CN106148476A

CN106148476A - 环境空气中藻细胞滤膜式采样与培养的方法

Info

Publication number: CN106148476A
Application number: CN201510173494.8A
Authority: CN
Inventors: 梁文艳; 王媛媛; 胡静茹
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明涉及环境空气微生物监测领域，具体地，本发明涉及环境空气中藻细胞滤膜式采样与培养的方法。所述方法包括以下步骤：1）采样滤膜和液体培养液的灭菌；2）滤膜采样夹的消毒；3）空气藻细胞的采集；4）空气藻细胞采样滤膜的培养，获得空气中藻细胞样品。本发明提供的方法优点在于该法能够有效的采集到空气中藻细胞，并使所采集到的藻细胞能够在实验室条件下培养生长。

Description

环境空气中藻细胞滤膜式采样与培养的方法

技术领域

本发明涉及环境空气微生物监测领域，具体地，本发明涉及环境空气中藻细胞滤膜式采样与培养的方法。

背景技术

近年来，环境空气污染问题备受关注。通常，环境空气污染分为物理化学性污染和微生物污染。目前对环境空气污染关注的焦点仍是物化性质的污染，如：烟尘、粉尘、TSP、PM₁₀、PM_2.5、SO₂、NO_x、光化学烟雾等，对微生物的问题关注较少，而对于空气中藻细胞的了解更是少之又少。

从微生物自身角度来看，空气中微生物无处不在，空气中的微生物在强烈的光照下会很快的失去活性或死亡，但当它们遇到适宜的生存条件就会大量繁殖，造成一定空间范围内数量的骤增，使位于该区域免疫低下的人和其他生物因接触、呼吸、吸食而感染。与此同时，很多物理性污染物，如灰尘、粉粒等，为微生物提供载体，微生物常附着于其上以生物气溶胶的形式存在于空气中，随着气候变化造成了微生物污染范围的进一步扩大。因此，空气微生物污染问题不容忽视。

藻类细胞是空气微生物中具有光合作用的低等植物类细胞，藻类细胞在空气中形成的生物气溶胶粒径一般为0.5µm，是属于PM_2.5范围的空气气溶胶。空气中的藻细胞，如蓝绿藻中的微囊藻会产生微囊藻毒素，微囊藻毒素除了可以直接对人畜产生毒害之外，也是肝癌的重要诱因。由于藻类细胞形成的空气气溶胶粒径较小，而且细胞内物质组成复杂，当这些藻细胞通过呼吸道进入人体后，能对人体神经系统、呼吸系统等造成伤害，同时也能与其他的化学、物理污染物产生联合作用而造成更大的危害。

对空气微生物所建立的采样与培养方法，目前主要是针对空气中的异养细菌、光合细菌、真菌、病毒、噬菌体等微生物，缺乏针对空气中藻类细胞的采样与培养方法。与这些微生物不同，藻细胞是具有光合作用的微生物体，其生长环境和培养方式与一般细胞、真菌、病毒完全不同。在采用过滤阻留式采集法进行空气微生物采集与培养的过程中，是让空气通过滤膜而使微生物粒子阻留在滤膜上，然后将滤膜倒扣放置于固体培养基上进行培养。但是由于藻细胞的生长需要光照，而覆盖在固体培养基上的滤膜阻挡了光线的入射，从而影响藻细胞生长繁殖。在过滤阻留式采集法中，由于藻细胞个体比一般细菌和真菌要大，过高的气流速度和撞击力将影响藻细胞活性，使空气中具有活性的藻细胞在采集过程中死亡而影响后续的培养。

本发明采用常规的环境空气颗粒物采样装置，将采集藻细胞的滤膜放置于液体培养基中进行培养，以实现空气中藻细胞采样监测。与传统的环境空气微生物采样与培养方法相比，该方法能够保证藻细胞采集过程中的活性，能够使藻细胞生长不受其他微生物的干扰，培养所得样品纯净，易于观测。该方法操作简单，培养效果好，能够实现空气中蓝绿藻和绿藻的采集与培养。

发明内容

本发明的目的在于提供一种空气中藻类细胞采样及培养的方法，以解决空气中藻细胞的采集问题，并使所采集的藻细胞能够在实验室条件下实现生长。

根据本发明的方法包括以下步骤：

（1）对采样用滤膜和液体培养基进行高压灭菌；

（2）拆开空气颗粒物采样器的滤膜夹，对每一个构件进行消毒；

（3）将滤膜安装在滤膜夹内，并安装好空气颗粒物采样器；

（4）对空气中藻细胞进行滤膜式采样；

（5）采样后的滤膜浸泡于盛装有液体培养基的透明玻璃容器中；

（6）将容器放入光照培养箱中进行培养。

进一步，本发明所述藻类优先为蓝绿藻和绿藻。

进一步，在步骤（1）中，所使用的滤膜为下列之一：玻璃纤维滤膜、石英滤膜、聚氯乙烯滤膜、聚丙烯滤膜、聚四氟乙烯滤膜、混合纤维滤膜，更进一步，所述滤膜孔径≤0.45µm。

进一步，在步骤（3）中，使用75%-95%的乙醇水溶液对滤膜夹各构件进行擦拭消毒，擦拭2-4遍。

进一步，在步骤（4）中，所述的采样装置优选中流量空气颗粒物采样器，可选用气流采样速度为60-120L/min，采集时间为2-12小时。

进一步，在步骤（5）中，所述液体培养基为下列之一：BG-11培养基、BB培养基、SE培养基，为本领域公知液体培养基。

更进一步，BG-11培养液终浓度组成为：NaNO₃ 1500 mg/L、K₂HPO₄ 40 mg/L、MgSO₄·7H₂O 75 mg/L、CaCl₂·2H₂O 36 mg/L、柠檬酸6 mg/L、柠檬酸铁铵6 mg/L、Na₂EDTA 1 mg/L、Na₂CO₃ 20 mg/L、H₃BO₃ 2.86 mg/L、MnCl₂·4H₂O 1.81 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 0.222 mg/L、NaMoO₄·2H₂O 0.39 mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.079 mg/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494 mg/L；BB培养液终浓度组成为：NaNO₃ 25 mg/L、CaCl₂·2H₂O 2.5 mg/L、MgSO₄·7H₂O 7.7 mg/L、K₂HPO₄ 7.5 mg/L、KH₂PO₄ 17.5 mg/L、NaCl 2.5 mg/L、Na₂EDTA 50 mg/L、KOH 31 mg/L、FeSO₄·7H₂O 4.98 mg/L、浓H₂SO₄1mL、H₃BO₃11.42 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.82 mg/L、MnCl₂·4H₂O 1.44 mg/L、MoO₃ 0.71 mg/L、CuSO₄·5H₂O 1.57 mg/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.49 mg/L；SE培养基：NaNO₃25 mg/L、NaCl 2.5 mg/L、MgSO₄·7H₂O 7.5 mg/L、MnCl₂·4H₂O 0.181 mg/L、KH₂PO₄17.5 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 0.022 mg/L、Na₂EDTA 1 mg/L、CaCl₂2.5 mg/L、H₃BO₃ 0.286 mg/L、FeCl₃·6H₂O mg/L 1.31、Na₂MnO₄·2H₂O 0.0039 mg/L、K₂HPO₄ 7.5 mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0079 mg/L、土壤浸出液4mL。

更进一步，培养基配制后用碱性水溶液或酸性水溶液调节pH值为7.1-7.2，所述碱性水溶液优选为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液，更优选摩尔浓度为1-2mol/L的氢氧化钠水溶液或摩尔浓度为1-2mol/L的氢氧化钾水溶液，所述酸性水溶液优选为硫酸水溶液或盐酸水溶液，更优选摩尔浓度为1-2mol/L的硫酸水溶液或摩尔浓度为1-2mol/L的盐酸水溶液。

更进一步，在步骤（5）中，所述液体培养基体积为透明玻璃容器容积的15%-40%。

进一步，在步骤（6）中，培养温度为25-30℃，昼:夜比为20:4-8:16，光照强度为1000Lux-4000Lux，培养时间为4-20天。

与其他空气微生物采集培养方法相比，本发明提供的方法优点在于，该方法能够保证藻细胞采集过程中的活性，能够使藻细胞生长不受其他微生物的干扰，能够采集并培养种类丰富的藻细胞，所培养藻细胞的样品纯净，易于观测和分离。该方法具有简便有效、经济实用、在一般实验条件下即可实现并且相对稳定的特点，能够实现空气中的蓝绿藻和绿藻细胞的采集与培养。

具体实施方式

实施例 1 使用玻璃纤维滤膜采样和 BG11 培养基培养藻细胞

取玻璃纤维滤膜用牛皮纸包装好，于121℃条件下进行高压灭菌30min。拆开空气颗粒物采样器的滤膜夹，使用95%的乙醇水溶液对滤膜夹各构件进行擦拭消毒，擦拭3遍，将灭菌后的玻璃纤维滤膜取出，放入消毒后的采样夹中。开启中流量空气颗粒物采样器，气流采样速度为80L/min，采集时间为4小时。配制BG11培养基于500mL透明玻璃锥形瓶中，调节培养基pH值为7.1-7.2，于121℃条件下进行高压灭菌30min。将采样后的玻璃纤维滤膜取出，立即放入盛装有BG11培养基的锥形瓶中。锥形瓶放入光照培养箱中，培养温度为25℃，昼:夜比为10:14，光照强度为2000Lux，培养时间为14天。在培养的第7天，玻璃纤维滤膜上开始有绿色小点长出。在第14天，玻璃纤维滤膜表面会被绿色覆盖，于显微镜下观察到有集胞藻属、束丝藻属和席藻属的藻细胞。

实施例 2 使用玻璃纤维滤膜采样和 BB 培养基培养藻细胞

取玻璃纤维滤膜用牛皮纸包装好，于121℃条件下进行高压灭菌30min。拆开空气颗粒物采样器的滤膜夹，使用95%的乙醇水溶液对滤膜夹各构件进行擦拭消毒，擦拭3遍，将灭菌后的玻璃纤维滤膜取出，放入消毒后的采样夹中。开启中流量空气颗粒物采样器，气流采样速度为70L/min，采集时间为3小时。配制BB培养基于500mL透明玻璃锥形瓶中，调节培养基pH值为7.1-7.2，于121℃条件下进行高压灭菌30min。将采样后的玻璃纤维滤膜取出，立即放入盛装有BB培养基的锥形瓶中。锥形瓶放入光照培养箱中，培养温度为30℃，昼:夜比为16:8，光照强度为3000Lux，培养时间为14天。在培养的第5天，玻璃纤维滤膜上开始有绿色小点长出。在第14天，玻璃纤维滤膜表面会被绿色覆盖，于显微镜下观察到有绿球藻属、球藻属和席藻属的藻细胞。

实施例 3 使用聚氯乙烯滤膜采样和 BB 培养基培养藻细胞

取聚氯乙烯滤膜用牛皮纸包装好，于121℃条件下进行高压灭菌30min。拆开空气颗粒物采样器的滤膜夹，使用85%的乙醇水溶液对滤膜夹各构件进行擦拭消毒，擦拭3遍，将灭菌后的聚氯乙烯滤膜取出，放入消毒后的采样夹中。开启中流量空气颗粒物采样器，气流采样速度为80L/min，采集时间为6小时。配制BB培养基于500mL透明玻璃锥形瓶中，调节培养基pH值为7.1-7.2，于121℃条件下进行高压灭菌30min。将采样后的聚氯乙烯滤膜取出，立即放入盛装有BB培养基的锥形瓶中。锥形瓶放入光照培养箱中，培养温度为30℃，昼:夜比为16:8，光照强度为3000Lux，培养时间为14天。在培养的第5天，聚氯乙烯滤膜上开始有绿色小点长出。在第14天，聚氯乙烯滤膜表面会被绿色覆盖，于显微镜下观察到有束丝藻属、葡萄藻属和颤藻属的藻细胞。

实施例 4 使用混合纤维滤膜采样和 BG11 培养基培养藻细胞

取混合纤维滤膜用牛皮纸包装好，于121℃条件下进行高压灭菌30min。拆开空气颗粒物采样器的滤膜夹，使用95%的乙醇水溶液对滤膜夹各构件进行擦拭消毒，擦拭3遍，将灭菌后的混合纤维滤膜取出，放入消毒后的采样夹中。开启中流量空气颗粒物采样器，气流采样速度为60L/min，采集时间为8小时。配制BG11培养基于500mL透明玻璃锥形瓶中，调节培养基pH值为7.1-7.2，于121℃条件下进行高压灭菌30min。将采样后的混合纤维滤膜取出，立即放入盛装有BG11培养基的锥形瓶中。锥形瓶放入光照培养箱中，培养温度为25℃，昼:夜比为10:14，光照强度为2000Lux，培养时间为10天。在培养的第5天，混合纤维滤膜上开始有绿色小点长出。在第10天，混合纤维滤膜表面会被绿色覆盖，于显微镜下观察到有集胞藻属、束丝藻属和小球藻属的藻细胞。

实施例 5 使用石英滤膜采样和 BB 培养基培养藻细胞

取石英滤膜用牛皮纸包装好，于121℃条件下进行高压灭菌30min。拆开空气颗粒物采样器的滤膜夹，使用95%的乙醇水溶液对滤膜夹各构件进行擦拭消毒，擦拭4遍，将灭菌后的石英滤膜取出，放入消毒后的采样夹中。开启中流量空气颗粒物采样器，气流采样速度为80L/min，采集时间为4小时。配制BB培养基于500mL透明玻璃锥形瓶中，调节培养基pH值为7.1-7.2，于121℃条件下进行高压灭菌30min。将采样后的石英滤膜取出，立即放入盛装有BB培养基的锥形瓶中。锥形瓶放入光照培养箱中，培养温度为25℃，昼:夜比为12:12，光照强度为3000Lux，培养时间为16天。在培养的第8天，石英滤膜上开始有绿色小点长出。在第16天，石英滤膜表面会被绿色覆盖，于显微镜下观察到有束丝藻属、球藻属、葡萄藻属和颤藻属的藻细胞。

实施例 6 使用聚丙烯滤膜采样和 SE 培养基培养藻细胞

取聚丙烯滤膜用牛皮纸包装好，于121℃条件下进行高压灭菌30min。拆开空气颗粒物采样器的滤膜夹，使用95%的乙醇水溶液对滤膜夹各构件进行擦拭消毒，擦拭4遍，将灭菌后的聚丙烯滤膜取出，放入消毒后的采样夹中。开启中流量空气颗粒物采样器，气流采样速度为80L/min，采集时间为4小时。配制SE培养基于500mL透明玻璃锥形瓶中，调节培养基pH值为7.1-7.2，于121℃条件下进行高压灭菌30min。将采样后的聚丙烯滤膜取出，立即放入盛装有SE培养基的锥形瓶中。锥形瓶放入光照培养箱中，培养温度为25℃，昼:夜比为10:14，光照强度为2500Lux，培养时间为18天。在培养的第8天，聚丙烯滤膜上开始有绿色小点长出。在第18天，聚丙烯滤膜表面会被绿色覆盖，于显微镜下观察到有束丝藻属、球藻属、葡萄藻属和颤藻属的藻细胞。

Claims

1.本发明公开了环境空气中藻细胞滤膜式采样与培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）对采样用滤膜和液体培养基进行高压灭菌；

（3）将滤膜安装在滤膜夹内，并安装好空气颗粒物采样器；

（4）进行空气中藻细胞滤膜式采样；

（6）将容器放入光照培养箱中进行培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所使用的滤膜为下列之一：玻璃纤维滤膜、石英滤膜、聚氯乙烯滤膜、聚丙烯滤膜、聚四氟乙烯滤膜、混合纤维滤膜。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述滤膜孔径≤0.45µm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，使用75%-95%的乙醇水溶液对滤膜夹各构件进行擦拭消毒，擦拭2-4遍。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，气流采样速度为60-120L/min，采集时间为2-12小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述液体培养基为下列之一：BG-11培养基、BB培养基、SE培养基。

7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述液体培养基体积为透明玻璃容器容积的15%-40%。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（6）中，培养温度为25-30℃，昼:夜比为20:4-8:16，光照强度为1000Lux-4000Lux，培养时间为6-20天。