CN107873731A - 一种用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料及其活性评价方法和应用 - Google Patents

一种用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料及其活性评价方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料及其活性评价方法和应用，流感病毒主要包括H3、H4、H5（包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支）、H6、H7、H9亚型流感病毒，本发明所提供的含有Fe3O4纳米颗粒的口罩，针对流感病毒具有显著的防护作用，这对于提高活禽交易市场、养禽业从业人员等高危人群对流感的防护能力具有重要意义，Fe3O4纳米材料可以大批量制备，成本低廉、室温保存的稳定性较好、安全性好等特点，因此该抗流感病毒的应用具有一定的经济价值和应用前景。

Description

一种用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料及其活性评价方法和 应用
技术领域
本发明公开了一种Fe3O4纳米材料具有抗流感病毒的功能，并提供了其应用于抗流感病毒防护口罩的方法，属于纳米材料及生物医学纳米技术领域。
背景技术
流行性感冒简称流感（Influenza），是由流感病毒（Influenza virus）引起的一种人畜共患传染病。流感病毒的结构由外到内包括脂质囊膜、基质蛋白以及核酸三部分，囊膜表面分布两种重要的糖蛋白，即血凝素和神经氨酸酶，分别负责病毒的入侵和释放。流感病毒可分为A型、B型和C型流感病毒，其中A型流感病毒对人类的威胁最大。除了季节性人流感病毒以外，禽流感病毒对人类的潜在威胁也在日益增大。自1997年首次报道禽流感病毒能直接感染人以来，先后有H5N1、H9N2、H7N7和H7N9亚型AIV感染人类的报道。截止2017年5月为止，世界卫生组织（WHO）(http://www.who.int)报道全世界已有859例人感染H5N1亚型禽流感病毒，其中453例死亡，死亡率52.7%；已有1486例人感染H7N9亚型AIV，其中572例死亡，死亡率38.5%。疫苗接种虽然是一种重要的防控手段，但由于流感病毒亚型众多，变异较快，疫苗免疫的效果并不理想，而目前认为采取消毒、阻断传播等综合性的生物安全防控措施更为有效，特别是如何提高活禽交易市场、养禽业从业人员等高危人群对流感的防护能力具有重要意义。
Fe3O4纳米材料通常被认为是一种无机的惰性物质，其磁性特征被广泛应用于蛋白质与核酸的分离纯化、细胞标记、肿瘤治疗以及核磁共振成像。2007年发现Fe3O4纳米颗粒本身具有内在类似辣根过氧化物酶的催化活性，是真正意义上的纳米酶，该特性开拓了其在医学检测、免疫诊断、肿瘤治疗、体内示踪检测、环境监测与污水治理等领域的应用前景。该纳米材料还具有在极端环境下较好的稳定性，制备简单、廉价、安全性好，已被美国食品与药品监督管理局（FDA）批准向临床应用。
流感病毒变异较频繁且抗原型较多，不同抗原型间交叉保护性较差，可见通过疫苗防控效果不理想，因此开展综合性的生物安全防控措施更有意义。目前市场上对流感病毒有效的多为毒性较大的化学消毒剂，难以应用于动物或人本身。
本研究挖掘了Fe3O4纳米材料新型生物学功能-具有抗流感病毒的作用，将该功能应用于抗流感防护口罩、空气过滤装置等，将有助于提高老百姓特别是活禽交易市场、养禽业从业人员等高危人群对流感的防护能力。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料及其活性评价方法和应用，本发明的Fe3O4纳米材料，安全性更好，具有抗流感病毒的功能，并提供了其应用于抗流感病毒防护口罩的方法，以此提高活禽交易市场、养禽业从业人员等高危人群对流感的防护能力。
本发明的技术方案如下：一种用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料，其特征是，该纳米材料由Fe3O4采用水热法合成，所述Fe3O4纳米材料的粒径为10-500纳米，所述流感病毒为A型流感病毒。
所述A型流感病毒为H3、H4、H5、H6、H7、H9亚型流感病毒，所述H5亚型流感病毒包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株。
上述用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料活性的评价方法，其特征是，包括以下步骤：
1）备好Fe3O4粉剂、M199细胞培养液， H3、H4、H5、H6、H7、H9亚型流感病毒，其中H5亚型流感病毒包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株，制备1%的鸡红细胞、鸡胚成纤维细胞（CEF细胞）；
2）将Fe3O4粉剂采用水热法合成Fe3O4纳米颗粒，粒径为10-500纳米；
3）称取40 mg 的Fe3O4纳米颗粒于15 ml离心管中，并加入10 ml的无水乙醇，然后放入超声波清洗仪中超声15 min；随后用磁铁将超声过的Fe3O4纳米颗粒吸至离心管的底部，弃上清（上层清液），再加入5 ml PBS缓冲液（磷酸盐缓冲溶液）清洗三遍，弃上层清液（清洗三遍指的是加入PBS，用磁铁将超声过的Fe3O4纳米颗粒吸至离心管的底部，弃上清，循环操作三次），目的为了去除未弃干净的无水乙醇；
4）加入4 ml的PBS缓冲液重悬被磁铁吸到管底的Fe3O4纳米颗粒，调整Fe3O4纳米颗粒的浓度为10 mg/ml，该浓度为Fe3O4纳米颗粒的储存浓度；分别配置浓度为4 mg/ml、2 mg/ml、1mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml的Fe3O4纳米颗粒悬液；
5）将上述配置好的不同浓度的Fe3O4纳米颗粒悬液分别与200 μl的H3、H4、H5、H6、H7、H9不同亚型的流感病毒尿囊液作用2 h后，检测10株流感病毒的血凝效价（HA效价）和组织半数感染量（TCID50）的变化；其中H5亚型流感病毒包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株；检测10株流感病毒的血凝效价需用1%的鸡红细胞检测，检测组织半数感染量的变化时需用鸡胚成纤维细胞检测，培养鸡胚成纤维细胞的培养液为M199细胞培养液；
6）血凝效价（HA效价）的测定：
① 1%鸡红细胞悬液的制备：采集新鲜鸡血于含抗凝剂（枸橼酸钠溶液）的锥形瓶中；将抗凝鸡血分装于10 ml离心管中配平并离心1200 rpm，10 min；吸上清，并吸弃最上层的白色粘稠均质（白细胞和血小板集中的部分）；加10 ml PBS 用滴管轻轻将红细胞重新悬浮；重复上述步骤2次，必要时可洗4次直至上清清亮透明，最后一次1200 rpm，离心15 min，取出并测量红细胞体积，吸弃上清，并加PBS按体积比配成1%的红细胞溶液，4℃保存备用。使用前需摇匀红细胞；
② 在96孔血凝板中每孔加入25 μl PBS；在96孔血凝板的第1列孔中加入25 μl病毒，从左至右倍比稀释至第11孔，弃掉25 μl。第12孔为阴性对照。每孔补加25 μl PBS；在每孔中均加入25 μl 1%红细胞，轻轻震荡血凝板使孔内液体混匀；将血凝板放置37℃温箱10min；放置规定时间后，将V形血凝板倾斜，使阴性对照孔红细胞挂线。然后观察其它实验孔，取红细胞完全不挂线的稀释度为该病毒的HA效价；
7）组织培养物半数感染量（TCID50）的测定：
将CEF细胞接种到96孔细胞培养板中，待细胞形成单层后，去除培养上清并用无菌PBS洗涤2次，随后将10倍系列稀释的病毒液接种至细胞表面，感染后的细胞在37℃，5% CO2条件下继续培养，感染72 h后统计感染阳性孔数，根据Reed-Muench法计算TCID50；
8）Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H3亚型流感病毒的HA效价显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml、2 mg/ml时，病毒HA效价降为0；纳米颗粒在0.25 mg/ml-4 mg/ml时，可使H3亚型流感病毒的TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4mg/ml时，病毒TCID50滴度降为0；
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H4亚型流感病毒的HA效价和TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml时，病毒TCID50滴度降为0；
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml和2 mg/ml时，可使H6亚型流感病毒的HA效价显著下降；Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml时，可使H6亚型流感病毒的TCID50滴度显著下降；
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H7亚型流感病毒的HA效价和TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml和2 mg/ml时，病毒HA效价和TCID50滴度均降为0；
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H9亚型流感病毒的HA效价显著下降，纳米颗粒在0.5 mg/ml-4 mg/ml时，可使H9亚型流感病毒的TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml和2 mg/ml时，病毒TCID50滴度降为0；
不同浓度的Fe3O4纳米颗粒显著引起H5亚型的各分支病毒HA效价和TCID50滴度不同程度的下降。
上述用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料的应用，其特征是，利用Fe3O4纳米颗粒制作抗流感病毒防护口罩，该口罩罩体由内到外依次分为八层，第一层为无纺布层，第二层为脱脂棉纱布层，第三层为Fe3O4纳米颗粒的脱脂棉纱布层，第四层至第七层为脱脂棉纱布层，第八层为无纺布层；
其中第三层Fe3O4纳米颗粒的脱脂棉纱布层的制备方法包括以下步骤：
A. 称取40 mg的Fe3O4纳米颗粒于15 ml离心管中，并加入10 ml的无水乙醇，然后放入超声波清洗仪中超声15 min；随后用磁铁将超声过的Fe3O4纳米颗粒吸至离心管的底部，弃上清，再加入5 ml PBS缓冲液清洗三遍，弃上清；
加入4 ml的PBS缓冲液重悬被磁铁吸到管底的Fe3O4纳米颗粒，调整Fe3O4纳米颗粒的浓度为10 mg/ml，该浓度为Fe3O4纳米颗粒的储存浓度，根据需要配置浓度为0.125-4 mg/ml的Fe3O4纳米颗粒悬液；
B. 将A中配置好的Fe3O4纳米颗粒悬液均匀滴加至第三层脱脂棉纱布中，使作用浓度达到0.1-0.8 mg/cm2，随后用吹风机将纱布吹干，使Fe3O4纳米颗粒完全吸附至该层脱脂棉纱布上，缝合口罩。
所述口罩抗流感病毒防护的评价方法为：将H5N1亚型流感病毒尿囊液均匀滴加至纱布的最外层上，室温放置0.5 -1 h后，随机剪取5 cm2口罩，包括1-8层，随后滴加400 μl无菌PBS将流感病毒从口罩中洗脱，测定洗脱液中流感病毒血凝效价和半数细胞感染量，以评价该口罩的抗流感病毒防护效果。
本发明以Fe3O4为原料，制备纳米颗粒，与不同亚型的A型流感病毒相互作用，通过血凝（HA）效价试验和半数细胞感染量（TCID50）评价该纳米颗粒的抗流感病毒功效；Fe3O4纳米颗粒粒径优选范围为10-500纳米范围内，Fe3O4纳米颗粒试验所用浓度范围为0.125-4mg/ml。
本发明的有益效果如下：
本发明涉及Fe3O4纳米颗粒的制备工艺方法科学合理、简单、成本低廉，稳定性好，而且安全无毒；Fe3O4纳米颗粒可以显著降低或杀灭多种亚型的流感病毒，其中包括H3、H4、H5（包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支）、H6、H7、H9亚型流感病毒；将Fe3O4纳米颗粒应用于抗流感病毒防护口罩，起到了显著的防护作用，这对于提高活禽交易市场、养禽业从业人员等高危人群对流感的防护能力具有重要意义。
本发明的Fe3O4纳米材料可以大批量制备，成本低廉、室温保存的稳定性较好、安全性好等特点，因此该抗流感病毒的应用具有一定的经济价值和应用前景。
附图说明
图1为Fe3O4纳米颗粒对多种亚型流感病毒具有抗病毒作用，包括H3、H4、H6、H7、H9亚型流感病毒（﹡ P＜0.05差异显著；﹡﹡ P＜0.01差异极显著）；
图2为Fe3O4纳米颗粒对H5亚型多种分支毒株具有抗病毒作用，包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株（﹡ P＜0.05差异显著；﹡﹡ P＜0.01差异极显著）；
图3 （A）为基于Fe3O4纳米颗粒抗流感防护口罩结构示意图；
图3（B）为利用HA效价评价抗流感口罩防护流感病毒的效果；
图3（C）为利用TCID50滴度评价抗流感口罩防护流感病毒的效果（﹡ P＜0.05差异显著；﹡﹡ P＜0.01差异极显著）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1：Fe3O4纳米颗粒抗流感病毒活性的评价
试验材料：Fe3O4粉剂购于北京化学试剂公司；H3、H4、H5（包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株）、H6、H7、H9亚型流感病毒由农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离、鉴定和保存。1%的鸡红细胞、鸡胚成纤维细胞（CEF）均由本实验室制备提供；M199细胞培养液购于Hyclone公司。
方法：1）Fe3O4纳米颗粒的合成。
Fe3O4纳米颗粒是由水热法合成（参见W. Q. Jiang, etc, J Magn. Magn. Mater.283, 210 (2004)和H. Deng, etc, Angew. Chem. Int. Ed. 44, 2782(2005)）。
2）Fe3O4纳米颗粒与流感病毒作用
称取40 mg的Fe3O4纳米颗粒于15 ml离心管中，加入10 ml的无水乙醇，放入超声波清洗仪中超声15 min，随后用磁铁将超声过的Fe3O4纳米颗粒吸至离心管的底部，弃上层清液，加入5 ml PBS缓冲液清洗三遍，弃上清，目的为了去除未弃干净的无水乙醇。
加入4 ml的PBS重悬被磁铁吸到管底的Fe3O4纳米颗粒，调整Fe3O4纳米颗粒的浓度为10 mg/ml，该浓度为Fe3O4纳米颗粒的储存浓度，分别配置浓度为4 mg/ml、2 mg/ml、1mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml的Fe3O4纳米颗粒悬液。
将上述配置好的不同浓度的Fe3O4纳米颗粒分别与200 μl的H3、H4、H5（具体包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株）、H6、H7、H9不同亚型的流感病毒尿囊液作用2 h后，检测10株流感病毒的血凝效价（HA）和组织半数感染量（TCID50）的变化。
3）血凝效价（HA效价）的测定：① 1%鸡红细胞悬液的制备：采集新鲜鸡血于含抗凝剂（枸橼酸钠溶液）的锥形瓶中。将抗凝鸡血分装于10 ml离心管中配平并离心1200 rpm，10min；吸上清，并吸弃最上层的白色粘稠均质（白细胞和血小板集中的部分）；加10 ml PBS用滴管轻轻将红细胞重新悬浮；重复上述步骤2次，必要时可洗4次直至上清清亮透明，最后一次1200 rpm，离心15 min，取出并测量红细胞体积，吸弃上清，并加PBS按体积比配成1%的红细胞溶液，4℃保存备用。使用前需摇匀红细胞。② 在96孔血凝板中每孔加入25 μl PBS；在96孔血凝板的第一列孔中加入25 μl病毒，从左至右倍比稀释至第11孔，弃掉25 μl。第12孔为阴性对照。每孔补加25 μl PBS；在每孔中均加入25 μl 1%红细胞，轻轻震荡血凝板使孔内液体混匀；将血凝板放置37℃温箱10 min；放置规定时间后，将V形血凝板倾斜，使阴性对照孔红细胞挂线。然后观察其它实验孔，取红细胞完全不挂线的稀释度为该病毒的HA效价。
4）组织培养物半数感染量（TCID50）的测定：将CEF细胞接种到96孔细胞培养板中，待细胞形成单层后，去除培养上清并用无菌PBS洗涤2次，随后将10倍系列稀释的病毒液接种至细胞表面，感染后的细胞在37℃，5% CO2条件下继续培养，感染72 h后统计感染阳性孔数，根据Reed-Muench法（Reed LML. Am J Hyg, 27: 493-497（1938））计算TCID50。
试验结果：如图1所示，Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，与对照组相比，可使H3亚型流感病毒的HA效价显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml、2 mg/ml时，病毒HA效价降为0；
纳米颗粒在0.25 mg/ml-4 mg/ml时，可使H3亚型流感病毒的TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml时，病毒TCID50滴度降为0。
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H4亚型流感病毒的HA效价和TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml时，病毒TCID50滴度降为0。
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml和2 mg/ml时，可使H6亚型流感病毒的HA效价显著下降；Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml时，可使H6亚型流感病毒的TCID50滴度显著下降。
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H7亚型流感病毒的HA效价和TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml和2 mg/ml时，病毒HA效价和TCID50滴度均降为0。
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H9亚型流感病毒的HA效价显著下降，纳米颗粒在0.5 mg/ml-4 mg/ml时，可使H9亚型流感病毒的TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml和2 mg/ml时，病毒TCID50滴度降为0。
如图2所示，不同浓度的Fe3O4纳米颗粒也可以显著引起H5亚型的各分支病毒（Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株）HA效价和TCID50滴度不同程度的下降。
上述结果表明，Fe3O4纳米颗粒对多种不同亚型或分支的流感病毒具有显著的抗病毒作用。因此可将Fe3O4纳米颗粒作为一种新型的抗流感病毒材料，从而为流感病毒的防控提供新的视角。
实施例2：Fe3O4纳米颗粒应用于抗流感病毒防护口罩
试验材料：Fe3O4粉剂购于北京化学试剂公司；H5N1亚型流感病毒（SY株，鸡胚尿囊液来源）由农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离、鉴定和保存。1%的鸡红细胞、鸡胚成纤维细胞（CEF）均由本实验室制备提供；M199细胞培养液购于Hyclone公司。
方法：1）Fe3O4纳米颗粒的合成。
Fe3O4纳米颗粒是由水热法合成（参见W. Q. Jiang, etc, J Magn. Magn. Mater.283, 210 (2004)和H. Deng, etc, Angew. Chem. Int. Ed. 44, 2782(2005)）。
2）基于Fe3O4纳米颗粒的抗流感病毒防护口罩制备方法。
如附图3（A）所示，用脱脂棉纱布以及无纺布缝制口罩，由罩体I、耳带II构成，罩体I两端四角上均设有一连接点III，其罩体I与耳带II通过连接点III相连接，罩体I由内到外依次分为八层，第一层为无纺布层、第二层为脱脂棉纱布层、第三层为Fe3O4纳米颗粒的脱脂棉纱布层、第四层至第七层为脱脂棉纱布层、第八层为无纺布层。本发明最里层和最外层均为无纺布层给佩戴者制造相对舒适的佩戴环境。
其中第三层Fe3O4纳米颗粒的脱脂棉纱布层制备包括：A. 如实施例1中方法配置浓度为4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml、0.5 mg/ml的Fe3O4纳米颗粒悬液；
B. 将A中配置好的Fe3O4纳米颗粒均匀滴加至第三层脱脂棉纱布中，使作用浓度分别达到0.8 mg/cm2、0.4 mg/cm2、0.2 mg/cm2、0.1 mg/cm2，随后用吹风机将纱布吹干，使Fe3O4纳米颗粒完全吸附至该层脱脂棉纱布上，缝合口罩；同时制备不加Fe3O4纳米颗粒的口罩，作为对照组；
C. 将H5N1亚型流感病毒（SY株）尿囊液均匀滴加至纱布的最外层（即第八层）上，室温放置0.5 h或1 h后，随机剪取5 cm2口罩（包括1-8层），随后滴加400 μl无菌PBS将流感病毒从口罩中洗脱，测定洗脱液中流感病毒血凝效价（HA）和半数细胞感染量（TCID50），以评价该口罩的抗流感病毒防护效果。
D. 血凝效价（HA效价）的测定：① 1%鸡红细胞悬液的制备：采集新鲜鸡血于含抗凝剂（枸橼酸钠溶液）的锥形瓶中。将抗凝鸡血分装于10 ml离心管中配平并离心1200 rpm，10 min；吸上清，并吸弃最上层的白色粘稠均质（白细胞和血小板集中的部分）；加10 mlPBS 用滴管轻轻将红细胞重新悬浮；重复上述步骤2次，必要时可洗4次直至上清清亮透明，最后一次1200 rpm，离心15 min，取出并测量红细胞体积，吸弃上清，并加PBS按体积比配成1%的红细胞溶液，4℃保存备用。使用前需摇匀红细胞。② 在96孔血凝板中每孔加入25 μlPBS；在96孔血凝板的第一列孔中加入25 μl病毒，从左至右倍比稀释至第11孔，弃掉25 μl。第12孔为阴性对照。每孔补加25 μl PBS；在每孔中均加入25 μl 1%红细胞，轻轻震荡血凝板使孔内液体混匀；将血凝板放置37℃温箱10 min；放置规定时间后，将V形血凝板倾斜，使阴性对照孔红细胞挂线。然后观察其它实验孔，取红细胞完全不挂线的稀释度为该病毒的HA效价。
E. 组织培养物半数感染量（TCID50）的测定：将CEF细胞接种到96孔细胞培养板中，待细胞形成单层后，去除培养上清并用无菌PBS洗涤2次，随后将10倍系列稀释的病毒液接种至细胞表面，感染后的细胞在37℃，5% CO2条件下继续培养，感染72 h后统计感染阳性孔数，根据Reed-Muench法（Reed LML. Am J Hyg, 27: 493-497（1938））计算TCID50。
试验结果：如附图3（B）和（C）所示：当Fe3O4纳米颗粒的作用浓度分别达到0.8 mg/cm2、0.4 mg/cm2、0.2 mg/cm2、0.1 mg/cm2时，与不添加Fe3O4纳米颗粒的对照口罩相比，可使流感病毒的HA效价和TCID50滴度显著降低，特别是当纳米颗粒的作用浓度分别达到0.8/cm2、0.4/cm2、0.2/cm2时，0.5 h和1 h作用后，可使流感病毒的HA效价下降为0，当浓度达到0.8 mg/cm2、0.4 mg/cm2、0.2 mg/cm2、0.1 mg/cm2时，0.5 h和1 h作用后，可使流感病毒的TCID50滴度下降为0。
以上结果表明，基于Fe3O4纳米颗粒制备的抗流感防护口罩具有显著的防护流感病毒的作用。

Claims (5)

1.一种用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料，其特征是，该纳米材料由Fe3O4采用水热法合成，所述Fe3O4纳米材料的粒径为10-500纳米，所述流感病毒为A型流感病毒。
2.根据权利要求1所述的用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料，其特征是，所述A型流感病毒为H3、H4、H5、H6、H7、H9亚型流感病毒，所述H5亚型流感病毒包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料活性的评价方法，其特征是，包括以下步骤：
1）备好Fe3O4粉剂、M199细胞培养液、H3、H4、H5、H6、H7、H9亚型流感病毒，其中H5亚型流感病毒包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株，制备1%的鸡红细胞、鸡胚成纤维细胞；
2）将Fe3O4粉剂采用水热法合成Fe3O4纳米颗粒，粒径为10-500纳米；
3）称取40 mg的 Fe3O4纳米颗粒于15 ml离心管中，并加入10 ml无水乙醇，然后放入超声波清洗仪中超声15 min；随后用磁铁将超声过的Fe3O4纳米颗粒吸至离心管的底部，弃上清，再加入5 ml PBS缓冲液清洗三遍，弃上清，目的为了去除未弃干净的无水乙醇；
4）加入4 ml的PBS重悬被磁铁吸到管底的Fe3O4纳米颗粒，调整Fe3O4纳米颗粒的浓度为10 mg/ml，该浓度为Fe3O4纳米颗粒的储存浓度；分别配置浓度为4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml的Fe3O4纳米颗粒悬液；
5）将上述配置好的不同浓度的Fe3O4纳米颗粒悬液分别与200 μl的H3、H4、H5、H6、H7、H9不同亚型的流感病毒尿囊液作用2 h后，检测10株流感病毒的血凝效价和组织半数感染量的变化；其中H5亚型流感病毒包括Clade0、Clade2.3.4、Clade2.3.2.1、Clade7.2、Clade2.3.4.4分支毒株；
6）Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H3亚型流感病毒的HA效价显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml、2 mg/ml时，病毒HA效价降为0；纳米颗粒在0.25mg/ml-4 mg/ml时，可使H3亚型流感病毒的TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml时，病毒TCID50滴度降为0；
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H4亚型流感病毒的HA效价和TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml时，病毒TCID50滴度降为0；
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml和2 mg/ml时，可使H6亚型流感病毒的HA效价显著下降；Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml时，可使H6亚型流感病毒的TCID50滴度显著下降；
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H7亚型流感病毒的HA效价和TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml和2 mg/ml时，病毒HA效价和TCID50滴度均降为0；
Fe3O4纳米颗粒的浓度为4 mg/ml、2 mg/ml以及1 mg/ml时，可使H9亚型流感病毒的HA效价显著下降，纳米颗粒在0.5 mg/ml-4 mg/ml时，可使H9亚型流感病毒的TCID50滴度显著下降，特别是纳米颗粒在4 mg/ml和2 mg/ml时，病毒TCID50滴度降为0；
不同浓度的Fe3O4纳米颗粒显著引起H5亚型的各分支病毒HA效价和TCID50滴度不同程度的下降。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料的应用，其特征是，利用Fe3O4纳米颗粒制作抗流感病毒防护口罩，该口罩罩体由内到外依次分为八层，第一层为无纺布层，第二层为脱脂棉纱布层，第三层为Fe3O4纳米颗粒的脱脂棉纱布层，第四层至第七层为脱脂棉纱布层，第八层为无纺布层；
其中第三层Fe3O4纳米颗粒的脱脂棉纱布层的制备方法包括以下步骤：
A. 称取40 mg的 Fe3O4纳米颗粒于15 ml离心管中，并加入10 ml的无水乙醇，然后放入超声波清洗仪中超声15 min；随后用磁铁将超声过的Fe3O4纳米颗粒吸至离心管的底部，弃上清，再加入5 ml PBS缓冲液清洗三遍，弃上清；
加入4 ml的PBS缓冲液重悬被磁铁吸到管底的Fe3O4纳米颗粒，调整Fe3O4纳米颗粒的浓度为10 mg/ml，该浓度为Fe3O4纳米颗粒的储存浓度，根据需要配置浓度为0.125-4 mg/ml的Fe3O4纳米颗粒悬液；
B. 将A中配置好的Fe3O4纳米颗粒悬液均匀滴加至第三层脱脂棉纱布中，使作用浓度达到0.1-0.8 mg/cm2，随后用吹风机将纱布吹干，使Fe3O4纳米颗粒完全吸附至该层脱脂棉纱布上，缝合口罩。
5.根据权利要求4所述的用于抗流感病毒的Fe3O4纳米材料的应用，其特征是，所述口罩抗流感病毒防护的评价方法为：将H5N1亚型流感病毒尿囊液均匀滴加至纱布的最外层上，室温放置0.5 -1 h后，随机剪取5 cm2口罩，包括1-8层，随后滴加400 μl无菌PBS缓冲液将流感病毒从口罩中洗脱，测定洗脱液中流感病毒血凝效价和半数细胞感染量，以评价该口罩的抗流感病毒防护效果。
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