CN107746893A - 沙门氏菌的ic‑lamp检测引物组及其应用 - Google Patents

沙门氏菌的ic‑lamp检测引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌的IC‑LAMP检测引物组及其应用，其包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3P；本发明检测方法采用4条LAMP特异性引物、沙门氏菌多克隆抗体、Protein A/G免疫沉淀磁珠及BstDNA聚合酶等为主要成分构成的IC‑LAMP反应液，建立的沙门氏菌环介导等温扩增快速检测方法，能够在紫外灯下通过肉眼直观的判定检测结果；该技术整合了抗体和环介导等温扩增技术的双重特异性，具有准确、快速、方便、高效、特异、灵敏且无需进行菌体的长时扩增培养、提取基因及质粒的特点，适用于进出口检疫、食品卫生检验等的现场快速检测，对于保障食品安全具有重要意义。

Description

沙门氏菌的IC-LAMP检测引物组及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于沙门氏菌检测的引物组、试剂盒和沙门氏菌的IC-LAMP检测方法。
背景技术
沙门氏菌为革兰阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。食品中存在的沙门氏菌的食源性疾病呈逐年上升趋势，给人们的健康带来很大的潜在威胁。沙门氏菌可穿入低位肠段的粘膜，出现发热不适、全身疼痛，此后患者出现持续高热、相对脉缓、肝脾肿大，外周白细胞下降、皮肤出现玫瑰疹。严重肠局部坏死和溃疡，有出血、穿孔等并发症。
由沙门氏菌在全球范围内引发的食源性疾病导致大量人员死亡，造成数十亿美元损失。一份 2003-2007 年中国细菌性食源性疾病流行病学特征分析显示，由微生物引起的食源性疾病事件中，沙门氏菌的比例为 10.3％导致的食源性疾病事件总数占到统计的1060 起食源性疾病时间的 20％以上。沙门氏菌广泛存在于食品中，大量食入，会引起严重后果。因此，快速准确地检测出沙门氏菌就显得尤为重要。
目前临床应用的沙门氏菌的检测方法包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学检测方法等，但这些方法都存在一些缺陷。传统的检测方法主要采用细菌前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤，一般需4至7天，此方法培养时间长、工作量大、实验步骤繁琐，在很多突发事件中不能及时反映准确的数据。免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低。常规 PCR 方法检测其灵敏度低，检测时间长，在检测前还需要进行菌体的富集，DNA的提取。免疫磁分离技术是将特异性抗体与一定大小的磁珠偶联，利用特异性抗体能与细胞表面抗原相结合的原理，将磁球与细胞结合，在外磁场的作用下，将磁球-细胞复合物从环境中分离出来，达到获取目标细胞的一项技术，但是单独使用该技术时只能实现分离，还需结合其他手段进行检测，而目前使用免疫磁分离技术进行分离的检测方法的灵敏度仍有待提高。
发明内容
本发明目的在于提供了一种用于检测沙门氏菌的IC-LAMP特异性引物组，它包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，各引物序列如下：
FIP:5'-GCGCGGCATCCGCATCAATATTTTGGTATGCCCGGTAAACAGAT-3'；（如SEO ID NO：1所示）
BIP:5'-GCGAACGGCGAAGCGTACTGTTTTCATCGCACCGTCAAAGGAA -3'；（如SEO ID NO：2所示）
F3: 5' -CGCGGCCCGATTTTCTCT-3'；（如SEO ID NO：3所示）
B3: 5' -GGCAATAGCGTCACCTTTG-3'；（如SEO ID NO：4所示）。
本发明另一目的是提供一种沙门氏菌的IC-LAMP检测试剂盒，其包括上述的沙门氏菌的IC-LAMP检测引物组和结合有沙门氏菌特异抗体的Protein A/G偶联磁珠。
其中结合有沙门氏菌特异抗体的Protein A/G偶联磁珠是通过抗体与Protein A/G磁珠偶联而制得；其具体方法参考Production of mono- and polyclonal antibodiesto Citrus leprosis virusC2and their application in triple antibody sandwichELISA andimmunocaptureRT-PCR diagnostic assays中方法。
本发明试剂盒还包括常规LAMP检测中所需的常规试剂（12.8 U Bst 2.0 DNAPolmerase、150nM MgSO4、40nMdNTP），还包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP、无核酸酶水。
本发明另一目的是提供了一种沙门氏菌检测的新方法，利用Protein A/G免疫沉淀磁珠与沙门氏菌的多克隆抗体偶联形成免疫磁珠去捕捉样品中的沙门氏菌，然后通过直接裂解法获得基因组，通过LAMP扩增，确认是否存在有沙门氏菌扩增产物。
所述的待测样品可以是被沙门氏菌污染的水、食品及人和动物的粪便等。
检测方法具体步骤如下：
（1）待测样品的制备，将待测样品用已经灭菌的LB液体培养基进行稀释；
（2）在待测样品中添加结合有沙门氏菌特异抗体的Protein A/G偶联磁珠，混匀后进行磁性分离，弃上清液，然后加入PBS-T溶液重悬后再进行磁性分离，重复2-3次；
（3）采用直接裂解法裂解步骤（2）中捕获菌体的基因组DNA，即在步骤（2）获得的磁珠-抗体-抗原的复合物中加入裂解液进行裂解，然后加入终止液终止反应；
（4）采用针对沙门氏菌的IC-LAMP检测引物组对获得基因组DNA进行环介导等温扩增，反应体系：12.8 U Bst 2.0 DNA Polmerase，150nM MgSO4，40nM dNTP、20pM正向内引物FIP、20pM反向内引物BIP、5pM反向外引物B3、5pM 正向外引物F3步骤（3）裂解液模板2μL，加无核酸酶水补至终体积25μL；反应条件：63℃扩增40min，80℃变性5min；
（5）扩增产物利用紫外检测系统、色素法或荧光法检测，判断是否存在沙门氏菌；例如扩增反应结束后，直接在紫外灯下观察结果；结果判定：PCR管在紫外照射下出现绿色荧光，检测结果为阳性，则说明样品中含有沙门氏菌；PCR管在紫外照射下不出现绿色荧光，检测结果为阴性，则说明样品中不含有沙门氏菌。
实验结果表明：采用本发明所公开的沙门氏菌的IC-LAMP特异性引物组制备的试剂盒在检测沙门氏菌方面IC-LAMP具有良好的积极效果。
本发明公开的用于检测沙门氏菌的试剂盒与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）本发明采用的LAMP技术具有操作简便、快速、敏感等特点，其敏感性比常规PCR高数倍以上；而且检测过程只需恒温水浴锅和便携式磁力架即可完成，不需要PCR仪等昂贵的设备，更适合于基层推广应用。此外，本发明将LAMP技术与免疫磁珠技术相结合，可以通过肉眼直接观察和判定结果，仅需40min，比传统的生化培养法节省3天，比提取基因组进行PCR方法（琼脂糖凝胶电泳）缩短3h，且不需要对菌体进行富集，提取其基因组等，使检测更为便捷、高效；
（2）基于IC-LAMP方法的敏感、特异，成本低廉，便于操作等诸多优势，本发明在一定程度上提高了我国沙门氏菌菌株的检测能力，为沙门氏菌疾病的临床实时快速诊断、动物和食品的出入境检验检疫中该菌的快速准确检测提供了新技术来源，对提高我国检验检疫机构沙门氏菌的疫情监控和快速检测水平，以及普及先进技术在基层检验检疫机构的推广应用均具有重要意义。特别对于液体、半固体、固体等特殊样品的检测，此方法解决了从液体、半固体、固体等特殊样品中菌体的获取、富集的难题，其灵敏度比利用普通检测方法如PCR、多重荧光定量PCR等方法高，耗时短。
附图说明
图1（a）为常规PCR鉴定体系的特异性检测结果，泳道1，2的反应模板为沙门氏菌的基因组，泳道3至泳道8依次为大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌基因组，泳道9为去核酸酶水作为模板的阴性对照；（b）为本发明PCR鉴定体系的灵敏度检测结果，其反应模板为质粒，泳道1-10其质粒浓度依次为109、108、107、106、105、104、103、102、101、100 copies/μL，泳道11为去核酸酶水作为模板的阴性对照；
图2（a）为常规PCR鉴定体系的特异性检测结果，泳道1，2的反应模板为沙门氏菌的裂解液，泳道3至泳道8依次为大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌的裂解液，泳道9为去核酸酶水作为模板的阴性对照；（b）为本发明PCR鉴定体系的灵敏度检测结果，其反应模板为的裂解液，泳道1-7其浓度依次为106、105、104、103、102、101、100CFU/mL，泳道8为去核酸酶水作为模板的阴性对照；
图3（a）为本发明LAMP鉴定体系的特异性检测结果，泳道1，2的反应模板为沙门氏菌的基因组，泳道3至泳道8依次为大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌基因组，泳道9为去核酸酶水作为模板的阴性对照；（b）为本发明LAMP鉴定体系的灵敏度检测结果，其反应模板为质粒，泳道1-10其浓度依次为109、108、107、106、105、104、103、102、101、100 copies/μL，泳道11为去核酸酶水作为模板的阴性对照。
图4（a）为本发明LAMP鉴定体系的菌液特异性检测结果，泳道1，2的反应模板为沙门氏菌的裂解液，泳道3至泳道8依次为大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌的裂解液，泳道9为去核酸酶水作为模板的阴性对照；（b）为本发明IC-LAMP鉴定体系的菌液灵敏度检测结果，其反应模板为菌的裂解液，泳道1-7其浓度依次为106、105、104、103、102、101、100 CFU/mL，泳道8为去核酸酶水作为模板的阴性对照。
图5（a）为本发明IC-LAMP鉴定体系的特异性检测结果，泳道1，2的反应模板为利用免疫磁珠捕获含有沙门氏菌的混合菌（志贺氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌）的裂解液，泳道3-7为利用免疫磁珠捕获混合菌种大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌的裂解液，泳道8为去核酸酶水作为模板的阴性对照；。图5（b）为本发明IC-LAMP鉴定体系的灵敏度检测结果，其反应模板为污染样品的裂解液，用 1-6是用免疫磁珠捕获污染样品的裂解液，菌浓度分是5×105，5 × 104，5× 103，5 × 102，5×101，5 × 100 CFU/ml，泳道7为去核酸酶水作为模板的阴性对照；图5（c）为本发明IC-LAMP鉴定体系在紫外照射下特异性检测结果；图5（d）为本发明IC-LAMP鉴定体系在紫外照射下灵敏度检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1：特异性靶基因的引物设计
1、本地BLAST分析
从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载的沙门氏菌invA基因，对本地的核酸数据库进行本地BLAST检索，获取得到菌种各序列片段与数据库比对结果。
2、引物设计
本试验以基因名invA，Genbank登陆号为CP022491.1（1643280..1643559）的序列设计特异引物；针对invA基因的3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区6个不同的位点设计4种引物，包括一对内引物（FIP、BIP）和一对外引物(F3、B3)，该引物用于LAMP技术检测，其中外引物还用作PCR反应的上、下游引物，用于沙门氏菌的鉴定。
实施例2：LAMP检测方法的建立
1、DNA的提取
（1）用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
1）取沙门氏菌培养液5mL，12000rpm离心1分钟，尽量吸净上清；
2）向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37℃温浴30分钟；每隔10分钟颠倒混匀数次；12000rpm离心2分钟，尽量吸净上清；
3）向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮；
4）向管中加入6μLRNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟；
5）向管中加入10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀；
6）加入25μL裂解缓冲液S，颠倒混匀；
7）加入250μL缓冲液B，振荡10秒，70℃放置10分钟。12,000rpm离心1分钟，取上清放入一新管中，弃去沉淀；
8）加入250μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠；
9）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
10）向吸附柱中加入500μL缓冲液C，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
11）向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
12）向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12000rpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；然后12000rpm离心2分钟，将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
13）将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
（2）使用直接裂解液，其配方为：
溶液A：125mM NaOH、1mM EDTA、0.1％ Tween 20；
溶液B：125mM HCl、10mM TrisHCl；
取沙门氏菌样加入10μL 溶液A 65℃孵育10min，加入10μL 溶液B，混匀即可。
2、阳性质粒载体构建及获得
（1）靶序列PCR扩增
以沙门氏菌的基因组DNA为模板，对特异基因进行PCR扩增，将其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。
（2）目的产物的回收
从脂糖凝胶中切下目的片段，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
1）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量；
2）向胶块中加入2倍体积溶胶液，55℃水浴10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
4）向吸附柱中加入700µL漂洗液W2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
5）向吸附柱中加入50µL漂洗液W2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
6）将吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液；
7）将室温吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。将吸附柱放入到一个干净离心管，向吸附柱中间悬空滴加30µL的洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟；12,000rpm离心2分钟，收集DNA溶液。
（3）连接、转化及筛选
1）大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
①挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mL LB培养基中，37℃振荡2小时；当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物；
②将细菌转移到一个50mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10分钟，使培养物冷却；
③于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出培养液，并将管倒置l分钟以使残留的培养基流尽；
④每50mL初始培养液用30mL预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重悬细胞沉淀；
⑤于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出上清液，并将管倒置l 分钟以使残留的液体流尽；
⑥每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀，分装后备用。
2）连接到PMD19-T Simple
①在微量离心管中加入1µL Takara pMD19-T simple载体、4μL目的基因基因PCR产物及5µL的连接酶缓冲混合物；
②16℃反应过夜
3）转化DH5α
①全量(10µL)加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟；
②42℃加热90秒后，再在冰中放置1分钟；
③加入37℃温浴过的LB培养基890µL，37℃缓慢振荡培养60分钟；
④取200μL涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养16h以形成单菌落；
（4）阳性克隆的筛选
挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，以M13F 和M13R为引物进行菌落PCR扩增。对扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳后紫外观察，将经PCR验证正确的阳性克隆送昆明硕擎生物科技有限公司进行测序。
（5）阳性质粒提取
挑取上述单菌落于LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，进行PCR扩增；扩增引物F3（CGCGGCCCGATTTTCTCT）、B3（GGCAATAGCGTCACCTTTG），扩增条件：95℃，5min；95℃，30s；59℃，30s；72℃，30s；72℃，7min；16℃，∞；将经PCR确证的阳性克隆，接种于LB液体培养基，37℃，160 rpm培养过夜。取每个菌株过夜培养液5mL，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司小量质粒提取试剂盒进行质粒抽提，具体操作步骤如下：
1）取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清；
2）向留有菌体沉淀的离心管中加入250µL溶液1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
3）向离心管中加入250µL溶液2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；
4）向离心管中加入350µL溶液3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中，12,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
5）向吸附柱中加入700µL漂洗液W2，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
6）向吸附柱中加入500µL漂洗液W2，12,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
7）将吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
8）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60µL洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。
（6）阳性质粒浓度测定
打开Thermo Scientific BioMate 3S紫外分光光度计，预热15分钟；选定Mode方式为dsDNA，将比色杯用超纯水反复洗几次后加入100µL TE缓冲液调零；将TE缓冲液完全吸出，然后加入待测样品(1μL样品加入49μL TE缓冲液)，选定稀释倍数为50倍进行测定，读取质粒DNA浓度。
（7）质粒数目换算及梯度稀释
阳性质粒测完浓度后，分别根据其所测浓度换算成质粒数目；质粒数目换算公式为 (注：X为质粒浓度ng/μL；Y为目的产物碱基对数；NA为阿伏伽德罗常数；2692为载体碱基对数；660为碱基平均分子量)。取已知浓度的质粒进行10倍梯度稀释到底。
3、菌落计数
（1）菌液的培养
配制LB固体培养基，用高压蒸汽灭菌锅灭菌121℃，20min。将在-80℃冰箱中保藏的沙门氏菌种接种于新鲜的LB液体培养基，37℃震荡培养12小时。
（2）稀释平板计数法计数及其步骤
1）熔化培养基；
2）倒平皿；
3）梯度稀释法稀释原菌样品；
4）涂平皿：
选取1/106，1/107，1/108三个稀释度计数，每皿取菌液0.1ml，用玻璃刮铲涂布均匀，每个稀释度做一个重复；
5）37℃倒置培养1天；
6）计数：
每1mL原菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU=（同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数）/原菌样品体积（mL）。
4、建立PCR鉴定体系
（1）PCR条件优化
对退火温度进行优化。退火温度为6个梯度，51、53、55、57、59、61℃.具体反应体系为：12.5 μL 2×TSINGKE Master Mix (包含DNA polymerase 1 U,1.5 mM MgCl2,200 μMdNTP)，10 μM的上下游引物，50 ng基因组DNA，无菌水补至25 μL。
（2）在PCR仪中按以下程序扩增：
95℃预变性5 min；95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30s，28个循环，最后72℃延伸7min。
（3）沙门氏菌基因组特异性检测
沙门氏菌菌株2株，大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌，使用试剂盒提取该7株菌的基因组，利用最优的反应条件进行特异性检测。
结果：图1（a）显示所设计的引物具有良好特异性，只能特异性的扩增沙门氏菌，而大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌菌不能被扩增出来。
（4）沙门氏菌阳性质粒灵敏度
用上述稀释好的质粒作为模板进行PCR扩增，其反应体系为：12.5 μL 2×TSINGKEMaster Mix (包含DNA polymerase 1 U,1.5 mM MgCl2,200 μM dNTP)，10 μM的上下游引物，2 μL阳性质粒，无菌水补至25 μL。PCR反应过程为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
结果：图1（b）显示所设计的引物具有良好灵敏度，能检测出100 copies/μL的阳性质粒。
（5）沙门氏菌菌液特异性检测
将培养好的沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌。使用直接裂解液获得基因组作为模板进行PCR扩增，其反应体系为：12.5 μL 2×TSINGKE Master Mix (包含DNA polymerase 1 U,1.5 mM MgCl2,200 μMdNTP)，10 μM的上下游引物，50 ng基因组DNA，无菌水补至25 μL。PCR反应过程为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
结果：图2（a）显示所设计的引物能特异性的扩增直接裂解获得沙门氏基因组，而不能扩增大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌。
（6）沙门氏菌菌液灵敏度检测
利用计数后的菌液进行10倍梯度稀释，使用直接裂解液获得基因组作为模板进行PCR扩增，其反应体系为：12.5 μL 2×TSINGKE Master Mix (包含DNA polymerase 1 U,1.5mM MgCl2,200 μM dNTP)，10 μM的上下游引物，50 ng基因组DNA，无菌水补至25 μL。PCR反应过程为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
结果：图2（b）显示所设计的引物能良好灵敏度，能检测出100CFU/mL，并且利用直接裂解获得基因组具有简便、快捷，无需试剂盒进行基因组的提取。
5、建立LAMP鉴定体系
（1）LAMP反应
反应体系：12.8 U Bst 2.0 DNA Polmerase，150 nM MgSO4，40 nM dNTP mixture， 20pM FIP and BIP primers, 5 pM F3 and B3 primers, 1 μL of Bst DNA polymerase，2.5 μL10×Bio Labs Buffer，100 ng基因组DNA，最后，加去核酸酶水补足25μL。该反应使用PCR仪，其过程为：63℃温育40min，80℃变性5min。
（2）基因组特异性检测
沙门氏菌菌株2株，大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌，使用试剂盒提取该7株菌的基因组，利用最优的反应条件进行特异性检测。
结果：图3（a）显示环介导等温扩增所设计的一对外引物（F3、B3）和一对内引物（FIP、BIP）能特异性的扩增沙门氏基因组，而不能扩增大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌。
（3）阳性质粒灵敏度检测
将构建好的阳性质粒用庄盟小量质粒提取试剂盒进行质粒的提取，并计算浓度进行10倍梯度稀释，取2µL作为模板进行LAMP扩增反应。
结果：图3（b）显示环介导等温扩增所设计的一对外引物（F3、B3）和一对内引物（FIP、BIP）具有能良好灵敏度，能检测出100 copies/μL的阳性质粒。利用LAMP技术检测沙门氏菌仅需40min，比PCR检测技术更简单、方便、快捷。
（4）沙门氏菌菌液特异性检测
将培养好的沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌。使用直接裂解液获得基因组作为模板进行LAMP扩增，其反应体系为:12.8 U Bst 2.0 DNA Polmerase，150 nM MgSO4，40 nM dNTP mixture， 20 pM FIP andBIP primers, 5 pM F3 and B3 primers, 1 μL of Bst DNA polymerase，2.5 μL10×BioLabs Buffer，100 ng基因组DNA，最后，加去核酸酶水补足25μL。该反应使用PCR仪，其过程为：63℃温育40min，80℃变性5min。
结果：图4（a）显示所设计的LAMP引物能特异性的扩增直接裂解获得沙门氏基因组，而不能扩增大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌。
（5）沙门氏菌菌液灵敏度检测
利用计数后的菌液进行10倍梯度稀释，使用直接裂解液获得基因组作为模板进行PCR扩增，其反应体系为：12.8 U Bst 2.0 DNA Polmerase，150 nM MgSO4，40 nM dNTPmixture， 20 pM FIP and BIP primers, 5 pM F3 and B3 primers, 1 μL of Bst DNApolymerase，2.5 μL10×Bio Labs Buffer，100 ng基因组DNA，最后，加去核酸酶水补足25μL。该反应使用PCR仪，其过程为：63℃温育40min，80℃变性5min。
结果：图4（b）显示LAMP所设计的引物能良好灵敏度，能检测出100CFU/mL的沙门氏菌，并且利用LAMP检测方法配合直接裂解获得基因组具有简便、快捷的检测出沙门氏菌。
6、建立IC-LAMP鉴定体系
（1）沙门氏菌的培养
取出冻存的菌液进行LB平板划线，于37℃恒温培养箱培养过夜。第二天挑取单克隆于LB液体培养基中37℃，180转/小时培养4-5小时。
（2）沙门氏菌多克隆抗体的制备
将培养好的菌液稀释到108CFU/mL，并进行灭活，取100µL与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀免疫BAB/c小鼠；第一次免疫后14天进行第二次免疫，取100µL与等体积的弗氏不完全佐剂混合均匀免疫BAB/c小鼠；第三，四次免疫与第二次免疫相同；第四次免疫4天后摘眼球取血分离多抗血清。
（3）利用免疫磁珠捕获抗原
（a）抗原的准备：分别用巴氏灭菌的脱脂奶粉稀释菌液至终浓度5 × 105、 5× 104、5 × 103、5 × 102、5×101和5×100 CFU/mL。
（b）磁珠预处理：将免疫沉淀磁珠（Protein A/G偶联磁珠）漩涡振荡1min，使磁珠充分振荡重悬；取25~50μL（相当于25~50μg）磁珠悬液置于1.5mLEP管中；加入200μL结合缓冲液（binding buffer；50 mmol/LTris、150 mmol/LNaCl、0.1%-0.5% Tween20、pH 7.5）洗涤，进行磁性分离（将EP管放置于磁力架上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；该操作描述以下省略），弃上清液，从磁性分离器上取下EP管，重复洗涤一次，最后加入200μL bindingbuffer重悬磁珠以备用。
（c）抗体结合反应：将步骤（b）预处理的磁珠悬液进行磁性分离加入300µL的沙门氏菌抗体(1:1000)，于室温100转/分钟反应2小时。然后进行磁性分离，加入1mL的PBS-T（PBS-T; NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 10mmol/L, KH2PO4 2mmol/L, tween-20 22.5mmol/L pH 7.4）重悬后磁性分离（此步骤重复3次）。
（d）抗原沉淀反应：将步骤（a）抗原加入步骤（c）的结合有沙门氏菌特异抗体的Protein A/G偶联磁珠中，于室温100转/分钟反应0.5小时；然后进行磁性分离，加入1mL的PBS-T重悬后磁性分离（此步骤重复3次）。
（e）抗原的裂解：将步骤（d）中的磁珠-抗体-抗原的复合物中加入10μL的A液（125mM NaOH、1mM EDTA、0.1％Tween 20)于65℃反应10分钟，最后加入10μL溶液B终止反应。
（4）特异性检测
分别用免疫磁珠（结合有沙门氏菌特异抗体的Protein A/G偶联磁珠）捕获含有沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌混合菌液及不含有沙门氏菌的混合菌液，捕获完成后进行直接裂解；各取2μL作为模板进行IC-LAMP反应。在金属浴中的反应体系为：12.8 U Bst 2.0 DNA Polmerase，150nM MgSO4，40nM dNTP、20pM正向内引物FIP、20pM反向内引物BIP、5pM反向外引物B3、5pM 正向外引物F3步骤（3）裂解液模板2μL，加无核酸酶水补至终体积25μL；反应条件：63℃扩增40min，80℃变性5min，终止反应。
结果：混合菌中（含有沙门氏菌）均能被IC-LAMP检测出来，PCR管在紫外照射下出现绿色荧光，检测结果为阳性，其电泳条带如图5（a）泳道1，2，紫外照射结果如图5（c）管1，2，；而混合菌中（不含有沙门氏菌）均不能被IC-LAMP检测出来，PCR管在紫外照射下不出现绿色荧光，检测结果为阴性，其电泳条带如图5（a）3、4、5、6、7所示，紫外照射结果如电泳条带如图5（c）管3、4、5、6、7所示。
（5）灵敏度检测
取2μL步骤（3）中裂解液进行LAMP反应。在金属浴的反应体系为：12.8 U Bst 2.0 DNAPolmerase，150nM MgSO4，40nM dNTP、20pM正向内引物FIP、20pM反向内引物BIP、5pM反向外引物B3、5pM 正向外引物F3步骤（3）裂解液模板2μL，加无核酸酶水补至终体积25μL；反应条件：63℃扩增40min，80℃变性5min。
结果：利用IC-LAMP检测方法，可将污染样本中沙门氏菌快速准确的检测出来，且检测下限达到5 × 100 CFU/mL， PCR管在紫外照射下出现绿色荧光，检测结果为阳性，其电泳结果如图5（b），泳道1、2、3、4、5、6分别表示利用IC-LAMP检测含有沙门氏菌的样本（样本菌浓度依次为5×105，5 × 104，5 × 103，5 × 102，5×101，5 × 100 CFU/mL），其紫外照射结果如图5（d）管1、2、3、4、5、6分别表示利用IC-LAMP检测含有沙门氏菌的样本（样本菌浓度依次为5×105，5 × 104，5 × 103，5 × 102，5×101，5 × 100 CFU/mL）。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 沙门氏菌的IC-LAMP检测引物组及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
gcgcggcatc cgcatcaata ttttggtatg cccggtaaac agat 44
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gcgaacggcg aagcgtactg ttttcatcgc accgtcaaag gaa 43
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
cgcggcccga ttttctct 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
ggcaatagcg tcacctttg 19

Claims (6)

1.一种沙门氏菌的IC-LAMP检测引物组，其特征在于：包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，各引物序列如下：
正向内引物FIP：
FIP:5'-GCGCGGCATCCGCATCAATATTTTGGTATGCCCGGTAAACAGAT-3'；
反向内引物BIP：
BIP:5'-GCGAACGGCGAAGCGTACTGTTTTCATCGCACCGTCAAAGGAA-3'；
正向外引物F3：
F3: 5'-CGCGGCCCGATTTTCTCT-3'；
反向外引物B3：
B3: 5' -GGCAATAGCGTCACCTTTG-3'。
2.一种沙门氏菌的IC-LAMP检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的沙门氏菌的IC-LAMP检测引物组和结合有沙门氏菌特异抗体的Protein A/G偶联磁珠。
3.根据权利要求2所述的沙门氏菌的IC-LAMP检测试剂盒，其特征在于：IC-LAMP检测试剂盒还包括12.8 U Bst 2.0 DNA Polmerase、150nM MgSO4、40nMdNTP、无核酸酶水。
4.权利要求2所述沙门氏菌的IC-LAMP检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）待测样品的制备，将待测样品用已经灭菌的LB液体培养基进行稀释；
（2）在待测样品中添加结合有沙门氏菌特异抗体的Protein A/G偶联磁珠，混匀后进行磁性分离，弃上清液，然后加入PBS-T溶液重悬后再进行磁性分离，重复2-3次；
（3）采用直接裂解法裂解步骤（2）中捕获菌体的基因组DNA，即在步骤（2）获得的磁珠-抗体-抗原的复合物中加入裂解液进行裂解，然后加入终止液终止反应；
（4）采用针对沙门氏菌的IC-LAMP检测引物组对获得基因组DNA进行环介导等温扩增，反应体系：12.8 U Bst 2.0 DNA Polmerase、150nM MgSO4、40nM dNTP、20pM正向内引物FIP、20pM反向内引物BIP、5pM反向外引物B3、5pM 正向外引物F3，模板2μL，加无核酸酶水补至终体积25μL；反应条件：63℃扩增40min，80℃变性5min；
（5）扩增产物利用紫外检测系统、色素法或荧光法检测，判断是否存在沙门氏菌。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：裂解液为含有125mmol/LNaOH、1mmol/L EDTA、0.1%Tween 20的溶液。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：终止液为含有125mmol/LHCl、10mmol/L TrisHCl的溶液。
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