CN111500423A - 一种采样液、气溶胶中rna病毒的采样系统及采样方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种采样液、气溶胶中RNA病毒的采样系统及采样方法，所述采样液包括A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液，其中，A存储液为浓度68～89g/mL的异硫氰酸胍水溶液，B存储液为浓度0.7mol/L、pH 6.0～6.5的柠檬酸水溶液，C存储液为浓度1mol/L的二硫苏糖醇水溶液，D存储液为浓度2mol/L、pH 4.0的醋酸钠水溶液，E存储液为质量浓度10％的十二烷基硫酸钠水溶液，F存储液为pH 4.5～5.0的水饱和酚，G存储液为氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合溶液，H存储液为浓度1g/100mL的低熔点琼脂糖水溶液，I存储液为质量浓度10％的8‑羟基喹啉水溶液。本发明提供的采样液能够使气溶胶中的RNA病毒失活，释放病毒的核酸于采样液中。

Description

一种采样液、气溶胶中RNA病毒的采样系统及采样方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种采样液、气溶胶中DNA病毒的采样系统及采样方法。

背景技术

气溶胶是固态和液态微粒与气体介质构成的分散系统，生物气溶胶则是悬浮于大气中的含有微生物或生物大分子等生命活性物质的固态或液态微粒。微生物气溶胶包括病毒性气溶胶、细菌和真菌气溶胶以及真菌孢子和花粉等气溶胶。微生物气溶胶种类及致病性与人类的健康密切相关，可引起呼吸道感染以及其他疾病。流感是第一个实行全球监测的呼吸道传染病，也是人类尚未完全征服的急性传染病之一，其发病率居各种传染病之首；近年来，引起人类呼吸道综合征的SARS病毒，引起禽流感的HxNy病毒以及新近发生的新冠病毒，以气溶胶形式进行传播是其主要的传播方式之一。

目前，气溶胶采样和检测环节都被广泛的研究，且采样环节对后续的处理至关重要。传统的气溶胶病原体的采样方法包括自然沉降法、撞击法、冲击法、离心法、采样膜法等，其往往存在对气溶胶颗粒物的采集效率低、采集气溶胶粒子粒径范围小、气溶胶中病原体存活率高等问题。近年来也出现了一些新的气溶胶病原体采样方式，例如有学者设计了首个便携式空气气溶胶病原体快速采样检测系统，通过微流控芯片实现病原体的采集与检测，操作简便；或者在微流控通道内加装鱼骨构型，可实现气溶胶病原体快速采集，9min样本采集效率接近100％；或者将微流控芯片与环介导恒温扩增(LAMP)结合，对金黄色葡萄球菌的检测限为24个/反应，检测总时间为1.5h。尽管在采样及后续检测技术上都取的了较大的进展，但对于高致病性的病毒，目前采样环节依然暴露了一些问题，如采样器的采样液中病原体依然具有活性，导致对后续的处理需要严格在高级生物安全实验室中进行，给普通实验室和课题组对环境样本的监测带来了极大的不便。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种采样液、气溶胶中RNA病毒的采样系统及采样方法，旨在解决现有采样方式中采样液中收集到的病原体依然具有活性，不便于后续研究和检测的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种采样液，用于气溶胶中RNA病毒的采样，所述采样液包括A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液，其中，所述A存储液为浓度68～89g/mL的异硫氰酸胍水溶液，所述B存储液为浓度0.7mol/L、pH 6.0～6.5的柠檬酸水溶液，所述C存储液为浓度1mol/L的二硫苏糖醇水溶液，所述D存储液为浓度2mol/L、pH 4.0的醋酸钠水溶液，所述E存储液为质量浓度10％的十二烷基硫酸钠水溶液，所述F存储液为pH 4.5～5.0的水饱和酚，所述G存储液为氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合溶液，所述H存储液为浓度1g/100mL的低熔点琼脂糖水溶液，所述I存储液为质量浓度10％的8-羟基喹啉水溶液。

可选地，所述A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液的体积比为(8～10)：(0.3～0.4)：(0.05～0.1):(1～1.5)：(1.5～2)：(10～12)：(10～15)：(1～3)：(0.4～0.5)。

本发明还提出一种气溶胶中RNA病毒的采样系统，包括气溶胶采样器，所述气溶胶采样器包括：

液体撞击瓶，所述液体撞击瓶设有进气口和出气口；

微流泵，与所述液体撞击瓶的出气口连接；以及，

取样管，设于所述液体撞击瓶的内部，且对应所述进气口设置，所述取样管用于盛装如上所述的采样液，以收集进入所述取样管的气溶胶中病毒的核酸。

可选地，所述气溶胶中RNA病毒的采样系统还包括：

气溶胶发生器，设有第一进样口和第一出样口，所述气溶胶发生器用于使待采样的病毒样品雾化成为气溶胶；以及，

密闭箱，设有第二进样口和出第二出样口，所述第二进样口与所述第一出样口连接，所述第二出样口与所述液体撞击瓶的进气口连接，所述密闭箱用于稀释所述气溶胶。

本发明还提出一种气溶胶中RNA病毒的采样方法，包括以下步骤：

步骤S20、开启微流泵使气溶胶采集器采气，使气溶胶进入到所述取样管中，与所述取样管中的采样液接触，以使所述气溶胶中RNA病毒的核酸释放于所述采样液中，得到收集于所述取样管中的失活病毒样品；

步骤S30、对所述失活病毒样品进行振荡，然后离心收集上清液；

步骤S40、向所述上清液加入异丙醇，混合后在室温下静置10～30min，然后离心收集沉淀；

步骤S50、将所述沉淀使用乙醇溶液清洗后干燥，然后溶于DEPC水中，得到可用于病毒基因检测的病毒样品；

其中，步骤S20中的所述采样液为如上所述的采样液。

可选地，步骤S20中：所述气溶胶采样器采气时的采气量为7～10L/min，采气时间为5～10min。

可选地，步骤S20之前，还包括：

步骤S10、将待采样的病毒样品制备成病毒溶液，然后置于气溶胶发生器中通过雾化形成气溶胶，然后使所述气溶胶进入密闭箱中进行稀释。

可选地，步骤S10中：所述雾化时的进样量为0.1～0.3mL/min，雾化时间为20～30min。

可选地，步骤S10中：所述病毒溶液中病毒的终浓度为(1～8)×10⁴TU/mL。

本发明提供的技术方案中，以A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液为原液，配制所得的采样液能够使气溶胶中的RNA病毒失活，释放病毒的核酸于采样液中，从而使得采集到的病毒样品不再具有传染性和致病性，更便利于实验室开展后续的研究、检测等工作，降低了研究人员在研究检测过程中的安全隐患。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的气溶胶中RNA病毒的采样系统的一实施例的结构示意图；

图2为本发明提供的气溶胶中RNA病毒的采样方法的一实施例的流程示意图。

附图标号说明：

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

传统的气溶胶病原体的采样方法包括自然沉降法、撞击法、冲击法、离心法、采样膜法等，其往往存在对气溶胶颗粒物的采集效率低、采集气溶胶粒子粒径范围小、气溶胶中病原体存活率高等问题。近年来也出现了一些新的气溶胶病原体采样方式，例如有学者设计了首个便携式空气气溶胶病原体快速采样检测系统，通过微流控芯片实现病原体的采集与检测，操作简便；或者在微流控通道内加装鱼骨构型，可实现气溶胶病原体快速采集，9min样本采集效率接近100％；或者将微流控芯片与环介导恒温扩增(LAMP)结合，对金黄色葡萄球菌的检测限为24个/反应，检测总时间为1.5h。尽管在采样及后续检测技术上都取的了较大的进展，但对于高致病性的病毒，目前采样环节依然暴露了一些问题，如采样器的采样液中病原体依然具有活性，导致对后续的处理需要严格在高级生物安全实验室中进行，给普通实验室和课题组对环境样本的监测带来了极大的不便。

鉴于此，本发明提出一种采样液，用于气溶胶中RNA病毒的采样，所述采样液包括A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液，其中，所述A存储液为浓度68～89g/mL的异硫氰酸胍水溶液，所述B存储液为浓度0.7mol/L、pH6.0～6.5的柠檬酸水溶液，所述C存储液为浓度1mol/L的二硫苏糖醇水溶液，所述D存储液为浓度2mol/L、pH 4.0的醋酸钠水溶液，所述E存储液为质量浓度10％的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液，所述F存储液为pH 4.5～5.0的水饱和酚，所述G存储液为氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合溶液，所述H存储液为浓度1g/100mL的低熔点琼脂糖水溶液，所述I存储液为质量浓度10％的8-羟基喹啉水溶液。

本发明提供的技术方案中，以A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液为原液，配制所得的采样液能够使气溶胶中的RNA病毒失活，释放病毒的核酸于采样液中，从而使得采集到的病毒样品不再具有传染性和致病性，更便利于实验室开展后续的研究、检测等工作，降低了研究人员在研究检测过程中的安全隐患。

进一步地，为保证所述采样液的使用效果，优选为先对应准备各个存储液，在需要使用时，再按比例配制新鲜的采样液，在配制时，所述A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液的体积比为(8～10)：(0.3～0.4)：(0.05～0.1):(1～1.5)：(1.5～2)：(10～12)：(10～15)：(1～3)：(0.4～0.5)，在此比例下配制所得的采样液，均可以实现使气溶胶中的RNA病毒失活，释放病毒的核酸于所述采样液中。

基于上述提供的采样液，本发明还提出一种气溶胶中RNA病毒的采样系统，通过在病毒采样过程中使病毒与所述采样液接触混合而失活，降低了病毒的采样风险，图1所示为本发明提供的气溶胶中RNA病毒的采样系统的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述气溶胶RNA病毒的采样系统100包括气溶胶采样器10，所述气溶胶采样器包括液体撞击瓶11、微流泵12以及取样管13，其中，所述液体撞击瓶11设有进气口和出气口(附图未标示)；所述微流泵12与所述液体撞击瓶11的出气口连接；所述取样管13设于所述液体撞击瓶11的内部，且对应所述进气口设置，所述取样管13用于盛装本发明上述提供的采样液，以收集进入所述取样管13的气溶胶中病毒的核酸。

所述气溶胶采样器10的工作原理如下：开启所述微流泵12，使气溶胶样品经由所述液体撞击瓶11的进气口进入，并对应与所述取样13管内预先放置的采样液接触混合，使所述气溶胶样品中的RNA病毒失活，并释放出病毒的核酸于所述采样液中，剩余的部分自所述液体撞击瓶11的出气口排出。通过此种方式，可以直接对空气环境中可能包含有RNA病毒的气溶胶样品进行采样，并收集气溶胶中RNA病毒的核酸，作为后续可用于基因检测的病毒样品。

此外，当待检测采样的RNA病毒并非以气溶胶形式存在时，本发明提供的气溶胶中RNA病毒的采样系统100还包括可以使待采样的病毒形成气溶胶的装置，具体请参阅图1，在本实施例中，所述气溶胶中RNA病毒的采样系统还包括气溶胶发生器20以及密闭箱30，其中，所述气溶胶发生器20设有第一进样口和第一出样口(附图未标示)，所述气溶胶发生器20用于使待采样的病毒样品雾化成为气溶胶；所述密闭箱30设有第二进样口和出第二出样口(附图未标示)，所述第二进样口与所述第一出样口连接，所述第二出样口与所述液体撞击瓶11的进气口连接，所述密闭箱30用于稀释所述气溶胶。

通过所述气溶胶发生器20和密闭箱30的设置，可以将待采样的病毒样品先雾化成为气溶胶，然后使所述气溶胶进入到所述密闭箱30中稀释，以模拟气溶胶在空气环境中的存在形式和浓度，然后再通过所述液体撞击瓶11的进气口进入到所述取样管13中，与所述取样管13中预置的采样液接触混合，释放RNA病毒的核酸于所述取样液中，如此，更贴合于从空气环境中直接进行病毒采样的采样结果。其中，所述密闭箱30的作用是为经过所述气溶胶发生器20处理后的气溶胶提供一个密闭的空间，对于所述密闭箱30的尺寸和材质不作限定，而作为一种优选的实施方式，所述密闭箱30的尺寸为长1.5m、宽1m、高0.8m，材质为聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃。

可以理解的是，对于自身在空气中即可以以气溶胶形式存在的RNA病毒，也可以先经由所述气溶胶发生器20和所述密闭箱30处理后，再进入到所述气溶胶采样器10中，并不会对病毒采样结果造成影响。如此，本发明提供的气溶胶中RNA病毒的采样系统100不仅可以直接对在空气中以气溶胶形式存在的RNA病毒进行采样，对于待检测的、而又并非以气溶胶形式存在的病毒样品，例如从患者身上采集到的唾液等可能含有病毒的样品，也可以通过先将其雾化成为气溶胶后再采集气溶胶中RNA病毒的方式进行采样。

基于上述提供的采样液和气溶胶中RNA病毒的采样系统100，本发明还提出一种气溶胶中RNA病毒的采样方法，使得RNA病毒在采样过程失活，降低RNA病毒的采样风险，图2所示为本发明提供的气溶胶中RNA病毒的采样方法的一实施例。请参阅图2，在本实施例中，所述气溶胶中RNA病毒的采样方法包括以下步骤：

步骤S20、开启微流泵12使气溶胶采集器10采气，使气溶胶进入到所述取样管13中，与所述取样管13中预置的采样液接触，以使所述气溶胶中RNA病毒的核酸释放于所述采样液中，得到收集于所述取样管13中的失活病毒样品，其中，所述采样液为如上所述提供的采样液；

对气溶胶中RNA病毒进行采样时，开启所述微流泵12，使气溶胶样品经由所述液体撞击瓶11的进气口进入，并对应进入到所示取样管13中，与所述取样管13内预先放置的采样液接触混合，使所述气溶胶样品中的RNA病毒失活，并释放出病毒的核酸于所述采样液中。进一步地，所述气溶胶采样器采气时的采气量为7～10L/min，采气时间为5～10min。通过控制采气参数，可以使得进入所述取样管13中的气溶胶与所述采样液具有充分的接触时间，而释放出RNA病毒的核酸于所述采样液中。

步骤S30、对所述失活病毒样品进行振荡，然后离心收集上清液；

待所述气溶胶采样器10采气结束后，从所述液体撞击瓶11中取出所述取样管13，置于涡旋振荡器上，以1000～3000r/min的转速运行3～5min，然后以8000～12000g的离心力离心后收集上清液，为便于离心操作，所述取样管13优选为离心管，避免对收集有RNA病毒的核酸的采样液进行不必要的转移，导致影响采样结果。

步骤S40、向所述上清液加入异丙醇，混合后在室温下静置10～30min，然后离心收集沉淀；

离心收集所述上清液后，向所述上清液中加入异丙醇，优选为所述异丙醇的体积与所述上清液的体积等同，混合均匀后，在室温下静置10～30min，然后在4℃下，以8000～12000g的离心力离心5～10min，收集沉淀。

步骤S50、将所述沉淀使用乙醇溶液清洗后干燥，然后溶于DEPC水中，得到可用于病毒基因检测的病毒样品；

将收集到的沉淀使用1mL体积分数为75％的乙醇溶液(不含RNase)清洗一次并干燥，然后再将清洗、干燥后的沉淀溶于30μL不含有RNase(Ribonuclease，核糖核酸酶)的DEPC水中，得到可用于病毒基因检测的病毒样品。其中，所述DEPC水是指用DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水(一级水)。

经过上述步骤S20至步骤S50，可以对在空气中以气溶胶形式存在的RNA病毒直接进行采样，而当所需要采样检测的RNA病毒样品并非以气溶胶形式呈现时，还可以先将其雾化成为气溶胶，然后再加以采样。具体地，在本实施例中，步骤S20之前还包括：

步骤S10、将待采样的病毒样品制备成病毒溶液，然后置于气溶胶发生器20中通过雾化形成气溶胶，然后使所述气溶胶进入密闭箱30中进行稀释。

将待采样的病毒样品制备成为病毒溶液，然后在气溶胶发生器20中通过雾化作用形成为气溶胶，再使所述气溶胶进入到密闭箱30中稀释，以模拟其在空气环境中以气溶胶形式存在的模式，更贴合于从空气环境中直接进行病毒采样的采样结果。

进一步地，步骤S10中利用所述气溶胶发生器20通过雾化使待采样的病毒样品成为气溶胶的过程中，雾化参数优选为：所述雾化时的进样量为0.1～0.3mL/min，雾化时间为20～30min，雾化效果较佳，能够使得放置于所述气溶胶发生器20中待采样的病毒样品充分被雾化为气溶胶。

更进一步地，在将待采样的病毒样品制备成为病毒溶液时，优选为所述病毒溶液中病毒的终浓度为(1～8)×10⁴TU/mL，通过所述病毒溶液浓度的控制，以及雾化参数及采气参数的设置，使得所述病毒溶液经过雾化处理后所得的气溶胶，在经过所述密闭箱30稀释后进入到所述取样管13中后，能够完全释放出病毒的核酸，不会出现部分病毒无法释放其核酸于所述采样液中的情况。

本发明提供的气溶胶中RNA病毒的采样方法，不仅可以直接对在空气中以气溶胶形式存在的RNA病毒进行采样，对于待检测的、而又并非以气溶胶形式存在的病毒样品，例如从患者身上采集到的唾液等可能含有病毒的样品，也可以通过先将其雾化成为气溶胶后再采集气溶胶中RNA病毒的方式进行采样，并且通过在采样过程中使RNA病毒与采样液接触混合而失活，释放病毒的核酸于所述采样液中，从而使得采集到的病毒样品不再具有传染性和致病性，更便利于实验室开展后续的研究、检测等工作，降低了研究人员在研究检测过程中的安全隐患。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

采样液：A存储液9mL、B存储液350μL、C存储液75μL、D存储液1.2mL、E存储液1.7mL、F存储液11mL、G存储液12mL、H存储液2mL、I存储液450μL。

实施例2

采样液：A存储液8mL、B存储液300μL、C存储液100μL、D存储液1.5mL、E存储液2mL、F存储液12mL、G存储液15mL、H存储液3mL、I存储液400μL。

实施例3

采样液：A存储液10mL、B存储液400μL、C存储液50μL、D存储液1mL、E存储液1.5mL、F存储液10mL、G存储液10mL、H存储液1mL、I存储液500μL。

实施例4

(1)将鸡新城疫病毒配制成终浓度5×10⁴TU/mL的病毒溶液，然后取10mL病毒溶液置于气溶胶发生器中形成气溶胶，气溶胶发生器的雾化参数设置为：进样量0.2mL/min，雾化时间25min；

(2)在气溶胶采样器的液体撞击瓶中置入预先盛有实施例1中新鲜配制的采样液的离心管，在步骤(1)中的雾化停止后，开启微流泵使气溶胶采样器采气，设置采气量为8L/min，采气时间为7min；

(3)采气结束后，从气溶胶采样器的液体撞击瓶中取出离心管，置于涡旋振荡器上，以2000r/min的转速运行4min，然后以10000g的离心力离心后收集上清液；

(4)向上清液中加入等体积的异丙醇，混合均匀后，在室温下静置20min，然后在4℃下，以10000g的离心力离心8min，收集沉淀；

(5)将收集到的沉淀使用1mL体积分数为75％的乙醇溶液(不含RNase)清洗一次并干燥，然后再将清洗、干燥后的沉淀溶于30μL不含有RNase的DEPC水中，得到可用于病毒基因检测的病毒样品。

对步骤(5)中采集到的鸡新城疫病毒进行活性检测(参见申之义等.鸡新城疫病毒分离株细胞培养特征的研究[J].试验与研究,2004,12:30-33)，未检测到活病毒；进一步进行RT-PCR检测(参见张文通等.一例鸡新城疫病RT-PCR的诊断[J].家禽科学,2018,9:28-29.)，病毒基因组正常，鸡新城疫病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.87，浓度为5.3ng/μL。

实施例5

(1)将鸡新城疫病毒配制成终浓度1×10⁴TU/mL的病毒溶液，然后取10mL病毒溶液置于气溶胶发生器中形成气溶胶，气溶胶发生器的雾化参数设置为：进样量0.1mL/min，雾化时间30min；

(2)在气溶胶采样器的液体撞击瓶中置入预先盛有实施例1中新鲜配制的采样液的离心管，在步骤(1)中的雾化停止后，开启微流泵使气溶胶采样器采气，设置采气量为7L/min，采气时间为10min；

(3)采气结束后，从气溶胶采样器的液体撞击瓶中取出离心管，置于涡旋振荡器上，以1000r/min的转速运行5min，然后以8000g的离心力离心后收集上清液；

(4)向上清液中加入等体积的异丙醇，混合均匀后，在室温下静置10min，然后在4℃下，以8000g的离心力离心10min，收集沉淀；

(5)将收集到的沉淀使用1mL体积分数为75％的乙醇溶液(不含RNase)清洗一次并干燥，然后再将清洗、干燥后的沉淀溶于30μL不含有RNase的DEPC水中，得到可用于病毒基因检测的病毒样品。

对步骤(5)中采集到的鸡新城疫病毒进行活性检测，未检测到活病毒；进一步进行RT-PCR检测，病毒基因组正常，鸡新城疫病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.89，浓度为1.7ng/μL。

实施例6

(1)将鸡新城疫病毒配制成终浓度8×10⁴TU/mL的病毒溶液，然后取10mL病毒溶液置于气溶胶发生器中形成气溶胶，气溶胶发生器的雾化参数设置为：进样量0.3mL/min，雾化时间30min；

(2)在气溶胶采样器的液体撞击瓶中置入预先盛有实施例1中新鲜配制的采样液的离心管，在步骤(1)中的雾化停止后，开启微流泵使气溶胶采样器采气，设置采气量为10L/min，采气时间为5min；

(3)采气结束后，从气溶胶采样器的液体撞击瓶中取出离心管，置于涡旋振荡器上，以3000r/min的转速运行3min，然后以12000g的离心力离心后收集上清液；

(4)向上清液中加入等体积的异丙醇，混合均匀后，在室温下静置30min，然后在4℃下，以12000g的离心力离心5min，收集沉淀；

(5)将收集到的沉淀使用1mL体积分数为75％的乙醇溶液(不含RNase)清洗一次并干燥，然后再将清洗、干燥后的沉淀溶于30μL不含有RNase的DEPC水中，得到可用于病毒基因检测的病毒样品。

对步骤(5)中采集到的鸡新城疫病毒进行活性检测，未检测到活病毒；进一步进行RT-PCR检测，病毒基因组正常，鸡新城疫病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.84，浓度为6.8ng/μL。

实施例7

步骤与实施例4相同不同之处在于，将鸡新城疫病毒替换成为禽流感病毒。

对采集到的禽流感病毒进行活性检测(检测方法参见：史爱华等.H9N2亚型禽流感病毒在MDCK细胞中增殖最佳条件研究[J].动物医学进展,2011,32:42-45.)，未检测到活病毒；进一步进行RT-PCR检测(检测方法参见：李燕等.双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒[J].中国药科大学学报,2014,4:486-490.)，病毒基因组正常，禽流感病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.92，浓度为5.6ng/μL。

对比例1

(1)采样液的配制与实施例1相同，不同之处在于不添加A存储液；

(2)对鸡新城疫病毒和禽流感病毒进行采样，采样方法与实施例4相同，不同之处在于使用步骤(1)中配制的采样液。

对采集到的鸡新城疫病毒和禽流感病毒进行活性检测，皆未检测到活病毒；RT-PCR检测病毒基因组正常，禽流感病毒基因组OD260/OD280为1.92，浓度为51ng/μL。鸡新城疫病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.86，浓度为4.5ng/μL。

对比例2

(1)采样液的配制与实施例1相同，不同之处在于不添加F存储液；

(2)对鸡新城疫病毒和禽流感病毒进行采样，采样方法与实施例4相同，不同之处在于使用步骤(1)中配制的采样液。

对采集到的鸡新城疫病毒和禽流感病毒进行活性检测，皆未检测到活病毒；RT-PCR未检测到病毒基因组，禽流感病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为0.95，浓度为0.02ng/μL；鸡新城疫病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为0.76，浓度为0.015ng/μL。

对比例3

(1)采样液的配制与实施例1相同，不同之处在于不添加H存储液；

(2)对鸡新城疫病毒和禽流感病毒进行采样，采样方法与实施例4相同，不同之处在于使用步骤(1)中配制的采样液。

对采集到的鸡新城疫病毒和禽流感病毒进行活性检测，皆未检测到活病毒；禽流感病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.87，浓度为42ng/μL。鸡新城疫病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.89，浓度为4.7ng/μL。

对比例4

(1)采样液的配制与实施例1相同，不同之处在于不添加F存储液和G存储液；

(2)对鸡新城疫病毒和禽流感病毒进行采样，采样方法与实施例4相同，不同之处在于使用步骤(1)中配制的采样液。

对采集到的鸡新城疫病毒和禽流感病毒进行活性检测，皆未检测到活病毒；禽流感病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为0，浓度为0ng/μL。鸡新城疫病毒基因组OD₂₆₀/OD₂₈₀为0，浓度为0ng/μL。

从实施例4至7与对比例1至4的对比可知，本发明实施例提供的采样液同时包括A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液，能够有效的使RNA病毒失活，释放病毒的核酸于采样液中，且不会对后续的相关病毒基因造成不良影响，而当缺少其中的一种或多种时，得到的采样液会对病毒的后续检测造成影响，甚至出现无法检测到病毒基因组的情况。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种采样液，用于气溶胶中RNA病毒的采样，其特征在于，所述采样液包括A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液，其中，所述A存储液为浓度68～89g/mL的异硫氰酸胍水溶液，所述B存储液为浓度0.7mol/L、pH 6.0～6.5的柠檬酸水溶液，所述C存储液为浓度1mol/L的二硫苏糖醇水溶液，所述D存储液为浓度2mol/L、pH 4.0的醋酸钠水溶液，所述E存储液为质量浓度10％的十二烷基硫酸钠水溶液，所述F存储液为pH 4.5～5.0的水饱和酚，所述G存储液为氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合溶液，所述H存储液为浓度1g/100mL的低熔点琼脂糖水溶液，所述I存储液为质量浓度10％的8-羟基喹啉水溶液。

2.如权利要求1所述的采样液，其特征在于，所述A存储液、B存储液、C存储液、D存储液、E存储液、F存储液、G存储液、H存储液和I存储液的体积比为(8～10)：(0.3～0.4)：(0.05～0.1):(1～1.5)：(1.5～2)：(10～12)：(10～15)：(1～3)：(0.4～0.5)。

3.一种气溶胶中RNA病毒的采样系统，其特征在于，包括气溶胶采样器，所述气溶胶采样器包括：

液体撞击瓶，所述液体撞击瓶设有进气口和出气口；

微流泵，与所述液体撞击瓶的出气口连接；以及，

取样管，设于所述液体撞击瓶的内部，且对应所述进气口设置，所述取样管用于盛装如权利要求1或2所述的采样液，以收集进入所述取样管的气溶胶中病毒的核酸。

4.如权利要求3所述的气溶胶中RNA病毒的采样系统，其特征在于，还包括：

气溶胶发生器，设有第一进样口和第一出样口，所述气溶胶发生器用于使待采样的病毒样品雾化成为气溶胶；以及，

密闭箱，设有第二进样口和出第二出样口，所述第二进样口与所述第一出样口连接，所述第二出样口与所述液体撞击瓶的进气口连接，所述密闭箱用于稀释所述气溶胶。

5.一种气溶胶中RNA病毒的采样方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S20、开启微流泵使气溶胶采集器采气，使气溶胶进入到所述取样管中，与所述取样管中的采样液接触，以使所述气溶胶中RNA病毒的核酸释放于所述采样液中，得到收集于所述取样管中的失活病毒样品；

步骤S30、对所述失活病毒样品进行振荡，然后离心收集上清液；

步骤S40、向所述上清液加入异丙醇，混合后在室温下静置10～30min，然后离心收集沉淀；

步骤S50、将所述沉淀使用乙醇溶液清洗后干燥，然后溶于DEPC水中，得到可用于病毒基因检测的病毒样品；

其中，步骤S20中的所述采样液为如权利要求1或2所述的采样液。

6.如权利要求5所述的气溶胶中RNA病毒的采样方法，其特征在于，步骤S20中：所述气溶胶采样器采气时的采气量为7～10L/min，采气时间为5～10min。

7.如权利要求5所述的气溶胶中RNA病毒的采样方法，其特征在于，步骤S20之前，还包括：

步骤S10、将待采样的病毒样品制备成病毒溶液，然后置于气溶胶发生器中通过雾化形成气溶胶，然后使所述气溶胶进入密闭箱中进行稀释。

8.如权利要求7所述的气溶胶中RNA病毒的采样方法，其特征在于，步骤S10中：所述雾化时的进样量为0.1～0.3mL/min，雾化时间为20～30min。

9.如权利要求7所述的气溶胶中RNA病毒的采样方法，其特征在于，步骤S10中：所述病毒溶液中病毒的终浓度为(1～8)×10⁴TU/mL。

Images