CN103060254A - 霍乱弧菌hlyA基因的质粒克隆菌株以及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种霍乱弧菌hlyA基因的质粒克隆菌株、其制备方法，及其在非疾病诊断目的方面的应用,其以大肠杆菌pCC1FOS为载体，转化了霍乱弧菌的hlyA基因的质粒克隆菌株，保藏编号为CGMCC NO.6999。主要用于霍乱弧菌相应基因检测的阳性对照样品，进行质量控制，也可用来考核检验人员的技术水平，以保证检验工作质量；并且可以对不同的分析方法和不同的鉴定仪器进行检验和校准，使之具有准确性、统一性、可比性和规范性。具有广泛的应用前景。

Description

霍乱弧菌hlyA基因的质粒克隆菌株以及制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及霍乱弧菌全基因组DNA提取和hlyA基因的质粒克隆菌株、其制备方法及非疾病诊断目的方面的应用。

背景技术

霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的烈性肠道传染病，能引起霍乱流行的霍乱弧菌主要有两种血清型，既O1群和O139群，霍乱弧菌的强致病作用主要是由其分泌的霍乱肠毒素导致严重腹泻所致，因此准确、快速的检测霍乱弧菌，特别是产毒霍乱弧菌，对于预防霍乱弧菌感染具有重要意义。随着分子生物学研究的发展，人们对细菌的侵袭素和毒力岛等毒力基因认识的不断深入，细菌的检测方法已经从传统的一般表型特征鉴定深化为遗传特征基因的鉴定。霍乱弧菌hlyA基因编码具有溶血-溶细胞的蛋白，是弧菌属高度保守的管家基因；霍乱弧菌rfb-O1基因和rfb-O139基因分别是O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌菌体抗原编码基因，ctxAB基因是分泌霍乱肠毒素的毒力标志，具有高度保守性。

由于霍乱弧菌的相关毒力基因、管家基因和功能基因总是成簇的位于染色体上，一般都在几kb到几十kb之间，难以用一般的PCR方法扩增并克隆这些基因。基因组文库(genomiclibrary)是上世纪70年代末发展起来的一种分离基因组基因的新技术，它包含了基因组的全套遗传信息(即全部基因)，人们可用相应的基因探针从文库中钓取出任一特定的基因片段加以研究。目前宏基因组学的应用已成为研究已有基因和寻找新基因及其产物的一条新途径，载体包括Cosmid、Fosmid和BAC等，平均插入片段大于40Kb，Fosmid载体是一种替代Cosmid载体构建大片段文库的新载体，与BAC文库构建相比，Fosmid文库稳定性、随机性好、技术成熟、构建更简单快速。Fosmid载体由于插入了大肠埃希菌致育因子F^一因子，所以它在宿主菌中以单拷贝形式存在，稳定性好。并且载体上有一个可诱导的oriV高拷贝复制起始点，需要时可诱导达到高拷贝(50个左右)。另外，Fosmid文库随机性好，保证了每段DNA在文库中出现的频率均等。

为了防止“生物安全事故”而引发“公共卫生事件”，国内外均一致要求在PIII或PII生物安全实验室内对霍乱弧菌可疑样品进行检测，通过构建霍乱弧菌Fosmid文库的目的就是要把霍乱弧菌染色体的全部基因克隆到易于培养的大肠杆菌中，筛选出霍乱弧菌hlyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因单克隆菌株，霍乱弧菌克隆基因的宿主菌为大肠杆菌，不需要培养活的霍乱弧菌菌株，所以可以在PI生物安全实验室进行操作，有利于生物安全防护；同时也是研究霍乱弧菌的致病机理、潜伏机制、血清学变异机理、基因疫苗的制备和基因结构及功能等分子生物学特性的前提；而且有利于进行霍乱弧菌的基因功能的研究和满足地方基层实验室应对霍乱疫情和疫源地疫情检测时快速检测霍乱弧菌的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供霍乱弧菌(Vibrio cholerae)全基因组DNA提取方法和霍乱弧菌(Vibriocholerae)hlyA基因的单克隆菌株，主要用于霍乱弧菌相应基因检测的阳性对照样品，进行质量控制，也可用来考核检验人员的技术水平，以保证检验工作质量；并且可以对不同的分析方法和不同的鉴定仪器进行检验和校准，使之具有准确性、统一性、可比性和规范性。

本发明的一方面在于提供一种霍乱弧菌(Vibrio cholerae)hlyA基因的质粒克隆菌株，其以大肠杆菌pCC1FOS为载体，转化了霍乱弧菌的hlyA基因的质粒克隆菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.6999。

本发明的另一方面在于提供一种霍乱弧菌hlyA基因检测试剂盒，其包括上文所述的保藏编号为CGMCC NO.6999的质粒克隆菌株作为阳性对照，及上下游引物与探针：SEQ IDNO.4；SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.6。

此外，试剂盒中还可以包括用于PCR扩增的2×PCR Taqman GEx酶预混液等试剂，本领域技术人员可依据试剂盒所应用的PCR反应类型，确定所需的缓冲液或扩增酶等试剂种类。

本发明的再一方面在于提供一种非疾病诊断目的的，霍乱弧菌hlyA基因的多重PCR检测方法，其利用上文所述霍乱弧菌hlyA基因检测试剂盒，对样品DNA进行多重PCR方法检测。

对于上述技术方案中，优选的情况下，所述的多重PCR方法检测的条件为：

①反应体系总体积为20μL，其中：

②以上各组分混匀，5000r/min，离心10s后，进行多重PCR方法检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环。

对于上述技术方案中，所述保藏编号为CGMCC NO.6997、CGMCC NO.6998、CGMCCNO.6999、CGMCC NO.7000的霍乱弧菌质粒克隆菌株的构建方法为：采用低熔点琼脂糖包埋法提取霍乱弧菌总基因组DNA、构建霍乱弧菌Fosmid文库、提取甘油菌DNA和PCR方法筛选目的基因，具体包括如下步骤：

利用低熔点琼脂糖包埋法，分别提取O1和O139两种血清型霍乱弧菌（N16961和MO45）完整基因组，用随机剪切法将基因组进行片段化处理，脉冲电泳分离片段化的DNA并切胶回收38～48Kb之间的DNA片段，然后对回收的DNA片段进行末端平滑化和磷酸化处理后，再与pCC1FOS质粒载体连接，经包装、转染后构建霍乱弧菌Fosmid文库。从建好的文库中取少量甘油菌进行单克隆纯培养和提取DNA，并用PCR方法筛选出霍乱弧菌的毒力基因ctxAB、管家基因hlyA和O1及O139菌体抗原基因rfb，最终筛选出具有良好稳定性的霍乱弧菌hlyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因的单克隆菌株，宿主菌为大肠杆菌pCC1FOS载体。

本发明中，所使用的引物和探针分别是申请号为201110281129.0中具有很高特异性的O1群霍乱弧菌的rfb基因(SEQ ID NO.13)的检测引物和探针（SEQ ID NO.1、2和3），霍乱弧菌hlyA基因(SEQ ID NO.14)的检测引物和探针（SEQ ID NO.4、5和6）以及O139群霍乱弧菌的rfb基因(SEQ ID NO.15)的检测引物和探针（SEQ ID NO.7、8和9）和检测方法；基于此，本发明进一步公开了霍乱弧菌毒力基因ctxAB(SEQ ID NO.16)的引物和探针序列（SEQ IDNO.10、11和12）。

附图说明

图1不同OD值菌悬液提取的总基因组DNA脉冲电泳图，其中M2:Low Range PFGEMarker；1-3:N16961 OD4,6,8 1/2胶块；4-6:MO45 OD4,6,8 1/2胶块。

图2Not I酶切分析Fosmid文库插入片段大小，DNA MWM XV Marker（200ng）；

图3普通电泳法检测阳性质粒克隆菌株稳定性

其中，M1为λ-Hind ⅢMarker（100ng）；1.SYFW296-29(0代)；2.SYFW296-29(50代)；3.SYFW296-29(100代)；4.SYFW296-49(0代)；5.SYFW296-49(50代)；6.SYFW296-49(100代)；7.SYFW296-165-1(0代)；8.SYFW296-165-1(50代)；9.SYFW296-165-1(100代)；10.SYFW296-192-1(0代)；11.SYFW296-192-1(50代)；12.SYFW296-192-1(100代)；13.SYFW296-195(0代)；14.SYFW296-195(50代)；15.SYFW296-195(100代)；

使用筛选得到的四种目的基因阳性质粒克隆菌株，它们是hlyA基因阳性单克隆菌：SYFW296-29和SYFW296-49、rfb-O1基因阳性单克隆菌：SYFW296-165、rfb-O139基因阳性单克隆菌：SYFW296-192和ctxAB基因阳性单克隆菌：SYFW296-195共五株菌.。阳性质粒克隆菌株分别接种于3mL含氯霉素的2YT液体培养基中，37℃200r/min下过夜培养，再从过夜培养的菌液中吸取5μl接种于3mL含氯霉素的2YT液体培养基中，37℃200r/min下过夜培养。重复以上步骤培养至第5天。提取第1天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的单克隆菌株DNA，进行普通电泳确认。

其中，泳道M1为λ-Hind ⅢMarker，泳道1～6分别表示hlyA质粒阳性克隆培养0代、培养50代和培养100代的单克隆菌株DNA；泳道7～9分别表示rfb-O1质粒阳性克隆培养0代、培养50代和培养100代的单克隆菌株DNA；泳道10～12分别表示rfb-O139质粒阳性克隆培养0代、培养50代和培养100代的单克隆菌株DNA；泳道13～15分别表示ctxAB质粒阳性克隆培养0代、培养50代和培养100代的单克隆菌株DNA。

图4脉冲电泳法检测阳性质粒克隆菌株稳定性

其中，M2为DNA MWM XV Marker（200ng），1.SYFW296-29(0代)；2.SYFW296-29(50代)；3.SYFW296-29(100代)；4.SYFW296-49(0代)；5.SYFW296-49(50代)；6.SYFW296-49(100代)；7.SYFW296-165-1(0代)；8.SYFW296-165-1(50代)；9.SYFW296-165-1(100代)；10.SYFW296-192-1(0代)；11.SYFW296-192-1(50代)；12.SYFW296-192-1(100代)；13.SYFW296-195(0代)；14.SYFW296-195(50代)；15.SYFW296-195(100代)；

使用筛选得到的四种目的基因阳性质粒克隆菌株，它们是hlyA基因阳性单克隆菌：SYFW296-29和SYFW296-49、rfb-O1基因阳性单克隆菌：SYFW296-165、rfb-O139基因阳性单克隆菌：SYFW296-192和ctxAB基因阳性单克隆菌：SYFW296-195共五株菌。阳性质粒克隆菌株分别接种于3mL含氯霉素的2YT液体培养基中，37℃200r/min下过夜培养，再从过夜培养的菌液中吸取5μl接种于3mL含氯霉素的2YT液体培养基中，37℃200r/min下过夜培养。重复以上步骤培养至第5天。提取第1天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的单克隆菌株DNA，提取的DNA经NotⅠ酶切后跑脉冲场电泳。

其中，泳道M2为DNA MWM XV Marker（200ng），泳道1～6分别表示hlyA质粒阳性克隆培养0代、培养50代和培养100代的单克隆菌株DNA；泳道7～9分别表示rfb-O1质粒阳性克隆培养0代、培养50代和培养100代的单克隆菌株DNA；泳道10～12分别表示rfb-O139质粒阳性克隆培养0代、培养50代和培养100代的单克隆菌株DNA；泳道13～15分别表示ctxAB质粒阳性克隆培养0代、培养50代和培养100代的单克隆菌株DNA。

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，对本发明技术方案的建立及其应用作进一步的说明，下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明实施例中所使用的化学试剂或溶剂溶液，如无特殊说明，均可以由常规方法制备或者由商业途径获得。

若无特殊说明，本发明所用生物样品来自丹东出入境检验检疫局微生物实验室。

细胞悬浊液(CSB)：10ml 1M Tris-HCl（pH8.0）和20ml 0.5M EDTA（pH8.0），用灭菌的超纯水稀释到100mL。

文库构建使用Epicentre公司的copycontrol fosmid library production kit，载体为pCC1FOS，宿主菌为大肠杆菌；

低熔点琼脂糖凝胶（SeaPlague GTG Agarose）购自美国Lonza公司；

Xho I、Barn H I、λ-Hind Ⅲ、蛋白酶K、DNA MWM XV Marker、DNA纯化试剂盒和平端化加磷试剂盒均购自大连宝生物公司；

N-甲基甘氨酸钠盐购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；

PMSF（苯甲基磺酰氟）购自美国sigma公司；

TSA(大豆酪蛋白琼脂培养基)购自美国Oxoid公司；

PFGE胶和一次性制胶模具均购自美国Bio-Rad（伯乐）公司；

2YT(胰蛋白胨酵母提取物肉汤)购自美国Oxoid公司；

质粒DNA提取使用AxyPrep Easy-96质粒DNA试剂盒购自美国Axygen Bioscience公司；

引物和探针由美国应用生物系统公司合成；

2×PCR Taqman GEx酶预混液购自美国应用生物系统公司；

主要仪器有BioMerieux Vitek Colorimeter菌浓度测定仪、Bio-Rad公司的脉冲场电泳仪和成像仪、ABI7300实时荧光PCR仪和ABI PRISMTM3730XL DNA Analyzer。

实施例1

霍乱弧菌全基因组DNA的提取：

DNA提取方法有很多，但只有采用低熔点琼脂糖包埋法对DNA机械损伤最小，片断最完整而且能一次大量提取，提取的DNA能长期保存不会被降解，所以本发明采用低熔点琼脂糖包埋法提取的DNA最适合用于购建Fosmid基因组文库。具体操作步骤如下：

从TSA培养基上刮取培养18h～24h的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)MO45和N16961菌体（国家疾病预防控制中心惠赠），分别均匀悬浊于2ml细胞悬浊液（CSB）中，用BioMerieux VitekColorimeter测定菌浓度分别为4、6、8三个OD值梯度，优化最优细胞悬浊液浓度。取400μl细菌悬浊液于相应的1.5ml Eppendorf管中，并加入置于45℃水浴中的400μl的2%的低熔点琼脂糖，混匀后立即加入可制成胶块的一次性模具中，放在4℃凝固30min，取出胶块，置于10倍体积的ESP缓冲液（0.4mol/L EDTA中含有终浓度为2%N-甲基甘氨酸钠盐和1mg/ml的蛋白酶K）中，50℃水浴中裂解48h左右，其间24h左右更换一次ESP缓冲液，裂解后观察胶块，呈透明状时可以先切小块凝胶跑普通电泳观察裂解情况，如果电泳结果不理想继续放在50℃中裂解，裂解结束后用等体积的含有0.1mmol/L PMSF的1×TE室温温浴2h，再用1×TE洗涤包埋块两次，将包埋块保存于0.5mol/L EDTA（pH8.0）中，4℃保存，此时，凝胶块中包含纯化的总基因组DNA。

三个OD值梯度的菌体悬浊液经包埋法提取基因组DNA后跑脉冲场电泳，上样量均为1/2胶块，上Low Range PFG Marker，其电泳图如图1。由图1可知，对于两种血清型的霍乱弧菌O₁和O₁₃₉，OD值为8的菌体悬浊液，裂解48h后提取的基因组DNA含量最大，因此选用这个OD值提取的DNA来构建Fosmid文库。

实施例2

Fosmid文库的构建（鉴定和末端测序）

用随即剪切法将基因组DNA进行片段化处理，跑脉冲电泳后分离片段化的DNA，脉冲电泳条件为14℃,6V/cm，脉冲1～10s，16h。电泳结束后切胶回收38～48kb之间的DNA片段，回收的DNA片段通过普通电泳和脉冲电泳确认，利用copycontrol Fosmid library productionkit中的试剂补平粘性末端，再用平端化加磷试剂盒进行磷酸化处理，将处理后的DNA片段连接到pCC1FOS载体上，4℃过夜，根据试剂盒提供的方法将连接液进行包装、转染、涂布平板。

从由上述方法获得的平板中随机选取16个白色单菌落，培养提取Fosmid DNA，用NotI进行酶切，因Not I可以识别8个碱基，按概率约40Kb左右会有酶切位点，但是也有可能插入片段中有不止一个酶切位点。从图2（Not I酶切分析Fosmid文库插入片段大小）可以看出，16个白色阳性菌落的酶切产物都有一条同样大小的条带，此条带即代表pCC1FOS载体，插入片段有一个酶切位点的片段35Kb～40Kb之间，有多个酶切位点的片段加和也在35Kb以上，Fosmid最适插入长度在35Kb左右，所以酶切结果均符合要求。对以上16个克隆随机挑选8个Fosmid DNA进行双末端测序，测序结果经BLAST后，证实均为霍乱弧菌相关序列，说明文库制备正确。

分别挑取阳性白色菌落保存在96孔板上，以每孔一个单克隆进行制作，37℃过夜培养，将培养后的板用含有30%甘油的LB培养基进行悬浮并移至新96孔板中，-70℃下贮存获得的甘油菌。

实施例3

从实施例2获得的甘油菌中筛选阳性克隆菌株，操作方法如下：

取2～10μL甘油菌加入含有氯霉素的终浓度为12.5ng/μL的100μL LB中，37℃1800rpm振荡过夜培养后，往培养液中添加500μL2YT（含有氯霉素的终浓度为12.5ng/μL）1/1000量的诱导剂（1000×Induction），37℃1800rpm振荡培养5h。使用试剂盒AxyPrep Easy-96质粒DNA试剂盒进行DNA提取，对提取的质粒DNA进行实时荧光多重PCR扩增，筛选出hlyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因的单克隆菌株，具体PCR方法操作步骤如下：

1、各基因的PCR检测使用以下引物和探针

rfb-O1：正向引物：5’-GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3’（SEQ ID NO.1）

反向引物：5’-CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3’（SEQ ID NO.2）

探针：5’FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(Eclipse)-3’（SEQ ID NO.3）

hlyA：正向引物：5’-GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3’；（SEQ ID NO.4）

反向引物：5’-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3’（SEQ ID NO.5）

探针：5’NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3’（SEQ ID NO.6）

rfb-O139：正向引物：5’-AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3’（SEQ ID NO.7）

反向引物：5’-CCATCACCAGACAAGCATACAG-3’（SEQ ID NO.8）

探针：5’VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(Eclipse)-3’（SEQ ID NO.9）

ctxAB：正向引物：5’-CTCATCCAGATGAACAAGAAGTTTCTG-3’（SEQ ID NO.10）

反向引物：5’-CTATCTCTGTAGCCCCTATTACGATGT-3’（SEQ ID NO.11）

探针：5’FAM-AAGCCCCCAAAATGA(MGB)-3’（SEQ ID NO.12）

2、多重PCR反应体系

总体积20ul，包括步骤③制得的模板DNA溶液2μL，2×PCR Taqman GEx酶预混液10μL，rfb-O1基因和ctxAB基因上下游引物各0.8μL、探针0.4μL，hlyA基因和rfb-O139基因上下游引物各0.4μL、探针0.2μL，根据实验需要选择不同引物对和探针进行扩增实验，补充灭菌超纯水至总体积为20μL；其中引物和探针的浓度均为10μM。

以上各组分加入至0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

上述反应体系按下述条件进行PCR检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。

Ct值≥40，可判断该基因筛选结果为阴性；Ct值＜40，可判断该基因筛选结果为阳性。

实施例4

一.阳性单克隆菌株稳定性检测

使用实施例3中筛选得到的四种目的基因阳性质粒克隆菌株，它们是hlyA基因阳性单克隆菌：SYFW296-29和SYFW296-49、rfb-O1基因阳性单克隆菌：SYFW296-165、rfb-O139基因阳性单克隆菌：SYFW296-192和ctxAB基因阳性单克隆菌：SYFW296-195共五株菌，分别接种于3mL含氯霉素的2YT液体培养基中，37℃200r/min下过夜培养。分别从过夜培养的菌液中吸取5μl接种于3mL含氯霉素的2YT液体培养基中，37℃200r/min下过夜培养，重复以上步骤培养至第5天。提取第1天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的单克隆菌株DNA，进行普通电泳确认，经NotⅠ酶切后进行琼脂糖脉冲电泳，检测克隆稳定性。

提取的阳性单克隆菌株DNA普通电泳结果见图3（提取的Fosmid DNA普通电泳）；图中所示结果可知图谱无明显差异，没有发现插入片段的丢失或重排，说明所构建的阳性质粒克隆菌株是稳定的。

阳性单克隆菌株DNA经Not Ⅰ酶切，酶切产物脉冲场电泳结果见图4（提取的FosmidDNA Not Ⅰ酶切脉冲场电泳）。图中所示结果可知图谱无明显差异，没有发现插入片段的丢失或重排，说明所构建的阳性质粒克隆菌株是稳定的。

二.菌种保藏

将筛选的阳性质粒克隆菌株于2012年12月17日，分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，具体信息如下：

大肠杆菌pCC1FOS载体，转化了霍乱弧菌的rfb-O139基因的质粒克隆菌株SYFW296-192，即转化了霍乱弧菌rfb-O139基因克隆质粒的大肠杆菌，命名为VC-rfb-O139，保藏号为：CGMCC NO.6997；

大肠杆菌pCC1FOS载体，转化了霍乱弧菌的rfb-O1基因的质粒克隆菌株SYFW296-165，即转化了霍乱弧菌rfb-01基因克隆质粒的大肠杆菌，命名为VC-rfb-O1，保藏号为：CGMCCNO.6998；

大肠杆菌pCC1FOS载体，转化了霍乱弧菌hlyA基因的质粒克隆菌株SYFW296-29，即转化了霍乱弧菌hlyA基因克隆质粒的大肠杆菌，命名为VC-hlyA，保藏号为：CGMCC NO.6999；

大肠杆菌pCC1FOS载体，转化了霍乱弧菌的ctxAB基因的质粒克隆菌株SYFW296-195，即转化了霍乱弧菌ctxAB基因克隆质粒的大肠杆菌，命名为VC-ctxAB。保藏号为：CGMCCNO.7000。

实施例5

一.实验分组

分别利用实施例4所述方法制备获得的转化了霍乱弧菌的rfb-O139（CGMCC NO.6997）、rfb-O1（CGMCC NO.6998）、hlyA（CGMCC NO.6999）、ctxAB（CGMCC NO.7000）基因的质粒克隆菌株，做下述实验。

将待检测样品分别标记：

已知含有霍乱弧菌N16961和MO45的阳性对照样品：标记为PC；

样品水：标记为NC；

霍乱弧菌的rfb-O139基因的质粒克隆菌株冻干菌CGMCC NO.6997：标记为A；

霍乱弧菌的rfb-O1基因的质粒克隆菌株冻干菌CGMCC NO.6998：标记为B；

霍乱弧菌的hlyA基因的质粒克隆菌株冻干菌CGMCC NO.6999：标记为C；

霍乱弧菌的ctxAB基因的质粒克隆菌株冻干菌CGMCC NO.7000：标记为D；

将分别标记的待检测样品作为盲样，分给检验员检测，检测方法和结果如下：

检验员1：利用引物和探针SEQ ID NO.1、2和3，做如下实验。

检验员2：利用引物和探针SEQ ID NO.4、5和6，做如下实验。

检验员3：利用引物和探针SEQ ID NO.7、8和9，做如下实验。

检验员4：利用引物和探针SEQ ID NO.10、11和12，做如下实验。

二.检验方法

对上述待检的样品，分别提取DNA，方法如下：

①称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液和10μL浓度为20mg/μL蛋白酶K，65℃30min振荡混匀；12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400μL的体积比为24：1的三氯甲烷：异戊醇，充分混匀；

②12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1～2h；

③12000r/min离心10min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μL TE，溶解DNA沉淀；

④DNA浓度和纯度的测定：取步骤③获得的DNA溶液加水稀释，至浓度为10μg/mL～100μg/mL，A260/A280比值在1.7～1.9之间，备用。

三.检验结果

利用实施例3中所述的实时PCR筛选方法，分别对提取DNA的样品进行检测，每个样品4次重复，其结果如下：

PC

NC

A

B

C

D

检验员1

+

-

+

-

-

-

检验员2

+

-

-

+

-

-

检验员3

+

-

-

-

+

-

检验员4

+

-

-

-

-

+

其中，+为阳性结果；-为阴性结果。

NC组：阴性对照检测结果显示，FAM通道、NED通道和VIC通道均无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；

PC组：阳性对照检测结果显示，FAM通道、NED通道和VIC通道均有荧光信号检出，反应结果正常；

样品ABCD检测结果均与预期相符。

此外，在实际工作中，采用上述方法检测实际样品，以传统的检测方法为对照(SN/T1022-2010)。实际检测样品包括食品样品260份，水体标本310份，例如江瑶贝、海螺肉、冻牛肉及水样等共570份，由大量的实际检测结果可见，应用本发明方法检测不同血清型霍乱弧菌具有较好的应用结果。

Claims (4)

1.一种霍乱弧菌hlyA基因的质粒克隆菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.6999。

2.一种霍乱弧菌hlyA基因检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.6999的质粒克隆菌株，及上下游引物与探针：SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.6。

3.一种非疾病诊断目的的霍乱弧菌hlyA基因的多重PCR检测方法，其特征在于：利用权利要求2所述霍乱弧菌hlyA基因检测试剂盒，对样品DNA进行多重PCR方法检测。

4.根据权利要求3所述的非疾病诊断目的的霍乱弧菌hlyA基因的多重PCR检测方法，其特征在于：所述的多重PCR方法检测的条件为：

①反应体系总体积为20μL，其中：

②以上各组分混匀，5000r/min，离心10s后，进行多重PCR方法检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环。

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