CN1472331A - 测定空气净化装置去除病毒效果的方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定空气净化装置去除病毒效果的方法，属于空气生物学和空气净化领域。本发明采用中央空调空气多重净化消毒系统测试平台，在该平台建立的全封闭空气循环系统中，散布噬菌体液滴或粉尘，模拟生物气溶胶，以一定的风速使气溶胶通过各种待评价的灭病毒处理装置，通过测定装置入口和出口处回收的噬菌体数量来反映其去除病毒的效果。本发明是针对室内空气特别是中央空调系统的空气净化装置的去除病毒效果评价而提出的，是一种灵敏、高效、可靠的空气病毒含量和活性测定方法，为提高中央空调空气净化器的研究和开发质量、规范市场行为、提供了依据。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种测定空气净化装置去除病毒效果的方法，特别是一种用噬菌体模拟中央空调系统空气中的病毒测定空气净化装置去除病毒效果的方法，属于空气生物学和空气净化领域。
背景技术
SARS病毒的爆发流行，使公众对室内空气的生物学质量产生了异乎寻常的关心和担忧。如何清除空气中的包括SARS病毒在内的各种呼吸道病毒，成为目前急需解决的问题。气传微生物是以生物气溶胶(bioaerosol)的形式存在的。呼吸道病原物的生物气溶胶一般是病人通过咳嗽、大声讲话和打喷嚏形成的。另外，排泄物中的病毒可以通过冲马桶时激起的水花和漩涡以气溶胶的形式释放到空气中去。气传病毒可以通过呼吸、吞咽和皮肤接触几种方式到达和进入人体，其中呼入生物气溶胶是最重要的感染呼吸道病毒的方式。虽然空气生物学研究已经有几十年的历史，但是，目前使用的空气气溶胶采样方法以及对收集的微生物进行活性测定的方法绝大多数是针对细菌和真菌的。针对病毒的采样和测定有很多困难：1)动物和人的病毒具有侵染性，研究它们在空气中的传播规律必须避免对实验者造成感染，因此，这类试验只能在微生物安全控制级别很高的实验室使用特殊的小型装置来做。对于中央空调是无法也不允许用有生物安全性问题的动物和人的病毒来进行病毒清除效果测定的。2)人和动物的病毒是否已经被灭活，只能用细胞培养的方法来测定，测定的周期因而较长，检出灵敏度也不够。细胞培养检测不出，不一定说明病毒已经完全被去除和灭活。
经文献检索发现，申请人为：布.安格莱荻公司分子生物学研究所，中国发明专利名称为：生物样品中生物分子的噬菌体检测法，专利号：ZL98806434.0，该专利公开了一种利用噬菌体检测生物样品中目的分子的存在情况的方法，该方法仅限于实验室使用特殊的装置，操作复杂，检测时间长，需要依靠分子和噬菌体自身基因组间的联系才可检测是否存在被检分子。该方法与测定空气中的噬菌体活性无关，不能用于评价空气中病毒清除的效果。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足和缺陷，提供一种测定空气净化装置去除病毒效果的方法，使其可以灵敏、高效、可靠的测定空气病毒含量和活性，及时、客观地评价中央空调各种病毒清除装置的实际效果。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明采用中央空调空气多重净化消毒系统测试平台，在该平台建立的全封闭空气循环系统中，散布噬菌体液滴或粉尘，模拟生物气溶胶，鼓风使气溶胶通过各种不同原理的待评价的灭病毒处理装置，通过测定该装置入口和出口处回收的噬菌体数量来反映其去除病毒的效果。
以下对本发明作进一步的说明，方法包括以下步骤：
1、测试前的准备
安装中央空调空气多重净化消毒系统测试平台，该平台建立有全封闭空气循环系统，然后对该系统除尘、杀毒、净化。全封闭空气循环的模拟中央空调系统的试验测试平台，可以实时调节房间内温湿度，为噬菌体的测定提供了可靠稳定的室内微环境，粉尘或雾通过中央空调空气多重净化消毒系统测试平台试验箱箱体上的孔喷入，多个回收噬菌体的培养皿放入试验箱内，设噬菌体培养皿也放入测试箱内。
除尘：吸除地面灰尘；
杀毒：喷入消毒剂，杀灭残留病毒以及杂菌
净化：运行系统，对系统内空气进行净化。
2、检测用病毒及其制备
从自然环境分离制备检测用噬菌体，噬菌体以大肠杆菌为侵染对象，其对温度、干燥等主要环境因子的抵抗力超过各种空气传播的病毒特别是SARS-CoV病毒。
病毒可以分为三类：动物病毒、植物病毒和细菌病毒(即噬菌体)。SARS-COV病毒属于动物病毒，侵染哺乳类、禽类等动物，而噬菌体侵染对象为细菌，未发现对人体和其他动植物有不利影响。本发明采用的噬菌体分离自自然环境，以无致病性大肠杆菌为侵染对象，安全无害。噬菌体培养增殖方便，对干燥、温度、超声波的耐受性都超过包括SARS-CoV在内的呼吸道病毒，同时，噬菌体的噬菌斑清晰、透明，方便辨认和记数。
接种一个单菌落的大肠杆菌于5毫升LB培养基，37度振荡培养过夜，取1毫升培养物与100微升噬菌体储备液混匀，37度保温30分钟，然后全部接入装在250毫升三角瓶的50毫升LB培养液中，37度振荡培养4-8小时，培养液由浑浊变为透明，并可观察到絮状沉淀，停止培养，向瓶中加入0.5毫升的氯仿，振荡混合，2500rpm离心10分钟，上清液转移到灭菌的离心管中，加1-2滴氯仿，在4度保存备用。噬菌体的效价测定采用梯度稀释，具体做法与5相同。
3、病毒的散布和气溶胶的制备
采用粉尘喷射器或者超声波雾化器进行病毒的散布和气溶胶的制备，向系统中稳定持续的喷入直径在1-5微米的病毒粉尘气溶胶或超声波雾化的1-5微米的浓度为106-107pfu/ml的病毒液滴。
病毒的散布是一个比较难以解决的问题。病毒的传播途径方式比较多，和呼吸道疾病有关的病毒一般为空气传播，而这种传播必须以一定的载体为介质，一般为微尘和飞沫构成所谓的“生物气溶胶”。灭菌杀毒系统对病毒的杀灭作用首先表现在对微尘和飞沫的截留和收集作用上，然后才是对病毒本身的杀灭作用。
病毒的散布和气溶胶的制备可以有两种主要方法，一是制备直径在1-5微米的粉尘，这些粉尘可以是二氧化硅等各种惰性的对生物分子无反应活性的材料制成，并且颗粒表面经过化学修饰，避免了颗粒之间的相互吸附、聚集，噬菌体储备液与粉尘混合，经冷冻干燥、超声粉碎，喷雾形成含一定数量病毒粉尘的气溶胶用于测试。采用粉尘喷射器作为病毒的散布装置，是应用射流泵原理制成的，高压气流从喷嘴流过在管内的局部形成负压区，产生吸入效应，从而使微粉从粉斗内吸入混合管内，卷吸和携带的微粉与高压空气进行搅合，保证了一定病毒浓度的粉尘均匀、快速、连续地喷入试验箱体内。
第二种是超声雾化，采用超声波雾化器作为病毒的散布装置，通过高频振荡将106-107pfu/ml浓度的病毒溶液雾化成1-5微米液滴的汽雾。超声波雾化器制造的汽雾小而均匀，液滴直径分布在1-5微米，噬菌体浓度可以比较高，可以灵活调配噬菌体浓度，对噬菌体活性无显著影响，是一个理想的气溶胶源。
4、空气采样
在试验段前后的测试段内采用明胶-LB双层平皿对粉尘或汽雾在与水平面60度夹角迎风面收集1分钟，对噬菌体完成一次空气采样，更换培养皿，重复空气采样操作每个工况5-20次。
明胶平皿(3％Gelatin，每皿10毫升，华美生物工程公司)是一种简单实用的空气取样方式。明胶-LB双层平皿，对噬菌体的收集效果良好。采用喷雾时，低浓度(106)组实验每平皿也可达到约100个噬菌斑，高浓度(108)组稀释100倍后效果和低浓度(106)组类似。采用超声波雾化器时使用的原液为105-108pfu/ml，对其汽雾收集1分钟后稀释1000倍后每平皿可以达到100的噬菌斑。采样平皿放置在装置的进口和出口，以与水平面60度的夹角迎着风向固定，系统通风运行1分钟后，将平皿取出。在试验段前后的测试段内与水平面60度夹角迎风面设置小平台，放置平皿收集噬菌体1分钟，对试验段内安装的空气净化装置的运行或不运行状态下通过装置的噬菌体浓度对比后，评估灭病毒效果。
在预试验中，需要摸索最佳处理条件，包括噬菌体原液浓度、雾化速度、风速、取样时间等，在装置运行和不运行时，噬菌体的数量必须有1-2个数量级的差别，才能确认装置的去病毒效果。
5、噬菌体记数
经过明胶和LB回收、除菌、梯度稀释、平皿培养之后，对所有培养皿开始噬菌斑记数。具体步骤如下：
明胶和LB回收：将取样后的平皿装入专用铁筒，37℃保存至明胶融化后，超净台操作将明胶回收移入10mL离心管，平皿装回专用铁筒后灭菌。
除菌：回收的明胶中含有杂菌，将与指示菌竞争生长，影响噬菌斑的观察。所以，在融化状态下，将明胶15000r/min离心10分钟，细菌将沉降到管底。
梯度稀释：取1mL明胶，移入2mL离心管；再在其中吸取100μL明胶移入1.5mL离心管加入900MB液体培养基，旋涡；取100μL移入另一个1.5mL离心管加入900MB液体培养基，旋涡；依次类推，做梯度稀释。对噬菌体培养6-12小时即可在平皿中得到30-300个噬菌斑。
平皿培养：将以上稀释液各取100μL移入1.5mL离心管后加入300μL指示菌后，旋涡混合后静置15分钟，使噬菌体侵染指示菌。然后倒入7mL 0.4％熔化的素琼脂中，混合后倒入LB固体培养皿中，37℃培养8-12小时。
噬菌斑记数：统计平皿上的噬菌斑数量。
6、数据分析
“系统”通风运行时，用明胶平皿回收法测定装置出风口处病毒的数量，如果装置需要通电才能发挥作用，则测定其通电和不通电两种工况下出口处的病毒回收量，两种工况下的回收病毒的差值反映装置的去除病毒效果；如果装置安装完毕即可发挥作用，则用同样形状和大小的风管来作为对照，测定对照和装置出风口处在同样工况下的病毒数量的差值来表示装置的去除病毒效果。所有测定须重复一定数量满足统计学要求，处理与对照的病毒数量要相差10-100倍才能认定装置具有显著的清除病毒效果。
本发明方法是长时间的前期摸索中确定的最佳噬菌体制备、原液浓度、雾化速度、风速、取样时间、稀释梯度、培养时间等条件下严格按步骤测定的，具有一定的标准化程序。
本发明具有实质性特点和显著进步，本发明是针对室内空气特别是中央空调系统的空气净化装置的去除病毒效果评价而提出的，但还可以应用到各种检测净化消毒的装置和设备内评估其效果，也可脱离本测试系统而应用到空气生物学的一些病毒检测操作中。本发明是一种灵敏、高效、可靠的空气病毒含量和活性测定方法，对于及时、客观地评价中央空调各种病毒清除装置的实际效果具有十分重要的意义，同时为客观评价各种空气净化装置在用于中央空调时的去除和杀灭病毒的效果提供了一个可行的技术方法，对于提高中央空调空气净化器的研究和开发质量，规范市场行为，提供了依据。
具体实施方式
结合本发明的方法提供以下实施例：
实施例1：用噬菌体汽雾评价“静电除尘与紫外线杀毒复合处理装置”(以下简称装置)的病毒清除效果。
将装置安装在系统的处理段。在超声加湿器内加入浓度为106pfu/ml的含有噬菌体的液体。在装置的出风口处迎着风向放置一个直径9厘米的明胶+LB双层板，系统以2.5米/秒风速运行，启动超声加湿器，产生汽雾，持续1分钟后关闭加湿器和风机，取出明胶平板，回收测定每个平板上俘获的噬菌体的数量。系统再次鼓风运行5分钟，然后开始下一次测定。装置处于带电和不带电状态时各测定5次。试验重复3次。装置不带电时每板俘获的噬菌体为90.2±35.79pfu，装置带电运行后每板俘获的噬菌体为8.25±11.01，经统计学检验差异显著，表明该装置具有显著的清除病毒效果。
实施例2：用噬菌体汽雾评价“光催化杀毒除菌复合处理装置”(以下简称装置)的病毒清除效果。
将装置安装在系统的处理段。在超声加湿器内加入浓度为107pfu/ml的含有噬菌体的液体。在装置的出风口处迎着风向放置一个直径9厘米的明胶+LB双层板，系统以5米/秒风速运行，启动超声加湿器，产生汽雾，持续1分钟后关闭加湿器和风机，取出明胶平板，回收测定每个平板上俘获的噬菌体的数量。系统再次鼓风运行10分钟，然后开始下一次测定。用与装置同样形状和大小的风管代替装置，用上述同样参数和工况重复测定，作为对照。使用装置时时每板俘获的噬菌体为测不出。使用空管对照时560±270.14pfu，经统计学检验差异显著，表明该装置具有显著的清除病毒效果。
实施例3：用噬菌体汽雾评价“镀银过滤网杀毒除菌复合处理装置”(以下简称装置)的病毒清除效果。
将装置安装在系统的处理段。在超声加湿器内加入浓度为107pfu/ml的含有噬菌体的液体。在装置的出风口处迎着风向放置一个直径9厘米的明胶+LB双层板，系统以8米/秒风速运行，启动超声加湿器，产生汽雾，持续1分钟后关闭加湿器和风机，取出明胶平板，回收测定每个平板上俘获的噬菌体的数量。系统再次鼓风运行10分钟，然后开始下一次测定。用与装置同样形状和大小的风管代替装置，用上述同样参数和工况重复测定，作为对照。使用装置时时每板俘获的噬菌体为测不出。使用空管对照时780±130。77pfu，经统计学检验差异显著，表明该装置具有显著的清除病毒效果。
Claims (10)
1、一种测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征在于，采用中央空调空气多重净化消毒系统测试平台，在该平台建立的全封闭空气循环系统中，散布噬菌体液滴或粉尘，模拟生物气溶胶，鼓风使气溶胶通过各种待评价的灭病毒处理装置，通过测定装置入口和出口处回收的噬菌体数量来反映其去除病毒的效果。
2、根据权利要求1所述的测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征是，方法包括以下步骤：
(1)测试前的准备，(2)检测用病毒及其制备，(3)病毒的散布和气溶胶的制备，(4)空气采样，(5)噬菌体记数，(6)数据分析。
3、根据权利要求2所述的测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征是，所述的测试前的准备，具体如下：
安装中央空调空气多重净化消毒系统测试平台，该平台建立有全封闭空气循环系统，然后对该系统除尘、杀毒、净化，粉尘或雾通过中央空调空气多重净化消毒系统测试平台试验箱箱体上的孔喷入，多个回收噬菌体的培养皿放入试验箱内，设噬菌体培养皿也放入测试箱内。
4、根据权利要求2所述的测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征是，所述的检测用病毒及其制备，具体如下：
从自然环境分离制备检测用的噬菌体，噬菌体以大肠杆菌为侵染对象，其对温度、干燥等主要环境因子的抵抗力超过各种空气传播的病毒，特别是SARS-CoV病毒，接种一个单菌落的大肠杆菌于5毫升LB培养基，37度振荡培养过夜，取1毫升培养物与100微升噬菌体储备液混匀，37度保温30分钟，然后全部接入装在250毫升三角瓶的50毫升LB培养液中，37度振荡培养4-8小时，培养液由浑浊变为透明，并可观察到絮状沉淀，停止培养，向瓶中加入0.5毫升的氯仿，振荡混合，2500rpm离心10分钟，上清液转移到灭菌的离心管中，加1-2滴氯仿，在4度保存备用。
5、根据权利要求2所述的测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征是，所述的病毒的散布和气溶胶的制备，具体如下：
采用粉尘喷射器或者超声波雾化器进行病毒的散布和气溶胶的制备，向系统中稳定持续的喷入直径在1-5微米的病毒粉尘气溶胶或超声波雾化的1-5微米的浓度为105-107pfu/ml的病毒液滴，制备直径在1-5微米的粉尘，这些粉尘采用各种惰性的对生物分子无反应活性的材料制成，并且颗粒表面经过化学修饰，噬菌体储备液与粉尘混合，经冷冻干燥、超声粉碎，喷雾形成含病毒粉尘的气溶胶用于测试。
6、根据权利要求2所述的测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征是，所述的空气采样，具体如下：
在试验段前后的测试段内采用明胶-LB双层平皿对粉尘或汽雾在与水平面60度夹角迎风面收集1分钟，对噬菌体完成一次空气采样，更换培养皿，重复空气采样操作每个工况5-20次。
7、根据权利要求6所述的测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征是，在试验段前后的测试段内与水平面60度夹角迎风面设置小平台，放置平皿收集噬菌体1分钟，对试验段内安装的空气净化装置的前后噬菌体浓度对比后，评估灭菌效果。
8、根据权利要求2所述的测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征是，所述的噬菌体记数，具体如下：
经过明胶和LB回收、除菌、梯度稀释、平皿培养之后，对所有培养皿开始噬菌斑记数。
9、根据权利要求8所述的测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征是，所述的噬菌体记数，具体步骤如下：
明胶和LB回收：将取样后的平皿装入专用铁筒，37℃保存至明胶融化后，超净台操作将明胶回收移入10mL离心管，平皿装回专用铁筒后灭菌；
除菌：回收的明胶中含有杂菌，在融化状态下，将明胶15000r/min离心10分钟，细菌将沉降到管底；
梯度稀释：取1mL明胶，移入2mL离心管，再在其中吸取100μL明胶移入1.5mL离心管加入900MB液体培养基，旋涡，取100μL移入另一个1.5mL离心管加入900MB液体培养基，旋涡，依次类推，做梯度稀释，对噬菌体培养6小时即可在平皿中得到30-300个噬菌斑；
平皿培养：将以上稀释液各取100μL移入1.5mL离心管后加入300μL指示菌后，旋涡混合后静置15分钟，使噬菌体侵染指示菌，然后倒入7mL 0.4％熔化的素琼脂中，混合后倒入LB固体培养皿中，37℃培养8-12小时；
噬菌斑记数：统计平皿上的噬菌斑数量。
10、根据权利要求2所述的测定空气净化装置去除病毒效果的方法，其特征是，所述的数据分析，具体如下：
系统通风运行时，用明胶平皿回收法测定装置出风口处病毒的数量，如果装置需要通电才发挥作用，则测定其通电和断电两种工况下出口处的病毒回收量，两种工况下的回收病毒的差值反映装置的去除病毒效果，如果装置安装完毕即发挥作用，则用同样形状和大小的风管来作为对照，测定对照和装置出风口处在同样工况下的病毒数量的差值来表示装置的去除病毒效果，重复所有测定，处理与对照的病毒数量相差10-100倍认定装置具有显著的清除病毒效果。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |