CN104593487B - 一种区分克罗诺杆菌属不同种的pcr‑rflp分子分型方法 - Google Patents

一种区分克罗诺杆菌属不同种的pcr‑rflp分子分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种区分克罗诺杆菌属不同种的PCR‑RFLP分子分型方法。以rpoA基因为对象，通过特异性引物扩增得到克罗诺菌属四种不同菌的rpoA基因片段，然后采用TaiI限制性内切酶对扩增的rpoA基因片段进行单酶切，获得克罗诺菌属四种不同菌的差异性PCR‑RFLP指纹图谱，进而区分克罗诺菌属不同菌种。通过大量克罗诺菌属的菌株事例验证，该分子分型方法能有效获得不同种差异性的酶切多态性图谱，快速、准确区分克罗诺菌属四种不同菌。本发明适用于区分克罗诺菌属的菌种，对食品中克罗诺菌的准确鉴定及病原的快速诊断具有重要意义。

Description

一种区分克罗诺杆菌属不同种的PCR-RFLP分子分型方法
技术领域
本发明属于食品微生物检验技术领域，具体涉及一种区分克罗诺杆菌属不同种的PCR-RFLP分子分型方法。
背景技术
克罗诺菌属（Cronobacter），是重要食源性致病菌，属肠杆菌科的革兰氏阴性杆菌，能导致新生婴幼儿脑膜炎、致死性结肠炎和菌血症等，流行病数据调查表明婴幼儿配方奶粉是其感染疾病的主要传播媒介。目前，国内克罗诺菌属的分型技术主要包括抗生素分型、噬菌体分型、Enterobabcterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR（ERIC-PCR）,脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE）、随机扩增多态性（RandomApplied Polymorphic DNA-PCR）等技术，这些方法无法有效区分克罗诺菌属不同的菌种，而尽管国际上多位点序列分析 (Multilocus Sequenching Typing, MLST) 能对克罗诺菌属的不同种，但核酸纯化、测序与分析等操作较繁琐，耗时较长，不利于该菌在食品污染或流行病病原的快速诊断。因而，操作方便、快速地区分克罗诺菌属不同种的分子分型方法对食品中克罗诺菌污染的鉴定及克罗诺菌感染疾病的快速鉴定均具有重要的理论和实际意义。
发明内容
为准确、快速鉴定克罗诺菌属的不同菌种，达到对克罗诺菌污染食品和感染疾病病原的快速诊断，本发明提供一种用于区分克罗诺菌属不同种的方便、快速和准确的分子分型方法。
一种区分克罗诺杆菌属不同种的PCR-RFLP分子分型方法,选用rpoA基因；用扩增引物F:5’- ATGCAGGGTTCTGTGACAGAG -3’；R：5’- GGTGGCCARTTTTCYAGGCGC-3’对rpoA基因扩增，再用限制性内切酶TaiI酶切rpoA基因扩增产物。结果表明，四种克罗诺菌种均能扩增得到大小为968bp大小的目的片段，酶切结果显示不同菌种获得不同的酶切图谱。
所述rpoA基编码RNA聚合酶-α亚单位。
扩增片段大小为968bp，rpoA基因的扩增条件是：PCR扩增在PCR仪上进行，反应体系：引物（10 mmol/L）0.5-1 µL，DNA模板5-10ng，20-25 mmol/L Tris-HCl、80-100 mmol/LKCl、2.5-3.0 mmol/L MgCl2），加无菌双蒸水至50 µL。反应条件： 94 ℃预变性5 min；94℃变性30 s，56-58 ℃退火45-60 s，72℃延伸50-60 s，35个循环；72 oC10 min。
酶切条件：rpoA基因PCR 扩增产物10µL，无核酸酶无菌水18µL，1×buffer 2µL（10mM Tris-HCl (pH7.4), 2.5-5mM MgCl2, 80-100mM NaCl, 0.1-0.2mg/mL小牛血清白蛋白）, TaiI限制性内切酶1-2µL, 60-65oC 孵育1-4h。
本发明具有以下方面的优点：
1、rpoA基因具有较好的保守性
rpoA基因在克罗诺杆菌属中不同菌基因组中均存在，并且不同菌种之间rpoA酶切位点存在差异；
2、TaiI单酶切反应
本发明只使用一种限制性内切酶TaiI对rpoA基因进行酶切，避免RFLP分型技术中双酶切带来的酶切条件差异及其酶活性减弱等问题。采用TaiI单酶切反应，不仅实验操作方便、快速，而且酶切反应彻底、干扰少。
附图说明
图1为克罗诺杆菌属四种不同种的rpoA基因片段图。
图2为克罗诺杆菌属四种不同种的TaiI酶切rpoA基因的RFLP多态性图谱。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。
实施例
一种区分克罗诺杆菌属不同种的PCR-RFLP分子分型方法为两个实验阶段，第一阶段为图1所示，扩增rpoA基因片段，第二阶段如图2所示，采用TaiI酶切第一阶段扩增的rpoA基因片段，获得不同的酶切图谱，进而区分克罗诺菌属四种不同菌种。
具体操作步骤如下：
（1）选用rpoA基因
rpoA基编码RNA聚合酶-α亚单位；
（2）对rpoA基因扩增
用扩增引物F:5’- ATGCAGGGTTCTGTGACAGAG -3’；R：5’-GGTGGCCARTTTTCYAGGCGC-3’对rpoA基因扩增，得到克罗诺菌属四种不同菌的rpoA基因片段，见图1：克罗诺菌属四种不同菌种的菌株rpoA扩增结果；图1中M（孔道M）：DL2000分子量标记物（100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp）；lane25（孔道25）: C. sakazakii ATCC29544（阪崎克罗诺菌ATCC29544）; lane26（孔道26）: C.muytjensii （莫金斯克罗诺菌）ATCC51329; lane7: C. dublinnensis（都柏林克罗诺菌）; lane8, 28, 31, 32, 37,52 and 57（孔道8，28，31，32，52，57）: C.malonaticus（丙二酸盐克罗诺菌）；Other lanes（其他孔道）: C. sakazakii（阪崎克罗诺菌）；
扩增片段大小为968bp，rpoA基因的扩增条件是：PCR扩增在PCR仪上进行，反应体系：引物（10 mmol/L）0.5-1 µL，DNA模板5-10ng，20-25 mmol/L Tris-HCl、80-100 mmol/LKCl、2.5-3.0 mmol/L MgCl2），加无菌双蒸水至50 µL。反应条件： 94 ℃预变性5 min；94℃变性30 s，56-58 ℃退火45-60 s，72℃延伸50-60 s，35个循环；72 oC10 min；
（3）TaiI单酶切反应
采用TaiI限制性内切酶对扩增的四种不同菌的rpoA基因片段分别进行单酶切，
区分克罗诺杆菌属4种不同种RFLP酶切多态性的TaiI酶切条件：rpoA基因PCR 扩增产物10µL，无核酸酶无菌水16µL，1×buffer 3µL（10mM Tris-HCl (pH7.4), 2.5-5mMMgCl2, 80-100mM NaCl, 0.1-0.2mg/mL小牛血清蛋白）, TaiI限制性内切酶1-2µL, 60-65oC 孵育1-4h。
获得克罗诺菌属四种不同菌的差异性PCR-RFLP指纹图谱，进而为比对区分克罗诺菌属的不同菌种奠定基础。见图2：克罗诺菌属四种不同菌种rpoA基因的TaiI酶切结果，图2中：M（孔道M）：DL2000分子量标记物（100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp）； lane25（孔道25）: C. sakazakii ATCC29544（阪崎克罗诺菌ATCC29544）; lane26（孔道26）:C.muytjensii （莫金斯克罗诺菌）ATCC51329; lane7: C. dublinnensis（都柏林克罗诺菌）; lane8, 28, 31, 32, 37, 52 and 57（孔道8，28，31，32，52，57）: C.malonaticus（丙二酸盐克罗诺菌）；Other lanes（其他孔道）: C. sakazakii（阪崎克罗诺菌）。

Claims (1)

1.一种区分克罗诺杆菌属不同种的PCR-RFLP分子分型方法，其不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于：选用rpoA基因；用扩增引物F:5’- ATGCAGGGTTCTGTGACAGAG -3’；R：5’-GGTGGCCARTTTTCYAGGCGC-3’对rpoA基因扩增，得到克罗诺菌属四种不同菌的rpoA基因片段，所述克罗诺菌属四种不同菌为阪崎克罗诺菌（sakazakii）、莫金斯克罗诺菌（muytjensii）、都柏林克罗诺菌（dublinnensis）、丙二酸盐克罗诺菌（malonaticus）；然后采用TaiI限制性内切酶对扩增的四种不同菌的rpoA基因片段分别进行酶切，获得克罗诺菌属四种不同菌的差异性PCR-RFLP指纹图谱，进而为比对区分克罗诺菌属的不同菌种奠定基础；
所述rpoA基编码RNA聚合酶-α亚单位；
扩增片段大小为968bp，rpoA基因的扩增条件是：PCR扩增在PCR仪上进行，反应体系：终浓度为10 mmol/L引物0.5-1 µL，DNA模板5-10ng，20-25 mmol/L Tris-HCl、80-100 mmol/LKCl、2.5-3.0 mmol/L MgCl2，加无菌双蒸水至50 µL；
反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56-58 ℃退火45-60 s，72℃延伸50-60s，35个循环；72 oC10 min；
酶切条件：rpoA基因PCR 扩增产物10µL，无核酸酶无菌水18µL，1×buffer 2µL：10mMTris-HCl pH7.4、2.5-5mM MgCl2、80-100mM NaCl、0.1-0.2mg/mL小牛血清白蛋白；TaiI限制性内切酶1-2µL, 60-65oC 孵育1-4h。
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