CN1318607C - 评价膜法过滤空气和水环境中病毒效果的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种评价膜法过滤空气和水环境中病毒效果的检测方法。以环境中容易分离得到的噬菌体为模型病毒，以双层琼脂法培养的噬菌斑为病毒存在的直观指示，通过测定空气和水环境中模型病毒经膜过滤装置过滤前后的浓度变化来评价该膜装置过滤病毒的效果。本发明是针对空气和水环境中病毒的膜法过滤效果如何评价而提出的，发明思路是通过检测膜过滤装置对体积相对较小的模型病毒的截留效果来评价该膜装置对各种环境病毒的过滤效果。该方法是一种简易、高效、灵敏、可靠的膜过滤效果测定方法，为研制和开发各种病毒采样富集装置和环境病毒净化装置提供了合适的测试技术平台，也为客观评价这些装置的质量提供了一个可行的方法。

Description

评价膜法过滤空气和水环境中病毒效果的检测方法

技术领域

本发明涉及一种评价膜法过滤空气和水环境中病毒效果的检测方法，它是用噬菌体作模型病毒模拟自然环境中微量病毒的富集与检测，属于环境病毒学和环境监测领域。

背景技术

SARS病毒的爆发使得人们对于空气和水环境中存在的病毒污染产生的很大的担忧，尤其是一些敏感场所如医院、商场、车站等环境重的空气质量。另外，人们生活环境周围的各种水体中也会存在各种致病病毒，导致疾病的蔓延。而且空气和水中的病毒可以相互之间传播，如排泄物中的病毒可以通过冲马桶时激起的水花和漩涡以气溶胶的形式释放到空气中去。通过空气传播的病原微生物包括病毒大多以气溶胶的形式存在，呼吸道病原微生物的生物气溶胶一般是通过咳嗽、大声讲话形成的。这些病毒气溶胶可以通过呼吸、吞咽和皮肤接触等方式到达和进入人体，其中呼入生物气溶胶是最重要的感染呼吸道病毒的方式。而水源性病毒则可能由于饮用水源的污染、娱乐场所的消毒不彻底、生活污水处理不当等造成病毒的传播，也可以散布到空气中产生病毒气溶胶。虽然空气生物学和环境病毒学研究已经有几十年的历史，但是，目前使用的空气气溶胶采样方法和水质的采样检测的方法以及对收集的微生物进行活性测定的方法绝大多数是针对细菌和真菌的。针对病毒的采样和检测面临很多困难：1)动物和人的病毒具有侵染性，研究它们在空气和水中的传播规律必须避免对实验者造成感染。因此，这类试验只能在生物安全控制级别很高的实验室使用特殊的小型装置来做，只有通过反复多次试验验证，保障其安全性后，才有可能采用有生物安全性问题的动物和人的病毒进行实际应用试验。2)人和动物的病毒是否已经被灭活，只能用细胞培养的方法来确定，测定的周期因而较长，检测灵敏度也不够。细胞培养检测不出，不一定说明病毒已经完全被去除或灭活。

经文献检索发现，申请人为：布安格莱荻公司分子生物学研究所，中国发明专利名称为：生物样品中生物分子的噬菌体检测法，专利号：ZL98806434.0，该专利公开了一种利用噬菌体检测生物样品中目的分子的存在情况的方法，该方法仅限于实验室使用特殊的装置，操作复杂，检测时间长，需要依靠噬菌体和生物分子自身基因组间的联系才可检测是否存在被检分子。该方法与富集检测空气和水中噬菌体无关，不能用于评价空气和水环境中病毒的富集和检测效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种评价膜法过滤空气和水环境中病毒效果的检测方法。

它以环境中容易分离得到的噬菌体为模型病毒，以双层琼脂法培养的噬菌斑为噬菌体存在的直观指示，通过测定空气和水环境中模型病毒经膜过滤装置过滤前后的浓度变化来评价该膜装置过滤病毒的效果。

方法的步骤如下：

1)模型病毒样品的制备

将生活污水、大肠杆菌与LB液体培养基混合，振荡培养，待培养液转为透明，离心，上清液过滤除菌得到噬茵体液，再与大肠杆菌混合，平板培养，采取单个噬菌斑接种到LB液体培养基，待菌液溶解，过滤除菌得到纯化的噬菌体，将纯化的噬菌体再与大肠杆菌混合，LB液体培养基培养，过滤除菌，重复几次，制得高效价的噬菌体；

2)膜过滤装置过滤前模型病毒样品的处理

将高效价的噬菌体液逐级10倍稀释，取三个连续稀释度的噬菌体分别与大肠杆菌混合，静置后再与上层培养基(含0.4％琼脂的LB液体培养基)迅速混合，倒入底层培养基(含1.5％琼脂的LB液体培养基)培养计数噬菌斑，并计算效价，用于空气或水环境中的试验时，可将噬菌体液配制成不同浓度；

3)膜装置过滤空气和水环境中的模型病毒

将不同浓度的噬茵体液采用负压抽滤的平板膜过滤器和膜过滤式大气采样仪进行截留，分别模拟水和空气中病毒的富集，用于空气中试验时先将噬菌体液气溶胶化，将富集在膜上的噬菌体洗脱，获得洗脱液、滤液和收集液；

4)噬菌体的双层琼脂法培养及计数

对洗脱液、滤液和收集液用双层琼脂法进行培养或者直接将可能含有噬菌体的气流喷向预涂有大肠杆菌的琼脂平皿上，进行噬菌斑计数；

5)对膜装置过滤病毒效果的评价

进行多次平行试验，并设置阴阳性对照，通过统计的方法计算洗脱液、收集液、滤液或气流中的噬菌体量。

本发明是针对空气和水环境中病毒的膜法过滤效果如何评价而提出的，发明思路是通过检测膜过滤装置对体积相对较小的模型病毒的截留效果来评价该膜装置对各种环境病毒的过滤效果。该法以自然环境中容易分离得到的噬菌体为模型病毒，以双层琼脂法培养的噬菌斑为病毒存在的直观指示，通过测定空气和水环境中模型病毒经膜过滤装置过滤前后的浓度变化来评价该膜装置过滤病毒的效果，是一种简易、高效、灵敏、可靠的膜过滤效果测定方法，为研制和开发各种病毒采样富集装置和环境病毒净化装置提供了合适的测试技术平台，也为客观评价这些装置的质量提供了一个可行的技术方法。

具体实施方式

评价膜法过滤空气和水环境中病毒效果的检测方法，主要步骤：①模型病毒样品的制备；②膜过滤装置过滤前模型病毒样品的处理；③膜装置过滤空气和水环境中的模型病毒；④噬菌体的双层琼脂法培养及计数；⑤对膜装置过滤病毒效果的评价。

①模型病毒样品的制备：

从生活污水中分离大肠杆菌噬菌体，并对其进行纯化，将纯化的噬菌体进行增殖，制备高效价噬菌体。具体步骤如下：

分离大肠杆菌噬菌体：从生活污水中取水样200毫升，加入2毫升培养18小时的大肠杆菌菌悬液，倒入盛有100毫升3倍浓缩的LB液体培养基的三角瓶中。在摇床上200rpm，37度振荡培养12～24小时，直到培养液由混浊逐渐变为透明，并可观察到絮状沉淀。停止培养，将此培养液2500rpm离心15分钟，取上清液，用细菌过滤装置采用0.22微米的醋酸纤维素膜进行过滤除菌，此即初步制得的噬菌体。

纯化噬菌体：用接种环取滤液接种到LB液体培养基，再加入0.1ml大肠杆菌菌悬液，混匀后取混合液0.2ml加入上层培养基(含0.4％琼脂的LB液体培养基)，混匀后倒入LB固体培养基37℃培养24小时。用接种针在长出的单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体接入含有大肠杆菌的LB液体培养基，37℃培养，待管内菌液完全溶解，过滤除茵，即得到纯化的噬菌体。

增殖制备高效价噬菌体：将纯化的噬菌体与LB液体培养基按1∶10混合，再加入等量或1/2量的大肠杆菌悬液混合培养，重复几次，最后过滤除菌，得到高效价的噬菌体制品，4度冰箱保存备用。

②膜过滤装置过滤前模型病毒样品的处理：

在进行病毒的富集检测试验前，先要将所制得的噬菌体液进行效价测定、稀释或气溶胶化。具体步骤如下：

测定噬菌体效价：采用双层琼脂法。将上层培养基(含0.4％琼脂的LB液体培养基)分装在试管中，每管约4ml，先将其融化并保持在48℃水浴中备用。将噬菌体液逐级10倍稀释，选择三个连续稀释度各取0.1ml加入到含0.9ml大肠杆菌悬液的试管中，静置15分钟后倒入上层培养基，振荡均匀后迅速倒入LB固体培养基铺匀。倒置培养12～24小时后进行噬菌斑计数，以每皿噬菌斑数30～300个为宜，每个稀释度平行作3皿，计数时取3皿噬菌斑数的平均值，同时作空白对照(不加噬菌体)。噬菌体效价(PFU/ml)＝某稀释度噬菌斑平均数×稀释度×100；

当用于水环境中的试验时，只是将已知效价的噬菌体液逐级稀释，得到不同浓度或效价的噬菌体溶液。配制噬菌体水溶液：在试管中加入9毫升去离子水，取1毫升噬菌体液加入，振荡均匀后，从中再取1毫升加入另一含9毫升去离子水的试管中，依次逐级稀释，得到不同浓度的噬菌体液；

当用于空气环境中试验时，可取一定体积一定效价的噬菌体液进行雾化处理产生噬菌体气溶胶。制备噬菌体气溶胶：取一定浓度的噬菌体溶液，用超声雾化器雾化，通过高频振荡将10²～10⁶pfu/ml的噬菌体溶液雾化成液滴直径1～3微米的不同浓度的噬菌体气溶胶。可以灵活调配噬菌体浓度，对噬菌体活性无显著影响，是一个理想的气溶胶源。

③膜装置过滤空气和水环境中的模型病毒：

用于病毒富集的膜及装置：

对于水环境中病毒的富集检测，采用负压抽滤的平板膜过滤器，试验中采用了两种超滤膜：截留分子量5万的醋酸纤维素膜和截留分子量10万的聚砜膜。对于空气中病毒富集检测的模拟，采用了膜过滤式大气采样仪，并在模拟试验中采用了聚四氟乙烯膜和聚偏氟乙烯膜。

在膜法空气净化装置中采用三级串连的折叠式膜组件，所用的终端滤膜为孔径0.01微米的聚四氟乙烯膜。

膜装置过滤空气和水环境中模型病毒的具体操作如下：

对于水环境中病毒的富集检测：将不同浓度的噬菌体液通过膜装置过滤，液体过滤完后将膜小心取下，用少量生理盐水洗脱收集膜上的噬菌体，对洗脱液和滤液进行噬菌体检测。

对于空气中病毒富集检测：对含不同浓度噬菌体气溶胶的空气采样，将膜安装在采样头上，用真空泵进行抽气采样，透过的气体通入到盛有收集液的收集管中。抽气采样一定时间后，将膜小心取下，用少量生理盐水洗脱，对洗脱液和收集液进行噬菌体检测。

膜法空气净化：膜法净化空气中病毒时，将不同浓度的噬菌体溶液雾化成气溶胶，用空气净化装置抽气一定时间，对进气口和排气口分别进行噬菌体检测。

④噬菌体的双层琼脂法培养及计数：

对洗脱液、收集液、滤液用双层琼脂法进行培养及噬菌斑计数：将上层培养基(含0.4％琼脂的LB液体培养基)分装在试管中，每管约4ml，先将其融化并保持在48度水浴中备用。取100微升待测样品加到含900微升LB液体培养基的离心管中，再从中取100微升加到另一含900微升LB液体培养基的离心管中，依次进行10倍梯度稀释。取每一稀释度的噬菌体液100微升加到含有900微升大肠杆菌18小时培养液的离心管中，静置15分钟后，倒入预先融化并保持48度的上层培养基中，混匀后迅速倒入LB固体琼脂平板，培养过夜后进行噬菌斑计数。以每皿噬菌斑数30～300个为宜，每个稀释度平行作3皿，计数时取3皿噬菌斑数的平均值，同时作空白对照(不加噬菌体)。噬菌体效价(PFU/ml)＝某稀释度噬菌斑平均数×稀释度×100。

在检测膜净化装置去除空气中病毒的效果时，将预涂有大肠杆菌的琼脂平皿与气流方向成60度角放置，排出的气流撞击在平板上，若排气中含有噬菌体，则培养后会在大肠杆菌菌苔上产生透明的噬菌斑，则为阳性。若无噬菌斑产生，则为阴性。对进气口和排气口进行噬菌体检测并判断阴性或阳性。

⑤对膜装置过滤病毒效果的评价：

对每一浓度的噬菌体液或噬菌体气溶胶进行多次平行试验，并设置阴阳性对照，通过统计的方法计算洗脱液、收集液、滤液或气流中的噬菌体量。在噬菌斑的计数上除了作平行试验取平均值外，所有测定还须重复一定数量满足统计学要求。洗脱液、滤液、收集液或过滤前后气流中噬菌斑数要相差100～1000倍以上才能认定膜过滤装置具有显著截留病毒的作用。实际操作中，滤液、收集液或过滤后气流中应检测不到病毒，这样才能认定此膜过滤装置具有应用价值。

实施例1：

用噬菌斑法评价10万截留分子量的聚砜膜富集水中噬菌体的效果

取效价为5万pfu/ml的噬菌体液20ml通过膜过滤装置，待溶液过滤完全后，从装置上小心取下膜，加入2ml生理盐水，轻轻振荡，将噬菌体洗脱下来。取洗脱液100微升与900微升培养18小时的大肠杆菌悬液混合，静置15分钟后倒入预先融化并保持在48度的LB上层培养基(含琼脂0.4％)，混匀后倒入LB固体琼脂培养皿，倒置培养12～24小时，观察产生的清晰噬菌斑并计数。每次试验平行作3皿，噬菌斑数取3皿结果的平均值，同时作空白对照。同时也取滤液100微升，用同样方法检测噬菌斑。为考虑统计学结果，重复以上试验多次。试验表明：滤液中检测不到噬菌体，而从膜上的洗脱液中检测到的噬菌体数为680±18pfu，经统计学检查差异显著，表明该膜及装置具有显著的富集水中病毒的效果。LB液体培养基：1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g NaCl，加水至100ml，用NaOH调pH至7.0～7.2。LB固体培养基：LB液体培养基中加1.5％琼脂粉。双层琼脂法中上层培养基加入0.4％琼脂粉，底层培养基为1.5％。

实施例2：

用噬菌斑法评价5万截留分子量的醋酸纤维素膜富集水中噬菌体的效果

取效价为5万pfu/ml的噬菌体液20ml通过膜过滤装置，待溶液过滤完全后，从装置上小心取下膜，加入2ml生理盐水，轻轻振荡，将噬菌体洗脱下来。取洗脱液100微升与900微升培养18小时的大肠杆菌悬液混合，静置15分钟后倒入预先融化并保持在48度的LB上层培养基(含琼脂0.4％)，混匀后倒入LB固体琼脂培养皿，倒置培养12～24小时，观察产生的清晰噬菌斑并计数。每次试验平行作3皿，噬菌斑数取3皿结果的平均值，同时作空白对照。同时也取滤液100微升，用同样方法检测噬菌斑。为考虑统计学结果，重复以上试验多次。试验表明：滤液中检测不到噬菌体，而从膜上的洗脱液中检测到的噬菌体数为650±9pfu，经统计学检查差异显著，表明该膜及装置具有显著的富集水中病毒的效果。

实施例3：

用噬菌斑法评价聚偏氟乙烯膜富集空气中噬菌体的效果

先将浓度为30万pfu/ml的噬菌体液超声雾化为噬菌体气溶胶，把膜装在大气采样装置上，对着散布有噬菌体气溶胶的空气进行抽气采样10分钟，大气采样装置的排气通入到收集液中。将膜小心取下，加入2ml生理盐水，轻轻振荡，将噬菌体洗脱下来。取洗脱液100微升与900微升培养18小时的大肠杆菌悬液混合，静置15分钟后倒入预先融化并保持在48度的LB上层培养基(含琼脂0.4％)，混匀后倒入LB固体琼脂培养皿，倒置培养12～24小时，观察产生的清晰噬菌斑并计数。每次试验平行作3皿，噬菌斑数取3皿结果的平均值，同时作空白对照。同时也取收集液100微升，用同样方法检测噬菌斑。为考虑统计学结果，重复以上试验多次。试验表明：收集液中检测不到噬菌体，而从膜上的洗脱液中检测到的噬菌体数为427±21pfu，经统计学检查差异显著，表明该膜及装置具有显著的富集空气中病毒的效果。

实施例4：

用噬菌斑法评价聚四氟乙烯膜空气净化装置富集去除空气中噬菌体的效果

此空气净化装置采用聚四氟乙烯膜，采用三级串连的折叠式膜组件用来截留空气中病毒，起到净化空气病毒的作用。同时该装置间歇用臭氧对富集的病毒进行灭活。取30万pfu/ml的噬菌体液20ml，超声雾化为噬菌体气溶胶，将此气溶胶成60度角喷向涂布有大肠杆菌的LB固体琼脂培养皿平面，采集2分钟，以此作为噬菌体气溶胶通过膜法空气净化器前的噬菌体数，即作为阳性对照。开启空气净化装置，收集不含病毒气溶胶的空气，排气成60度角喷向涂布有大肠杆菌的LB固体琼脂培养皿平面，采集2分钟，以此作为阴性对照。同时，采集含有噬茵体气溶胶的空气，排气成60度角喷向涂布有大肠杆菌的LB固体琼脂培养皿平面，采集2分钟，以此作为通过膜后的待测样。在同样的采样时间内，可连续测定许多样品。将所有培养皿倒置培养12～24小时，观察大肠杆菌菌苔表面有无清晰噬菌斑并计数。重复以上试验多次，符合统计学要求。试验表明：阴性对照都检测不到噬菌斑，阳性对照噬菌斑数为521±37pfu，而待测样品中都检测不到噬菌斑。经统计学检查差异显著，表明该膜及装置具有显著的富集或去除空气中病毒的效果。

Claims (1)

1.一种评价膜法过滤空气和水环境中病毒效果的检测方法，其特征在于：以环境中容易分离得到的噬菌体为模型病毒，以双层琼脂法培养的噬菌斑为病毒存在的直观指示，通过测定空气和水环境中模型病毒经膜过滤装置过滤前后的浓度变化来评价该膜装置过滤病毒的效果，具体步骤如下：

1)模型病毒样品的制备

将生活污水、大肠杆菌与LB液体培养基混合，振荡培养，待培养液转为透明，离心，上清液过滤除菌得到噬菌体液，再与大肠杆菌混合，平板培养，采取单个噬菌斑接种到LB液体培养基，待菌液溶解，过滤除菌得到纯化的噬菌体，将纯化的噬菌体再与大肠杆菌混合，LB液体培养基培养，过滤除菌，重复几次，制得高效价的噬菌体；

2)膜过滤装置过滤前模型病毒样品的处理

将高效价的噬菌体液逐级10倍稀释，取三个连续稀释度的噬菌体分别与大肠杆菌混合，静置后再与上层0.4％琼脂的LB液体培养基迅速混合，倒入底层含1.5％琼脂的LB液体培养基培养计数噬菌斑，并计算效价，用于空气或水环境中的试验时，可将噬菌体液配制成不同浓度；

3)膜装置过滤空气和水环境中的模型病毒

将不同浓度的噬菌体液采用负压抽滤的平板膜过滤器和膜过滤式大气采样仪进行截留，分别模拟水和空气中病毒的富集，用于空气中试验时先将噬菌体液气溶胶化，将富集在膜上的噬菌体洗脱，获得洗脱液、滤液和收集液；

4)噬菌体的双层琼脂法培养及计数

对洗脱液、滤液和收集液用双层琼脂法进行培养或者直接将可能含有噬菌体的气流喷向预涂有大肠杆菌的琼脂平皿上，进行噬菌斑计数；

5)对膜装置过滤病毒效果的评价

进行多次平行试验，并设置阴阳性对照，通过统计的方法计算洗脱液、收集液、滤液或气流中的噬菌体量。