CN110982909A - 一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物、试剂盒及检测方法，所述引物包括：如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所示。所述检测方法，包括以下步骤：提取待测鸡蛋基因组DNA，采用两步PCR方法对基因组DNA扩增，根据第二步PCR产物基因序列68bp处碱基进行基因分型，当该位置碱基为G时，为泰和乌鸡鸡蛋；当该位置基因为C时，为非泰和乌鸡鸡蛋。本发明所针对的变异位点为泰和乌鸡鸡蛋所特有的，利用该引物和检测方法可以100％准确的鉴定被检个体是否为泰和乌鸡鸡蛋，可排除不良商贩用非泰和乌鸡蛋或混有非泰和乌鸡鸡蛋的“泰和乌鸡鸡蛋”冒充泰和乌鸡蛋。

Description

一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物检测技术领域，特别是涉及一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
泰和乌鸡养殖是泰和县域经济发展最具鲜明特色的优势产业，已经成为泰和县农业领域的一张名片。泰和乌鸡自古有名，随着经济社会发展和人民生活水平的提高，人们对优质、安全、健康的食品需求日益增多，泰和乌鸡鸡蛋的优质优价凸显，假的乌鸡蛋逐渐增多，而消费者大都不具备鉴别泰和乌鸡蛋的能力。这给很多不法的商家提供了违规操作的机会，不利于整体市场的正规化。
目前，尚无鉴别泰和乌鸡蛋的有效手段。最常见的两种方法：①是通过商家贴商标的办法；②建立产品可追溯系统，通过射频识别、二维码或者条形码技术全程追踪记录产品。但是上述手段都是建立在商家诚信的基础上，不良商家同样可以通过技术手段来用非乌鸡蛋冒充泰和乌鸡蛋。为保护泰和乌鸡产业健康发展，稳定泰和乌鸡蛋品质，规范乌鸡蛋市场，避免非乌鸡蛋冒充优质高价的乌鸡蛋。基因检测技术是可以直接检测DNA分子的碱基，准确度比较高。因此，利用基因检测技术，建立泰和乌鸡蛋的鉴别方法尤为迫切。鉴别泰和乌鸡蛋分子检测方法的建立，一来可以打击鱼目混珠者，防止不良商贩把乌鸡蛋市场搞乱；二来可以提升泰和乌鸡形象，进一步提升泰和乌鸡的品牌价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物、试剂盒及检测方法，通过引物两步扩增鸡蛋基因组DNA，可以获取足量的用于测序分型的PCR产物，经过对PCR产物变异位点的鉴定，进而准确判断真伪泰和乌鸡鸡蛋。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物，包括：如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的检测方法，包括以下步骤：提取待测鸡蛋基因组DNA，采用两步PCR方法对所述基因组DNA进行扩增，根据所得的第二步PCR产物基因序列68bp处碱基进行基因分型，当该位置碱基为G时，为泰和乌鸡鸡蛋；当该位置基因为C时，为非泰和乌鸡鸡蛋。优选的是，第一步PCR扩增时，引物为权利要求1所述的SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2；
30μL扩增体系：模板DNA 2μL，2×PCR mix 15μL，混合引物0.6μL，其余为水；
扩增程序：95℃3min；94℃15s、55℃30s、72℃20s，20个循环；72℃，3min。
优选的是，第二步PCR扩增时，引物为权利要求1所述的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
20μL扩增体系：第一次PCR产物1μL；2×PCR mix 10μL，混合引物0.4μL，其余为水；
扩增程序：96℃3min；96℃30s、52℃30s、72℃30s，35个循环。
本发明还提供所述的用于检测泰和乌鸡鸡蛋的检测方法在鉴别泰和乌鸡鸡蛋上的应用。
本发明还提供一种包含所述的用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物的试剂盒。
本发明还提供一种所述的试剂盒在鉴别真伪泰和乌鸡鸡蛋上的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明基于第二步PCR产物序列68bp位点的多态性，通过基因测序方法判定该位点等位基因，当该位点为G时，判定为泰和乌鸡鸡蛋，当该位点为C时，判定为非泰和乌鸡鸡蛋，这种方法可以有效的防止非法商贩违规操作，用非泰和乌鸡鸡蛋冒充泰和乌鸡鸡蛋进行售卖欺骗消费者的情况出现。
本发明提供的检测方法，采用两步PCR扩增进行检测，由于鸡蛋尤其是未受精蛋的胚珠只是一个细胞，通过组织抽提,会导致仅有的DNA损失殆尽，很难提取到足量DNA进行PCR。本发明中，胚珠未经过抽提而是采用物理方法使其破碎并释放基因组DNA，然后通过两步PCR扩增，获取了足量用于测序的PCR产物，进而通过测序对其进行分型，以准确获取变异位点的基因型。本发明公开的检测方法，所检测的SNP位点是泰和乌鸡特有的变异位点，该方法可以100％准确的鉴定被检个体是否为泰和乌鸡所产鸡蛋，可排除不良商贩用非泰和乌鸡蛋冒充泰和乌鸡蛋，此方法简单、易操作，检测准确率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为泰和乌鸡鸡蛋变异位点分型结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中所述的“份”如无特别说明，均按质量份计。
实施例1
一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的方法，包括以下步骤：
1、样本DNA提取
(1)打破待测鸡蛋的蛋壳，将蛋清和蛋黄分离，将蛋黄放置于盛有PBS的平皿中。
(2)取卵黄膜上的胚珠或者胚盘(白色，直径约2mm)，手术刀划破胚珠或者胚盘周围卵黄膜，并将该部分取出放置于2mL的离心管中，之后将组织置于-20℃冰箱或者液氮中。
(3)组织破碎：将放有胚珠或者胚盘组织的2mL的离心管加入适量液氮，用组织破碎仪破碎。
(4)将破碎后的组织，加入0.2mL双蒸水，涡旋震荡30s。
(5)于13000r/min离心10min，取上清于另一离心管中。
2、PCR扩增
2.1第一步PCR扩增
将引物SF1：cccccactcagagcgctctg，SR1：ggcggaccggcgcggcctta，分别用1×TE溶解到浓度为10pmoL，并将其引物混合在一起，涡旋混匀。
配制30μL PCR扩增体系(如表1所示)：
表1
Figure BDA0002326617870000061
将配制的PCR总管分装到96孔PCR板中，离心，每孔加入2uLDNA样品，离心，上PCR仪，获取扩增产物，其基因序列如下所示(【】内为目的位点)：
cccccactcagagcgctctgcgactctcaacgcgggaacgccgcgagaggccgtcaggcgcggaagacgagcgaagcgggaagggagagccgcgctgcctcgcttta【c/g】ggcccgtgtgcgacgcgcaagatggctgcccccagggcgcaataaggccgcgccggtccgcc。
上述PCR扩增条件为：95℃3min；94℃15s、55℃30s、72℃20s，20个循环；72℃3min。
2.2第二步PCR扩增
以第一次扩增得到的PCR产物作为模板，利用引物SF2：
ccgcgagaggccgtcaggcg，SR2：ttgcgccctgggggcagcca，采用20μL扩增体系进行第二次PCR扩增，获取扩增产物，其序列如下所示(“【】”内为目的位点)：
ccgcgagaggccgtcaggcgcggaagacgagcgaagcgggaagggagagccgcgctgcctcgcttta【c/g】ggcccgtgtgcgacgcgcaagatggctgcccccagggcgcaa。
配制20μL扩增体系(如表2所示)。
表2
Figure BDA0002326617870000071
扩增条件：96℃3min；96℃30s、52℃30s、72℃30s，35个循环。
2.3将第二次扩增得到的PCR产物送生物公司测序。用DNAStar软件的SeqMan模块读取实验结果，查看目的位点基因型。
2.4结果分析
如果变异位点为GG基因型，则为泰和乌鸡鸡蛋，否则为非泰和乌鸡鸡蛋(如图1所示)。
实施例2
利用实施例1的检测方法鉴别泰和乌鸡鸡蛋和非泰和乌鸡鸡蛋(白耳黄鸡鸡蛋、宁都黄鸡鸡蛋、康乐黄鸡鸡蛋、安义瓦灰鸡鸡蛋)，各取10枚。
如表3所示，结果显示：仅有泰和乌鸡鸡蛋的变异位点的碱基为G，其他均为C，判定结果和实际情况相符合。
表1不同鸡蛋分型结果
蛋品 基因型
泰和乌鸡蛋(10) G
白耳黄鸡鸡蛋(10) C
宁都黄鸡鸡蛋(10) C
康乐黄鸡鸡蛋(10) C
安义瓦灰鸡鸡蛋(10) C
实施例3
采用实施例1的检测方法，鉴别纯种泰和乌鸡蛋(A组)和混有非泰和乌鸡蛋的鸡蛋(B组)。选取泰和乌鸡鸡蛋30枚，混有非泰和乌鸡鸡蛋30枚。
通过实施例1的检测方法分型，并统计每组蛋目的位点基因频率。如果为纯种泰和乌鸡蛋，G等位基因评论应该为100％，否则为＜100％的某个数值。
如表4所示，结果显示，A组G等位基因为100％，B组G等位基因频率为57％，C等位基因为43％。根据统计结果，即可判定A组为泰和乌鸡鸡蛋，B组为杂合乌鸡鸡蛋。
表2两组别鸡蛋判定结果
Figure BDA0002326617870000081
从实施例2-3的检测结果可以看出，本发明提供的检测方法不仅仅能够准确鉴别泰和乌鸡鸡蛋和非泰和乌鸡鸡蛋，还能鉴别市售的所谓“泰和乌鸡鸡蛋鸡蛋”中是否混有非泰和乌鸡鸡蛋，可以实现从基因水平上，真正的规范市场，防止不法商贩用非泰和乌鸡鸡蛋或者非纯合泰和乌鸡鸡蛋冒充泰和乌鸡鸡蛋，损害消费者利益。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物，其特征在于，包括：如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4所示。
2.一种用于检测泰和乌鸡鸡蛋的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测鸡蛋基因组DNA，采用两步PCR方法对所述基因组DNA进行扩增，根据所得的第二步PCR产物基因序列68bp处碱基进行基因分型，当该位置碱基为G时，为泰和乌鸡鸡蛋；当该位置基因为C时，为非泰和乌鸡鸡蛋。
3.如权利要求2所述的用于检测泰和乌鸡鸡蛋的检测方法，其特征在于，第一步PCR扩增时，引物为权利要求1所述的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
30μL扩增体系：模板DNA 2μL，2×PCR mix 15μL，混合引物0.6μL，其余为水；
扩增程序：95℃3min；94℃15s、55℃30s、72℃20s，20个循环；72℃，3min。
4.如权利要求2所述的用于检测泰和乌鸡鸡蛋的检测方法，其特征在于，第二步PCR扩增时，引物为权利要求1所述的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
20μL扩增体系：第一次PCR产物1μL；2×PCR mix 10μL，混合引物0.4μL，其余为水；
扩增程序：96℃3min；96℃30s、52℃30s、72℃30s，35个循环。
5.如权利要求2-4任一项所述的用于检测泰和乌鸡鸡蛋的检测方法在鉴别泰和乌鸡鸡蛋上的应用。
6.一种包含权利要求1所述的用于检测泰和乌鸡鸡蛋的引物的试剂盒。
7.一种如权利要求6所述的试剂盒在鉴别真伪泰和乌鸡鸡蛋上的应用。
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