CN104922938B - 一种亲和层析柱的清洗方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种亲和层析柱的清洗方法，包括如下步骤：步骤1，将不洁的亲和层析柱填料，用水清洗，再用盐酸胍清洗；步骤2，用水清洗，再用氢氧化钠水溶液清洗；步骤3，用平衡缓冲液(pH5.0‑8)清洗；根据需要，本发明还包括步骤4和步骤5的步骤，如下：步骤4，取步骤3得到的清洗液，滴磷酸，观察有无沉淀产生，如无沉淀，用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果低于500ppm，则表示清洗合格；步骤5，取步骤4得到的清洗液，滴磷酸，观察有无沉淀产生，如无沉淀，用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果低于500ppm，则表示清洗合格；步骤6，若有沉淀产生，须用水将步骤4得到清洗液稀释直至滴加磷酸后无沉淀出现后，将稀释后的清洗液用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果乘以稀释倍数获得的数据低于500ppm，则表示清洗合格。

Description

一种亲和层析柱的清洗方法

技术领域

本发明涉及层析柱的清洗方法，特别涉及一种亲和层析柱的清洗方法。

背景技术

亲和层析法是蛋白分离的一种技术，可将含有特殊结构的蛋白质吸附在层析柱上，以达到蛋白纯化的目的。在生物制药领域，亲和层析法被广泛应用。亲和层析柱使用后，可能会对下次使用造成污染，引入外来污染物，比如会对下一次使用引入内毒素或者将上一次没有清洗干净的蛋白引入到下次产物中。现有亲和层析柱的清洗方法无固定的技术方案，故对清洗效果无法保障。为保证每次使用后的亲和层析柱的清洗干净，不会对下一次使用造成污染，需要建立规范的亲和层析的清洗流程。

现有清洗方法主要用水浸泡冲洗，或用缓冲溶液，酸，碱等溶液进行浸泡冲洗，但因没有适当的检测方法对清洗过的填料进行检测，对清洗效果无法保障。

本发明是研究一种亲和层析柱(填料为对氨基苯甲醚)的清洗方法。

本发明经过研究，找到一种简单易行，适合工业化的清洗方法，即通过五步清洗法，并经过总有机碳分析仪测定清洗合格。通过本发明的方法对亲和层析柱进行清洗，使得亲和层析柱清洗效果得到了保障，去除了亲和层析柱内的内毒素，微生物以及上一次使用残留的蛋白，确保了总有机碳检验合格。

发明内容

本发明提供了一种亲和层析柱的清洗方法，所述清洗是指对使用过或将要使用的不洁填料进行清洗，清洗合格后进行下一次的柱层析。

本发明所述亲和层析柱，其填料为任何一种具有亲和层析柱功能的填料，选自：GE医疗集团的Benzamidine Sepharose4FF H-SUB。

优选：对氨基苯甲醚，明胶（Gelatin）.最优选的为对氨基苯甲醚。

上述填料均可以通过现有技术制备，也可通过购买得到。

本发明提供一种亲和层析柱的清洗方法，包括如下步骤：

步骤1，

将不洁的亲和层析柱填料，用水清洗，再用盐酸胍清洗；

步骤2，

用水清洗，再用氢氧化钠水溶液清洗

步骤3，

用平衡缓冲液(pH5.0-8)清洗。

根据需要，本发明还包括步骤4和步骤5的步骤，如下：

步骤4，

取步骤3得到的清洗液，滴磷酸，观察有无沉淀产生，如无沉淀，用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果低于500ppm，则表示清洗合格。

步骤5，

若有沉淀产生，须用水将步骤4得到清洗液稀释直至滴加磷酸后无沉淀出现

后，将稀释后的清洗液用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果乘以稀释

倍数获得的数据低于500ppm，则表示清洗合格。

本发明所述的亲和层析柱，优选填料为对氨基苯甲醚（BenzamidineSepharose4Fast Flow（high sub）），柱型号：BPG100/500或XK26/20或XK50/20，优选BPG100/500

柱子径高比：0.5-1.5:1，优选1.5:1，最佳为柱高15cm以内，直径10cm。

本发明所述步骤中冲柱子，清洗时液体流速为120～150ml/min（优选为120ml/min）。

本发明步骤（1）、（2）所述用水清洗，用水量为4200～4500ml（优选为4200ml）.

步骤（1）中所述的用盐酸胍清洗是指：用6～8M盐酸胍清洗7000～8000ml，优选6M盐酸胍清洗7000ml。此浓度的盐酸胍能够很好的溶解蛋白质。

本发明优选6M盐酸胍配制方法：称取盐酸胍4300g，用注射用水将其移入血清瓶或储液袋中，放入搅拌子，移至磁力搅拌器上使固体全部溶解均匀，将血清瓶或储液袋内溶液标定到7.5L，继续搅拌2分钟。配制后放置于2～12℃环境的准备间指定区域内备用。

本发明步骤（2）中所述的NaOH清洗是指：用0.5～1M NaOH清洗4200～4500ml，优选0.5M NaOH清洗4200ml。此浓度的效去除蛋白和核酸。同时，它还能灭活大多数的病毒、细菌、酵母、真菌以及内毒素。氢氧化钠能皂化脂肪并且可溶解蛋白。

所述的0.5M NaOH溶液的配制方法：称取氢氧化钠200.0g，用注射用水将其移入血清瓶或储液袋中，放入搅拌子，移至磁力搅拌器上使固体全部溶解均匀，将血清瓶或储液袋内溶液标定到10L，继续搅拌2分钟。配制后放置于2～12℃环境的准备间指定区域内备用。

本发明步骤（3）中所述的平衡缓冲液（pH5.0-8），为磷酸缓冲液，优选pH7.0,其中缓冲液中含有NaCl。本发明的优选平衡缓冲液为0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0±0.1含0.3-0.4mol/L NaCl)，用量为14000～15000ml；最佳为0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0±0.1含0.4mol/L NaCl)，用量为14000ml。

本发明的0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0±0.1含0.4mol/L NaCl)的配制方法：称取氯化钠235.6g，磷酸二氢钠3.7g，磷酸氢二钠10.5g，，用注射用水将其移入血清瓶或储液袋中，放入搅拌子，移至磁力搅拌器上使固体全部溶解均匀，将血清瓶或储液袋内溶液标定到10L，继续搅拌2分钟，确定其pH值在7.0±0.1范围内。配制后放置于2～12℃环境的准备间指定区域内备用。

本发明的清洗方法，可以将填料从层析柱上取下后在容器中清洗，也可装在层析柱中清洗，优选装在层析柱中清洗，

氢氧化钠一直被认为能有效去除蛋白和核酸。同时，它还能灭活大多数的病毒、细菌、酵母、真菌以及内毒素。氢氧化钠能皂化脂肪并且可溶解蛋白。总体来说，氢氧化钠可溶解沉淀的蛋白。氢氧化钠将蛋白和核酸从层析介质中去除的能力主要取决于介质本身性质、样品、以及干扰清洗效果的样品中的污染物性质。盐酸胍能够很好的溶解蛋白质。

本发明步骤（3）中所述的滴磷酸，是将清洗液加到容器中，加入浓磷酸，静置，肉眼观察有无沉淀析出。其目的是初步确认清洗液中含碳量，如果出现沉淀说明含碳量较高，可能在检验过程中会堵塞总有机碳分析仪管路。

所述用总有机碳分析仪测定，是用总有机碳分析仪清洗液中的总有机碳浓度本发明步骤（4）中所述的须用水稀释清洗液，方法如下：若有沉淀产生，须用水将清洗液稀释直至滴加磷酸后无沉淀出现后，将稀释后的清洗液用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果乘以稀释倍数获得的数据低于500ppm，则表示清洗合格。

本发明相关术语的解释：

1、亲和层析：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。

2、内毒素：是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来。

3、盐酸胍：能够很好的溶解蛋白质。

4、总有机碳（TOC）：是指水体中溶解性和悬浮性有机物含碳的总量。TOC是一个快速检定的综合指标，它以碳的数量表示水中含有机物的总量，单位为ppm或ppb。在国际上TOC被作为评价水体中有机物污染程度的一项重要参考指标。

本发明的亲和层析柱的清洗方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1、清洗步骤的选择：

表一

本发明经过2次清洗液的清洗，内毒素和总有机碳均符合标准。

清洗液浓度的选择:

下表2清洗液按照实施例的顺序冲洗，结果如下：

表2

清洗液用量的选择：

表3

清洗液名称	清洗体积1	清洗体积2	清洗体积3	清洗体积4
					盐酸胍	4200ml	7000ml	8000ml	9000ml
0.5MNaOH清洗	2800ml	4200ml	4500ml	4800ml
					结果
内毒素	＞0.25EU/ml	≤0.25EU/ml	≤0.25EU/ml	≤0.25EU/ml
					总有机碳	1641ppb	132ppb	117ppb	129ppb

从上表可见，清洗液用体积4500与4800效果相同，出于节省原则，优选清洗液体积为4200-4500ml。

以下通过比较实验证明本发明的有益效果：

现有技术冲柱子方法与本发明的方法进行比较

表4

现有技术方法1:

将使用过的亲和层析柱首先用2800ml注射用水清洗，用4200ml6M盐酸胍清洗，用4200ml注射用水清洗，用2800ml0.5M NaOH清洗，然后用7000ml0.01mol/L平衡缓冲液（pH7.0±0.1含0.4M NaCl）冲柱子，清洗时液体流速为120ml/min；取清洗液进行TOC及内毒素检测，不符合要求。

现有技术方法2:

将使用过的亲和层析柱首先用4200ml注射用水清洗，用7000ml6M盐酸胍清洗，用4200ml注射用水清洗，然后用1400ml0.01mol/L平衡缓冲液（pH7.0±0.1含0.4M NaCl）冲柱子，清洗时液体流速为120ml/min；取清洗液进行TOC及内毒素检测，不符合要求。

现有技术方法3:

将使用过的亲和层析柱首先用4200ml注射用水清洗，用7000ml3M盐酸胍清洗，用4200ml注射用水清洗，用4200ml0.3M NaOH清洗，然后用1400ml0.01mol/L平衡缓冲液（pH7.0±0.1含0.4M NaCl）冲柱子，清洗时液体流速为120ml/min；取清洗液进行TOC及内毒素检测，不符合要求。

试验例2

对本发明实施例1的方法进行了多次实证实验，证明在本发明的条件下，用实施例1的方法，内毒素含量,总有机碳含量,微生物含量,残留蛋白含量合格率可以达到99%。

实验如下：

将使用过的亲和层析柱首先用4200ml注射用水清洗，用7000ml6M盐酸胍清洗，用4200ml注射用水清洗，用4200ml0.5M NaOH清洗，然后用14000ml0.01mol/L平衡缓冲液（pH7.0±0.1含0.4M NaCl）冲柱子，清洗时液体流速为120ml/min，取清洗液10ml于一试管中，滴2～3滴磷酸，观察有无沉淀产生，若有沉淀产生，须用MilliQ水进行稀释直至滴加磷酸后无沉淀出现后，方可转移至总有机碳专用瓶，然后用总有机碳分析仪测定三次，三次测定结果均低于500ppm，则表示清洗合格；清洗合格后，将亲和层析柱保存于2～12℃的层析柜内。

■亲和层析柱使用完毕开始清洗

■清洗时液体流速为：120ml/min

■用注射用水清洗4200ml

■用6M盐酸胍清洗7000～8000ml

■用注射用水清洗4200ml

■用0.5M～1M NaOH清洗4200～4500ml

■然后用磷酸缓冲液（0.01mol/L平衡缓冲液（pH7.0±0.1含0.4M NaCl））冲柱子14000～15000ml；

■清洗结束后，将层析柱保存于2～12℃的层析柜内

其中，内毒素含量的检测方法如下：

1.1检验前准备

1.1.1实验开始前准备鲎试剂、阳性对照液、细菌内毒素检查用水、样品及实验相关用

品（除热源枪头、移液器、酒精、剪刀、封口膜等）；

1.1.2轻敲干粉状鲎试剂安瓿瓶上部，使瓶内干粉末保留在瓶底部，避免开瓶时丢失粉末；

1.1.3用75%酒精将安瓿瓶外壁擦拭一遍，待酒精挥发后，小心掰开安瓿瓶。

1.2样品处理

1.2.1使用λ=0.25EU的鲎试剂进行实验，样品处理同时进行阳性对照、供试品阳性及阴性对照实验，作为实验是否成立的依据。

1.2.2阳性对照：取鲎试剂1支，向其中加入0.1ml细菌内毒素检查用水复溶，再加入0.1ml细菌内毒素阳性对照液（0.5EU/ml）；

1.2.3阴性对照：取鲎试剂1支，向其中加入0.2ml细菌内毒素检查用水。

1.2.4供试品阳性：取鲎试剂1支，向其中加入0.1ml纯化溶液样品复溶，再加入0.1ml细菌内毒素阳性对照液（0.5EU/ml）；

1.2.5样品处理：取鲎试剂1支，向其中加入0.1ml细菌内毒素检查用水复溶，再加入0.1ml样品（具体操作可见下表）；

	阳性对照	阴性对照	供试品阳性	样品
					细菌内毒素检查用水	0.1ml	0.2ml		0.1ml

阳性对照液	0.1ml		0.1ml
					样品溶液			0.1ml	0.1ml

1.2.6样品保温：将加样后的鲎试剂安瓿瓶轻轻混匀后，用封口膜封口，放在试管架上；

将此试管架放入37℃±1℃的恒温条件，保温60±2min，保温过程应避免受到震动。

1.2.7结果观察

1.2.7.1保温结束后，将放有鲎试剂安瓿瓶的试管架从恒温培养箱中取出；

1.2.7.2从试管架上小心拿起鲎试剂安瓿瓶，缓缓倒转180°；

1.2.7.3若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性记为（+）；

1.2.7.4未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性记为（-）；

1.2.8检验结果判定

1.2.8.1实验成立条件：阳性对照管及供试品阳性均为（+），阴性对照管为（-），该实验方可成立。

1.2.8.2样品管为（-），则表明样品检测合格（<0.25EU/ml）

1.2.8.3若样品为（+），取备用样品进行复试2支，两支结果均显示（-），则表明样品检测合格（<0.25EU/ml），否则表明样品检测不合格（>0.25EU/ml）

其中

总有机碳含量的检测方法如下：

柱子清洗液，滴磷酸，观察有无沉淀产生，如无沉淀，用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果低于500ppm，则表示清洗合格；若有沉淀产生，须用MilliQ水将清洗液稀释直至滴加磷酸后无沉淀出现后，将稀释后的清洗液用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果乘以稀释倍数获得的数据低于500ppm，则表示清洗合格。

微生物含量的检测方法如下：

1.0检验方法：

1.0.1实验操作均在生物洁净工作台内进行。

1.0.2实验开始前，在生物洁净工作台的工作区域内左右各放置1块大豆酪蛋白琼脂培养基90mm预制平皿，用于监测操作环境。

1.0.3供试液（1:10）的制备：

1.0.3.1水溶性液体供试品：用无菌移液管移取供试品10ml于250ml无菌三角瓶中，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml（刻度线），混匀，作为1:10的供试液。

1.2.8.1水溶性固体或半固体供试品：称取供试品10g于250ml无菌三角瓶中，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml（刻度线），轻振摇使完全溶解，用适宜的方法混匀，作为1:10的供试液。

1.0.3.2非水溶性供试品及需用特殊方法制备供试液的供试品：按照药典相关规定进行制备。

1.0.4供试液的过滤及贴膜：

1.0.4.1装滤杯及滤膜：

◆蠕动泵：打开带膜滤杯的包装，将其扣在蠕动泵的卡扣上，打开杯盖。

◆微生物检测抽滤系统：

●点燃酒精灯，用止血钳夹住酒精棉球点燃，三个不锈钢支架过滤头用酒精棉火焰逐一过火消毒，让火焰与过滤头内部和边缘充分接触。消毒完毕，将燃烧的酒精棉球投入收集废物的烧杯中。

●打开滤芯的灭菌包装，取止血钳在酒精灯火焰上灼烧1min左右灭菌，从包装袋中夹出灭菌滤芯，逐一置于过滤头中。

●取无齿镊子在酒精灯火焰上灼烧1min左右灭菌，打开无菌滤膜包装（注意不要用手碰到滤膜），夹取滤膜放在抽滤系统的过滤口上。

●从包装的底部打开一袋无菌滤杯，拿住滤杯中部小心扣在不锈钢支架的滤口上，并确认滤杯卡紧。

1.0.4.2润湿滤膜

◆水溶性供试液过滤前应先润湿滤膜，取约10～20ml冲洗液（以能润湿整张滤膜表面的量为准）沿滤杯口倒入滤杯中；开启蠕动泵或真空隔膜泵，将溶液滤尽后关闭。

◆油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥，勿须润膜。

1.0.4.3供试液过滤：

◆用10ml无菌移液管吸取10ml供试液(相当于每张滤膜含1g或1ml的供试品)加入适量的稀释剂（约100ml）中，混匀；

◆后沿滤杯口倒入滤杯中；开启蠕动泵或空隔膜泵，将溶液滤尽后关闭。

1.0.4.4冲洗滤膜：

◆非抑菌性待检品：将冲洗液沿滤杯口倒入滤杯中至滤杯的100ml刻度线，开启蠕动泵或真空隔膜泵，将溶液滤尽后关闭。共冲洗2次，每次100ml。

◆抑菌性待检品：应经过验证确认其冲洗量，每次检验应按验证过的冲洗量对滤膜进行冲洗，每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。

◆冲洗过程中应注意保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面，以发挥滤膜的最大过滤效率。

1.0.4.5贴膜：

◆除去滤杯：

●蠕动泵：轻按带膜滤杯杯身，使滤杯与膜分离，取下滤杯。

●微生物检测抽滤系统：拿住滤杯边缘以下轻轻地让滤器向后倾斜，从支架上将滤杯移开。取无齿镊子，经酒精灯火焰灭菌后冷却片刻（以免烧坏滤膜），小心夹取滤器上的滤膜贴于琼脂培养基上。

◆贴膜时，滤膜一端与培养基表面接触后（菌面朝上），滤膜慢慢靠近培养基表面，确保滤膜内圈没有气泡，直至整张滤膜贴于培养基上，然后用无齿镊子轻轻赶出滤膜外圈的气泡，使整张滤膜与培养基表面之间没有气泡形成。

◆按供试品的标准要求，贴于大豆酪蛋白琼脂培养基预制平皿或玫瑰红钠琼脂培养基预制平皿上。

◆贴膜后，盖上培养皿盖，于培养皿底部记录样品名称、批号和日期后倒置于生物洁净工作台上。

1.0.5阴性对照的过滤及贴膜：参照6.4.4项下内容操作，润膜后，取稀释剂10ml加入适量的稀释剂（约100ml）中，混匀后过滤，再用冲洗液冲洗滤膜后贴膜。

1.0.6检验时间：供试液从制备至加入检验用培养基，时间不得超过1h。

1.0.7实验过程中，每间隔15分钟左右，用无菌75%乙醇溶液喷洒手部进行再次消毒。

1.0.8实验全部完毕

1.0.8.1取2块大豆酪蛋白琼脂培养基90mm预制平皿，左右手各一块，将五指按压于大豆酪蛋白琼脂培养基面上5秒，盖上培养皿盖。

1.0.8.2将生物洁净工作台上的90mm预制平皿收起，盖上培养皿盖。

1.1培养：除另有规定外，按照下述温度和时间进行培养。

1.1.1将大豆酪蛋白琼脂培养基预制平皿倒置于培养箱中，30～35℃培养5天，逐日点检。1.1.2将玫瑰红钠琼脂培养基预制平皿倒置于培养箱中，23～28℃培养5天，逐日点检。1.2计数：培养期内，逐日点检菌落数

1.2.1若无菌生长，计为0。

1.2.2若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数；菌落蔓延生长成片的平板不宜计数，填写TNTC。若出现TNTC时，即终止培养。

1.2.3大豆酪蛋白琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌和酵母菌计数；若大豆酪蛋白琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，应分别点计霉菌和酵母菌、细菌的菌落数，然后将大豆酪蛋白琼脂培养基上的霉菌和酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或大豆酪蛋白琼脂培养基上的细菌数进行比较，以菌数高的培养基中的菌落数作为计数结果。

1.3结果判定：

1.3.1实验有效性：

1.3.1.1阴性对照平皿经培养后（培养时间与样品一致），菌落数应为0（即＜1）。

1.3.1.2每片滤膜上的菌落数应≤100CFU。

1.3.2结果计算：

1.3.2.1结果报告值：点检最终日，点计平皿结果，比较大豆酪蛋白琼脂培养基及玫瑰红钠琼脂培养基上点计的细菌、酵母菌菌落数和霉菌菌落数。分别取其中较大值作为最终菌落数值。

1.3.2.2计算出每1g（ml）供试品的微生物数量，公式如下：

检品结果（CFU/g（ml））=供试品各菌的结果报告值（CFU）÷供试品过滤量g（ml）×供试品报告量g（ml）。

通过上述清洗方法对阴离子交换层析柱进行清洗，使得阴离子交换层析柱清洗效果得到了保障，去除了阴离子交换层析柱内的内毒素，微生物以及上一次使用后残留的蛋白。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

将使用过的亲和层析柱（填料为Benzamidine Sepharose4FF H-SUB，柱型号为：BPG100,高为15cm，直径为10cm）首先用4200ml注射用水清洗，用7000ml6M盐酸胍清洗，用4200ml注射用水清洗，用4200ml0.5M NaOH清洗，然后用14000ml0.01mol/L平衡缓冲液（pH7.0±0.1含0.4M NaCl）冲柱子，清洗时液体流速为120ml/min，取清洗液10ml于一试管中，滴2～3滴磷酸，观察有无沉淀产生，若有沉淀产生，须用MilliQ水进行稀释直至滴加磷酸后无沉淀出现后，方可转移至总有机碳专用瓶，然后用总有机碳分析仪测定三次，三次测定结果均低于500ppm，则表示清洗合格；清洗合格后，将亲和层析柱保存于2～12℃的层析柜内。

Claims (11)

1.一种亲和层析柱的清洗方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，将不洁的亲和层析柱填料，用水清洗，再用盐酸胍清洗；

步骤2，用水清洗，再用NaOH水溶液清洗；

步骤3，用平衡缓冲液pH5.0-8清洗；所述NaOH水溶液为0.5～1M NaOH的水溶液,用量为4200～4500ml；

步骤4，取步骤3得到的清洗液，滴磷酸，观察有无沉淀产生，如无沉淀，用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果低于500ppm，则表示清洗合格；

步骤5，若有沉淀产生，须用水将步骤4得到的清洗液稀释直至滴加磷酸后无沉淀出现后，将稀释后的清洗液用总有机碳分析仪测定该清洗液，测定结果乘以稀释倍数获得的数据低于500ppm，则表示清洗合格。

2.根据权利要求1的清洗方法，其特征在于，填料为对氨基苯甲醚。

3.根据权利要求1的清洗方法，其特征在于，所述亲和层析柱柱型号选自：BPG 100、BPG500，XK26、XK 20，XK50、XK 20中一种。

4.根据权利要求1的清洗方法，其特征在于，所述亲和层析柱柱子径高比0.5-1.5:1。

5.根据权利要求4的清洗方法，其特征在于，柱子径高比1.5:1。

6.根据权利要求1的清洗方法，其特征在于，是将填料装在层析柱中清洗，清洗液流速为120～150ml/min。

7.根据权利要求1的清洗方法，其特征在于，步骤1、2中所述用水为注射用水，用量为4200～4500ml。

8.根据权利要求1的清洗方法，其特征在于，步骤1中所述的盐酸胍清洗是指：用6～8M盐酸胍水溶液清洗，用量为7000～8000ml。

9.根据权利要求1的清洗方法，其特征在于，步骤3中所述的平衡缓冲液为磷酸缓冲液。

10.根据权利要求9的清洗方法，其特征在于，平衡缓冲液为0.01mol/L磷酸缓冲液其中含有氯化钠，用量为14000～15000ml。

11.根据权利要求10的清洗方法，其特征在于，平衡缓冲液为0.01mol/L磷酸缓冲液，pH7.0±0.1，含0.3-0.4mol/L氯化钠。