CN107012260A - 新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式pcr检测引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式pcr检测引物、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测引物、试剂盒及检测方法，属于分子遗传学技术领域。本发明的多重巢式PCR检测试剂盒中包含检测新孢子虫ITS1、布氏杆菌16S rRNA和牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的内外引物对，采用该试剂盒能够同步检测出引起奶牛流产的3种病原。该多重巢式PCR检测方法具有非常高的敏感性和特异性；一次即可检测出3种流产病原的感染情况，检测快速，并且节约了大量的成本。检测方法中对于PCR各个反应体系的组分进行了优化，使得体系组成简单合理，对各个阶段的反应程序进行了优化，使得扩增结果易判别、耗时短。
Description
技术领域
本发明涉及新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测引物、试剂盒及检测方法，属于分子遗传学技术领域。
背景技术
流产是奶牛妊娠期间的一种常见疾病，奶牛流产导致产犊间隔扩大，增加养牛的饲料成本，影响高产奶量的获得和后备牛的扩充，给奶牛养殖业造成了严重的经济损失。据统计，每个流产病例平均经济损失达640美元。一般认为，牛场的年流产率在3％～5％为正常现象，但据近年调查显示，国内奶牛流产率达10％～25％。诊断分析流产原因，对预防和控制奶牛流产具有重要的意义。
引起妊娠母牛流产的原因可分为病原性因素和非病原性因素。国内外研究发现病原性因素引起的奶牛流产最多，达90％左右。大量的调查研究发现，引起奶牛流产的病原有新孢子虫(Neospora caninum)、布氏杆菌(Brucella abortus)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、胎儿三毛滴虫(Tritrichomonas foetus)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)等，其中新孢子虫(N.caninum)、布氏杆菌(B.abortus)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)3种病原最常见。对这3种病原进行确诊可有效控制该病的发生和蔓延。
目前商品化检测这3种疾病的试剂盒主要采用的是血清学检测方法，采用抗原抗体反应原理检测血清中的病原或者病原抗体。对于新孢子虫病(目前引起奶牛流产非常重要的疾病)，目前仅有进口的商业化血清抗体检测试剂盒，且价格昂贵，但动物体内抗体的存在状况并不能完全反映动物体内是否一定存在着病原。另外，这3种疾病要分开检测，即花费大量资金购买3种试剂盒，且费时费力。
公布号为CN103409543A的中国发明专利公开了一种检测牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，该试剂盒能够同时检测新孢子虫和弓形虫，但是其采用的是传统的PCR鉴定方法，其鉴定特异性及灵敏性都有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测引物，该引物能快速、特异、灵敏的鉴定出样本中是否含有新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒。
本发明还提供了一种新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测试剂盒，该试剂盒能够快速、特异、灵敏的检测出样本中是否含有三种病原。
本发明还提供了一种新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测引物，包括外引物组和内引物组：所述外引物组为：
引物NC EX 1：5’-CTTTTCAACCCTCAACCTTT-3’；
引物NC EX 2：5’-TGACACCCAATCATACTGCTC-3’；
引物BA EX 1：5’-CTACGGAATAACTCAGGGAAAC-3’；
引物BA EX 2：5’-AACCCAACATCTCACGACAC-3’；
引物IBRV EX 1：5’-ACGGACCTGGTGGACAAGAA-3’；
引物IBRV EX 2：5’-GTGCGTGCCGTTGTAGCG-3’；
所述内引物组为：
引物NC IN 3：5’-TGAGTTGTATCGCCTTCTT-3’；
引物NC IN 4：5’-ATTCACATTGCGTTTCG-3’；
引物BA IN 3：5’-GGTAAAGGCTCACCAAGGC-3’；
引物BA IN 4：5’-CAGGCGGAATGTTTAATGC-3’；
引物IBRV IN 3：5’-AGGTGGTGGCCTTTGACC-3’；
引物IBRV IN 4：5’-TCGTCTCGCAGCATTTCGTC-3’。
检测试剂盒，包含上述多重巢式PCR检测引物。
上述的检测试剂盒，还包括Taq酶、PCR Buffer、dNTPs。
所述Taq酶为TranStart Taq DNA聚合酶。
所述PCR Buffer为10×TranStart Taq Buffer。
上述的检测试剂盒，还包括阳性对照模板和阴性对照模板。
所述阳性对照模板为：新孢子虫ITS1、布氏杆菌16S rRNA和牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列。例如，由引物NC EX 1和引物NC EX 2扩增出的新孢子虫ITS1基因片段序列、由BA EX 1和引物BA EX 2扩增出的布氏杆菌16S rRNA基因片段序列以及由引物IBRV EX 1和引物IBRV EX 2扩增出的牛传染性鼻气管炎病毒gB基因片段序列，或者包含上述序列的质粒溶液。
所述阳性对照模板中各个质粒溶液中质粒的浓度均为3×106拷贝/μL。
所述阴性对照模板为无菌水。
新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测方法，包括如下步骤：
1)提取待测样本的DNA；
2)以步骤1)得到的DNA为模板，加入外引物组，进行第一轮PCR扩增，得第一轮扩增产物；
3)以所述第一轮扩增产物为模板，加入内引物组，进行第二轮PCR扩增，得第二轮扩增产物；
4)将所述第二轮扩增产物进行电泳分离，根据电泳条带得出检测结果；
所述外引物组为：
引物NC EX 1：5’-CTTTTCAACCCTCAACCTTT-3’；
引物NC EX 2：5’-TGACACCCAATCATACTGCTC-3’；
引物BA EX 1：5’-CTACGGAATAACTCAGGGAAAC-3’；
引物BA EX 2：5’-AACCCAACATCTCACGACAC-3’；
引物IBRV EX 1：5’-ACGGACCTGGTGGACAAGAA-3’；
引物IBRV EX 2：5’-GTGCGTGCCGTTGTAGCG-3’；
所述内引物组为：
引物NC IN 3：5’-TGAGTTGTATCGCCTTCTT-3’；
引物NC IN 4：5’-ATTCACATTGCGTTTCG-3’；
引物BA IN 3：5’-GGTAAAGGCTCACCAAGGC-3’；
引物BA IN 4：5’-CAGGCGGAATGTTTAATGC-3’；
引物IBRV IN 3：5’-AGGTGGTGGCCTTTGACC-3’；
引物IBRV IN 4：5’-TCGTCTCGCAGCATTTCGTC-3’。
所述第一轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的PCR Buffer；1.5mmol/L的dNTPs；外引物组中各引物均为0.6μmol/L；1.5U的Taq酶；模板1μl；余量为水。
所述Taq酶为TranStart Taq DNA聚合酶。
所述PCR Buffer为10×TranStart Taq Buffer。
所述第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
所述第二轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的PCR Buffer；1.5mmol/L的dNTPs；内引物组中各引物均为0.6μmol/L；1.5U的Taq酶；模板1μl；余量为水。
所述Taq酶为TranStart Taq DNA聚合酶。
所述PCR Buffer为10×TranStart Taq Buffer。
所述第二轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
所述检测结果的判断为：在380bp处具有条带的为样本中含有新孢子虫；在601bp处具有条带的为样本中含有布氏杆菌；在481bp处具有条带的为样本中含有牛传染性鼻气管炎病毒。
所述样本为流产胎牛的脑组织、肝脏组织或肺脏组织的混合匀浆物。
所述样本为流产母牛的血样、鼻腔分泌物、乳汁、体液或者分泌物的混合物。
本发明的新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒的多重巢式PCR检测试剂盒中包含检测新孢子虫ITS1、布氏杆菌16S rRNA和牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的内外引物对，采用多重巢式PCR检测方法能够同步检测出引起奶牛流产的3种病原，新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒。该试剂盒为巢式PCR试剂盒，具有非常高的敏感性和特异性；利用该试剂盒检测一次样品，即可检测出3种流产病原的感染情况，检测快速，并且节约了大量的成本。
本发明的多重巢式PCR检测方法能够快速、简便的检测出样品中是否含有新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒。对于PCR各个反应体系的组份进行了优化，使得体系组成简单合理，对各个阶段的反应程序进行了优化，使得扩增结果易判别、耗时短。
附图说明
图1为各内外引物采用不同的退火温度时的扩增效果图；
图2为试验例2中试剂盒外引物组不同退火温度的扩增效果图；
图3为试验例2中试剂盒内引物组不同退火温度的扩增效果图；
图4为试验例2中试剂盒外引物组不同引物浓度的扩增效果图；
图5为试验例2中试剂盒内引物组不同引物浓度的扩增效果图；
图6为试验例2检测方法中不同用量TranStart Taq DNA聚合酶的扩增效果图；
图7为试验例2检测方法中不同dNTPs用量的扩增效果图
图8为试验例3检测试剂盒对于不同模板浓度的敏感性实验效果图；
图9为试验例4检测方法的特异性实验效果图。
具体实施方式
下述实施例及试验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例及试验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例及试验例中各条引物的获得：以GenBank公布的新孢子虫ITS1基因(Genbank登录号为L49389)，布氏杆菌16S rRNA基因(Genbank登录号为KF780869)和牛传染性鼻气管炎病毒gB基因为(Genbank登录号为KF584168)参照序列，每个基因用PrimerPremier 5.0软件分别设计出2对引物，一对为内引物对，扩增片段较短；另一对为外引物对，扩增片段较长，并且扩增的片段中包含内引物对扩增片段。3种病原的外引物对和内引物对退火温度均相近，引物序列及产物的长度如表1所示：
表1多重巢式PCR检测试剂盒中各条引物信息表
以下实施例及试验例中阳性对照模板中的新孢子虫ITS1阳性质粒、布氏杆菌16SrRNA阳性质粒和牛传染性鼻气管炎病毒gB阳性质粒由以下方法制得：
提取新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒这3种病原的基因组DNA。分别用上述设计的外引物对扩增这3种病原相应的基因，回收扩增的目的片段，与pEASY-T1Simple克隆载体连接，转化至北京全式金公司的Trans1-T1感受态细胞中，经蓝白斑筛选后，选择白色的阳性菌株提取质粒，并测序鉴定。新孢子虫ITS1基因外引物对扩增出序列如SEQ ID NO.1所示；布氏杆菌16S rRNA外引物对扩增出序列如SEQ ID NO.2所示；牛传染性鼻气管炎病毒gB外引物对扩增出序列如SEQ ID NO.3所示。序列正确的分别为新孢子虫ITS1阳性质粒、布氏杆菌16S rRNA阳性质粒和牛传染性鼻气管炎病毒gB阳性质粒，将3种提取的阳性质粒溶液均稀释成3×106拷贝/μL，留待以下实施例中及试验例中使用。
新孢子虫ITS1基因内引物对扩增出序列如SEQ ID NO.1中101-480位所示；布氏杆菌16S rRNA内引物对扩增出序列如SEQ ID NO.2中104-704位所示；牛传染性鼻气管炎病毒gB内引物对扩增出序列如SEQ ID NO.3中65-545位所示。
实施例1
本实施例中新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测引物，包括：外引物组：
引物NC EX 1：5’-CTTTTCAACCCTCAACCTTT-3’；
引物NC EX 2：5’-TGACACCCAATCATACTGCTC-3’；
引物BA EX 1：5’-CTACGGAATAACTCAGGGAAAC-3’；
引物BA EX 2：5’-AACCCAACATCTCACGACAC-3’；
引物IBRV EX 1：5’-ACGGACCTGGTGGACAAGAA-3’；
引物IBRV EX 2：5’-GTGCGTGCCGTTGTAGCG-3’；
内引物组：
引物NC IN 3：5’-TGAGTTGTATCGCCTTCTT-3’；
引物NC IN 4：5’-ATTCACATTGCGTTTCG-3’；
引物BA IN 3：5’-GGTAAAGGCTCACCAAGGC-3’；
引物BA IN 4：5’-CAGGCGGAATGTTTAATGC-3’；
引物IBRV IN 3：5’-AGGTGGTGGCCTTTGACC-3’；
引物IBRV IN 4：5’-TCGTCTCGCAGCATTTCGTC-3’。
实施例2
本实施例中新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测试剂盒，包括：外引物组、内引物组，阳性对照模板，阴性对照模板，TranStart Taq DNA聚合酶，10×TranStart Taq Buffer，dNTPs。
外引物组为：
引物NC EX 1：5’-CTTTTCAACCCTCAACCTTT-3’；
引物NC EX 2：5’-TGACACCCAATCATACTGCTC-3’；
引物BA EX 1：5’-CTACGGAATAACTCAGGGAAAC-3’；
引物BA EX 2：5’-AACCCAACATCTCACGACAC-3’；
引物IBRV EX 1：5’-ACGGACCTGGTGGACAAGAA-3’；
引物IBRV EX 2：5’-GTGCGTGCCGTTGTAGCG-3’；
内引物组为：
引物NC IN 3：5’-TGAGTTGTATCGCCTTCTT-3’；
引物NC IN 4：5’-ATTCACATTGCGTTTCG-3’；
引物BA IN 3：5’-GGTAAAGGCTCACCAAGGC-3’；
引物BA IN 4：5’-CAGGCGGAATGTTTAATGC-3’；
引物IBRV IN 3：5’-AGGTGGTGGCCTTTGACC-3’；
引物IBRV IN 4：5’-TCGTCTCGCAGCATTTCGTC-3’。
阳性对照模板为新孢子虫ITS1阳性质粒、布氏杆菌16S rRNA阳性质粒和牛传染性鼻气管炎病毒gB阳性质粒。阴性对照模板为无菌水。
实施例3
本实施例中新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒的多重巢式PCR检测方法，包括如下步骤：
1)提取胎牛的脑、肝脏和肺组织混匀后样本的DNA；
2)以步骤1)得到的DNA为模板，加入所述外引物组，进行第一轮PCR扩增；第一轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的10×TranStart Taq Buffer(购自北京全式金公司)，1.5mmol/L的dNTPs，外引物组中各引物均为0.6μmol/L，1.5U的TranStart Taq DNA聚合酶，模板1μl，余量为水；反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min；得第一轮扩增产物；
3)以所述第一轮扩增产物为模板，加入所述内引物组，进行第二轮PCR扩增；第二轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的10×TranStart Taq Buffer，1.5mmol/L的dNTPs，内引物组中各引物均为0.6μmol/L，1.5U的TranStart Taq DNA聚合酶，模板1μl，余量为水；反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃40s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min；得第二轮扩增产物；
4)将所述第二轮扩增产物进行电泳分离，根据电泳380bp、601bp、481bp的条带有无判断样本中是否存在新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒；
所述外引物组为：
引物NC EX 1：5’-CTTTTCAACCCTCAACCTTT-3’；
引物NC EX 2：5’-TGACACCCAATCATACTGCTC-3’；
引物BA EX 1：5’-CTACGGAATAACTCAGGGAAAC-3’；
引物BA EX 2：5’-AACCCAACATCTCACGACAC-3’；
引物IBRV EX 1：5’-ACGGACCTGGTGGACAAGAA-3’；
引物IBRV EX 2：5’-GTGCGTGCCGTTGTAGCG-3’；
所述内引物组为：
引物NC IN 3：5’-TGAGTTGTATCGCCTTCTT-3’；
引物NC IN 4：5’-ATTCACATTGCGTTTCG-3’；
引物BA IN 3：5’-GGTAAAGGCTCACCAAGGC-3’；
引物BA IN 4：5’-CAGGCGGAATGTTTAATGC-3’；
引物IBRV IN 3：5’-AGGTGGTGGCCTTTGACC-3’；
引物IBRV IN 4：5’-TCGTCTCGCAGCATTTCGTC-3’。
检测结果的判断为：在380bp处有条带为具有新孢子虫，无条带则没有新孢子虫；601bp处有条带为具有布氏杆菌，无条带则没有布氏杆菌；481bp处有条带为具有牛传染性鼻气管炎病毒，无条带则没有牛传染性鼻气管炎病毒。
根据上述结果，发现该胎牛组织样本含有新孢子虫，不含有布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒。
试验例1
实施例3中使用的各内外引物采用不同的退火温度时的扩增效果实验：
如表1所示，该实验分为6组，分别为A组(引物为BA EX 1和BA EX 2)、B组(引物为BA IN 3和BA IN 4)，所使用的模板为新孢子虫ITS1阳性质粒；C组(引物为NC EX 1和NC EX2)、D组(引物为NC IN 3和NC IN 4)，所使用的模板为布氏杆菌16S rRNA阳性质粒；E组(引物为IBRV EX 1和IBRV EX 2)、F组(引物为IBRV IN 3和IBRV IN 4)，所使用的模板为牛传染性鼻气管炎病毒gB阳性质粒。
阴性对照组模板为无菌水。
各组PCR反应体系，总25μL：1μL模板，各引物对(每条引物的终浓度为0.6μmol/L)，TranStart Taq DNA聚合酶为1.5U，2.5μL的10×TranStart Taq Buffer，dNTPs浓度为1.5mmol/L，余量为水。
各实验组PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，退火温度(各退火温度设置为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃)1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。阴性对照组退火温度设置为53℃。
上述实验中三种病原内外引物对退火温度优化结果如图1所示：A、布氏杆菌16SrRNA基因外引物对；B、布氏杆菌16S rRNA基因内引物对；C、新孢子虫ITS1基因外引物对；D、新孢子虫ITS1基因内引物对；E、牛传染性鼻气管炎gB基因外引物对；F、牛传染性鼻气管炎gB基因内引物对。其中各图中M为DNA Marker DL2000DNA分子量标准，从上至下大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。1-5为退火温度分别为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃时的扩增结果；“—”为阴性对照。
试验例2
(一)实施例3中的多重巢式PCR检测方法中不同反应体系及反应程序的扩增效果实验
1、多重巢式PCR检测方法中第一轮PCR扩增外引物组不同退火温度的扩增效果实验：
PCR反应体系，总25μL：加入3种阳性质粒，每种质粒1μL；外引物对(共六条引物，每条引物的终浓度为0.6μmol/L)，TranStart Taq DNA聚合酶为1.5U，2.5μL的10×TranStartTaq Buffer，dNTPs浓度为1.5mmol/L，余量为水。
PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，退火温度(分别设定为51℃、53℃、55℃、57℃)1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
将获得的PCR产物进行电泳分离，结果如图2所示，其中M为DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-4：退火温度分别为51℃、53℃、55℃、57℃时的扩增结果；5为阴性对照，模板为灭菌水，退火温度为53℃。从图2中可以看出当退火温度设为51℃和53℃时，同时能扩增出三条带(644bp、914bp和708bp)，其中53℃条带较亮，扩增结果较好。
2、多重巢式PCR检测方法中第二轮PCR扩增内引物组不同退火温度的扩增效果实验：
PCR反应体系，总25μL：加入3种阳性质粒，每种质粒1μL；内引物对(共六条引物，每条引物的终浓度为0.6μmol/L)，TranStart Taq DNA聚合酶为1.5U，2.5μL的10×TranStartTaq Buffer，dNTPs浓度为1.5mmol/L，余量为水。
PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，退火温度(分别设定为51℃、53℃、55℃、57℃)40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
将获得的PCR产物进行电泳分离，结果如图3所示，其中M为DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-4：退火温度分别为51℃、53℃、55℃、57℃时的扩增结果；5为阴性对照，模板为灭菌水，退火温度为55℃。从图3中可以看出当退火温度设为53℃和55℃时，同时能扩增出三条带(380bp、601bp和481bp)，其中53℃时条带较亮，扩增结果较好。
3、多重巢式PCR检测方法中第一轮PCR扩增外引物组的不同引物浓度的扩增效果实验：
根据上述实验，得知外引物组的最佳退火温度为53℃，因此将退火温度都设置为53℃。
PCR反应体系，总25μL：加入3种阳性质粒，每种质粒1μL；外引物对(共六条引物，每条引物的终浓度分别为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.6μmol/L)，TranStart Taq DNA聚合酶为1.5U，2.5μL的10×TranStart Taq Buffer，dNTPs浓度为1.5mmol/L，余量为水。
PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，53℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
将获得的PCR产物进行电泳分离，结果如图4所示，其中M为DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-3：每条引物的终浓度分别为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.6μmol/L时的扩增结果；4为阴性对照，模板为灭菌水，引物浓度为0.6μmol/L。从图4中可以看出当每条引物的终浓度设置为0.6μmol/L时，同时能扩增出三条较亮条带(644bp、914bp和708bp)，扩增结果较好。
4、多重巢式PCR检测方法中第二轮PCR扩增内引物组的不同引物浓度的扩增效果实验：
根据上述实验，得知内引物组的最佳退火温度为53℃，因此将退火温度都设置为53℃。
PCR反应体系，总25μL：加入3种阳性质粒，每种质粒1μL；内引物对(共六条引物，每条引物的终浓度分别为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.6μmol/L)，TranStart Taq DNA聚合酶为1.5U，2.5μL的10×TranStart Taq Buffer，dNTPs浓度为1.5mmol/L，余量为水。
PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，53℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
将获得的PCR产物进行电泳分离，结果如图5所示，其中M为DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-3：每条引物的终浓度分别为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.6μmol/L时的扩增结果；4为阴性对照，模板为灭菌水，引物浓度为0.6μmol/L。从图5中可以看出当每条引物的终浓度设置为0.6μmol/L时，同时能扩增出三条带(380bp、601bp和481bp)，条带较亮，扩增结果较好。
5、多重巢式PCR检测方法中不同用量Taq DNA聚合酶的扩增效果实验：
本实验采用内引物组作为实验引物，根据上述实验，得知内引物组的最佳退火温度为53℃，因此将退火温度都设置为53℃；得知内引物组的最佳引物浓度为0.6μmol/L，因此将各条引物设置为0.6μmol/L。
PCR反应体系，总25μL：加入3种阳性质粒，每种质粒1μL；内引物对(共六条引物，每条引物的终浓度分别为0.6μmol/L)，TranStart Taq DNA聚合酶(将TranStart Taq DNA聚合酶的用量分别设置为1U/25μL、1.25U/25μL、1.5U/25μL)，2.5μL的10×TranStart TaqBuffer，dNTPs浓度为1.5mmol/L，余量为水。
PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，53℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
将获得的PCR产物进行电泳分离，结果如图6所示，其中M为DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-3：TranStart Taq酶的用量分别设置为1U/25μL、1.25U/25μL、1.5U/25μL时的扩增结果。从图6中可以看出当Taq酶的用量设置为1.5U/25μL时，同时能扩增出三条带(380bp、601bp和481bp)，条带较亮，扩增结果较好。
6、多重巢式PCR检测方法中不同dNTPs用量的扩增效果实验：
本实验采用内引物组作为实验引物，根据上述实验，得知内引物组的最佳退火温度为53℃，因此将退火温度都设置为53℃；得知内引物组的最佳引物浓度为0.6μmol/L，因此将各条引物设置为0.6μmol/L。
PCR反应体系，总25μL：加入3种阳性质粒，每种质粒1μL；内引物对(共六条引物，每条引物的终浓度分别为0.6μmol/L)，1.5U/25μL的TranStart Taq DNA聚合酶，2.5μL的10×TranStart Taq Buffer，dNTPs(分别设置dNTPs的浓度为1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L)，余量为水。
PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，53℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
将获得的PCR产物进行电泳分离，结果如图7所示，其中M为DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-3：dNTPs的用量分别设置为1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L时的扩增结果。从图7中可以看出当dNTPs的用量设置为1.5mmol/L时，同时能扩增出三条较亮的条带(380bp、601bp和481bp)，扩增结果较好。
试验例3
本发明的实施例2中多重巢式PCR检测试剂盒对于不同模板浓度的敏感性实验
将上述得到的三种质粒按照10倍稀释法进行稀释，得到浓度分别为3×100～3×106拷贝/μL的质粒溶液，分别以质粒溶液为模板，采用实施例1的多重巢式PCR检测方法进行扩增，以检测本发明的检测试剂盒的检测敏感性。
检测方法包括如下步骤：
1)采用上述的浓度分别为3×100～3×106拷贝/μL的质粒溶液为模板，加入所述外引物组，进行第一轮PCR扩增；第一轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的10×TranStartTaq Buffer，1.5mmol/L的dNTPs，外引物组中各引物均为0.6μmol/L，1.5U的TranStart TaqDNA聚合酶，模板1μl，余量为水；反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min；得第一轮扩增产物；
2)以所述第一轮扩增产物为模板，加入所述内引物组，进行第二轮PCR扩增；第二轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的10×TranStart Taq Buffer，1.5mmol/L的dNTPs，内引物组中各引物均为0.6μmol/L，1.5U的TranStart Taq DNA聚合酶，模板1μl，余量为水；反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃40s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min；得第二轮扩增产物；
3)将所述第二轮扩增产物进行电泳分离，根据电泳380bp、601bp、481bp处的条带有无判断样本中是否存在新孢子虫，布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒。
将获得的PCR产物进行电泳分离，结果如图8所示，其中M为DNA Marker，从上至下大小依次为：600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；1-7：质粒的浓度为3×106拷贝/μL、3×105拷贝/μL、3×104拷贝/μL、3×103拷贝/μL、3×102拷贝/μL、3×101拷贝/μL、3×100拷贝/μL，8为阴性对照(模板为PCR缓冲溶液，其他与实验组相同)。
从图8中可以看出，当质粒的浓度为3×102拷贝/μL时，仍然能较好的检测出新孢子虫ITS1基因、布氏杆菌16S rRNA基因和牛传染性鼻气管炎gB基因，结果表明本发明的多重巢式PCR检测试剂盒具有较高的敏感性。
试验例4
本发明的实施例2和3中的多重巢式PCR检测试剂盒及检测方法的特异性实验
分别对住肉孢子虫、弓形虫、大肠杆菌、沙门氏菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的核酸样品进行PCR扩增，验证是否会存在非特异性扩增，以用来检测本发明的多重巢式PCR检测试剂盒的特异性。
检测方法包括如下步骤：
1)采用上述的住肉孢子虫、弓形虫、大肠杆菌、沙门氏菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的核酸样品为模板，加入所述外引物组，进行第一轮PCR扩增；第一轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的10×TranStart Taq Buffer，1.5mmol/L的dNTPs，外引物组中各引物均为0.6μmol/L，1.5U的TranStart Taq DNA聚合酶，模板1μl，余量为水；反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min；得第一轮扩增产物；
2)以所述第一轮扩增产物为模板，加入所述内引物组，进行第二轮PCR扩增；第二轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的10×TranStart Taq Buffer，1.5mmol/L的dNTPs，内引物组中各引物均为0.6μmol/L，1.5U的TranStart Taq DNA聚合酶，模板1μl，余量为水；反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃40s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min；得第二轮扩增产物；
3)将所述第二轮扩增产物进行电泳分离，根据电泳380bp、601bp、481bp处的条带有无判断样本中是否存在新孢子虫，布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒。
将获得的PCR产物进行电泳分离，结果如图9所示，其中M为DNA Marker DL2000，从上至下大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp；1-7：分别为住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门氏菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的核酸样品；8为阳性对照(模板为实施例1中获得的3种浓度为3×106拷贝/μL阳性质粒，其他与实验组相同)，9为阴性对照(模板为PCR缓冲溶液，其他与实验组相同)。从图9中可以看出，住肉孢子虫、弓形虫、大肠杆菌、沙门氏菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的核酸样品均未扩增出条带，该结果表明本发明的多重巢式PCR检测试剂盒具有较高的特异性。
试验例5
自河南某地区的5个奶牛养殖小区共采集46头流产胎牛和46份流产母牛抗凝血液，分别采集流产胎牛的脑、肝、脾和肺组织，每个组织各取样品3-5g混合并匀浆，再用组织基因组DNA提取试剂盒提取组织DNA；抗凝血用血液基因组DNA试剂盒提取其基因组DNA。
(一)采用实施例3中新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法检测46头流产胎牛和46份流产母牛的DNA样品。检测结果如表2所示。
(二)采用单巢式PCR检测方法分别检测46头流产胎牛和46份流产母牛的DNA样品，即每次仅使用一种病原的内引物组和外引物组进行检测，每个样品检测3次。检测结果如表2所示。
表2河南某地区奶牛养殖小区临床样品的检测结果
从表2中可以看出，46份流产胎牛组织样本中，18份(18/46，39.1％)检出新孢子虫，2份(2/46，4.3％)检出布氏杆菌，4份(4/46，8.7％)检出牛传染性鼻气管炎病毒，其中1份(1/46，2.2％)样本同时检测出新孢子虫和布氏杆菌；46份血液样本中，10份(10/46，21.7％)检出新孢子虫。采用单巢式PCR检测方法与本发明的多重巢式PCR检测方法结果一致，表明本申请的多重巢式PCR检测结果准确、快速，能够满足检测需求。
<110> 河南科技大学
<120> 新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测引物、试剂盒及检测方法
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<211> 644
<212> DNA
<213> 序列
<221> 新孢子虫ITS1基因外引物对扩增序列
<400> 1
cttttcaacc ctcaaccttt gaatcccaaa caaaacatga gcttgtatct ctctccttcg 60
gagaggggta cattcaagaa gcgtgatata ctactccctg tgagttgtat cgccttcttc 120
atgtggatat tttgcactac tgtgatcagg cgttctattg aaccgctgat aatgaaagtg 180
tgtgcatata tccgggagtg tacggcgaag ggactcggtc actggaaatt aatgtctcta 240
ttgggacttt aacttccagg agtttcttca atgtgcattc ttttttccca caccgttatt 300
ttaaaccaca aatctggata gcgtttgagg gaagagaaag atggtctctt tctgtatttc 360
tctctattcg ctttcagatt acttactaaa aactataatg tttttctaaa ttttcagcaa 420
tggatgtctt ggctcgcgca acgatgaagg acgcagcgaa ctgcgaaacg caatgtgaat 480
tgcagaattc agtgaatcat cagatttctg aacgcaaatg ccaccttggg gatattctcc 540
ttggtacgtc tgtttcagtg tctttgaaat cacaattttc tgctttttag ggtcgttgct 600
tcggtctcac tggagccgcc taagagcagt atgattgggt gtca 644
<211> 914
<212> DNA
<213> 序列
<221> 布氏杆菌16S rRNA外引物对扩增序列
<400> 2
ctacggaata actcagggaa acttgtgcta ataccgtatg tgcccttcgg gggaaagatt 60
tatcggcaaa tgatcggccc gcgttggatt agctagttgg tggggtaaag gctcaccaag 120
gcgacgatcc atagctggtc tgagaggatg atcagccaca ctgggactga gacacggccc 180
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc 240
catgccgcgt gagtgatgaa ggccctaggg ttgtaaagct ctttcaccgg tgaagataat 300
gacggtaacc ggagaagaag ccccggctaa cttcgtgcca gcagccgcgg taatacgaag 360
ggggctagcg ttgttcggat ttactgggcg taaagcgcac gtaggcggac ttttaagtca 420
ggggtgaaat cccggggctc aaccccggaa ctgcctttga tactggaagt cttgagtatg 480
gtagaggtga gtggaattcc gagtgtagag gtgaaattcg tagatattcg gaggaacacc 540
agtggcgaag gcggctcact ggaccattac tgacgctgag gtgcgaaagc gtggggagca 600
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gaatgttagc cgtcggggtg 660
tttacacttc ggtggcgcag ctaacgcatt aaacattccg cctggggagt acggtcgcaa 720
gattaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 780
cgaagcaacg cgcagaacct taccagccct tgacatcccg gtcgcggtta gtggagacac 840
tatccttcag ttaggctgga ccggagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 900
tgagatgttg ggtt 914
<211> 708
<212> DNA
<213> 序列
<221> 牛传染性鼻气管炎病毒gB外引物对扩增序列
<400> 3
acggacctgg tggacaagaa gtggcgctgc ctttcgaaag ccgagtacct gcgcagcggg 60
cgcaaggtgg tggcctttga ccgcgacgac gacccctggg aggcgccgct gaagcctgcg 120
cggctgagcg cgcccggggt gcggggctgg cacacgacgg acgatgtgta cacggcgctg 180
ggctcggcgg ggctctaccg cacgggcacc tctgtgaact gcatcgtgga agaagtggag 240
gcgcgctcgg tgtacccgta cgactcgttc gcgctctcga ccggggacat tatctacatg 300
tcgccctttt acgggctgcg cgagggcgcg caccgcgagc acaccagcta ctcgccggag 360
cgcttccagc agatcgaggg ctactacaag cgcgacatgg ccacgggccg gcgcctcaag 420
gagccggtct cgcggaactt tttgcgtaca cagcacgtga cggtagcctg ggactgggtg 480
cccaagcgca aaaacgtgtg ctcgctggcc aagtggcgcg aggcggacga aatgctgcga 540
gacgagagcc gcgggaactt ccgcttcacg gcccgctcgc tctcggcgac ctttgtgagc 600
gacagccaca ccttcgcgtt gcagaatgtg ccgctgagcg actgcgtgat cgaagaggcc 660
gaggccgcgg tcgagcgcgt ctaccgcgag cgctacaacg gcacgcac 708
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物NC EX 1
<400> 4
cttttcaacc ctcaaccttt 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物NC EX 2
<400> 5
tgacacccaa tcatactgct c 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物NC IN 3
<400> 6
tgagttgtat cgccttctt 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物NC IN 4
<400> 7
attcacattg cgtttcg 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物BA EX 1
<400> 8
ctacggaata actcagggaa ac 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物BA EX 2
<400> 9
aacccaacat ctcacgacac 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物BA IN 3
<400> 10
ggtaaaggct caccaaggc 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物BA IN 4
<400> 11
caggcggaat gtttaatgc 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物IBRV EX 1
<400> 12
acggacctgg tggacaagaa 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物IBRV EX 2
<400> 13
gtgcgtgccg ttgtagcg 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物IBRV IN 3
<400> 14
aggtggtggc ctttgacc 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> 引物IBRV IN 3
<400> 15
tcgtctcgca gcatttcgtc 20
Claims (9)
1.新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒多重巢式PCR检测引物，其特征在于：包括外引物组和内引物组：所述外引物组为：
引物NC EX 1：5’-CTTTTCAACCCTCAACCTTT-3’；
引物NC EX 2：5’-TGACACCCAATCATACTGCTC-3’；
引物BA EX 1：5’-CTACGGAATAACTCAGGGAAAC-3’；
引物BA EX 2：5’-AACCCAACATCTCACGACAC-3’；
引物IBRV EX 1：5’-ACGGACCTGGTGGACAAGAA-3’；
引物IBRV EX 2：5’-GTGCGTGCCGTTGTAGCG-3’；
所述内引物组为：
引物NC IN 3：5’-TGAGTTGTATCGCCTTCTT-3’；
引物NC IN 4：5’-ATTCACATTGCGTTTCG-3’；
引物BA IN 3：5’-GGTAAAGGCTCACCAAGGC-3’；
引物BA IN 4：5’-CAGGCGGAATGTTTAATGC-3’；
引物IBRV IN 3：5’-AGGTGGTGGCCTTTGACC-3’；
引物IBRV IN 4：5’-TCGTCTCGCAGCATTTCGTC-3’。
2.包含如权利要求1所述多重巢式PCR检测引物的检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：还包括Taq酶、PCR Buffer、dNTPs。
4.新孢子虫、布氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒的多重巢式PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)提取待测样本的DNA；
2)以步骤1)得到的DNA为模板，加入外引物组，进行第一轮PCR扩增，得第一轮扩增产物；
3)以所述第一轮扩增产物为模板，加入内引物组，进行第二轮PCR扩增，得第二轮扩增产物；
4)将所述第二轮扩增产物进行电泳分离，根据电泳条带得出检测结果；
所述外引物组为：
引物NC EX 1：5’-CTTTTCAACCCTCAACCTTT-3’；
引物NC EX 2：5’-TGACACCCAATCATACTGCTC-3’；
引物BA EX 1：5’-CTACGGAATAACTCAGGGAAAC-3’；
引物BA EX 2：5’-AACCCAACATCTCACGACAC-3’；
引物IBRV EX 1：5’-ACGGACCTGGTGGACAAGAA-3’；
引物IBRV EX 2：5’-GTGCGTGCCGTTGTAGCG-3’；
所述内引物组为：
引物NC IN 3：5’-TGAGTTGTATCGCCTTCTT-3’；
引物NC IN 4：5’-ATTCACATTGCGTTTCG-3’；
引物BA IN 3：5’-GGTAAAGGCTCACCAAGGC-3’；
引物BA IN 4：5’-CAGGCGGAATGTTTAATGC-3’；
引物IBRV IN 3：5’-AGGTGGTGGCCTTTGACC-3’；
引物IBRV IN 4：5’-TCGTCTCGCAGCATTTCGTC-3’。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述第一轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的PCR Buffer；1.5mmol/L的dNTPs；外引物组中各引物均为0.6μmol/L；1.5U的Taq酶；模板1μl；余量为水。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述第二轮PCR扩增的体系为25μl，包括：2.5μl的PCR Buffer；1.5mmol/L的dNTPs；内引物组中各引物均为0.6μmol/L；1.5U的Taq酶；模板1μl；余量为水。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述第二轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，53℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述检测结果的判断为：在380bp处具有条带的为样本中含有新孢子虫；在601bp处具有条带的为样本中含有布氏杆菌；在481bp处具有条带的为样本中含有牛传染性鼻气管炎病毒。
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|---|---|
| CN (1) | CN107012260A (zh) |
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