CN109136397A - 一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其包括步骤：S1、采集袭击现场样本并处理；S2、对处理后样本利用布鲁氏菌现场检测试剂盒进行实时荧光定量PCR检验，其中，试剂盒中包括阴性对照、阳性对照和布鲁氏菌属特异性上下游引物，将处理后样本、阴性对照及阳性对照分别作为底物在相同条件下进行同样的实时荧光定量PCR处理，对待测样品的检测结果进行分析，从而判断处理后样本是否带有布鲁氏菌。本发明建立的布鲁氏菌现场基因检测方法可直接使用样本作为PCR检测底物，适用于快速从各种相态的环境样本中筛选存在布鲁氏菌基因组DNA的样品。为消防部队在生物恐怖袭击现场的生物性危害快速识别提供了解决办法。

Description

一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法。

背景技术

布鲁氏菌可以感染人和牲畜造成布鲁氏菌病，在我国布鲁氏菌病属于乙类传染病，世界卫生组织将其定位B类传染病，传染性强，对人类伤害大，由于布病反复发转为慢性后，会留下后遗症导致终身残疾，且会传染给下一代，至今全世界有170余个国家和地区报告过疫情。我国虽然强制干预，布病疫情依然以目前两位数的百分比速率增长，对我国经济建设，人民健康，国家安全带来了严重威胁。

随着我国消防队应急管理职能的不断拓展，消防部队经常参与各类大型活动的安保以及国家反恐、处突的行动中。而生物恐怖由来已久，给全世界人民带来了巨大伤害，反生物武器、反生物恐怖是国家安全的重要组成部分。

但是，在我国国内尚没有针对消防部队等处置生物恐怖事件所建立的生物侦检方法，现在所使用的仪器和材料需要全部从国外进口，不仅操作复杂操作难度大，检测费用高昂。

因此，现有技术有待于进一步发展。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，以实现对布鲁氏菌生物恐怖战剂简便、高效、灵敏、快速、稳定的检测，其技术方案如下。

一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，包括以下步骤：

S1、采集袭击现场的样本并进行处理；

S2、对处理后样本利用布鲁氏菌现场检测试剂盒进行实时荧光定量PCR检验，其中，布鲁氏菌现场检测试剂盒中包括阴性对照、阳性对照和布鲁氏菌属特异性上下游引物，将处理后样本、阴性对照及阳性对照分别作为底物在相同条件下进行同样的实时荧光定量PCR处理，对待测样品的检测结果进行分析，从而判断处理后样本是否带有布鲁氏菌。

所述的布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，袭击现场采集的样本为擦拭样本、土壤样本或水样本；

当袭击现场采集的样本为擦拭样本时，样本处理步骤为：

1)将带有擦拭样本的药棉棒头插入吸附柱，用移液枪向每个有棉棒的吸附柱中加入200μL的磷酸缓冲液，关闭收集管；

2)将收集管离心，8000rpm，离心3min后关闭收集管；

3)将收集管调温振荡，温度65℃，600rpm，震荡10min；

4)将收集管调温振荡，设置温度15℃，1400rpm后冷却至40℃以下用于检测；

当袭击现场采集的样本为土壤样本时，样本处理步骤为：

1)打开采样瓶，用勺子取大约1g土壤样本于离心管中；

2)使用移液枪吸取1mL超纯水到离心管中，将离心管离心，3000rpm离心5min，吸取上清液到新的离心管中；

3)再次离心，10000rpm离心30s吸取下层液体用于检测；

当袭击现场采集的样本为水样本时，样本处理步骤为：

1)打开采样瓶，使用移液枪吸取1mL样本到一个离心管中；

2)将离心管离心，3000rpm离心5min，取上清液转移到新的离心管中；

3)将新离心管10000rpm离心30s取最下层液体用于检测。

3、根据权利要求1所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，布鲁氏菌属特异性上下游引物的序列如下：

上游引物：qBSF1:5-GCCGATAAATCTTTCCCCCG-3，如SEQ ID NO：2所示；

下游引物：qBSR2:5-GCGGCAGGCTTAACACATGC-3，如SEQ ID NO：3所示。

所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，布鲁氏菌现场检测试剂盒中还包括实时荧光定量PCR反应液Sybr Green pPCR mix，布鲁氏菌现场检测试剂盒中阴性对照为超纯水。

所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，实时荧光定量PCR采用以下20μL反应体系：Sybr Green qPCR mix 10μL，布鲁氏菌属特异性上下游引物各0.8μL，上下游引物浓度均为10μmol·L-1，超纯水7.4μL，底物1μL。

所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃条件下预变性5min；94℃变性10s，退火延伸59℃，30s，扩增40个循环；扩增阶段温度变化速率20℃/s；每次在59℃末尾收集荧光信号。

所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，所述对待测样品的检测结果进行以下分析：通过扩增阶段荧光信号变化曲线图获得Ct值，通过Ct值对检测结果进行判断：

若样品的Ct值≤28，检测结果为阳性，样品中含有布鲁氏菌；

若样品的Ct值在28～30间，则对样品进行复检一次，若Ct值仍为28～30间，则检测结果为阴性；

若样品的Ct值为Negative或＞30，样品中布鲁氏菌低于检测限度，检测结果为阴性。

所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，实时荧光定量PCR检验步骤具体为：

1)确定待测样本、阳性对照、阴性对照，每组样本至少进行2个复孔的重复，确定进行实时荧光定量检测的孔数为n；用移液枪分别吸取n×10μL Sybr green qPCR mix和n×0.8μL的布鲁氏菌属特异性上下游引物和n×7.4μL的超纯水至带有2mL容量的离心管中；

2)将离心管震荡混匀后，选择3000rmp，离心30s后，静置两分钟；

3)取必要量的毛细管装入冷却的Light Cycler适配块中，用移液枪将19μL的混合液移至每个毛细管中；

4)用移液枪分别将1μL阳性对照、阴性对照、待测样本移至每个毛细管中，并对每个毛细管进行加盖；

5)将装有毛细管的适配器放入离心机，3000rpm，离心15s；

6)取出毛细管放入定量仪转子中，将转子放入荧光定量仪进行检测。

所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，阳性对照的制备：利用扩增引物对特异基因序列进行基因扩增，并将扩增得到的特异基因序列进行回收，将回收产物连接到克隆载体pGSI-T后转化大肠杆菌Top10，并在氨苄青霉素钠平板培养基上筛选阳性克隆菌株，再对经过酶切鉴定和测序鉴定得到的阳性克隆进行质粒提取，作为阳性对照。其中，通过BLAST和DNAMAN对比分析各种布鲁氏菌16S核糖体RNA序列，利用MEGA软件的邻接法进行系统进化树构建，分析基因相似性，选取保守型最高作为特异基因序列。

所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，所述特异基因序列如SEQID NO：1所示，扩增引物上游引物B16SF：

5-GGCACATACGGTATTAGCACAAG-3，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

下游引物B16SR：5-GGCTTAACACATGCAAGTCGAG-3，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

有益效果：

本发明建立起布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，可直接使用样本作为PCR检测底物，省去了核酸提取步骤，适用于快速从各种相态的环境样本中筛选存在布鲁氏菌基因组DNA的样品。能够高效、可靠地检测布鲁氏菌，且具有良好的稳定性和特异性，为消防部队在生物恐怖袭击现场的生物性危害快速识别提供了解决办法。

附图说明

图1为基于16S核糖体RNA的序列信息利用MEGA6.06软件的邻接法构建的系统进化树。

图2为利用提取到重组质粒进行PCR扩增后凝胶鉴定结果，其中1:DNA Ladder；2、3:样本条带。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其中，包括以下步骤：

S1、采集袭击现场的样本并进行处理。

根据采集而来的不同类型的样本，需要对样本进行不同类型的处理，以得到能够用于检测的样本。当采集的样本为擦拭样本时，样本处理步骤为：

1)将带有擦拭样本的药棉棒头插入吸附柱，用移液枪向每个有棉棒的吸附柱中加入200μL的磷酸缓冲液，关闭收集管；

2)将收集管离心，8000rpm，离心3min后关闭收集管；

3)将收集管调温振荡，温度65℃，600rpm，震荡10min；

4)将收集管调温振荡，设置温度15℃，1400rpm后冷却至40℃以下用于检测；

5)在间歇时间对手套箱、容器支架、离心机、工作场地进行短时间消毒，湿处用纸巾擦干。

当采集的样本为土壤样本时，样本处理步骤为：

1)打开采样瓶，用勺子取大约1g土壤样本于离心管中；

2)使用移液枪吸取1mL超纯水到离心管中，将离心管离心，3000rpm离心5min，吸取上清液到新的离心管中；

3)再次离心，10000rpm离心30s吸取下层液体用于检测；

4)在间歇时间对手套箱、容器支架、离心机、工作场地进行短时间消毒，湿处用纸巾擦干。

当采集的样本为水样本时，样本处理步骤为：

1)打开采样瓶，使用移液枪吸取1mL样本到一个离心管中；

2)将离心管离心，3000rpm离心5min，取上清液转移到新的离心管中；

3)将新离心管10000rpm离心30s取最下层液体用于检测；

4)在间歇时间对手套箱、容器支架、离心机、工作场地进行短时间消毒，湿处用纸巾擦干。

本方案直接使用样本作为PCR检测底物，省去了核酸的提取步骤，适用于快速从各种相态的环境样本中筛选存在布鲁氏菌基因组DNA的样品。

S2、对处理后样本利用布鲁氏菌现场检测试剂盒进行实时荧光定量PCR检验，其中，布鲁氏菌现场检测试剂盒中包括阴性对照、阳性对照和布鲁氏菌属特异性上下游引物，将处理后样本、阴性对照及阳性对照分别作为底物在相同条件下进行同样的荧光定量PCR处理，对待测样品的检测结果进行分析，从而判断处理后样本是否带有布鲁氏菌。

具体的，布鲁氏菌现场检测试剂盒中还包括PCR反应液Sybr Green pPCR mix，布鲁氏菌现场检测试剂盒中阴性对照为超纯水。布鲁氏菌现场检测试剂盒为满足消防部队在生物恐怖袭击现场对病原菌快速鉴别的需要而制备。该试剂盒使用的实时荧光定量PCR方法以其敏感、快速、特异的特点符合消防部队生物恐怖战剂现场检测的要求。并且检测仪器和环境与消防部队所配备的NBC侦检车相适应，具备检测的实施的条件。试剂盒具体特点如下：

(1)快速：本试剂盒使用实时荧光定量PCR检测方法并将菌液作为底物直接检测，不仅与细菌学的布鲁氏菌分离培养方法相比可将检测时间大大缩短，并且免去了基因纯化提取所需的时间，将检验时间缩短为1～2h。

(2)特异：由于PCR反应引物的特异性，整个检测只能由布鲁氏菌属细菌引发。

(3)操作简单：本试剂盒组装考虑尽量简化操作流程，经过短期培训，检测者就可以完成该项工作。

(4)应用范围广、取样及样品处理方便：本系列试剂盒可用于多种相态样本(液体、气体、气溶胶等)中布鲁氏菌DNA的检测，样本处理简单快速。

实时荧光定量PCR检验步骤具体为：

1)确定待测样本、阳性对照、阴性对照，每组样本至少进行2个复孔的重复，确定进行实时荧光定量检测的孔数为n；用移液枪分别吸取n×10μL Sybr green qPCR mix和n×0.8μL的布鲁氏菌属特异性上下游引物和n×7.4μL的超纯水至带有2mL容量的离心管中；

2)将离心管震荡混匀后，选择3000rmp，离心30s后，静置两分钟；

3)取必要量的毛细管装入冷却的Light Cycler适配块中，用移液枪将19μL的混合液移至每个毛细管中；

4)用移液枪分别将1μL阳性对照、阴性对照、待测样本移至每个毛细管中，并对每个毛细管进行加盖；

5)将装有毛细管的适配器放入离心机，3000rpm，离心15s；

6)取出毛细管放入定量仪转子中，将转子放入荧光定量仪进行检测。将装有毛细管的转子放入PCR仪之后，操作计算机首先打开程序数据库EXOR2，得到确认运行的弹窗后打开检测软件LightCycler Software4，计算机检测到设备后，运行自检程序。自检通过后，可以开始进行检测。检测可以使用机器内储存的反应参数，也可以现场设置。设置过程按照不同阶段进行添加，每个阶段添加相应的反应条件，下方可以显示所设置的任务中温度随时间变化的情况

其中，实时荧光定量PCR采用以下20μL反应体系：Sybr Green qPCR mix 10μL，上下游引物各0.8μL，布鲁氏菌属特异性上下游引物浓度均为10μmol·L^-1，超纯水7.4μL，底物1μL。

实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃条件下预变性5min；94℃变性10s，退火延伸59℃，30s，扩增40个循环；扩增阶段温度变化速率20℃/s；每次在59℃末尾收集荧光信号。

按照步骤进行实时荧光定量PCR检测之后，得到检测图和Ct值，根据试剂盒上Ct值的说明得到检测结果。对待测样品的检测结果进行以下分析：通过扩增阶段荧光信号变化曲线图获得Ct值，通过Ct值对检测结果进行判断：

若样品的Ct值≤28，检测结果为阳性，样品中含有布鲁氏菌；若样品的Ct值在28～30间，则对样品进行复检一次，若Ct值仍为28～30间，则检测结果为阴性；若样品的Ct值为Negative或＞30，样品中布鲁氏菌低于检测限度，检测结果为阴性。

进一步的，阳性对照按照如下方法制备得到：

布鲁氏菌保守基因片段的获取：在从NCBI核酸数据库中获得的布鲁氏菌16S核糖体RNA的DNA序列信息的基础上，通过基因序列分析，选取特异基因序列作为布鲁氏菌保守基因片段，并人工合成所述的特异基因序列。

其中，所述特异基因序列如SEQ ID NO：1所示。所述基因序列分析方法为：通过BLAST和DNAMAN对比分析各种布鲁氏菌16S核糖体RNA序列，利用MEGA软件的邻接法构建如图1所示的系统进化树，并分析基因相似性，由进化树验证可知，所选取的基因序列与布鲁氏菌属生物基因有着极高的亲缘关系，与其他菌基因亲缘关系不高。因而有利于有效的将布鲁氏菌与其他细菌相分离，也有利于荧光定量PCR检测的应用。由此选取保守型最高的所述特异基因序列。用于检测的特异性目的片段16SrDNA扩增片段在布鲁氏菌属DNA中高度保守，且长度210bp，可以有效的将布鲁氏菌与其他细菌相分离，有利于荧光定量PCR检测的应用。

方法建立过程中所用到试剂来源：Sybr green qPCR mix、Taq PCR MasterMix、细菌基因组DNA快速提取试剂盒均购自北京艾德莱生物有限公司；D2000DNA Ladder购自biosharp公司，琼脂糖购自Biowest公司；引物的合成及纯化、布鲁氏菌基因的提取导入由中美泰和生物技术(北京)公司完成。其他试剂为国产分析纯试剂或其配置而成。

引物的设计：针对上述特异基因序列设计扩增引物和检测引物，扩增引物上游引物B16SF和扩增引物下游引物B16SR。用Primer Premier 5.0设计上下游一对引物。引物序列及相关参数如表1。具体，检测引物上游引物qBSF1序列如SEQ ID NO：2所示，检测引物下游引物qBSF1序列如SEQ ID NO：3所示扩增引物上游引物B16SF序列如SEQ ID NO：4所示，下游引物B16SR的序列如SEQ ID NO：5所示。

表1引物序列及参数

引物	序列及参数	碱基数	Tm值
				B16SF	GGCACATACGGTATTAGCACAAG	23	56.6
B16SR	GGCTTAACACATGCAAGTCGAG	22	56.4
				qBSF1	GCCGATAAATCTTTCCCCCG	20	60.8
qBSR2	GCGGCAGGCTTAACACATG	19	62.4

利用上述扩增引物对对特异基因序列进行基因扩增，并将扩增得到的特异基因序列进行回收，将回收产物连接到克隆载体pGSI-T后转化大肠杆菌Top10，在含有50mg·L^-1氨苄青霉素钠(Amp)LB平板上筛选阳性克隆菌株，再对经过酶切鉴定和测序鉴定得到的阳性克隆进行质粒提取，所得质粒为阳性对照。进一步的，阳性菌的培养主要包括

1、培养基的制备

培养导入了重组质粒的大肠杆菌需要制备LB培养基。使用电子天平称取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g于1L容量的锥形瓶中，加入500mL双蒸水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀。然后用1mol·L^-1的NaOH溶液和1mol·L^-1HCl调培养基pH至7.4左右，定容至1L。固体培养基需在上述基础上添加10g琼脂，且加入前需要将培养基水浴加热。

培养基配置完成后分装在50mL容量锥形瓶中，容量超过瓶底3cm左右。依次在锥形瓶口扎好封口膜，用皮筋捆扎锥形瓶口。用记号笔注明培养基名称、配制日期。完成后将所有锥形瓶连同实验将使用到的耗材放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌后的培养基可直接使用或保存。

2、阳性菌的接种和保存

首先打开操作台光照和通风，使用沾有75％乙醇的棉球擦拭操作台。后打开紫外杀菌30min。操作台杀菌后，带上手套、口罩，接种工作在操作台中完成。取出保存的锥形瓶，打开锥形瓶后，用酒精灯均匀灼烧瓶口，使用移液枪移取3％～5％的氨苄青霉素于培养基中，其中固体培养基需要先加热溶解。由于重组大肠杆菌中加入了抗氨苄青霉素的抗性基因所以能够在其中生存。取实验室储备的大肠杆菌冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管，使用移液枪吸取5％的大肠杆菌溶液于锥形瓶中。再次扎好封口膜，放入恒温摇床之中，设置恒温37℃，1200转/分钟，摇匀12h，使菌液在培养基中生长。

摇匀结束后观察菌液，若产生明显浑浊，则菌体生长良好，将锥形瓶放入冰箱中4℃短期保存。

下次使用时将菌液从冰箱中取出，取样1mL分装在离心管中。放入恒温摇床之中，设置37℃，1200转/分钟，摇匀12h后即可用于实验。若需要长期保存，在接种菌体后的培养基中加入10％的甘油，充分摇匀后置于-20℃冻存。

重组质粒提取步骤具体为：

根据Aidlab高纯质粒小量快速提取试剂盒的操作步骤提取质粒，作为后续实验的阳性标准品。

(1)取过夜培养的重组大肠杆菌菌液2mL于离心管中，设置离心条件12000rpm离心30s。离心结束后尽可能倒干净上清，收集菌体。弃上清后，可以在同一个管内加入更多菌液，重复此步骤，直到管底收集到足够的菌体；

(2)加入250μL溶液P1，旋窝震荡至菌体彻底悬浮；

(3)加入250μL溶液P2，温和的上下摇晃8次左右(以免质粒DNA剪切破裂)；

(4)加入350μL溶液P3，加入溶液后迅速温和的上下摇晃8次左右；

(5)将上述溶液离心13000rpm离心10min。之后取出收集管，将吸附柱置于收集管中，小心吸取上清液于吸附柱上。将收集管盖好离心，再次12000rpm离心1min，之后倒掉收集管中液体，将吸附柱放置收集管中；

(6)加入500μL去蛋白液于吸附柱中，将收集管离心12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放置收集管中；

(7)加入600μL漂洗液PW与吸附柱中，将收集管离心12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放置收集管中；

(8)将吸附柱放置于收集管中后，将收集管离心13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；

(9)取出吸附柱，放入一个新的离心管中，在吸附膜中间部位加入100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，之后12000rpm离心1min。收集管中的液体即含有提取的质粒。

通过PCR反应进行目的基因的扩增，以上述提取的质粒溶液作为反应的底物，反应结束后鉴定扩增产物及反应的特异性。其中PCR反应体系为单个样本反应体积20μL，包含上下游引物B16SF和B16SR各0.5μL，底物1μL、双蒸水8μL和Taq PCR MasterMix(其中包括反应所需要的DNTP、Mg²⁺等)10μL，将上述反应物混合后放入PCR仪进行扩增。扩增参数设置使用两部法，首先预变性94℃保持3min进行一个循环，然后变性阶段设置温度94℃保持10s，退火延伸阶段设置60℃保持30s后完成一个循环，共进行40个循环后结束。扩增产物能够进行检测也可以-4℃短期保存。

2、重组质粒的鉴定

将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，本次扩增预期产物为121bp，如电泳条带碱基数与预期相符，将质粒样品标记为阳性样品供后续实验使用。

琼脂糖凝胶电泳操作步骤：

(1)取50倍浓度TAE溶液(三羟甲基氨基甲烷Tris base、乙酸acetic acid和乙二胺四乙酸EDTA组成的缓冲液，)20mL加入980mL无菌纯净水中，配制成1倍浓度TAE缓冲液，备用；

(2)称取0.5g琼脂糖,加入50mL上述TAE缓冲液中，均匀摇晃三角烧瓶，使琼脂糖粉颗粒均匀分散在缓冲液中；

(3)将溶液放入微波炉加热至琼脂糖完全溶化形成凝胶溶液，注意控制温度，防止过热产生大量气泡使得缓冲液溢出锥形瓶；

(4)用宽胶带将有机玻璃槽的两端口(宽约1厘米)紧密封住。将封好的胶槽置于水平槽中，插好样品梳子，注意将梳子放置平整；

(5)向冷却至50℃～60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)使其终浓度为约0.1终浓度为约，轻轻摇动三角烧瓶使混匀；

(6)将琼脂糖凝胶溶液小心的倒入有机玻璃槽容器内，使凝胶液形成均匀的胶层，保证凝胶厚度0.4～0.6cm。倒凝胶液时速度要缓慢，避免产生气泡。待凝胶完全凝固后，小心取出梳子，避免损伤梳子底部的凝胶；

(7)将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液至槽中，让电泳液面高于胶面约1mm，使原梳子形成的样品孔空气完全排出；

(8)将PCR产物与1/5溴酚蓝指示剂溶液即上样缓冲液(6×)混匀后，将PCR产物加至凝胶的样本孔中，每空上样5μL。凝胶最后孔中加入DNA Ladder 3μL；

(9)接通电泳仪开关，保证点样孔靠近负极，设置电压120V、电流80mA电泳40min。

(10)结束切断电源后取出凝胶放置到紫外灯下观察结果，并拍照留样。

对提取得到的重组质粒进行PCR扩增后进行凝胶电泳反应检测扩增产物是否如预期，预期的扩增目的基因长度为121bp。经琼脂糖凝胶电泳后，其结果如图2所示，凝胶左侧条带为DNA Ladder标尺并已经表明了各长度的条带位置。右侧的条带为样本条带，可知样本条带的长度对应与Ladder条带的100bp至250bp之间，与预期相符，且不在其他位置产生扩增条带。由此可以认为该扩增反应扩增出了目的基因。该扩增的来自与布鲁氏菌16SrRNA的目标基因确实存在于重组的大肠杆菌质粒之中，并且制取的引物能够用于选取基因的特异性扩增之中。

本发明建立的布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法对比于普通PCR的检测方法与核酸检测试剂盒检测方法在有着更高检测灵敏度和稳定性的同时更有着检测耗时较低、检测难度较小的优势。而相对于胶体金免疫层析的方法，有着灵敏度高、特异性强的优势。可用于检测布鲁氏菌属的基因其灵敏度为2.2×10²cfu/μL菌浓度，远高于上转发光、胶体金等免疫层析等方法。

本发明建立起布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，可直接使用样本作为PCR检测底物，省去了核酸提取步骤，适用于快速从各种相态的环境样本中筛选存在布鲁氏菌基因组DNA的样品。能够高效、可靠地检测布鲁氏菌，且具有良好的稳定性和特异性，为消防部队在生物恐怖袭击现场的生物性危害快速识别提供了解决办法。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国人民武装警察部队学院

<120> 一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法

<141> 2018-10-14

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 207

<212> DNA

<213> 基因 BM210(gene of BM210)

<400> 1

ccaacgcggg ccgatcattt gccgataaat ctttcccccg aagggcacat acggtattag 60

cacaagtttc cctgagttat tccgtagcaa atggtacgtt cccacgcgtt actcacccgt 120

ctgccgctcc ccttgcgggg cgctcgactt gcatgtgtta agcctgccgc cagcgttcgt 180

tctgagccag gatcaaactc tcaagtt 207

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列 qBSF1(Synthetic sequence qBSF1)

<400> 2

gccgataaat ctttcccccg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列 qBSR2(Synthetic sequence qBSR2)

<400> 3

gcggcaggct taacacatgc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列 B16SF(Synthetic sequence B16SF)

<400> 4

ggcttaacac atgcaagtcg ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列 B16SR(Synthetic sequence B16SR)

<400> 5

ggcttaacac atgcaagtcg ag 22

Claims (10)

1.一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、采集袭击现场的样本并进行处理；

S2、对处理后样本利用布鲁氏菌现场检测试剂盒进行实时荧光定量PCR检验，其中，布鲁氏菌现场检测试剂盒中包括阴性对照、阳性对照和布鲁氏菌属特异性上下游引物，将处理后样本、阴性对照及阳性对照分别作为底物在相同条件下进行同样的实时荧光定量PCR处理，对待测样品的检测结果进行分析，从而判断处理后样本是否带有布鲁氏菌。

2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，袭击现场采集的样本为擦拭样本、土壤样本或水样本；当袭击现场采集的样本为擦拭样本时，样本处理步骤为：

1)将带有擦拭样本的药棉棒头插入吸附柱，用移液枪向每个有棉棒的吸附柱中加入200μL的磷酸缓冲液，关闭收集管；

2)将收集管离心，8000rpm，离心3min后关闭收集管；

3)将收集管调温振荡，温度65℃，600rpm，震荡10min；

4)将收集管调温振荡，设置温度15℃，1400rpm后冷却至40℃以下用于检测；

当袭击现场采集的样本为土壤样本时，样本处理步骤为：

1)打开采样瓶，用勺子取大约1g土壤样本于离心管中；

2)使用移液枪吸取1mL超纯水到离心管中，将离心管离心，3000rpm离心5min，吸取上清液到新的离心管中；

3)再次离心，10000rpm离心30s吸取下层液体用于检测；

当袭击现场采集的样本为水样本时，样本处理步骤为：

1)打开采样瓶，使用移液枪吸取1mL样本到一个离心管中；

2)将离心管离心，3000rpm离心5min，取上清液转移到新的离心管中；

3)将新离心管10000rpm离心30s取最下层液体用于检测。

3.根据权利要求1所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，布鲁氏菌属特异性上下游引物的序列如下：

上游引物：qBSF1:5-GCCGATAAATCTTTCCCCCG-3，如SEQ ID NO：2所示；

下游引物：qBSR2:5-GCGGCAGGCTTAACACATGC-3，如SEQ ID NO：3所示。

4.根据权利要求3所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，布鲁氏菌现场检测试剂盒中还包括实时荧光定量PCR反应液Sybr Green pPCR mix，布鲁氏菌现场检测试剂盒中阴性对照为超纯水。

5.根据权利要求4所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR采用以下20μL反应体系：Sybr Green qPCR mix 10μL，上下游引物各0.8μL，布鲁氏菌属特异性上下游引物浓度均为10μmol·L^-1，超纯水7.4μL，底物1μL。

6.根据权利要求5所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃条件下预变性5min；94℃变性10s，退火延伸59℃，30s，扩增40个循环；扩增阶段温度变化速率20℃/s；每次在59℃末尾收集荧光信号。

7.根据权利要求6所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，所述对待测样品的检测结果进行以下分析：通过扩增阶段荧光信号变化曲线图获得Ct值，通过Ct值对检测结果进行判断：若样品的Ct值≤t品，检测结果为阳性，样品中含有布鲁氏菌；

若样品的Ct值在28～30间，则对样品进行复检一次，若Ct值仍为28～30间，则检测结果为阴性；

若样品的Ct值为Negative或＞30，样品中布鲁氏菌低于检测限度，检测结果为阴性。

8.根据权利要求7所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR检验步骤具体为：

1)确定待测样本、阳性对照、阴性对照，每组样本至少进行2个复孔的重复，确定进行实时荧光定量检测的孔数为n；用移液枪分别吸取n×10μL Sybr green qPCR mix和n×0.8μL的布鲁氏菌属特异性上下游引物和n×7.4μL的超纯水至带有2mL容量的离心管中；

2)将离心管震荡混匀后，选择3000rmp，离心30s后，静置两分钟；

3)取必要量的毛细管装入冷却的Light Cycler适配块中，用移液枪将19μL的混合液移至每个毛细管中；

4)用移液枪分别将1μL阳性对照、阴性对照、待测样本移至每个毛细管中，并对每个毛细管进行加盖；

5)将装有毛细管的适配器放入离心机，3000rpm，离心15s；

6)取出毛细管放入定量仪转子中，将转子放入荧光定量仪进行检测。

9.根据权利要求8所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，阳性对照的制备：利用扩增引物对特异基因序列进行基因扩增，并将扩增得到的特异基因序列进行回收，将回收产物连接到克隆载体pGSI-T后转化大肠杆菌Top10，并在氨苄青霉素钠平板培养基上筛选阳性克隆菌株，再对经过酶切鉴定和测序鉴定得到的阳性克隆进行质粒提取，作为阳性对照，其中，通过BLAST和DNAMAN对比分析各种布鲁氏菌16S核糖体RNA序列，利用MEGA软件的邻接法进行系统进化树构建，分析基因相似性，选取保守型最高作为特异基因序列。

10.根据权利要求9所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，所述特异基因序列如SEQ ID NO：1所示，扩增引物上游引物B16SF：5-GGCACATACGGTATTAGCACAAG-3，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

下游引物B16SR：5-GGCTTAACACATGCAAGTCGAG-3，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。