,3-30为气溶胶检测样本，其中a1、a7、a18、a24为气溶胶布鲁氏杆菌阳性。

图8：牛种布鲁氏杆菌溶解曲线，模板为牛种布鲁氏杆菌A19株。

图9：羊种布鲁氏杆菌溶解曲线，模板为羊种布鲁氏杆菌M5-90株。

图10：猪种布鲁氏杆菌溶解曲线，模板为猪种布鲁氏杆菌S2株。

图11A：牛种、羊种和猪种布鲁氏杆菌分型的溶解曲线；图11B：SYBRGreenⅠ实时定量PCR鉴别牛、羊和猪种布鲁氏杆菌气溶胶样本溶解曲线。其中a1、a7、a18、a24为气溶胶布鲁氏菌阳性样本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用一些材料、试剂和菌株如下：

MS-I型多功能微生物采样器(青岛众瑞智能仪器有限公司),480Ⅱ荧光定量PCR仪(罗氏公司)。细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(目录号：DP209)和高纯度质粒小提中量试剂盒(目录号：DP107)购自天跟生化科技(北京)有限公司；大肠杆菌(DH5α)、pEASY-T3载体试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司。PremixExTaq^TMII(TIiRNaseHPlus)试剂盒(CodeNo.：RR820A)、LATaq(CodeNo.：RR02MA)均购自宝生物工程(大连)有限公司。牛布氏杆菌活疫苗A19株(新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)、羊种布鲁氏杆菌M5-90株(中牧实业股份有限公司)、猪种布鲁氏杆菌活疫苗S2株(哈药集团生物疫苗有限公司)。金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、结核杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌均为临床分离株，为山东省农科院奶牛研究中心疾病实验室保存。

实施例1引物的设计与合成

对牛种(GenBank：AF226278.1，序列表中序列10)、羊种(GenBank:DQ861303.1)和猪种(GenBank:AF141604.1)VirB10基因序列比对发现其高度保守，见图1。根据GeneBank中牛布鲁氏杆菌VirB10基因保守序列，设计全长扩增引物(如SEQIDNO.1、2所示)，用于阳性标准质粒的构建(表1中的序列1、2)；采用PrimerExpress3.0软件，设计一对特异性引物(如SEQIDNO.3、4所示)，用于布鲁氏杆菌属通用型检测(表1中的序列3、4)。分别根据GeneBank中牛种布鲁氏杆菌AlkB基因与IS711序列(GenBank:AF148682.1，如SEQIDNO.11所示)，山羊种布鲁氏杆菌插入序列IS711(GenBank:JF939171.1，如SEQIDNO.12所示)，猪种布鲁氏杆菌S1330株染色体序列(GenBank:CP006962.1的第1618935～1619107位的核苷酸基序，如SEQIDNO.13所示)，采用PrimerExpress3.0软件，分别设计牛种、山羊种和猪种布鲁氏杆菌特异性鉴别检测引物(表1中的序列5～9，如SEQIDNO.5～9所示)。

表1引物寡核苷酸序列

实施例2气溶胶中布鲁氏菌通过型检测方法的建立

(一)SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

1、待测样本的制备

参照细菌DNA提取试剂盒说明书，提取基因组DNA。

2、标准品的制备

以步骤1得到的牛布氏杆菌活疫苗(A19株)的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL：10×LAPCRBufferII(Mg²⁺Plus)5μL、2.5mMdNTPMixture8μL、LATaq0.5μL(5U/μL)、模板2μL，10μmol/L的VirB10基因全长上下游引物VirB10-1(表1中的序列1和序列2)各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性3min，然后进入94℃30s，55℃30s，72℃lmin，共进行30个循环；72℃延伸10min，最后停止于4℃。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体，重组质粒送华大基因进行测序，将测序结果与序列表中的SEQIDNO.10所示的序列进行比对，正确的重组质粒为阳性，将其命名为pEAST-T3-VirB10。

将pEAST-T3-VirB10质粒作为阳性标准品，用紫外分光光度计测定pEAST-T3-VirB10质粒浓度为350ng/μL，按照下述公式计算出每μL质粒中的DNA拷贝数，结果拷贝数为1.28×10¹⁰拷贝/μL，将该质粒作为标准品。

质粒拷贝数浓度(copies/μL)＝质粒浓度×(6.02×10²³)/DNA碱基数×2×324.5(碱基的平均分子量)

3、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的扩增条件的建立

设立引物终浓度梯度为0.2～1.0mol/L，以确定反应的最佳引物浓度；设立温度梯度为59～65℃，根据PCR扩增结果，选取最佳退火温度。以Ct最小值、荧光最高值、熔解曲线显示只有单特异峰为标准，分别对退火温度、引物浓度、循环条件进行优化(接下来的步骤4中的各项参数即为优化结果)。

4、标准曲线与溶解曲线的建立

将质粒pEAST-T3-VirB10按10倍进行稀释至1.28×10⁸-1.28×10⁰拷贝数/μL，该标准质粒为模板进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR扩增。扩增反应体系为20μL：2×SYBRPremixExTaqII10μL，质粒pEAST-T3-VirB10：2μL，浓度为10μmol/L的VirB10-2上游引物和下游引物(表1中的序列3和序列4)各0.5μL，RNaseFreeddH₂O7μL。同时设置空白对照(以等量RNaseFreeddH₂O代替模板)。然后进行扩增，反应程序如下：

预变性：95℃30s(升温速率4.4℃/秒)，1cycle；

PCR：分析模式：定量分析，95℃5s(升温速率4.4℃/秒)，62℃30s(升温速率2.2℃/秒，AcquisitionMode:Single)，40cycles；

融解：分析模式：融解曲线，95℃10秒钟(升温速率4.4℃/秒)，60℃1分钟(升温速率2.2℃/秒)，95℃(升温速率0.11℃/秒,AcquisitionMode:Continuous,Acquisitions:5per℃)，1cycle；

降温：50℃30秒钟(升温速率2.2℃/秒)，1cycle。

标准曲线如图2所示，使用480ⅡGeneScanningSoftwareVersion1.5的AbsQuant/2ndDerivativeMax分析模式分析，结果各点在一直线上，各参数值为Error：0.0658，Efficiency：2.411，Slope：-2.616。

溶解曲线如图3所示，只有单一的峰出现，为特异性扩增。

(二)SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的特异性试验

按照上述步骤(一)中4建立的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法进行特异性试验，检测布鲁氏杆菌属的特异性结果，如图4所示，1、2和3号曲线分别是以牛种布氏杆菌活疫苗A19株、羊种布鲁氏杆菌M5-90株和猪种布鲁氏杆菌活疫苗S2株为DNA模板的扩增曲线，4-12分别是大肠杆菌(DH5α)、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、结核杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌DNA和ddH₂O为模板，均没有特异性荧光曲线。证实所设计的引物扩增布鲁氏杆菌属特异性好，与其它检测菌株无交叉反应。因此，步骤(一)用VirB10-2上游引物和下游引物(如SEQIDNO.3、4所示)建立的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于鉴定未知样本是否有布鲁氏杆菌属核酸的存在。

(三)SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的灵敏度试验

以10倍系列稀释上述步骤(一)2中制备的pEASY-T3-VirB10质粒，得到拷贝数为1.28×10⁸-1.28×10⁰拷贝/μL的系列稀释液，将含有不同的质粒拷贝数的稀释液作为模板，同时设置空白对照进行SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增。结果如图5所示，对布鲁氏杆菌属的通用型型监测12.8个拷贝仍有荧光曲线，表明SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法对布鲁氏杆菌属细菌的灵敏度为12.8个拷贝。另外，本发明的发明人进行了三次重复检测，重复检测的结果一致。

(四)SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的重复性试验

以不同浓度的pEASY-T3-VirB10质粒DNA作为模板(同时设置空白对照)，每个模板浓度做3个重复，通过计算Ct值的标准差(S)和变异系数(CV)来验证荧光定量PCR的批内重复性；另选取一个浓度的pEASY-T3-VirB10质粒DNA作为模板，进行荧光PCR扩增，间隔7d重复一次，共进行3次重复，然后计算Ct值的变异系数(CV)，验证荧光定量PCR的批间重复性。

选取1.28×10⁸拷贝数/μL-1.28×10¹拷贝数/μL8个浓度的pEASY-T3-VirB10质粒作重复试验，其所得的Ct值分别为10.31、13.34、16.61、17.57、20.49、24.30、27.02和30.10，其Ct值变异系数均小于5％；选取1.0×10⁴拷贝数/μL的pEASY-T3-VirB10质粒，每间隔7d共三次进行荧光PCR测定，其Ct值的变异系数也小于5％。

结果显示，步骤(一)建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法重复性好，具体如图6所示。

实施例3气溶胶中牛种、羊种和猪种布鲁氏杆菌鉴别诊断方法的建立

分别以牛种布氏杆菌活疫苗A19株、羊种布鲁氏杆菌活疫苗M5-90株和猪种布鲁氏杆菌活疫苗S2株的DNA为模板，同时分别用Abortus引物(如SEQIDNO.5、6所示)、Melitensis引物(如SEQIDNO.6、7所示)和Suis引物(如SEQIDNO.8、9所示)，按照实施例2中步骤(一)的3和4进行引物浓度、退火温度和反应条件的优化，其他方法同实施例2。应用480ⅡGeneScanningSoftwareVersion1.5的TmCalling分析方法，分别计算布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种Tm值，通过Tm值的不同进行鉴别诊断。结果分别如图8、9、10所示，每个反应分别获得1个特异性溶解曲线，牛种布氏杆菌、羊种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌Tm值分别为：(87.80±0.01)℃、(86.71±0.03)℃和(84.56±0.04)℃。

实施例4养殖场气溶胶样本的采集与布鲁氏杆菌通用型检测

1.气溶胶样品采集

在奶牛养殖场的不同环境中(奶牛舍、运动场、挤奶厅等)，应用MS-Ⅰ型空气微生物采样箱，通过国际标准的AGI采样器采集空气样本。采样器放置高度为距地面1.5m，然后将10mLpH7.0的PBS(0.01％(V/V)牛血清白蛋白)注入Proton采样器，同时滴加一滴橄榄油。将Porton冲击式稳流器的一端接到主机入气口上，另一端用橡胶管连接到Proton采样器的出气口上。采样流量为12.5L/min，采样时间为20min。采样结束后将采样器内的采集液收集到15mL离心管保存用于检测。

2.气溶胶模板DNA制备

气溶胶收集液12000r/min离心10min，弃上清，取约200μL沉淀，采用细菌基因组DNA提取试剂盒制备DNA模板。将所有模板溶于50μL试剂盒自带的洗脱缓冲液TE中，-20℃存储备用。

3.养殖场气溶胶样本的布鲁氏杆菌属通用型检测

待测样本为山东省不同地区奶牛养殖场不同地点收集的气溶胶样本，共计30份(a1-a30)，分别提取这些气溶胶样本的基因组DNA。

以提取的30份气溶胶样本的基因组DNA作为模板，按照实施例2步骤4所述的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法进行检测。

若反应结果为S型曲线，则待测样本中含有布鲁氏杆菌属细菌；若反应结果为一条直线，测待测样本中没有布鲁氏杆菌属的细菌。

检测结果如下：

经测定待检样本中出现S型曲线的样品有4份，编号分别为a1、a7、a18和a24(如图7所示)，为一条直线的样品26份，说明待测样品中有4份为布鲁氏杆菌属细菌阳性。

实施例5养殖场布鲁氏杆菌属阳性气溶胶不同种鉴别诊断

以上述实施例4步骤3中检测到的4份布鲁氏杆菌属阳性气溶胶样本DNA为模板，按照实施例3中建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法进行鉴别诊断。

若溶解曲线的Tm值为分别为(87.80±0.01)℃、(86.71±0.03)℃和(84.56±0.04)℃，则说明该气溶胶样本分别为牛种布鲁氏杆菌、羊种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌阳性。

检测结果如图11显示：a1、a7和a18号气溶胶样品溶解曲线的Tm值分别为87.81℃、87.79℃、87.80℃，a24号气溶胶样品溶解曲线的Tm值为84.53℃，可以确诊a1、a7和a18号气溶胶样品为牛种布鲁氏杆菌阳性，a24号气溶胶样品为猪种布鲁氏杆菌阳性。

Claims (6)

1.一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)采集气溶胶样本；

(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；

(3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：

所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成；

所述pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDNO.10所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；

所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对；

所述通用型检测引物对的序列如下：

VirB10-2-F：5′-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3′；

VirB10-2-R：5′-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3′；

所述布鲁氏杆菌牛种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下：

牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：

Abortus-F：5′-GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3′；

Abortus-R：5′-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3′；

猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：

Suis-F：5′-CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3′；

Suis-R：5′-ACCGGAACATGCAAATGAC-3′；

(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；

(5)判断：当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有布鲁氏杆菌；

当所用特异性引物为布鲁氏杆菌牛种和猪种鉴别检测引物对时，若对应于牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛种布鲁氏杆菌；

若对应于猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有猪种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有猪种布鲁氏杆菌；

所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为：采用全玻璃液体冲击式采样器，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本；

所述步骤(2)中，提取基因组总DNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在室温下12000r/min离心5min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒提取总DNA。

2.根据权利要求1所述的检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于：

所述步骤(3)中，PCR的扩增体系为：20μL的扩增体系，包括2×SYBRPremixExTaqII10μL，模板2μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各0.5μL，RNaseFreeddH₂O7μL。

3.根据权利要求1所述的检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR的扩增条件为：预变性95℃30s，然后按照95℃变性5s、62℃退火延伸30s进行40个循环，每个循环结束后采集荧光信号；溶解曲线的条件为95℃10s、65℃60s，升温至95℃，最后50℃30s反应结束。

4.用于检测布鲁氏杆菌的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种和猪种鉴别检测引物对，具体如下：

所述通用型检测引物对的序列如下：

VirB10-2-F：5′-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3′；

VirB10-2-R：5′-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3′；

所述布鲁氏杆菌牛种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下：

牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：

Abortus-F：5′-GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3′；

Abortus-R：5′-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3′；

猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：

Suis-F：5′-CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3′；

Suis-R：5′-ACCGGAACATGCAAATGAC-3′。

5.权利要求4所述的特异性引物在制备用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒中的应用。

6.一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成；

所述pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDNO.10所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；

所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种和猪种鉴别检测引物对；

所述通用型检测引物对的序列如下：

VirB10-2-F：5′-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3′；

VirB10-2-R：5′-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3′；

所述布鲁氏杆菌牛种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下：

牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：

Abortus-F：5′-GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3′；

Abortus-R：5′-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3′；

猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：

Suis-F：5′-CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3′；

Suis-R：5′-ACCGGAACATGCAAATGAC-3′。