CN111876499A - 副溶血性弧菌的检测的引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种副溶血性弧菌检测的引物、试剂盒及检测方法，本发明提供的方法通过采用特定的引物，使得本发明提供的方法不但具备高特异性、高灵敏度的优点，而且操作简单、检测成本低，只需要水浴锅就能完成反应过程。SRCA只需要一对引物就能进行扩增反应，在一定程度上避免了非特异性的产生。此外，本方法不需要其他设备进行结果的检测，可通过肉眼直接观察荧光或沉淀的方式来获得结果。因此，即这项研究能够为副溶血性弧菌的现场筛查及基层快速特异性检测提供一定的参考。

Description

副溶血性弧菌的检测的引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及副溶血性弧菌的检测技术领域，尤其涉及一种副溶血性弧菌的检测的引 物、试剂盒及检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧的嗜盐性细菌， 广泛分布于近海岸水域和鱼类、虾类及贝壳类等海产品中，是一类重要的食源性致病菌。 该菌能够引起食物中毒并导致急性腹泻等病症，严重时会导致败血症乃至死亡。在患有潜 在慢性疾病的人中，尤其是患有肝病的人，感染副溶血性弧菌而患败血症的风险增加，严 重者可危及生命。随着经济的快速发展，海鲜成为了人们餐桌上的新宠。与此同时，由副 溶血性弧菌引起的人类食物中毒事件呈现出明显上升的趋势。在导致食源性疾病的致病菌 中，副溶血性弧菌的致病率有超越沙门氏菌的趋势。由副溶血性弧菌导致的食物中毒事件 已经成为中国、美国和日本等国家尤为重要的公共卫生安全问题之一。

目前检测致病菌的方法有传统检测方法，免疫学方法，分子生物学方法。传统检测方 法为国家标准法准确经典，但是费时费力。免疫学方法简单、快速，并已广泛应用于致病菌检测，但是特异性和灵敏度较低，并且样品中的杂质容易对其结果产生影响。分子生物学方法快速，特异性和灵敏度高。如聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)已成功应用于副溶血性弧菌的检测。但是，该方法比较依赖于热循环仪器和专业的技术人员，这些因素限制了PCR技术在基层检测机构的推广。与PCR相比，环介导等温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)反应所需时间更短，并且可以在恒定温 度下进行反应。但是，LAMP扩增需要4～6条引物，引物设计繁琐，多条引物之间的相 互作用可能产生非特异性的结果。

因此，开发一种简单、快速而准确的方法来检测副溶血性弧菌显得尤为迫切。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种副溶血性弧菌的检测的引物、试 剂盒及检测方法，本发明提供的方法只需要一对引物就能进行扩增反应，反应过程操作简 单，且检测结果肉眼可见，不需要不需要额外设备的辅助。

本发明提供了一种SEQ ID NO.1-2所示核苷酸序列的引物对，所述引物对的序列如表 3所示。

本发明还提供了一种所述的引物对在制备检测副溶血性弧菌的检测试剂中的应用。

本发明还提供了一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，包括本发明所述的引物对。

优选的，所述试剂盒还包括PCR反应试剂或SRCA反应试剂。

本发明还提供了一种副溶血性弧菌的检测方法，通过以本申请所述的引物对待测样品 进行检测，所述待测样品为从海产品中提取的DNA样品；

优选的，所述检测的检测方法为SRCA法或PCR法。

本发明中，所述SRCA法的反应体系包括：MgSO₄溶液、dNTPs，Thermopol reactionbuffer，引物，Bst DNA聚合酶，模板DNA和无菌去离子水；更具体的，SRCA的反应体 系共20μL，包括：20mmol/L MgSO₄，10mmol/L dNTPs，10×Thermopol reaction buffer， 10μmol/L正反向引物，8,000UBstDNA聚合酶，模板DNA(阴性不添加)，最后使用无 菌去离子水补足至20μL；其中，所述反应体系中，Mg²⁺在添加量为优选为1.5～3μL，更 优选为2～2.5μL；dNTPs添加量优选为3～5.00μL；Bst DNA聚合酶缓冲液的添加量优选 为1.50～2.00μL；引物的添加量优选为1μL；模板的添加量优选为1.00～2.00μL；Bst DNA 聚合酶的添加量优选为1.0～1.5μL。

本发明中，所述SRCA法检测的温度为61～63℃，所述检测的时间为60min以上。

本发明中，所述PCR的反应体系包括：Mg²⁺，dDTPs，Easy Taq Buffer2，引物， DNA模板，Easy Taq DNA聚合酶和无菌去离子水，优选的，PCR的反应体系共25μL， 其中20mmol/LMg²⁺0.5μL，10mmol/L dDTPs 2μL，10×Easy Taq Buffer 2μL，10μmol/L 正反向引物各1μL，DNA模板1μL，2.5U Easy Taq DNA聚合酶0.5μL，无菌去离子水 补足至25μL。

所述PCR法的反应程序：95℃预变性5min，95℃变性50s，55℃退火45s，72℃ 延伸1min(变性-退火-延伸，进行30个循环)，72℃再延伸45s。

与现有技术相比，本发明提供了一种副溶血性弧菌的检测的引物、试剂盒及检测方法， 本发明提供的方法通过采用特定的引物，使得本发明提供的方法不但具备高特异性、高灵 敏度的优点，而且操作简单、检测成本低，只需要水浴锅就能完成反应过程。SRCA只需 要一对引物就能进行扩增反应，在一定程度上避免了非特异性的产生。此外，本方法不需 要其他设备进行结果的检测，可通过肉眼直接观察荧光或沉淀的方式来获得结果。因此， 即这项研究能够为副溶血性弧菌的现场筛查及基层快速特异性检测提供一定的参考。

附图说明

图1为实施例1提供的引物缺省试验结果图；

图2为实施例1提供的温度对SRCA反应的影响图；

图3为SRCA反应时间的优化结果图；

图4为Mg²⁺添加量优化结果图；

图5为dNTPs添加量优化结果图；

图6为缓冲液浓度优化结果图；

图7为引物添加量优化结果图；

图8为模板添加量优化结果图；

图9为BstDNA聚合酶添加量优化结果图；

图10为引物特异性分析结果图；

图11为沉淀可视法引物特异性分析结果图；

图12为荧光可视法引物特异性分析结果图；

图13为副溶血性弧菌FWP/RVP引物SRCA反应的测序分析结果图；

图14为副溶血性弧菌SRCA酶切结果及原理图；

图15为SRCA的灵敏度分析结果；

图16为PCR灵敏度分析结果；

图17SRCA沉淀灵敏度结果图；

图18为SRCA荧光灵敏度检测结果；

图19为SRCA检出限分析结果图；

图20为PCR检出限分析结果图；

图21为SRCA沉淀检出限图；

图22为SRCA荧光检出限分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。

实施例

1.1试验材料

1.1.1试验菌株

本研究共选用41株菌，包括12株副溶血性弧菌及29株非副溶血性弧菌，如表1所示：

表1研究所用菌种

ATCC：美国模式菌种收集中心(America Type Culture Collection)

CMCC：中国医学细胞保藏管理中心(China Medical Culture Collection)

CICC：中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of IndustrialCulture Collection)

1.1.2试验培养基

本研究用到的培养基主要包括3％氯化钠碱性蛋白胨水、3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂、 营养肉汤、LB液体培养基及LB固体培养基。以上培养基均购自北京陆桥技术股份有限公 司，使用时皆参照培养基对应的说明书。

1.1.3试验试剂盒及试剂

基因组DNA提取试剂盒、基因克隆T₃载体试剂盒、DNA片段回收试剂盒、Taq DNA 聚合酶、脱氧核糖核苷酸(dNTPs)：北京全式金生物技术有限公司；

8,000U/mL Bst DNA聚合酶(Large fragment)、Taq I限制性内切酶：大连宝生物工 程有限公司；

100bp DNA Ladder：康为世纪生物科技有限公司；

SYBR Green I：Invitrogen，USA；

副溶血性弧菌生化鉴定试剂盒：北京陆桥技术股份有限公司；

SRCA引物：Beijing Genomics Institute

1.1.4试验仪器及设备

本研究主要应用到的仪器及设备见表2：

表2试验所需主要仪器与设备

1.2试验方法

1.2.1菌株的培养

将副溶血性弧菌(ATCC 17802)接入3％氯化钠碱性蛋白胨水液体培养基，37℃培养 12h，在3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂进行平板划线，之后挑取单菌落于3％氯化钠碱性蛋 白胨水液体培养基培养12h，备用。其他菌株接种到其对应的培养基，在适宜的培养条件下活化，挑取单菌落于液体培养基培养12h，备用。本研究所需菌种均冻存在-80℃，并 用甘油作为保护剂。

1.2.2细菌基因组DNA的提取

细菌基因组DNA的提取方法，包括冻融法、热裂解法、碱解法、酚氯仿法以及商业试剂盒法^[1]。由于菌株的来源很广泛，成分复杂，可能含有核酸扩增的抑制因子。为除去 这些抑制因子，提高基因组DNA的纯度，本研究采用商业试剂盒来提取基因组DNA，即 反应模板。细菌基因组DNA的具体提取过程，按试剂盒说明书进行，并通过Nanodrop 2000 分光光度计测定基因组DNA浓度及纯度。

1.2.3 SRCA引物的设计

本研究以副溶血性弧菌的toxR基因作为靶基因设计特异性引物。依照Genebank中副 溶血性弧菌的toxR基因(GenBank No.AB029908.1)，使用blast对该序列进行同源性分析， 确定其保守序列。通过使用Primer premier 5.0和DNAMAN软件设计SRCA的特异性引物， 并由Beijing Genomics Institute合成引物，引物序列如表3所示：

表3副溶血性弧菌toxR基因的引物

Tabl 3 Primers of toxR gene in Vibrio parahaemolyticus

1.2.4引物稀释及保存

将合成好的引物进行离心(12,000rpm，2min)，目的是把粘附在管壁和盖子上的粉末 状引物离心到管底部，确保引物的浓度。根据引物说明书的要求向离心管中加入去离子水， 再进行震荡离心，使粉末状引物能够完全溶解。使用引物前，要对引物进行分装，避免反 复冻融使引物降解，-20℃保存备用。

1.2.5 SRCA的预反应体系及反应程序

SRCA的反应体系共20μL，其中20mmol/L MgSO₄ 3μL，10mmol/L dNTPs 4μL，10 ×Thermopol reaction buffer 2μL，10μmol/L正反向引物各1μL，8,000U Bst DNA聚合酶1 μL，模板DNA 1μL(阴性不添加)，最后使用无菌去离子水补足至20μL。

SRCA的反应程序：将dNTPs、MgSO₄、10×Thermopol reaction buffer、引物、模板DNA和无菌去离子水混合液通过94℃预变性3min，然后冰浴2min，迅速添加Bst DNA 聚合酶，放入水浴锅，设置反应温度为62℃，时间60min，最后80℃，反应5min，终 止反应。

1.2.6 PCR反应体系及反应程序

SRCA的引物设计与PCR引物设计原理相同，本研究的引物也同样适用于PCR。PCR的反应体系共25μL，其中20mmol/L Mg²⁺0.5μL，10mmol/L dDTPs 2μL，10×Easy Taq Buffer2μL，10μmol/L正反向引物各1μL，DNA模板1μL，2.5U Easy Taq DNA聚合酶 0.5μL，无菌去离子水补足至25μL。

PCR的反应程序：95℃预变性5min，95℃变性50s，55℃退火45s，72℃延伸 1min(变性-退火-延伸，进行30个循环)，72℃再延伸45s。

1.3 SRCA反应条件和体系的优化

1.3.1引物缺省试验

为验证引物的正确性，对反应进行引物缺省试验。分为四种情况，即只添加正向引物、 只添加反向引物、正反向引物全添加和正反向引物都不添加，观察并分析条带。

1.3.2反应温度的优化

本研究依据引物的退火温度以及Bst DNA聚合酶活性的最适温度对反应温度进行优 化，设置6个温度梯度，分别为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，并选取最适 温度。

1.3.3反应时间的优化

本研究通过设置5个梯度对反应时间进行优化分别为40min、50min、60min、70min、80min。

1.3.3 Mg²⁺添加量优化

Mg²⁺会与dNTPs以及DNA模板结合形成复合体，合成DNA的时候，核苷酸进入聚 合酶的活性中心需要Mg²⁺来消除DNA骨架上磷酸基团的负电荷，只有这种复合体才能被 DNA聚合酶识别。Mg²⁺对SRCA的影响体现在多个方面，Bst DNA聚合酶的活性和DNA 双链的解链温度，会影响产物的产量；Mg²⁺和dNTPs以及引物结合形成二聚体，从而影响 试验的特异性。因此，选出合适的Mg²⁺浓度对试验的结果至关重要。本研究使用20mM 浓度的Mg²⁺，设置了0.50μL，1.00μL，1.50μL，2.00μL，2.50μL，3.00μL，3.50μL， 共7个梯度对Mg²⁺添加量进行优化。

1.3.5 dNTPs添加量的优化

dNTPs中含有四种脱氧核苷酸和高能磷酸键，为SRCA反应提供原材料和能量。本研究设置dNTPs(2.5mM each)的添加量依次为1.00μL、2.00μL、3.00μL、4.00μL、5.00μL、 6.00μL、7.00μL，从而确定反应最适dNTPs的添加量。

1.3.4 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量优化

Bst DNA聚合酶缓冲液的作用主要是稳定SRCA反应过程中的pH，此外，Mg²⁺可以 和缓冲液中的螯合剂(如：EDTA)以及带负电荷的丛团(如：磷酸根)结合，这些都会 对试验的结果产生影响。本试验使用10×ThermoPol reaction buffer，并设置7个梯度进行 优化，分别0.50μL、1.00μL、1.50μL、2.00μL、2.50μL、3.00μL、3.50μL。

1.3.6引物添加量的优化

引物的添加量也对试验结果有一定的影响。引物过多会导致模板与引物错配，同时引 物之间二聚体形成的几率增大，影响反应的特异性。而且非特异产物和二聚体会消耗酶、 dNTPs、Mg²⁺等，导致产量下降。引物量少，会导致SRCA反应效率变低。本试验设置引 物(10nM/μL)添加量分别为0.50μL、0.75μL、1.00μL、1.25μL、1.50μL、1.75μL。

1.3.7 DNA模板的优化

DNA模板即靶序列，模板量过少，则与引物的结合位点变少，产物产量变少。本试验使用Nanodrop 2000分光光度计对提取的模板的浓度及纯度进行测定。经测定DNA模板的浓度为65ng/μL，提取模板的纯度为A260/280约为1.80。对模板进行优化，设置6个梯度 分别为0.50μL、1.00μL、1.50μL、2.00μL、2.50μL、3.00μL。

1.3.8 Bst DNA聚合酶添加量的优化

全长的Bst DNA聚合酶来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)。它 具有5’→3’的聚合酶活性和强链置换活性，但没有3’→5’外切酶活性。本研究设置反应体 系中Bst DNA聚合酶的添加量依次为0.00μL、0.50μL、1.00μL、1.50μL、2.00μL、2.50μL、 3.00μL从而确定出体系中最适酶添加量。

1.4引物特异性分析

引物的特异性关系到整个试验的成败，因此对引物特异性的检测至关重要。本研究选 取41株菌对引物进行特异性验证，其中包括3株副溶血性弧菌标准菌株，9株副溶血性弧 菌分离菌株及29株非副溶血性弧菌(见表1)。先进行菌株活化，分别提取模板，进行SRCA反应观察反应结果。

1.5 SRCA扩增产物的分析

为验证SRCA反应的准确性，本研究采用2种方法对SRCA的扩增产物进行验证，分别是：SRCA扩增产物测序分析和SRCA扩增产物酶切验证。

1.5.1 SRCA扩增产物测序分析

先回收SRCA扩增产物(切割条带清晰的前4条)进行纯化，并将回收的扩增产物连接到T₃载体上构建新的载体，将新构建的载体导入感受态细胞，经增殖纯化后测序。具体操作步骤如下：

(1)回收SRCA扩增产物：取20μL扩增产物进行凝胶电泳，切取前4条电泳条带。

(2)纯化回收产物：利用

Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒对回收产 物进行纯化。

(3)构建新载体：使用

-T₃ Cloning Kit试剂盒进行连接，将纯化好的产物连接 到T₃载体上，构建新的载体。

(4)转化：将5μL的新构建载体导入50μL的感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30min，之后水浴锅中42℃热激90s，最后冰浴2min。

(5)增殖：向装有感受态细胞的离心管中加入600μL的LB液体培养基，37℃220rpm，摇床培养1h，获得大量带有新构建载体的转化子。

(6)筛选：制备合有0.1％的氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的LB固体培养基并倒平板，将增殖的转化子离心5000rpm，3min。弃去550μL上清，再加400μL的LB液体培 养基吹吸混匀，最后取100μL菌液于平板进行涂布。T₃载体含有Amp抗性基因，因此， 转化子可在含有Amp的培养基上正常生长，从而达到筛选的作用。

(7)挑取单菌落：从过夜培养的平板上挑取单菌落接种到600μL的LB液体培养基(含有0.1％的Amp)混匀，摇床培养5h。

(8)菌液PCR：取菌液进行PCR，并凝胶电泳观察电泳条带。

(9)测序：将单菌落进行扩大培养(用含0.1％的Amp的LB液体培养基)，取800μL 菌液于离心管送至Beijing Genomics Institute进行测序。

1.5.2 SRCA扩增产物酶切验证

为进一步验证SRCA扩增产物的正确性，对SRCA扩增产物进行酶切分析。应用Primer premier 5.0对目的序列进行酶切位点分析，选用Taq I限制性内切酶对产物进行酶切分析。 分别取1μL的SRCA扩增产物，1μL的Taq I限制性内切酶，2μL的10×Buffer和2μL的0.1％BSA，无菌去离子水补足至20μL，65℃反应1h。反应结束后进行凝胶电泳观察 条带。

1.6灵敏度分析

分别用SRCA法和PCR法检测相同浓度的模板，并比较其灵敏度。

1.6.1 SRCA的灵敏度

为了确立SRCA方法检测副溶血性弧菌的灵敏度，先取过夜培养的副溶血性弧菌1mL，提取模板并用分光光度计测定其浓度为65ng/μL，用无菌去离子水对模板进行10倍 梯度稀释，模板梯度浓度为6.5×10⁷～6.5×10^-1fg/μL，对各浓度模板分别进行SRCA反应。 分别采用凝胶电泳、沉淀可视法、荧光可视法确定其灵敏度。

1.6.2 PCR的灵敏度

将稀释好的模板用于PCR反应，并确定其灵敏度。

1.6.3比较SRCA和PCR的灵敏度

分别通过SRCA的凝胶电泳法、沉淀可视法、荧光可视法和PCR方法的灵敏度进行比较。

1.7人工污染牡蛎中副溶血性弧菌的检出限

对牡蛎样品进行人工污染，采用梯度稀释法，对副溶血性弧菌进行菌落计数^[2]。分别 用SRCA方法和PCR方法进行检测，确定两种方法的检出限，并进行比较。

1.7.1人工污染牡蛎处理

据报道，食用双壳类海鲜是导致人们食物中毒的主要原因，本研究采用牡蛎作 为人工污染样品^[3]。牡蛎购于某市场，多份牡蛎分别隔离保存。用GB 4789.7-2013 对购买样品进行检测，取阴性牡蛎样品25g均质，加入225mL无菌生理盐水(所 有步骤在无菌操作下进行)，取1mL副溶血性弧菌菌液分别用均质液和生理盐水进 行10倍梯度稀释。无菌生理盐水稀释的菌液进行菌落计数，计数估算人工污染牡 蛎菌悬液中副溶血性弧菌的活菌数为2.7×10⁸CFU/g。取人工污染各浓度菌悬液1 mL，并提取副溶血性弧菌的模板DNA，-20℃保存备用。

1.7.2 SRCA的检出限

将2.7.1中提取的各浓度模板进行SRCA反应，并通过凝胶电泳法、沉淀可视法、荧光可视法三种方法确定其检出限。

1.7.3 PCR的检出限

将2.7.1中提取的各浓度模板进行PCR反应，并确定其检出限。

1.7.4比较SRCA和PCR的检出限

分别通过SRCA的凝胶电泳法、沉淀可视法、荧光可视法三种方法与PCR的检出限比较。

1.8 GB 4789.7-2013、PCR和SRCA方法对实际样品中副溶血性弧菌检出率的比较与评价

为了验证SRCA技术在实际样品中检测的准确性，采用GB 4789.7-2013、PCR 及SRCA三种方法对在某市场购买的243份海产品(见表4)进行检测，并对三种 方法的检出率进行比较分析。

表4 243份实际样品清单

Table 4 The list of 243 practical samples

将上述样品按照GB 4789.7-2013进行样品前处理，取增菌液1mL(无菌操作)，采用试剂盒法提取模板DNA，将模板DNA用于SRCA方法和PCR方法的反应。同时严格按 照国标的方法对前增菌液进行检测。

2.1 SRCA反应条件及体系的优化

2.1.1引物缺省试验

为探究引物对SRCA检测技术的影响，分别加入正向引物和反向引物或不加入引物进 行试验。结果如图1所示，图1为实施例1提供的引物缺省试验结果图；其中，M：100bp DNALadder；1：阴性对照；2：阳性对照；3：未添加上游引物(FWP)；4：未添加下游 引物(RVP)；5：上下游引物均未添加；6：上下游引物均添加，可见，两条引物缺少任 何一条反应均不会发生，因此SRCA反应在两条引物同时存在的情况下才能发生反应，缺 一不可。

2.1.2反应温度的优化

本研究对SRCA反应的温度进行了优化，共6个温度梯度，分别为60℃至65℃。 试验结果如图2所示，图2为温度对SRCA反应的影响；其中，M：100bp DNA Ladder； 1：阴性对照；2：阳性对照；3～8：SRCA反应温度分别为60℃，61℃，62℃，63℃， 64℃，65℃。从图中可以看出，当反应温度为60℃时，出现非特异性扩增条带；61℃、 62℃和63℃时SRCA反应正常，条带清晰可辨；62℃及63℃条件下SRCA反应正常， 条带相对而言清晰可辨；64℃和65℃时反应产物条带开始变得模糊，出现非特异性扩增。 由此可见，反应温度对于SRCA反应的影响程度较高，但是在轻微的波动范围内，反应可 以正常发生。根据多次重复试验结果，本实验采用更为稳定的62℃作为反应温度。

2.1.3反应时间的优化

结果如图3所示，图3为SRCA反应时间的优化结果图，其中，M：100bp DNA Ladder；1：阴性对照；2：阳性对照；3～7：SRCA反应时间分别为40min，50min，60min，70min， 80min，从图中可以看出，反应40min和50min时泳道条带较暗，可能是反应没有完全。 时间达到60min后条带颜色基本稳定，选取60min作为最优反应时间。

2.1.4Mg²⁺的优化

本研究对Mg²⁺浓度进行优化，结果如图4所示，图4为Mg²⁺添加量优化结果图，其中，M：100bp DNA Ladder；1：阴性对照；2：阳性对照；3～9：Mg²⁺(20mM)添加量 分别0.50μL，1.00μL，1.50μL，2.00μL，2.50μL，3.00μL，3.50μL，从图中可以看出， Mg²⁺在添加量为2.00μL时条带清晰，无杂带。Mg²⁺添加量过少无扩增条带出现；随着添 加量增多条带逐渐变亮。当Mg²⁺添加过量时出现非特异性条带，可能是引物之间发生扩增。 在对此进行的重复试验中，2.00μL的添加量更加稳定，因此，本研究采用2.00μL的Mg²⁺添加量用于后续试验。

2.1.5 dNTPs添加量优化

dNTPs作为基因扩增的原料，添加量过少会影响扩增的效率及扩增产物数量，过多则 可能会抑制扩增或造成非特异性扩增。如图5所示，图5为dNTPs添加量优化结果图，其中，M：100bp DNA Ladder；1：阴性对照；2：阳性对照；3～9：dNTPs添加量分别为1.00 μL，2.00μL，3.00μL，4.00μL，5.00μL，6.00μL，7.00μL，从图中可以看出，当其添加 量为1.00μL时，基本无扩增产物；随着dDNTs添加量增加时，扩增产物产量随之增加， 条带逐渐变亮；当其浓度过高时，反应出现杂带。本研究采用5.00μL的dNTPs添加量。 2.1.6Bst DNA聚合酶缓冲液添加量优化

Bst DNA聚合酶缓冲液可以调节反应体系的pH值，Bst DNA聚合酶缓冲液添加量过少或过多均会对反应造成影响。结果如图6所示，图6为缓冲液浓度优化结果图，其中， M：100bp DNA Ladder；1：阴性对照；2：阳性对照；3～9：缓冲液添加量分别为0.50μL， 1.00μL，1.50μL，2.00μL，2.50μL，3.00μL，3.50μL；从图中可以看出，当缓冲液添加 量为0.50μL时，无扩增反应发生。随着缓冲液的添加量增加，条带逐渐变亮，当2.00μL 时最亮，超过2.00μL时出现杂带，当添加量达到3.5μL时，则无扩增条带，可能是pH 变化太大导致Bst DNA聚合酶失活。本研究采用2.00μL的添加量，反应更加稳定。

2.1.7引物添加量优化

本研究对引物添加量进行优化，结果如图7所示，图7为引物添加量优化结果图，其中，M：100bp DNA Ladder；1：阴性对照；2：阳性对照；3～8：引物量分别为0.50μL， 0.75μL，1.00μL，1.25μL，1.50μL，1.75μL，从图中可以看出，添加0.50μL引物时无扩 增产生(泳道3)；随着引物浓度的添加量增加，条带逐渐变亮，正反向游引物添加量各为 1.00μL时，凝胶条带清晰明亮；随着引物添加量的继续增加，出现非特异性扩增弥散的条 带。本研究采用1.00μL的引物添加量进行后续试验。

2.1.8模板添加量优化

结果如图8所示，图8为模板添加量优化结果图，其中，M：100bp DNA Ladder；1： 阴性对照；2：阳性对照；3～8：模板添加量分别为0.50μL，1.00μL，1.50μL，2.00μL， 2.50μL，3.00μL，从图中可以看出，在一定范围内模板的添加量对产物的结果无明显的影 响，泳道6、7、8出现出现少量模板条带，是由于模板过量，在反应时间内模板反应不完 全造成，对实验结果无影响。考虑试验成本及试验效果，本研究采用1μL作为模板的最优 添加量。

2.1.9 Bst DNA聚合酶大片段添加量优化

结果如图9所示，图9为Bst DNA聚合酶添加量优化结果图，其中，M：100bp DNALadder；1：阴性对照；2：阳性对照；3～8：Bst DNA聚合酶大片段添加量分别为0.00μL， 0.50μL，1.00μL，1.50μL，2.00μL，2.50μL，3.00μL，从图中可以看出，Bst DNA聚合 酶大片段催化反应图，在不添加酶时(泳道3)扩增反应不发生，只显示模板条带。泳道 4、5、6亮度相当，经多次重复，添加1.00μL和1.50μL时反应体系比较稳定。考虑到反 应需要及成本问题，本研究采用1.00μL的酶添加量。

3.2优化后的反应体系

经对SRCA反应条件及反应体系的优化，最终确定反应最优温度为62℃，最优反应体系如表5所示：

表5 SRCA反应体系

*：阴性对照体系不加模板，同时ddH₂O补足20μL。

2.3引物特异性验证

为验证正向引物和反向引物的特异性，本研究采用41株菌进行试验，其中包括3株标准副溶血性弧菌、9株实验室分离的副溶血性弧菌以及29株其他常见的食源性致病菌。采用2.2.2所述方法提取模板DNA后分别进行SRCA反应。

2.3.1 SRCA凝胶电泳检测法特异性

反应结果如图10所示，图10为引物特异性分析结果图，其中，M：100bp DNALadder； P：阳性对照；N：阴性对照；1.副溶血性弧菌CICC 21617；2.副溶血性弧菌CICC21528； 3.副溶血性弧菌ATCC 17802；4.副溶血性弧菌本实验室分离；5.副溶血性弧菌本实验室 分离；6.副溶血性弧菌本实验室分离；7.副溶血性弧菌本实验室分离；8.副溶血性弧菌本 实验室分离；9.副溶血性弧菌本实验室分离；10.副溶血性弧菌本实验室分离；11.副溶血 性弧菌本实验室分离；12.副溶血性弧菌本实验室分离；13.溶藻弧菌CICC 21664；14.创伤弧菌CICC 21615；15.单核细胞增生李斯特氏菌CMCC 54001；16.肺炎克雷伯氏菌 CICC21519；17.甲型副伤寒沙门氏菌CMCC 50001；18.乙型副伤寒沙门氏菌CICC 21495；19.丙型副伤寒沙门氏菌CICC 21512；20.肠炎沙门氏菌CMCC 50041；21.鼠伤寒沙门氏菌 CMCC50115；22.福氏志贺氏菌CMCC 51175；23.宋内氏志贺氏菌CMCC 51334；24.痢 疾志贺氏菌CICC 23829；25.鲍氏志贺氏菌CMCC 51522；26.大肠埃希氏菌ATCC 25922； 27.产肠毒素大肠埃希氏菌CICC 10421；28.肠出血性大肠杆菌CICC 21530；29.大肠埃希 氏菌CMCC44103；30.致病性大肠埃希氏菌CICC 21531；31.变形杆菌CMCC 49027；32. 酸土脂环酸芽胞杆菌ATCC 49025；33.蜡样芽胞杆菌CMCC 63302；34.阪崎克罗诺杆菌 ATCC 29544；35.金黄色葡萄球菌CMCC 26073；36.金黄色葡萄球菌CMCC 26003；37. 金黄色葡萄球菌CICC21600；38.酿脓链球菌CICC 10373；39.小肠结肠炎耶尔森氏菌 CICC 52303；40.产气荚膜梭菌ATCC 13124；41.铜绿假单胞菌CICC 21636

从图中可以看出，12株副溶血性弧菌均出现梯形条带，29株其他菌株均未出现任何条带， 说明本试验设计的引物具有良好的特异性，可以实现SRCA方法对副溶血性弧菌的特异性 鉴别。

2.3.2 SRCA沉淀可视法特异性

反应结果如图11所示，图11为沉淀可视法引物特异性分析结果图，其中，P：阳性对照；N：阴性对照；1～41：见图10图注。从图中可以看出，12株副溶血性弧菌均出现 白色沉淀，29株其他菌株均未出现白色沉淀。证明该引物具有良好的特异性。

2.3.3 SRCA荧光可视法特异性

反应结果如图12所示，图12为荧光可视法引物特异性分析结果图，其中，P：阳性对照；N：阴性对照；1～41：见图10图注；从图中可以看出，12株副溶血性弧菌均出现 绿色荧光，29株其他菌株均未出现绿色荧光，显示橙色。证明该引物具有良好的特异性。

2.4 SRCA扩增结果分析

2.4.1 SRCA扩增副溶血性弧菌产物的测序分析

将副溶血性弧菌toxR基因的引物(FWP、RVP)及副溶血性弧菌基因组用于SRCA反应，并对其产物进行测序分析，结果见图13，图13为副溶血性弧菌FWP/RVP引物SRCA 反应的测序分析结果图，其中，A中.用于设计副溶血性弧菌FWP及RVP引物的toxR基 因序列。B为副溶血性弧菌SRCA阳性扩增产物，M：100bp DNA Ladder，1.副溶血性弧 菌SRCA阳性扩增结果。C.FWP及RVP引物进行SRCA阳性扩增的测序结果(1～4分别 对应B中的条带1～4)注：A、C中黄色标亮部分为正向引物FWP，红色部分为反向引 物RVP的反向互补序列，绿色部分为正向引物上游的一段序列，紫色碱基为错配碱基(可 能由扩增过程中发生的错配等原因造成)。

图中，A部分：正反向引物及引物中间为目的片段长78bp，B为凝胶电泳结果，C 为对电泳结果1～4条带的测序结果。C中C-1为对第一条带的测序结果，和目的片段相对 应长78bp；由C-2、C-3、C-4可看出其测序结果均为目的片段的重复序列以及标亮绿和 亮紫部分组成，其中亮绿部分为正向引物的上游片段，亮紫部分为添加碱基(即跨越点)。 根据测序结果可以看出SRCA反应原理的正确性。

2.4.2 SRCA扩增副溶血性弧菌产物的酶切分析

为进一步验证SRCA反应的扩增产物为目的条带，本试验利用Taq I限制性内切酶对 产物进行酶切，酶切结果如图14所示：图14为副溶血性弧菌SRCA酶切结果及原理图， 其中，A：FWP及RVP引物对副溶血性弧菌进行SRCA反应后的产物酶切结果，M：100 bpDNALadder；1.SRCA阳性扩增结果；2.PCR阳性扩增结果；3.Taq I酶切SRCA产物 结果；B：限制性酶切原理图例。限制性内切酶Taq I的酶切位点为TCGA/AGCT，该识别 位点位于正反向引物之间，且有2个酶切位点。由图中的B部分可以看出，对248bp长度 反应产物的酶切位点，其酶切产物是由大量16bp、69bpDNA片段和少量38bp、24bp的 DNA片段组成。但是16bp的DNA片段太短，38bp、24bp的DNA片段太少，凝胶电泳 结果中胶带比较弥散显示不出，而69bp的DNA片段则十分明显。由酶切片段也可以证明 SRCA反应的正确性。

2.5 SRCA的灵敏度分析

本研究采用3种方法对SRCA的扩增产物进行观察，分别为凝胶电泳法、沉淀可视化法及荧光可视化法，并分别对这3种方法的灵敏度进行了测定。

2.5.1 SRCA凝胶电泳检测法灵敏度

提取副溶血性弧菌基因组DNA，使用Nanodrop 2000分光光度计对提取的模板进行浓 度测定及纯度测定。经测定，模板浓度为65ng/μL(6.5×10⁷fg/μL)，纯度约为1.80，证明提取的模板DNA纯度较好。将提取的模板进行10倍梯度连续稀释，分别取1μL稀释 后的模板用于SRCA反应，反应结果图15所示，图15为SRCA的灵敏度分析结果图，其 中，M：100bpDNA Ladder；1：阴性对照；2～10：模板浓度为6.5×10⁷～6.5×10^-1fg/μL。 从图中可以看出，在模板DNA浓度范围为6.5×10⁷至6.5×10¹fg/μL时，显示出标准的梯 形条带，之后则无条带扩增出来，由此可得，SRCA方法检测副溶血性弧菌凝胶电泳的灵 敏度为6.5×10¹fg/μL。

2.5.2PCR凝胶电泳检测法灵敏度

将梯度稀释的各浓度模板同时进行PCR反应，反应结果如图16所示，图16为PCR 灵敏度分析结果图，其中，M：100bp DNA Ladder；1：阴性对照；2：阳性对照；3～10： 模板浓度为6.5×10⁷～6.5×10⁰fg/μL；从图中可以看出，在模板浓度为6.5×10⁷至6.5× 10³fg/μL时，PCR反应出现阳性结果，且片段长度与目的片段长度相对应。随着模板浓度 再降低后无阳性结果出现，由此可知，PCR法检测副溶血性弧菌的灵敏度为6.5×10³fg/μL。2.5.3SRCA沉淀可视法灵敏度

取1μL梯度稀释后的基因组DNA进行SRCA反应。反应结果如图17所示，图17SRCA 沉淀灵敏度结果图，其中，P：阳性对照；N：阴性对照；1～9：模板浓度为6.5×10⁷～6.5 ×10^{- 1}fg/μL，从图中可以看出，阴性对照无沉淀，阳性扩增在小离心管底部出现沉淀，日 光下肉眼可辨别。模板浓度在6.5×10⁷至6.5×10¹fg/μL之间时都出现了白色沉淀，浓度 低于6.5×10¹fg/μL时，无沉淀产生。因此SRCA检测副溶血性弧菌沉淀可视化的灵敏度 为6.5×10¹fg/μL。

2.5.4 SRCA荧光可视法灵敏度

模板梯度稀释后，各取1μL模板DNA进行SRCA反应，反应结束后向反应管中添加 1μL荧光染料SYBR Green I(用前稀释10倍)。反应结果如图18所示，图18为SRCA 荧光灵敏度检测结果图，其中，P：阳性对照；N：阴性对照；1～10：模板浓度为6.5×10⁷～6.5×10^-2fg/μL，从图中可以看出，阴性对照显示橙色，阳性结果显示荧光绿色，日光下 肉眼可辨别。模板浓度在6.5×10⁷至6.5×10⁰fg/μL之间时出现绿色荧光，6.5×10⁰fg/μL 之后显示橙色。因此SRCA检测副溶血性弧菌的荧光灵敏度为6.5×10⁰fg/μL。

2.6人工污染牡蛎中副溶血性弧菌的检出限

2.6.1 SRCA凝胶电泳检出限

将人工污染牡蛎中的副溶血性弧菌用生理盐水进行10倍的梯度稀释，并分别取1μL 每个梯度的菌悬液采用试剂盒法提取模板。将提取的各浓度的模板用于SRCA反应，反应结果如图19所示，图19为SRCA检出限分析结果图，其中，M：100bp DNA Ladder；1： 阴性对照；2～10：菌液浓度为2.7×10⁷～2.7×10^-1CFU/g。从图中可以看出，当菌液浓 度为2.7×10⁷至2.7×10¹CFU/g时，出现典型的阳性扩增条带，浓度小于等于2.7×10⁰ CFU/g时，则无扩增条带出现。因此，SRCA检测人工污染牡蛎中副溶血性弧菌的凝胶电 泳检出限为2.7×10¹CFU/g。

2.6.2 PCR凝胶电泳检出限

将上述2.6.1中提取模板分别取1μL用于PCR反应，反应结果如图20所示，图20为PCR检出限分析结果，其中，M：100bp DNA Ladder；1：阴性对照；2：阳性对照；3～10： 菌液浓度为2.7×10⁷～2.7×10⁰CFU/g。从图中可以看出，当菌液浓度为2.7×10⁷至2.7× 10³CFU/g时，出现阳性扩增条带，浓度小于等于2.7×10²CFU/g时，无条带出现。因此， 传统PCR方法检测人工污染中副溶血性弧菌的检出限为2.7×10³CFU/g。

2.6.3 SRCA沉淀可视法检出限

将上述2.6.1中提取的模板分别进行SRCA反应，反应结果如图21所示，图21为SRCA沉淀检出限，其中，P：阳性对照；N：阴性对照；1～9：菌液浓度为4.7×10⁷～4.7×10^-1 CFU/g。从图中可以看出，当菌液浓度为2.7×10⁷至2.7×10¹CFU/g时，有大量扩增产物 生成，产生肉眼可见的白色沉淀，随着菌液浓度继续减少后产生的微量沉淀不易被肉眼观 察到。因此，SRCA检测人工污染牡蛎中副溶血性弧菌的沉淀法检出限为2.7×10¹CFU/g。 2.6.4SRCA荧光可视法检出限

将上述提取的模板后进行SRCA反应，反应结束后向反应管中添加1μL荧光染料SYBR Green I(用前10倍稀释)，反应结果如图22所示，图22为SRCA荧光检出限分析 结果，其中，P：阳性对照；N：阴性对照；1～10：菌液浓度2.7×10⁷～2.7×10^-2CFU/g， 从图中可以看出，当菌液浓度为2.7×10⁷至2.7×10⁰CFU/g时，显示绿色荧光，浓度小于 等于2.7×10^{- 1}CFU/g时，荧光保持原本的橙色不变。因此，SRCA检测人工污染牡蛎中副 溶血性弧菌的荧光显色法检出限为2.7×10⁰CFU/g。

2.7 GB 4789.7-2013、PCR及SRCA方法对实际样品中副溶血性弧菌检出率的比较与分析

利用已建立的GB 4789.7-2013、PCR方法及SRCA三种方法对实际购买的243份样品进行检测，经检测后GB 4789.7-2013法阳性检出样品数为142个。PCR方法检出阳性样品 数量为144个。SRCA方法检出阳性样品数目为145个。

本研究采用敏感性(Sensitivity)、特异性(Specificity)及符合率(Accuracy)三个指 标对SRCA方法进行方法学评价。这3个指标计算公式如下：

符合率＝(真阳性+真阴性)/(真阳性+假阴性+真阴性+假阳性) (公式1)

敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性) (公式2)

特异性＝真阴性/(真阴性数+假阳性) (公式3)

根据以上检测结果，以国标检测为标准，则243份样品检出真阳性数目为142，真阴性数目为101。则PCR方法检测真阳性数目为142，真阴性数目为99，假阳性数目为2， 假阴性数目为0；SRCA方法检测的真阳性数目为145，真阴性数目为98，假阳性数目为3， 假阴性数目为0。按照上述处理可分别获得SRCA及PCR方法在该研究中的敏感性、特异 性、符合率及检出率，结果如表6所示。

表6为SRCA及PCR方法评价

3.1 SRCA检测海产品中副溶血性弧菌方法的评价

副溶血性弧菌是一类广泛存在于海水及海产品中的细菌，通过感染伤口或者通过食物 摄入体内，能够引起呕吐、腹泻等胃肠道疾病，严重者会导致败血症甚至死亡。其发病率 有超越沙门氏菌的趋势。因此，快速、准确的检测出海产品中的副溶血性弧菌至关重要。若在检测时需在现场采样并进行检测，则对灵敏度有较高的要求，同时检测效率要尽可能的高，并且检测条件也要尽可能的简单。因此，对检测副溶血性弧菌技术的要求比较高。

目前，检测副溶血性弧菌的方法多种多样。主要包括传统检测方法、免疫学检测、化 学分析仪器和分子生物学检测等方法。传统检测方法无法满足现场检测的要求，并且当存 在VBNC菌时，可能导致假阴性的结果。免疫学检测方法操作简单，但灵敏度比较低，并且样品杂质易对其结果造成影响。化学分析仪器一般都要应用大型仪器，并且比较昂贵，无法普及应用。随着人们对基因结构和基因表达等生命本质问题认识的日益加深，分子生物学检测方法得到快速发展，如PCR、LAMP和RCA等方法。这些技术为副溶血性弧菌 的检测提供了新的研究方向。PCR方法需要昂贵的温度循环仪。LAMP方法需要4～6条引 物，引物自身或引物与产品中杂质结合的几率大，容易出现假阳性的结果，并且非特异性 条带和正常条带不易区分。RCA需要环状模板才能进行扩增，因此需要锁式探针对模板进 行环化，而探针的设计既繁琐又昂贵，增加了RCA技术成本，降低了其检测效率。因此， 急需开发一种简便、灵敏度高、特异性强的检测方法。

本申请提供的新型核酸等温扩增技术——SRCA技术。该方法的优点体现在以下几个 方面：第一，反应速度快，仅需要2条引物即可进行类似于指数RCA的扩增。第二，操 作简单，SRCA技术是核酸等温扩增技术，仅依靠一个水浴锅就能完成整个反应，并且无 需锁式探针进行环化。第三，结果判定快速简单，可以通过肉眼观察沉淀或者荧光就能判 断反应结果，避免了凝胶电泳等繁琐耗时的步骤。第四，灵敏度高，SRCA荧光可视法观 察结果灵敏度是PCR的1000倍。第五，特异性高，本试验的凝胶电泳的条带是有规律的 梯形条带，能够明显的区分出是不是特异性扩增。总之，SRCA技术能够有效地缩短检测 时间，降低检测成本，适合在基层检测机构推广应用。

3.2特异性基因的选择

靶基因的选择是SRCA反应的重要因素之一。要求靶基因的特异性高、高度保守而且 要具有普遍性，这样可以在一定程度上避免假阴性和假阳性的结果。经过比较副溶血性弧 菌的多个常用特异性基因(如：tlh基因、tdh基因、gyrB基因和toxR基因)，本研究采用tox基因作为SRCA检测副溶血性弧菌方法的靶基因。

3.3引物的设计

本研究的重点是引物的设计，引物决定了SRCA反应的特异性及稳定性。设计引物时 要从多方面对引物进行分析。从实验结果可以看出，首先，引物的长度要求在20bp左右，引物太短则特异性低，引物太长则自身容易发生扩增。其次，要考虑引物的CG含量，Bst DNA聚合酶的最适温度为60～65℃，所以引物的退火温度要尽可能在此范围内，而CG 含量基本上就决定了引物的退火温度。此外，要尽量减少引物之间的互补碱基数量，因为 引物之间碱基互补数量越多引物之间发生自身扩增的几率越大。而且目的片段的长度也要 适中，约100bp左右，太短特异性低，太长模板与引物的结合位点太多，容易出现非特异 性扩增。

3.4影响SRCA反应的主要因素

3.4.1反应温度

本研究应用Bst DNA聚合酶作为反应催化剂，该酶的最适温度为60～65℃。同时引物需要有效的结合到模板上，因此也要考虑到引物的退火温度。温度太低无扩增产物，太高出现非特异扩增或酶失活无扩增条带。经温度对比优化，本研究采用62℃作为反应的 最适温度。

3.4.2Mg²⁺和dNTPs的浓度

大多数的核酸体外扩增技术都对Mg²⁺和dNTPs的浓度有较高的要求，其用量对试验结果有显著的影响。Mg²⁺的浓度过高容易出现非特异性扩增条带浓度过低则影响Bst DNA聚合酶的活性，导致扩增产物变少甚至不出现扩增条带。dNTPs添加效果和Mg²⁺的添加效 果相似。

3.4.3 DNA模板及引物

SRCA反应是引物结合到模板，并在其它试剂作用下完成反应的。因此，保证引物和模板的完整性也是极为重要的，而反复冻融或是长期冷冻易使模板及引物降解。为了试验的严谨性，要对使用的模板及引物进行分装并定期更换。

3.5对SRCA扩增产物的分析

SRCA的扩增产物有明显的规律性。产物最短的一条带为目的片段，第二条带长度为 第一条带长度的2倍以上(两段目的片段重复序列的长度和正向引物上游部分片段)，依此类推。并且可以通过测序来验证SRCA的扩增产物。LAMP的扩增产物虽也为梯形条带， 但其扩增条带的规律性比较差，假阳性扩增条带和真阳性扩增条带没有明显的区分，无法 进行有效的鉴别。并且LAMP反应至少需要4条引物才能进行扩增，更是增大了假阳性率。 由此可见，SRCA不仅在反应过程和反应体系上有优势，更是在结果判定上也有良好的优 越性。

3.6 SRCA反应注意事项

SRCA技术作为一种超灵敏的体外扩增技术，在试验过程中防污染措施是至关重要的。 主要包括以下几个方面：

(1)实验室环境及超净工作台要保持干净整洁，要做到试验前后及时清理灭菌，要定时通风防止试验环境内气溶胶的污染。

(2)试验所用移液枪要定期校对并灭菌，保持用枪的量程准确和干净。

(3)枪头和离心管用前要灭菌并干燥。

(4)试验所用试剂要进行分装，即能防止污染，又能避免反复冻融对试验结果造成影响。

4结论

本申请中：

(1)比较筛选出检测副溶血性弧菌的特异性基因，即toxR基因，并针对该基因设计特异性引物。

(2)优化了SRCA的反应条件及反应体系。在62℃下反应，反应体系如下25mmol/LMgSO₄2μL，10mmol/L dNTPs5μL，10×Thermopol reaction buffer2μL，10μmol/L的正 反向引物各1μL，8,000U Bst DNA聚合酶1μL，模板DNA 1μL(阴性不添加)，最后使 用无菌去离子水补足20μL。

(3)对引物的特异性进行验证。包括12株副溶血性弧菌和29株非副溶血性弧菌。副溶血性弧菌均显示为阳性，非副溶血性弧菌均显示为阴性，则证明本研究所用引物具有良好的特异性。

(4)确定了SRCA方法和PCR方法检测副溶血性弧菌的灵敏度并进行比较。SRCA 方法的凝胶电泳法灵敏度为6.5×10¹fg/μL，沉淀可视化法灵敏度为6.5×10¹fg/μL，荧光 可视法灵敏度为6.5×10⁰fg/μL。PCR方法的灵敏度为6.5×10³fg/μL。SRCA灵敏度是PCR 的1000倍，展现出更高的灵敏度。

(5)通过SRCA方法和PCR方法对人工污染生牡蛎中的副溶血性弧菌进行检测，SRCA方法凝胶电泳检出限为2.7×10¹CFU/g，沉淀可视法检出限2.7×10¹CFU/g，荧光 可视法检出限为2.7×10⁰CFU/g。PCR方法的检出限为2.7×10³CFU/μL。SRCA展现出更 低的检出限，比PCR方法低1000倍。

(6)使用国标方法(GB 4789.7-72013)、PCR方法及SRCA方法对243份实际海产 品样品进行检测，并以GB 4789.7-2013法为标准对SRCA方法进行评价，最终确定SRCA 方法的敏感性为100％，特异性为97.02％，符合率为98.78％。

综上所述，利用SRCA方法检测海产品中副溶血性弧菌是切实可行的，且SRCA方法具有操作简便、成本低廉、特异性高、快速、灵敏的优势，特别适合在发展中国家的基层 检测机构及中小型食品企业中进行推广应用。

引用文献：

[1]Xin Z，Velten J P，Oliver M J，et al.High-throughput DNA extractionmethod suitable for PCR[J].Biotechniques，2003，34(4)：820；

[2]钱红玫，胡文忠，冯可，等.食源性致病菌快速检测的前增菌培养的研究进展[J]. 食品工业科技，2016，37(13)：360-364；

[3]Chen S，Ge B.Development of a toxR-based loop-mediated isothermalamplification assay for detecting Vibrio parahaemolyticus[J].BmcMicrobiology，2010，10(1)：1-9.

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干 改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 副溶血性弧菌的检测的引物、试剂盒及检测方法

<141> 2020-06-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgataacttg ccagacgata c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccattcggca ggtacttaac 20

Claims (9)

1.SEQ ID NO.1～2所示核苷酸序列的两条引物组成的引物对。

2.权利要求1所述的引物对在制备副溶血性弧菌的检测试剂中的应用。

3.一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，包括权利要求1所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂或SRCA反应试剂。

5.一种副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于，以权利要求1所述的引物对待测样品进行检测。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品为从海产品中提取的DNA样品。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测的检测方法为SRCA法或PCR法。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述SRCA法的反应体系包括：MgSO₄溶液、dNTPs，Thermopol reaction buffer，引物，Bst DNA聚合酶，模板DNA和无菌去离子水；所述SRCA法检测的温度为61～63℃，所述检测的时间为60min以上。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，

所述PCR法的反应体系包括：Mg²⁺，dDTPs，Easy Taq Buffer 2，引物，DNA模板，Easy TaqDNA聚合酶和无菌去离子水；

所述PCR法的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性50s，55℃退火45s，72℃延伸1min(变性-退火-延伸，进行30个循环)，72℃再延伸45s。

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