CN114940989B - 检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法 - Google Patents

检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法，所述引物探针组合物包括用于检测猫疱疹病毒I型的引物、用于检测猫杯状病毒的引物、用于监测反应体系内抑制情况的引物、用于检测猫疱疹病毒I型的探针、用于检测猫杯状病毒的探针、用于监测反应体系内抑制情况的探针。采用本发明可同时检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒，并且特异性强、敏感性高、快速、安全。

Description

检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及 其制备方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，尤其是涉及检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法。
背景技术
猫疱疹病毒I型(Feline herpesvirus type1，FHV1)属于大型的病毒(100～130nm直径)，为疱疹病毒科中的甲型疱疹病毒亚科、水痘属；感染病毒后常患猫病毒性鼻气管炎（简称猫鼻支），是目前已知最重要的猫呼吸道疾病之一，该病上呼吸道症状表现明显，主要表现为咳嗽、打喷嚏、眼睛、鼻子分泌物增多、结膜炎、角膜炎等。
猫杯状病毒(Feline Calicivirus，FCV)为无囊膜的单股正链RNA病毒，是猫杯状病毒科、杯状病毒属的一员，猫杯状病毒感染是猫病毒性呼吸道传染病，主要表现为上呼吸道症状，即精神沉郁、浆液性和粘液性鼻漏、结膜炎、口腔炎、气管炎、支气管炎，伴有双相热；是猫的多发病，发病率高，死亡率低。
猫杯状病毒与猫疱疹病毒I型引发的猫传染性鼻气管炎的症状类似，很难根据症状来分辨出患病猫是被什么感染，且临床上双重感染的情况也很常见，因此建立快速、准确的联合检测FHV1和FCV的方法至关重要。
现有技术中的检测试剂盒，对FHV1和FCV的检测采用单通道荧光PCR方法或者荧光PCR所具有的敏感性低、反应时间长。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法，并达到以下发明目的：可以同时检测猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒，提高检测敏感性，缩短反应时间。
本发明采用的技术方案：
检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括用于检测猫疱疹病毒I型的引物、用于检测猫杯状病毒的引物、用于监测反应体系内抑制情况的引物、用于检测猫疱疹病毒I型的探针、用于检测猫杯状病毒的探针、用于监测反应体系内抑制情况的探针；
所述用于检测猫疱疹病毒I型的引物具有如SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO .1和/或SEQ ID NO .2至少85%同一性的核苷酸序列；所述用于检测猫杯状病毒的引物具有如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO .3和/或SEQ ID NO .4至少85%同一性的核苷酸序列；所述用于监测反应体系内抑制情况的引物，具有如SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6所示的核苷酸序列；
所述用于检测猫疱疹病毒I型的探针具有如SEQ ID NO .7所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO .7至少85%同一性的核苷酸序列；所述用于检测猫杯状病毒的探针具有如SEQ ID NO .8所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO .8至少85%同一性的核苷酸序列；所述用于监测反应体系内抑制情况的探针具有如SEQ ID NO .9所示的核苷酸序列。
所述用于检测猫疱疹1型病毒的引物、用于检测猫杯状病毒的引物、用于监测反应体系内抑制情况引物的工作浓度均为100-400nmol；所述检测猫疱疹1型病毒的探针、用于检测猫杯状病毒的探针、用于监测反应体系内抑制情况性的探针的工作浓度均为50-200nmol。
所述用于检测猫疱疹病毒I型的探针、用于检测猫杯状病毒的探针的两端均分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；所述荧光报告基团为FAM或ROX或VIC；所述荧光淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
所述用于检测猫疱疹病毒I型的探针：荧光淬灭基团为BHQ1，荧光报告基团为FAM；所述用于检测猫杯状病毒的探针：荧光淬灭基团为BHQ2，荧光报告基团为ROX。
检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和外标对照品；所述PCR反应液包括具有如SEQ ID NO .1-SEQ ID NO .9所示核苷酸序列的引物探针组合、buffer和酶；所述阳性对照品包括含有猫疱疹病毒I型的质粒、含有猫杯状病毒的质粒；所述阴性对照品为灭菌去离子水；所述外标对照品包含拟南芥SUC2基因的质粒。
检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒的制备方法，包括设计引物探针、阳性对照品的制备、阴性对照品的制备、外标对照品的制备、荧光定量RT-PCR反应体系的构建；所述设计引物探针：设计如SEQ ID NO .1-SEQ ID NO .9所示核苷酸序列的引物和探针；所述阳性对照品的制备：所述阳性对照品的制备：将猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒按照1:1的浓度比例混合制备成阳性质粒混合液，阳性质粒混合液中，含有猫疱疹病毒I型的质粒、含有猫杯状病毒的质粒浓度分别为2×106拷贝/mL。
所述外标对照品的制备：将拟南芥SUC2基因连接到质粒载体上，得到质粒溶液。
所述荧光定量RT-PCR反应体系的构建：反应条件：50℃逆转录10min，循环1次；95℃预变性5min，循环1次；94℃变性15s，60℃退火30s，循环40次。
一种用于检测猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒的方法，待测样本的基因组核酸作为模板，使用上述的引物组或试剂盒进行PCR反应，根据扩增产物中含有的特异性片段或扩增曲线，判断待测样品是否含有猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒：若扩增产物中含有猫疱疹病毒I型的特异性片段或扩增曲线，则待测样本中包含猫疱疹病毒I型；若扩增产物中含有猫杯状病毒的特异性片段或扩增曲线，则待测样本中包含猫杯状病毒。
本发明的有益效果：
（1）本发明对含有微量FHV1和FCV基因组的样品检测效果良好，可用于FHV1和 FCV的实验室检测和分子流行病学调查。在闭管状态下进行扩增产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染。
（2）本发明提供的引物组中，用于检测猫疱疹病毒I型的引物和用于检测猫杯状病毒的引物，均是通过各病原体高度保守的区域设计的引物，与其它猫的病原体不存在交叉反应，具有特异性强、灵敏度高的特点。应用本发明提供的引物组，能够实现在同一反应体系中鉴别猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒2种猫呼吸道病原体。将三种引物放在同一反应体系中时，不同引物对相互之间无干扰，不影响PCR扩增的结果分析，相比传统方法大大减少了检测成本和时间。
附图说明
附图1为实施例2中阳性对照品和阴性对照品的荧光PCR扩增曲线；
附图2为实施例2中外标对照品的荧光PCR扩增曲线；
附图3为实施例3中采用本发明检测试剂盒对猫疱疹病毒I型、猫杯状病毒、阳性对照品和阴性对照品的检测结果图；
附图4为实施例3中采用本发明检测试剂盒对猫支原体、猫冠状病毒、猫艾滋病病毒和猫白血病病毒的检测结果图；
附图5为实施例3中采用本发明检测试剂盒对不同梯度含量猫疱疹病毒I型的检测结果图；
附图6为实施例3中采用本发明检测试剂盒对不同梯度含量猫杯状病毒的检测结果图。
具体实施方式
实施例1检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物
本发明提供检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物，包括：
（1）用于检测猫疱疹病毒I型的上游引物，序列为SEQ ID NO：1：5’-atgctatactggcgtagtctctttg-3’；
（2）用于检测猫疱疹病毒I型的下游引物，序列为SEQ ID NO：2：5’-tggatagtctggaatgtaaaagaagg-3’；
（3）用于检测猫杯状病毒的上游引物，序列为SEQ ID NO：3：5’-agccttcttttccttccacac-3’；
（4）用于检测猫杯状病毒的下游引物，序列为SEQ ID NO：4：5’-caacttcccgccaaacactc-3’；
（5）针对拟南芥SUC2基因设计，用于监测反应体系内抑制情况的上游引物，序列为SEQ ID NO：5：5’-cccatgtggatgcttcttatagtc-3’；
（6）针对拟南芥SUC2基因设计，用于监测反应体系内抑制情况的下游引物，序列为SEQ ID NO：6：5’-ccatccaatcagtgtcgaagagaa-3’；
（7）用于监测猫疱疹病毒I型的探针，序列为SEQ ID NO：7：5’-ctgatgttgtcggtggtatctatgccgtcc-3’；所述SEQ ID NO：7的5’端和3’端分别标记为荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；
（8）用于监测猫杯状病毒设计探针，序列为SEQ ID NO：8：
5’- tgtcaactggagtacatctgagacacaaggcaa-3’；所述SEQ ID NO：8的5’ 端和3’端分别标记为荧光报告基团ROX和荧光淬灭基团BHQ2；
（9）针对拟南芥SUC2基因设计，用于监测反应体系内抑制情况的探针序列为SEQID NO：9：5’-ctgcactaaactggatcgcttggttcc-3’；所述SEQ ID NO：9的5’ 端和3’端分别标记为荧光报告基团VIC和荧光淬灭基团BHQ1。
实施例2 用于检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒的制备方法
步骤1、设计引物探针
设计出可多重检猫疱疹病毒I型(简称FHV1)和猫杯状病毒(简称FCV)的引物组和探针及其组合，序列具体如下：
（1）针对猫疱疹病毒I型设计上游引物，该上游引物的序列为SEQ ID NO：1：5’-atgctatactggcgtagtctctttg -3’；
（2）针对猫疱疹病毒I型设计下游引物，该下游引物的序列为SEQ ID NO：2：5’-tggatagtctggaatgtaaaagaagg -3’；
（3）针对猫杯状病毒设计上游引物，该上游引物的序列为SEQ ID NO：3：5’-agccttcttttccttccacac -3’；
（4）针对猫杯状病毒设计下游引物，该下游引物的序列为SEQ ID NO：4：5’-caacttcccgccaaacactc -3’；
（5）针对拟南芥SUC2基因设计，用于监测反应体系内抑制情况的上游引物序列为SEQ ID NO：5：5’-cccatgtggatgcttcttatagtc-3’；
（6）针对拟南芥SUC2基因设计，用于监测反应体系内抑制情况的下游引物序列为SEQ ID NO：6：5’-ccatccaatcagtgtcgaagagaa-3’；
（7）针对猫疱疹病毒I型设计探针，该探针的序列为SEQ ID NO：7：5’-ctgatgttgtcggtggtatctatgccgtcc- 3’；所述SEQ ID NO：7的5’端和3’端分别标记为FAM和BHQ1；
（8）针对猫杯状病毒设计探针，该探针的序列为SEQ ID NO：8：tgtcaactggagtacatctgagacacaaggcaa；所述SEQ ID NO：8的5’端和3’端分别标记为ROX和BHQ2；
（9）针对拟南芥SUC2基因设计，用于监测反应体系内抑制情况的探针序列为SEQID NO：9：5’-ctgcactaaactggatcgcttggttcc- 3’；所述SEQ ID NO：9的5’ 端和3’端分别标记为荧光报告基团VIC和荧光淬灭基团BHQ1。
步骤2、阳性对照品的制备
将pFHV1和pFCV按照1:1的浓度比例混合制备成阳性质粒混合液，阳性质粒混合液中，含有猫疱疹病毒I型的质粒、含有猫杯状病毒的质粒浓度分别为2×106拷贝/mL。
将得到的阳性质粒混合液进行荧光PCR扩增，在FAM和ROX通道的Ct值均为25±3时，该阳性质粒混合液即为阳性对照品。按照每管500μL分装，储存于-20℃，备用。
阳性对照品的荧光PCR扩增曲线结果如附图1所示。
步骤3、阴性对照品的制备
阴性对照品为灭菌去离子水，按照每管500μL分装，储存于-20℃，备用。
步骤4、外标对照品的制备
外标对照品为包含拟南芥SUC2基因的质粒。
将拟南芥SUC2基因片段连接到质粒载体上，得到质粒溶液。得到的质粒溶液使用SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：9进行荧光PCR扩增，VIC通道的Ct值为28-31时，该质粒溶液即作为外标对照品，按照每管200μL分装，储存于-20℃，备用。
外标对照品的荧光PCR扩增曲线结果如附图2所示。
步骤5、试剂盒的成品组装
（1）PCR反应液：包括有特异性检测猫疱疹病毒I型的引物和探针、特异性检测猫杯状病毒的引物和探针和监测反应体系内抑制情况的引物和探针，即SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：9；以及buffer和酶。
所述buffer和酶：Buffer为2×Hifair V C58P2 MP Buffer，酶为Hifair V C58P2Enzyme Mix，购于翌圣生物科技（上海）股份有限公司，货号：13650ES50。
PCR反应液如下表所示：
（2）阳性对照品：即步骤2制备的阳性对照品；
（3）阴性对照品：即步骤3制备的阴性对照品；
（4）外标对照品：即步骤4制备的外标对照品。
步骤6、荧光定量RT-PCR反应程序的构建
取PCR反应液19μL，再加入1μL 外标对照品；将阳性对照样品和阴性对照样品，与待检样品同时进行荧光定量RT-PCR反应；所述荧光定量RT-PCR反应程序：50℃逆转录10min，循环1次；95℃预变性5min，循环1次；94℃变性15s，60℃退火30s，循环40次。设置60℃收集各个通道的荧光信号；阳性对照品的各通道Ct值均小于32；外标对照品的通道Ct值小于32，且阴性对照品的各个通道均无扩增。
实施例3 特异性和敏感性验证实验
荧光PCR扩增检测方法：
步骤1、扩增试剂准备
将试剂盒中的各组分取出进行室温解冻，试剂配制前，将所有试剂混匀后短暂离心。单个样本检测需要的PCR反应液用量为20μL，若待检测的样品数量n，配制n+2个反应用量，加入适当体积的离心管中，充分混匀后，分装20 μL于每孔反应管中，每次检测均需设置阳性对照和阴性对照。
步骤2、加样
按照顺序向分装好的反应管中加入已提取阳性对照样本5 µL、阴性对照样本5 µL、待检测样本5 µL，在添加上述样本时，同时加入外参对照，按照1 µL/T的量进行添加。盖好反应管管盖，充分混匀，瞬时离心，使液体集中在管底，转移到检测区。
步骤3、荧光PCR扩增检测
（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
特异性验证实验：
按照上述实验过程中荧光PCR扩增检测方法对猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒、阳性对照品（阳性质粒pFHV1、阳性质粒pFCV）、阴性对照品、猫支原体、猫冠状病毒、猫艾滋病病毒、猫白血病病毒，分别进行检测并分析结果。
实验结果：猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒、阳性对照品（阳性质粒pFHV1、阳性质粒pFCV）、阴性对照品检测结果如附图3所示；猫支原体、猫冠状病毒、猫艾滋病病毒、猫白血病病毒检测结果如附图4所示。阴性对照品没有起峰，阳性对照品全部起峰，符合要求，实验有效。
猫疱疹病毒I型和阳性质粒pFHV1仅FAM通道有Ct值，猫杯状病毒和阳性质粒pFCV仅ROX通道有Ct值，阴性对照品无扩增，说明该检测试剂盒及方法具有显著的特异性。
敏感性验证实验：
采用本发明检测试剂盒，按照上述实验过程中荧光PCR扩增检测方法，将待测样品的病毒含量设置为107拷贝/mL、106拷贝/mL、105拷贝/mL、104拷贝/mL、103拷贝/mL，分别对猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒进行检测。
实验结果：采用本发明检测试剂盒对不同梯度含量猫疱疹病毒I型的检测结果，如附图5所示；采用本发明检测试剂盒对不同梯度含量猫杯状病毒的检测结果，如附图6所示。
检测结果显示103拷贝/mL的猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒扩增曲线均有明显起峰，说明本发明检测试剂盒对猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒最低检测限均可达到103拷贝/mL，本发明引物组检测猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒具有较强的敏感性。
需要说明的是，以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。凡采用同等替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 山东康华生物医疗科技股份有限公司
青岛汉唐生物科技有限公司
<120> 检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctatact ggcgtagtct ctttg 25
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggatagtct ggaatgtaaa agaagg 26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agccttcttt tccttccaca c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caacttcccg ccaaacactc 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccatgtgga tgcttcttat agtc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccatccaatc agtgtcgaag agaa 24
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgatgttgt cggtggtatc tatgccgtcc 30
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtcaactgg agtacatctg agacacaagg caa 33
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgcactaaa ctggatcgct tggttcc 27

Claims (3)

1.检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和外标对照品；所述PCR反应液包括如SEQ ID NO .1-SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的引物探针组合、buffer和酶；所述阳性对照品包括含有猫疱疹病毒I型的质粒、含有猫杯状病毒的质粒，浓度比为1:1；所述阴性对照品为灭菌去离子水；所述外标对照品包含拟南芥SUC2基因的质粒；
所述SEQ ID NO .1-SEQ ID NO .9所示核苷酸序列的引物探针组合：
用于检测猫疱疹病毒I型的引物：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2；用于检测猫杯状病毒的引物：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；用于监测反应体系内抑制情况的引物：SEQ ID NO：5、SEQID NO：6；用于监测猫疱疹病毒I型的探针：SEQ ID NO：7，所述SEQ ID NO：7的5’端和3’端分别标记为荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；用于监测猫杯状病毒设计探针：SEQ IDNO：8，所述SEQ ID NO：8的5’端和3’端分别标记为荧光报告基团ROX和荧光淬灭基团BHQ2；用于监测反应体系内抑制情况的探针：SEQ ID NO：9，所述SEQ ID NO：9的5’端和3’端分别标记为荧光报告基团VIC和荧光淬灭基团BHQ1；
所述的检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒：荧光定量RT-PCR反应程序的构建：50℃逆转录10min，循环1次；95℃预变性5min，循环1次；94℃变性15s，60℃退火30s，循环40次。
2. 检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括设计引物探针、阳性对照品的制备、阴性对照品的制备、外标对照品的制备、荧光定量RT-PCR反应体系的构建；所述设计引物探针：设计如SEQ ID NO .1-SEQ ID NO .9所示核苷酸序列的引物和探针；所述阳性对照品的制备：将猫疱疹病毒I型质粒和猫杯状病毒质粒按照1:1的浓度比例混合制备成阳性质粒混合液，阳性质粒混合液中，含有猫疱疹病毒I型的质粒、含有猫杯状病毒的质粒浓度分别为2×106拷贝/mL。
3.根据权利要求2所述的检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述外标对照品的制备：将拟南芥SUC2基因连接到质粒载体上，得到质粒溶液。
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