CN105255908B - 与抗真菌危害有关的磷脂酶靶基因片段及其在提高植物抗病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与抗真菌危害有关的磷脂酶靶基因片段及其在提高植物抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。本发明通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)将大丽轮枝菌磷脂酶靶基因的靶基因序列导入本生烟中瞬时表达dsRNA，筛选到能极显著提高植物抗病性的靶基因。本发明进一步利用RNAi技术，构建稳定遗传干扰载体并将其转化本生烟，转化结果证明转基因烟草植株对大丽轮枝菌的抗病性极显著提高，表现出高抗，甚至达到免疫等级。本发明提供的抗真菌危害有关的磷脂酶靶基因片段以及所转录的RNA在提高植物对大丽轮枝菌的抗病能力以及培育抗大丽轮枝菌转基因植物新品种等方面应用前景广泛。

Description

与抗真菌危害有关的磷脂酶靶基因片段及其在提高植物抗病 性中的应用

技术领域

本发明涉及抗真菌危害有关的磷脂酶靶基因，尤其涉及大丽轮枝菌磷脂酶靶基因片段以及该磷脂酶靶基因片段所转录的RNA，本发明还涉及含有所述磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体，本发明进一步涉及所述大丽轮枝菌磷脂酶靶基因片段或含有该磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种危害极其严重土传维管束真菌病害，寄主范围非常广泛，能侵染棉花、向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等两百多种经济作物，给中国乃至世界造成极大的经济损失(HillocksI R.Cotton diseases.Centre Agriculture Bioscience International,1992:240～257.)，而且其后期产生的微菌核可以在极其恶劣的环境下存活数年甚至更长的时间(Klosterman SJ,Atallah ZK,Vallad GE,Subbarao KV:Diversity,pathogenicity,and management of Verticillium species.Ann Rev Phytopathol2009,47:39–62.)，主要存在于土壤耕作层，是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和初侵染源，用药剂难于防治，成为农业物生产发展的瓶颈(Fradin EF,Thomma BP:Physiology andmolecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V.dahliae andV.albo-atrum.Mol Plant Pathol 2006,7:71–86.)。鉴于其严重的危害性，探究大丽轮枝菌致病机理和寄主与病原菌之间的相互作用机制一直是研究的热点(Luo X,Xie C,DongJ,Yang X,Sui A.Interactions between Verticillium dahliae and its host:vegetative growth,pathogenicity,plant immunity.Applied microbiology andbiotechnology 2014,98:6921-6932.)。如何增强寄主植物体对大丽轮枝菌的抗病性是急待解决的问题。然而大丽轮枝菌致病机理的研究仍停留在初步探索阶段。最近研究表明：大丽轮枝菌入侵过程中分泌蛋白主要参与寄主植物细胞壁降解、活性氧应答，还包括一些效应因子、新陈代谢蛋白因子等，或许这些分泌蛋白参与了大丽轮枝菌的渗透侵染寄主植物的根部，达到入侵的目的(Hogenhout SA,Van der Hoorn RA,Terauchi R,KamounS.Emerging concepts in effector biology of plant-associatedorganisms.Molecular plant-microbe interactions 2009,22:115-122.Chu J,Li WF,Cheng W,Lu M,Zhou KH,Zhu HQ,Li FG,Zhou CZ.Comparative analyses of secretedproteins from the phytopathogenic fungus Verticillium dahliae in response tonitrogen starvation.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins andProteomics 2015,1854:437-448.)。

大丽轮枝菌如何渗透到寄主细胞和如何阻碍寄主细胞的防卫机制至今还没有文献报道。探索大丽轮枝渗透寄主细胞机制，寻找参与渗透过程中关键的蛋白因子或是信号诱导因子的研究显得尤其重要，并利用“反向遗传学”培育抗病的新材料品种提供了一条新的策略。

磷脂是真菌生物膜的主要组成成分，在生物体的新陈代谢中发挥着不可替代的作用。磷脂酶(phospholipase，PL)广泛存在于真菌生物体内，是水解磷脂的一类酶，因其水解的酯键不同，分为磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶B(PLB)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)和磷脂酶B(PLB)是乙酰水解酶，磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)为磷酸二酯酶，水解磷酸二酯键(Ghannoum MA.Potential role ofphospholipases in virulence and fungal pathogenesis.Clinical microbiologyreviews 2000,13:122–143.)。磷脂酶的激活不仅对细胞的结构和稳定性有很重要的作用，而且调控许多重要的细胞生理功能，如信号转导、细胞骨架组装、防御反应等(Huang P,Frohman MA.The potential for phospholipase D as a new therapeutictarget.Expert Opinion on Therapeutic Targets 2007,11:707–716.Cox GM,McDadeHC,Chen SC,Tucker SC,Gottfredsson M,Wright LC,Sorrell TC,Leidich SD,Casadevall A,Perfect JR.Extracellular phospholipase activity is a virulencefactor for Cryptococcus neoformans.Molecular Microbiology 2001,39:166–175.Jones JDG,Dangl JL.The plant immune system.Nature 2006,444:323–329.PinosaF,Buhot N,Kwaaitaal M,Fahlberg P,Thordal-Christensen H,M,AnderssonMX.Arabidopsis phospholipase Dδis involved in basal defense and nonhostresistance to powdery mildew fungi.Plant physiology 2013,163:896-906.)。研究发现，真菌的磷酸二酯酶在真菌细胞壁的完整性途经中发挥着重要作用，是调控细胞壁合成的重要蛋白因子(Yin ZY,Tang W,Wang JZ,Liu XY,Yang LN,Gao CY,Zhang JL,Zhang HF,Zheng XB,Wang P,Zhang ZG.Phosphodiesterase MoPdeH targets MoMck1of theconserved MAP kinase signaling pathway to regulate cell wall integrity inrice blast fungus Magnaporthe oryzae.Molecular Plant Pathology,2015.Lesage Gand Bussey H.Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae.Microbiology andmolecular biology reviews 2006,70:317-343.Levin DE.Cell wall integritysignaling in Saccharomyces cerevisiae.Microbiology and molecular biologyreviews 2005,69:262-291.Levin DE.Regulation of cell wall biogenesis inSaccharomyces cerevisiae:the cell wall integrity signaling pathway.Genetics2011,189:1145-1175.)。鉴于前人的研究结果，大丽轮枝菌的细胞壁成分及其跨膜蛋白在寄主细胞的渗透和防卫机制中的作用发挥重要的作用，可以推测磷脂酶或许参与大丽轮枝菌的渗透入侵和防卫过程。目前有关大丽轮枝菌的磷脂酶的功能分析还未见报道，因此利用已经成功测序并公布在Broad Institute(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/Gen omeDescriptions.html#VD_VdLs.17)上的大丽轮枝菌小种VdLs.17基因组数据信息(Klosterman SJ,Atallah ZK,Vallad GE,Subbarao KV:Diversity,pathogenicity,and management of Verticilliumspecies.Annual review of phytopathology 2009,47:39–62.)，查找到分别位于不同染色体上(第四条染色体，第六条染色体)，且序列信息不同的2个磷脂酶基因，命名为磷脂酶4(PL4，位于第一条染色体上)，磷脂酶6(PL6，位于第三条染色体上)，从这些磷脂酶基因中筛选得到与抗大丽轮枝菌有关的靶基因对于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供与抗大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)相关的磷脂酶靶基因片段以及由该磷脂酶靶基因片段所转录的RNA；

本发明的目的之二是提供含有与抗大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)相关的磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体及其宿主细胞；

本发明的目的之三是将所述与抗大丽轮枝菌相关的磷脂酶靶基因片段、其转录的RNA以及含有磷脂酶靶基因片段干扰载体应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性或构建获得抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了与抗大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)相关的磷脂酶靶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示；优选的，所述磷脂酶靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示；更优选的，所述磷脂酶靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。

本发明还公开了含有所述的磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体以及含有所述RNA干扰载体的宿主细胞。

此外，由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的磷脂酶靶基因片段所转录的RNA也自然包含在本发明的保护范围之内。

本发明所述磷脂酶靶基因片段能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括以下步骤：(1)构建含有所述磷脂酶靶基因的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

优选的，一种构建RNA干扰表达载体的方法，包括：通过BP反应，将所述的磷脂酶靶基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中，得到Gateway干扰载体。

本发明所述RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括以下步骤：(1)将所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

本发明进一步公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤：(1)构建含有所述磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。

所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移等。

本发明所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物，包括：烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。

本发明通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)将大丽轮枝菌磷脂酶基因的7段靶基因序列VdPL4-1(SEQ ID No.1所示)、VdPL4-2(SEQ ID No.2所示)、VdPL4-3(SEQ ID No.3所示)、VdPL4-4(SEQ ID No.4所示)、VdPL6-1(SEQ ID No.5所示)、VdPL6-2(SEQ ID No.6所示)、VdPL6-3(SEQ ID No.7所示)导入本生烟中，使其瞬时表达dsRNA，并进行大丽轮枝菌接种，观察本生烟植株的感病症状，并对其进行病情指数分析。结果发现，导入7段靶基因片段并产生dsRNA的本生烟植株对大丽轮枝菌的感病症状都显著低于空载注射的本生烟植株。在接菌第12天后，导入靶基因片段的本生烟植株没有出现明显的感病症状，仅局部出现感病症状，植株整体更没有萎蔫、枯死症状；而空载注射的本生烟植株整体出现明显的感病症状，表现出黄化、萎蔫、枯死症状。同时，导入7段磷脂酶靶基因片段的本生烟植株的抗病性增强，且导入不同靶基因的本生烟植株的感病症状之间也存在差异，导入靶基因片段VdPL4-2、VdPL4-3、VdPL6-2、VdPL6-3的本生烟植株的感病症状低于导入靶基因片段VdPL4-1、VdPL4-4、VdPL6-1的本生烟植株，植株对大丽轮枝菌的抗病性更强。

本发明进一步将大丽轮枝菌磷脂酶基因的七段基因片段VdPL4-1、VdPL4-2、VdPL4-3、VdPL4-4、VdPL6-1、VdPL6-2、VdPL6-3，利用Gateway技术，构建磷脂酶七段靶基因序列的稳定遗传干扰载体，转化本生烟，获得转基因的烟草植株。转靶基因的本生烟植株的抗病性实验结果表明，接菌第十二天以后，获得磷脂酶基因干扰片段的转基因烟草植株的感病症状极显著低于野生型植株。获得靶基因片段VdPL6-2(SEQ ID No.6所示)的转基因烟草植株基本没有出现感病症状，与未接菌的对照植株基本一致，植株达到免疫等级(病情指数基本是0)；获得转靶基因片段VdPL4-2(SEQ ID No.2所示)、VdPL4-3(SEQ ID No.3所示)、VdPL6-3(SEQ ID No.7所示)的烟草植株表现为高抗(病情指数在15％以下)；获得转靶基因片段VdPL4-1(SEQ ID No.1所示)、VdPL4-4(SEQ ID No.4所示)、VdPL6-1(SEQ ID No.5所示)的烟草植株表现为抗病(病情指数在15-30％)；而野生型烟草植株出现明显的感病症状，植株出现黄化、萎蔫、枯死症状。

转靶基因的本生烟植株中真菌生物量检测结果表明：野生型烟草植株中大丽轮枝菌的生物量都极显著高于获得的7段不同的转磷脂酶靶基因片段烟草植株中生物量，差异显著倍数都在10以上，有的甚至高达100倍。其中，转磷脂酶靶基因片段VdPL6-2的烟草植株中仅仅检测到痕量大丽轮枝菌生物量，与未侵染的对照植株基本一样。

综上，本发明所获得的磷脂酶七段靶基因序列VdPL4-1(SEQ ID No.1所示)、VdPL4-2(SEQ ID No.2所示)、VdPL4-3(SEQ ID No.3所示)、VdPL4-4(SEQ ID No.4所示)、VdPL6-1(SEQ ID No.5所示)、VdPL6-2(SEQ ID No.6所示)、VdPL6-3(SEQ ID No.7所示)的稳定遗传干扰载体转化本生烟，极显著提高烟草对大丽轮枝菌的抗病性。将其转入农作物中，有望获得高抗大丽轮枝菌的新试验材料，能够应用于棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生等抗病育种的实践生产中。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)从7段磷脂酶基因靶基因片段筛选到大丽轮枝菌磷脂酶基因的4段靶基因片段；进一步通过RNAi技术，构建磷脂酶基因的7段靶基因片段的稳定遗传的干扰载体，转化本生烟，获得高抗大丽轮枝菌的烟草植株，尤其是获得VdPL6-2靶基因片段的烟草植株的抗病性更显著，甚至达到免疫等级。本发明所述大丽轮枝菌磷脂酶基因的7段靶基因片段以及RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“RNA干扰(RNA interference,RNAi)”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同原序列的基因表达沉默的现象。

附图说明

图1为TRV1和TRV2的载体图；

图2为7段瞬时转入本生烟中的VIGS-VdPL干扰片段本生烟植株对大丽轮枝菌的抗病性；

图3为Gateway干扰载体信息；其中，A：pDONR207载体信息；B：pK7GWIWG2(I),0载体信息；

图4为本生烟草遗传转化苗的分子鉴定。分别以VdPL4-1-F/R(A)、VdPL4-2-F/R(B)、VdPL4-3-F/R(C)、VdPL4-4-F/R(D)、VdPL6-1-F/R(E)、VdPL6-2-F/R(F)、VdPL6-3-F/R(G)、为引物，分别转VdPL4-1(A)、VdPL4-2(B)、VdPL4-3(C)、VdPL4-4(D)、VdPL6-1(E)、VdPL6-2(F)、VdPL6-3(G)、靶基因的烟草转化植株的PCR分子检测。1-5(转靶标基因烟草植株)电泳通道分别扩增到相对应的靶基因片段，Wt(野生型植株)电泳通道均没有扩增到靶标片段，M是DNA marker；

图5为转靶基因烟草植株的抗病性分析和真菌生物量检测分析；其中，A：转靶基因烟草植株的病情指数统计分析；B：转靶基因烟草植株的真菌生物量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)V991：由中国农科院植保所简桂良研究员惠赠。

病毒载体：烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)双元载体(TRV1与TRV2)由清华大学刘玉乐教授惠赠。

根癌农杆菌：菌株GV3101和LBA4404，由本发明人实验室保存。

植物稳定遗传载体：pDONR207和pK7GWIWG2(I),0载体由本发明人实验室保存。

实施例1VIGS-PL4、VIGS-PL6瞬时干扰载体的构建、本生烟的农杆菌注射及大丽轮枝菌的接种

1、实验方法

以大丽轮枝菌总RNA为模板，设计4对磷脂酶4(PL4，VDAG_09206)、3对磷脂酶6(PL6，VDAG_03089)的靶基因引物(引物序列见表1)，分别扩增磷脂酶基因的靶标区段信息，长度约400bp。扩增获得的7段片段连接到载体TRV2的多克隆位点区域(图1)，获得重组载体TRV2-VdPL4-1，TRV2-VdPL4-2、TRV2-VdPL4-3、TRV2-VdPL4-4、TRV2-VdPL6-1、TRV2-VdPL6-2、TRV2-VdPL6-3，测序正确后电击转化农杆菌GV3101，与TRV1(携带TRV病毒另一部分基因信息)的农杆菌GV3101菌株1：1混合，利用注射器将混合好的农杆菌注射于3到5片真叶的本生烟苗的最嫩叶片中。同时以TRV2-PDS载体和TRV2空载体分别作为阳性和阴性对照，转化农杆菌GV3101，与TRV1的农杆菌GV3101菌株1：1混合注射本生烟。20天后(阳性植株出现白化后)，对已经侵染的本生烟植株采用蘸根法接种大丽轮枝菌，观察本生烟植株的感病症状，并对其进行病情指数分析。

表1引物序列

2、实验结果

本发明克隆的7段大丽轮枝菌磷脂酶基因片段VdPL4-1(SEQ ID No.1所示)、VdPL4-2(SEQ ID No.2所示)、VdPL4-3(SEQ ID No.3所示)、VdPL4-4(SEQ ID No.4所示)、VdPL6-1(SEQ ID No.5所示)、VdPL6-2(SEQ ID No.6所示)、VdPL6-3(SEQ ID No.7所示)，导入本生烟中表达出dsRNA(接种TRV2-PDS载体的本生烟顶部出现光漂白的新叶)，用大丽轮枝菌孢子悬浮液接种已注射的本生烟。

结果发现：导入靶基因片段并产生dsRNA的本生烟植株对大丽轮枝菌的感病症状显著低于空载注射的本生烟植株。在接菌第十二天后，导入靶基因片段的本生烟植株没有出现明显的感病症状，仅局部出现感病症状，植株整体更没有萎蔫、枯死症状；而空载注射的本生烟植株整体出现明显的感病症状，表现出黄化、萎蔫、枯死症状。说明导入磷脂酶靶基因片段的本生烟植株的抗病性增强。

同时导入的7段靶基因的本生烟植株的感病症状之间也存在差异，导入基因片段VdPL4-2(SEQ ID No.2所示)、VdPL4-3(SEQ ID No.3所示)、VdPL6-2(SEQ ID No.6所示)、VdPL6-3(SEQ ID No.7所示)的本生烟植株的感病症状低于导入基因片段VdPL4-1(SEQ IDNo.1所示)、VdPL4-4(SEQ ID No.4所示)、VdPL6-1(SEQ ID No.5所示)的本生烟植株，植株对大丽轮枝菌的抗病性更强。

对接种大丽轮枝菌的本生烟植株的病情指数统计分析结果发现：在接菌第八天、十天、十二天以后，注射磷脂酶靶基因片段的本生烟植株的病情指数都显著低于注射空载体的本生烟植株；同时随着天数的增加，注射磷脂酶靶基因片段的本生烟植株的病情指数逐渐增高，但也都显著低于注射空载体的本生烟植株(图2)。

综上结果表明，7段磷脂酶基因片段瞬时干扰的本生烟植株对大丽轮枝菌的抗病性显著增强，植株表现为抗病性；同时7段不同的靶基因片段之间的抗病性存在差异性，导入基因片段VdPL4-2、VdPL4-3、VdPL6-2、VdPL6-3的本生烟植株的抗病性极显著，植株表现为高抗病性。因此，本发明通过VIGS技术筛选，获得可以提高烟草抗病性的大丽轮枝菌磷脂酶基因靶标区段。

实施例2磷脂酶靶基因序列的稳定遗传干扰载体构建及转化本生烟

1、实验方法

1.1靶标片段的克隆和干扰载体的构建

为了获得稳定遗传的含有靶基因dsRNA的转基因植株，本发明利用Gateway技术，将上述磷脂酶基因家族的七段基因片段VdPL4-1(SEQ ID No.1所示)、VdPL4-2(SEQ IDNo.2所示)、VdPL4-3(SEQ ID No.3所示)、VdPL4-4(SEQ ID No.4所示)、VdPL6-1(SEQ IDNo.5所示)、VdPL6-2(SEQ ID No.6所示)、VdPL6-3(SEQ ID No.7所示)为靶基因，长度约300bp。设计七段两端含有BP位点的引物VdPL4-1-F/R，VdPL4-2-F/R,VdPL4-3-F/R,VdPL4-4-F/R，VdPL6-1-F/R，VdPL6-2-F/R，VdPL6-3-F/R(引物序列见表1)，在5’端加入了attB1位点部分序列(aaaaaagcaggct)，在3’端加入了attB2位点序列(aagaaagctgggt)，用于Gateway干扰载体的构建(引物信息见表1)。以大丽轮枝菌的总RNA为模板，分别扩增7段磷脂酶基因家族的靶基因片段，再用完整的attB位点序列attB-F/R为引物(引物序列见表1)，以上面的目的片段为模板，扩增带有完整attB位点的目标片段，连接pEASY-T1载体，测序正确后用于Gateway方法构建RNAi载体。构建Gateway干扰表达载体需要发生以下两个反应：(1)BP反应：采用入门载体pDONR^TM207(图3)，具有Gent抗性和ccdB致死基因(ccdB基因编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长，当目的载体和入门克隆发生重组时，ccdB基因被目的基因取代，携带有ccdB基因的未反应载体或保留有ccdB基因副产品的细胞将不会生长)，具有attP重组位点。BP反应参照invitrogn公司的BPII Enzyme mix(美国)说明书操作，反应载体为带有attB位点的pEASY-T1载体与带有attP重组位点的入门载体pDONR^TM207在25℃反应4h生成具有attL重组位点的中间载体，(2)LR反应：采用的干扰载体是pK7GWIWG2(I),0(图3)，具有Spe抗性和ccdB致死基因，具有attR重组位点。LR反应参照invitrogn公司的LRII Enzyme mix(美国)说明书操作，反应载体为发生BP反应生成的具有attL重组位点的中间载体与干扰载体pK7GWIWG2(I),0在25℃反应4h生成具有attB重组位点且含有磷脂酶靶基因片段的干扰载体。

通过BP反应和LR反应，将克隆获得的磷脂酶基因家族的7段靶基因片段构建到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上，形成含有真菌靶基因的植物转化载体。电击法将获得含有靶基因片段的干扰载体转化农杆菌LBA4404，用于本生烟等植株的遗传转化。

1.2本生烟草的遗传转化与分子鉴定

将种在MS基本培养基上的无菌的烟草，除去叶片边缘和主要叶脉，切成0.4×0.6cm大小的小段。将切好的外植体在上述OD₆₀₀为0.1～0.2的农杆菌菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，将小叶片摆放在铺有一层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2mg/L)上进行共培养，25℃暗培养3天。

将经过共培养的烟草外植体转移到含有抗生素的抗性芽筛选培养基(MS+NAA0.2mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中进行培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，2～3周后即可生芽。待抗性芽生长至1～2cm高时，切下小芽转入生根培养基(MS+Kan100mg/L+Carb 500mg/L)中诱导生根，1～2周后就会有不定根形成。

获得烟草的转化植株以后，对其进行分子鉴定。提取转化苗的总的基因组为模板，以VdPL4-1-J-F/R，VdPL4-2-J-F/R，VdPL4-3-J-F/R，VdPL4-4-J-F/R，VdPL6-1-J-F/R，VdPL6-2-J-F/R，VdPL6-3-J-F/R(引物序列见表1)，进行PCR分子检测，检测为阳性苗的植株进行继代培养，以获得纯合的阳性烟草植株，为下一步的抗病性实验准备。

1.3转基因烟草植株的抗病性试验与真菌生物量的检测和分子检测

分别将野生型烟草和已获得的7段不同靶基因片段的(每个靶基因片段各挑选三个不同的株系)烟草种子栽培在无菌的环境下，待幼苗长至七到九片真叶时，用已准备好的5×10⁶孢子/mL的野生型菌株的孢子悬浮液分别接种获得的二十一组不同靶基因片段不同株系的转基因烟草幼苗，每组设置三小组(十棵幼苗)重复，十二天以后观察植株的感病状况，并统计植株的病情指数。

利用qRT-PCR技术检测感病烟草植株内大丽轮枝菌的生物量变化。本发明分别用感病的野生型和七段转靶基因片段获得本生烟植株的地上1cm茎段作为qRT-PCR大丽轮枝菌生物量检测的材料，提取感病烟草植株的总DNA，以本生烟的actin(引物序列见表1)基因作为内参基因，大丽轮枝菌的核糖体RNA基因(Z29511)作为真菌生物量的检测基因，引物Vd-F/Vd-R(引物序列见表1)是基于核糖体RNA基因的ITS1和ITS2区域，检测感病本生烟中真菌的生物量，从分子生物学角度确定转基因烟草植株对大丽轮枝菌的抗病性等级。

2、实验结果

2.1转靶基因烟草植株的获得

通过农杆菌介导的本生烟的稳定遗传转化，将含有不同磷脂酶基因不同靶标区段的干扰载体稳定遗传转化到本生烟草，经100mg/L的卡那霉素筛选最终获得转基因烟草植株。对获得的转基因烟草植株进行PCR检测(图4)，每段靶基因均获得多个不同的阳性转化株系，分别随机挑选四个转基因株系进行下一步的抗病性分析。

2.2转靶基因烟草植株的抗病性分析和真菌生物量的分子检测

为了确定转磷脂酶靶基因片段的本生烟植株对大丽轮枝菌的抗性等级，是否能达到免疫等级，对其进行抗病性试验检测分析。本发明以野生型本生烟植株和转磷脂酶靶基因片段本生烟植株为大丽轮枝菌的寄主，待植株长至七到九片真叶时接种相同浓度的孢子(5×10⁶孢子/mL)悬浮液在第八天、第十天、第十二天以后观察植株的感病情况病统计病情指数，结果发现：在接菌第十二天以后，获得磷脂酶基因干扰片段的转基因烟草植株的感病症状极显著低于野生型植株。获得VdPL4-1(核苷酸序列为SED No.1所示)、VdPL4-2(核苷酸序列为SED No.2所示)、VdPL4-3(核苷酸序列为SED No.3所示)、VdPL4-4(核苷酸序列为SEDNo.4所示)、VdPL6-1(核苷酸序列为SED No.5所示)、VdPL6-2(核苷酸序列为SED No.6所示)、VdPL6-3(核苷酸序列为SED No.7所示)磷脂酶干扰片段的转基因烟草植株仅地上茎基部出现两到三片叶片萎焉，其他以上部分未出现感病症状，植株表现出抗病甚至达到高抗性。其中获得靶基因片段VdPL6-2(核苷酸序列为SED No.6所示)的转烟草植株基本没有出现感病症状，与未接菌的对照植株基本一致，植株达到免疫等级(病情指数基本是0)；获得转靶基因片段VdPL6-3、VdPL4-2、VdPL4-3的烟草植株表现为高抗(病情指数在15％以下)；获得转靶基因片段VdPL4-1、VdPL4-4、VdPL6-1的烟草植株表现为抗病(病情指数在15-30％)。而野生型烟草植株出现明显的感病症状，在接菌第十二天以后，植株出现黄化、萎蔫、枯死症状(图5)。

对接菌十二天后的转磷脂酶靶基因片段的本生烟植株和野生型本生烟植株中真菌生物量的检测结果发现：野生型烟草植株中大丽轮枝菌的生物量都极显著高于获得的7段不同的转磷脂酶靶基因片段烟草植株中生物量，差异显著倍数都在10以上，有的甚至高达100倍(图5)。而且检测结果显示：转磷脂酶靶基因片段VdPL6-2的烟草植株中仅仅检测到痕量大丽轮枝菌生物量，与未侵染的对照植株基本一样(图5)。

综上结果表明：获得的7段不同的磷脂酶靶基因片段的烟草转化植株VdPL4-1、VdPL4-2、VdPL4-3、VdPL4-4、VdPL6-1、VdPL6-2、VdPL6-3对大丽轮枝菌的抗病性极显著提高，植株达到抗病的水平以上，尤其获得VdPL6-2干扰片段的转基因烟草植株对大丽轮枝菌抗病性达到免疫的水平。

综上，本发明通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)将大丽轮枝菌磷脂酶基因7段靶基因序列导入本生烟中使其瞬时表达dsRNA，并进行大丽轮枝菌接种，发现导入7段靶基因片段的本生烟植株的抗病性都显著提高，而且其中有4段靶标序列的抗病性极显著提高。本发明利用RNAi技术，进一步构建磷脂酶基因七段靶基因序列的稳定遗传干扰载体，转化本生烟，获得转基因的烟草植株，其对大丽轮枝菌的抗病性显著增强，尤其是转化获得的VdPL6-2基因片段的烟草植株的抗病性最强，对大丽轮枝菌的抗病性表现出高抗，甚至达到免疫等级。因此，本发明获得磷脂酶七段靶基因序列的稳定遗传干扰载体，转化本生烟提高烟草对大丽轮枝菌的抗病性，将其转入农作物中，有望获得高抗大丽轮枝菌的新试验材料，应用于棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生等抗病育种的实践生产中。

Claims (13)

1.大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)磷脂酶靶基因片段，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。

2.由权利要求1所述磷脂酶靶基因片段所转录的RNA。

3.含有权利要求1所述磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体。

4.按照权利要求3所述的RNA干扰载体，其特征在于：所述RNA干扰载体是Gateway干扰载体。

5.一种构建权利要求4所述RNA干扰载体的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的磷脂酶靶基因片段插入到Gateway干扰载体，即得。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于,通过BP反应，将权利要求1所述的磷脂酶靶基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中，得到Gateway干扰载体。

7.权利要求1所述磷脂酶靶基因片段或权利要求2所述RNA在提高植物对大丽轮枝菌的抗病性中的应用。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有权利要求1所述磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

9.权利要求3所述RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌的抗病性中的应用。

10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求3所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

11.一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有权利要求1所述磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。

12.按照权利要求7或9所述的应用，其特征在于，所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物。

13.按照权利要求12所述的应用，其特征在于，所述寄主植物包括烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种。