CN104988139B

CN104988139B - 培育抗黄萎病的棉花的方法

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Publication number: CN104988139B
Application number: CN201510257627.XA
Authority: CN
Inventors: 郭惠珊; 张涛
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2035-05-19
Also published as: CN104988139A

Abstract

本发明涉及一种培育抗黄萎病的棉花的方法，包括向棉花基因组中导入SEQ ID NO.1所示序列的基因及其反向重复序列的基因。本发明通过在棉花植株中导入大丽轮枝菌致病基因，使棉花植株中转录生成与大丽轮枝菌致病基因相对应的双链RNA结构，棉花植株中的Dicer‑like蛋白将双链RNA切割成20‑25nt大小的siRNA，这些siRNA可以识别侵染棉花的大丽轮枝菌当中与之序列互补的致病基因mRNA并致其降解，降低大丽轮枝菌的致病性。

Description

培育抗黄萎病的棉花的方法

技术领域

本发明总地涉及生物技术领域，具体涉及一种培育抗黄萎病的棉花的方法。

背景技术

棉花黄萎病严重威胁着棉花的生产和相关产业的发展，因为黄萎病引起的棉花减产问题非常严重，给棉农及国家造成了很大的经济损失。棉花黄萎病已成为棉花生产可持续发展的主要障碍之一，被称为“棉花的癌症”(简桂良等.2003),并已成为当前制约棉花生产的突出问题。

棉花黄萎病是由土壤丝状真菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)所引起的，是一种土壤传播的维管束病害,而且病原菌变异较快，具有分布广，危害重，存活时间长，化学农药难于防治等特点，是棉花生长过程中最具毁灭性的病害之一。据2012年第11届国际轮枝菌大会的报导，棉花2005-2010年世界平均年产量2352万吨，因轮枝菌病害造成的损失高达年产的30％，每1％产量的损失相当于损失3.54亿美元。

传统的作物抗病技术包括抗病品种的培育和施用农药等手段，虽然棉花常规育种在获得抗病、农艺性状优良新品种方面已取得了很大成就，大大促进了棉花生产，但由于育种周期长，又难以找到高抗病性的棉花原始种质，所以仅依靠常规育种很难适应目前棉花生产对抗病性的要求。

近年来基因工程的快速发展使得使用生物控制各种病害虫的方法变得可行，利用转基因技术培育抗性的农作物新品种，是现代农业生产利用高科技提高农作物产量、保护生态环境、促进农业可持续发展的关键技术之一，早已成为国际上不争的共识和各国重点攻关的方向。但是，目前我国致力于棉花黄萎病抗病性的研究主要还是单一的从宿主出发，进行分离鉴定棉花基因，离产业化育种生产还有很长的一段路。

近年来报道的抗棉花黄萎病的转基因植物主要有以下几种：在拟南芥中过量表达棉花非共生的血红蛋白基因GhHbd1能够诱导防卫反应并提高转基因植物的抗病性(Qu,Zhong et al.2006)；在棉花中表达杆状病毒抗凋亡基因p35和op-iap能够增强转基因棉花对大丽轮枝菌的抗性(Tian,Zhang et al.2010)；在海岛棉Gossypium barbadense中克隆鉴定到一个抗大丽轮枝菌的基因GbVe，该基因转入拟南芥中能使转基因拟南芥获得抗性(Zhang,Yang et al.2012)；在棉花中转入一个编码过敏致病性蛋白的基因hpaXoo能增强植物对大丽轮枝菌的防卫反应(Miao,Wang et al.2010)；在转基因棉花中表达植物的抗性蛋白NaD1能增强对大丽轮枝菌及尖孢镰刀菌的抗性(Gaspar,McKenna et al.2014)。除此以外，转几丁质酶基因或者一些抗性相关基因也有报道。这些研究都是在寄主棉花中寻找抗病基因，且大多停留在实验室小范围试验阶段，尚未进行大规模的田间试验。

RNA沉默(RNA干扰)系统是一种在真核生物中广泛存在的保守机制，其作用方式是经一系列复杂的合成途径产生小分子RNA并以位点特异的剪切方式使与之序列互补的靶标RNA降解。反向重复序列、病毒复制过程或由RNA依赖的RNA聚合酶(RDR，RNA-dependent RNApolymerase)合成的长双链RNA产物、或能形成茎环结构的单链RNA都可能成为具有RNAeⅢ活性的核酸酶Dicer的底物，被Dicer剪切并产生21-24nt长度的小RNA。小RNA是RNA沉默反应的重要特征。这些小RNA分子可结合并指导包含AGO蛋白的RISC(RNA induced silencingcomplex)复合物降解与之序列同源的RNA分子，表现为小RNA－介导的RNA沉默现象(Voinnet2001,Voinnet 2002,Vaucheret 2005,Brodersen and Voinnet 2006,Vaucheret2006,Xie and Guo 2006)。小RNA主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)和小干扰RNA(siRNA)两种。小RNA介导的RNA沉默途径在植物抗病方面发挥着重要的作用。

发明内容

本发明提供了一种培育抗黄萎病的棉花的方法，通过在棉花中导入大丽轮枝菌的致病基因，使棉花产生siRNA，侵染棉花的大丽轮枝菌中与siRNA同源的mRNA序列被降解，降低大丽轮枝菌的致病性。

本发明的一个方面，提供了一种培育抗黄萎病的棉花的方法，向棉花基因组中导入SEQ ID NO.1所示序列的基因及其反向重复序列的基因。

在上述技术方案中，所述方法具体包括如下步骤：

(1)使用两对引物分别扩增SEQ ID NO.1所示序列的基因，将扩增后获得的基因导入表达载体，使导入后的表达载体中含有SEQ ID NO.1所示序列的基因及其反向重复序列的基因；

(2)通过步骤(1)中获得的含有SEQ ID NO.1所示序列的基因及其反向重复序列的基因的表达载体转化农杆菌；

(3)选取转化成功的农杆菌；

(4)通过步骤(3)中所述的转化成功的农杆菌转染棉花组织，培养转染后的棉花组织至棉花植株，选取产生siRNA的棉花植株培育即为抗黄萎病的棉花。

在上述技术方案中，步骤(1)中所述扩增SEQ ID NO.1所示序列的基因使用的两对引物序列如下：

上游引物1：5’→3’方向：GGATCC TTCGTGTATTCGGAGTTCTG；

下游引物1：5’→3’方向：GAATTC GATTGCTCTGTTTGCTGGA；

上游引物2：5’→3’方向：GAGCTC TTCGTGTATTCGGAGTTCTG；

下游引物2：5’→3’方向：AGATCT GATTGCTCTGTTTGCTGGA。

在上述技术方案中，步骤(1)中还具体包括如下步骤，

所述上游引物1及所述下游引物1以大丽轮枝菌基因组DNA为模板PCR扩增SEQ IDNO.1所示序列的基因，将PCR产物接到pGEM-T载体，获得载体pGEMT-VDH1i1；

使用所述上游引物2及所述下游引物2以大丽轮枝菌基因组DNA为模板PCR扩增SEQID NO.1所示序列的基因，将PCR产物连接到pGEM-T载体，获得载体pGEMT-VDH1i2；

利用BamHI和EcoRI酶切pGEMT-VDH1i1、利用SacI和BglII酶切pGEMT-VDH1i2，回收酶切后的片段连接到载体pSK-int，获得载体pSK-int-RNAi；

将载体PSK-int-RNAi用BamHI和SacI酶切，获得SEQ ID NO.3所示序列的基因，将SEQ ID NO.2所示序列的基因连接到pBI121载体中，获得VdH1 RNAi表达载体。

在上述技术方案中，步骤(2)中通过电击转化的方法将所述含有SEQ ID NO.1所示序列的基因及其反向重复序列的基因的表达载体导入农杆菌感受态细胞。

在上述技术方案中，步骤(3)中具体通过将农杆菌涂布于含有抗生素的平板上培养筛选转化成功的菌株。

在上述技术方案中，步骤(4)中所述的棉花组织为棉花无菌苗下胚轴。

本发明通过在棉花植株中导入大丽轮枝菌致病基因，使棉花植株中转录生成与大丽轮枝菌致病基因相对应的双链RNA结构，棉花植株中的Dicer-like蛋白将双链RNA切割成20-25nt大小的siRNA，这些siRNA可以识别侵染棉花的大丽轮枝菌当中与之序列互补的致病基因mRNA并致其降解，降低大丽轮枝菌的致病性。

附图说明

图1是Southern blot的结果图，其中，泳道1为表达载体对照，泳道2为本发明实施例的转基因株系；

图2是Northern blot的结果图；

图3是野生型棉花WC-CK的植株；

图4是被大丽轮枝菌V592侵染后的野生型棉花WC-CK的植株；

图5是被大丽轮枝菌V592侵染后的本发明实施例的转基因植株；

图6是本发明实施例的转基因植株与对照野生型棉花WC-CK的植株被侵染20天后的发病率对比图；

图7是本发明实施例的转基因植株与对照野生型棉花WC-CK的植株被侵染20天后的病情指数对比图；

图8为本发明实施例的转基因植株与对照野生型棉花WC-CK的植株被侵染20天后的病级数对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的根癌农杆菌EHA105(Elizabeth E.Hood.New Agrobacteriumhelper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Research,July 1993,Volume 2,Issue 4,pp 208-218)公众可从中国科学院微生物研究所获得。

下述实例中的大丽轮枝菌V592(Feng-Gao,Bang-JunZhou,A Glutamic Acid-RichProtein Identified in Verticillium dahliae from an Insertional MutagenesisAffects Microsclerotial Formation and Pathogenicity.PLoS ONE5(12):e15319.)公众可从中国科学院微生物研究所获得。

实施例一 VDH1i表达载体的构建

利用CTAB法提取大丽轮枝菌V592基因组DNA,利用以下引物以该基因组DNA为模板，进行PCR扩增：上游引物(5’→3’)：GGATCC TTCGTGTATTCGGAGTTCTG下游引物(下划线为BamHI酶切位点)(5’→3’)：GAATTC GATTGCTCTGTTTGCTGGA(下划线为EcoRI酶切位点)。将PCR产物连接到pGEM-T载体(购自TIANGEN公司货号为VT202-02)上，得到重组载体。利用上述上游引物和pGEM-T载体通用反向引物M13R(5’→3’：CAGGAAACAGCTATGACC)，通过PCR扩增鉴定正向插入的重组载体并测序，将测序结果表明含有SEQ ID NO.1所示的DNA分子的重组载体命名为pGEMT-VDH1i1。利用以下引物以大丽轮枝菌V592基因组DNA为模板，进行PCR扩增，上游引物(5’→3’)：GAGCTC TTCGTGTATTCGGAGTTCTG(下划线为SacI酶切位点)下游引物(5’→3’)：AGATCT GATTGCTCTGTTTGCTGGA(下划线为BglII酶切位点)将PCR产物连接到重组载体pGEM-T载体(购自TIANGEN公司)上，得到重组载体。利用上述上游引物(5’→3’：GAGCTCTTCGTGTATTCGGAGTTCTG)和pGEM-T载体通用反向引物M13R进行PCR扩增鉴定正向插入的重组载体并测序，将测序结果表明含有SEQ ID NO.1所示的DNA分子的重组载体命名为pGEMT-VdH1i2。然后分别利用BamHI和EcoRI以及SacI和BglII酶切，回收后的片段插入到PSK-int(记载PSK-int载体的文献是Hui-Shan Guo,Jifeng Fei,Qi Xie and Nam-Hai Chua.2003A chemical-regulated inducible RNAi system in plants.The Plant Journal,34,383-392，)公众可从中科院微生物所获得，获得PSK-int-RNAi。PSK-int-RNAi用BamHI和SacI酶切，获得的片段(核苷酸序列如序列中SEQ ID NO.2所示)插入到pBI121载体中，获得VdH1RNAi表达载体。

实施例二农杆菌介导法转化野生型棉花WC-CK

一、VdH1 RNAi表达载体转化农杆菌

将构建好的VdH1 RNAi表达载体用电击转化的方法导入农杆菌感受态细胞，具体操作如下：

(1)-80℃取出农杆菌感受态细胞EHA105，于冰上融化。

(2)将1μl的VdH1 RNAi表达载体质粒注入农杆菌液中，置于冰上。

(3)把混合好的农杆菌液注入电击杯(BIO-RAD公司，货号为165-2089)中，1500v电压下(BIO-RAD公司，Gene Pulser Xcell电转仪)电击两秒钟。

(4)电击杯中加入LB，将混合液吸出注入EP管中。

(5)置于摇床中在28℃,160转/分钟条件下摇45分钟。

(6)将菌液均匀的涂布在LB+Kan(质粒抗性)+Rif(农杆菌抗性)固体培养基上

涂布于附加相应抗生素的LB固体平板上，28℃，暗培养两天之后，长出的菌落即为转化成功的农杆菌。

二、农杆菌转化野生型棉花WC-CK(来自山西棉花所)。

(1)种子消毒

首先将欲转化的野生型棉花WC-CK的棉籽进行98％浓硫酸脱绒(原液)，用自来水冲干净凉干，将凉干的棉籽用70％的酒精消毒片刻，倾除，再倒入5～15％的过氧化氢淹没种子，3～4小时后，在超净台上用无菌水冲洗种子3～4次，最后用无菌水浸泡过夜，次日，将露白后的种子移至1/2MS、琼脂粉培养基上，pH值为7，在28℃光照下培养。

(2)下胚轴的感染

把培养5～7天的无菌苗下胚轴切成5mm的切片，浸泡在过夜培养的转化成功的农杆菌菌液中十分钟，菌接种到含有KT 0.1mg/L、2、4-D 0.1mg/L的MS培养基上，PH值为6，诱导愈伤组织，温度28±2℃，光照200LX，3个月后长出的愈伤组织再转到不含激素的MS固体培养基上进行分化。

(3)植株再生：将分化的胚性愈伤组织在上述培养基上进一步分化待长出芽和根后移入土壤中。

实施例三 Southern blot确定转基因棉花插入基因的拷贝数

A、CTAB法提取实施例一中的转基因棉花和野生型棉花WC-CK的基因组DNA。

B、提取的DNA用HindⅢ酶切

酶切体系：DNA 100μg，10×buffer 40μl，酶35μl，加H₂O定容至400μl，37℃，24小时。取5ul电泳检测酶切是否完全。加240μl异丙醇沉淀酶切产物，最后融于约40μl ddH₂O中，加Loading Buffer；点样前65℃，保温5～10min。

C、电泳

0.9％琼脂(0.5×TBE)；50V，18～24小时；最后再反向电泳5min。

D、凝胶处理

(1)电泳完毕后，照相；ddH₂O冲洗凝胶；

(2)0.2M HCl浸泡凝胶，并置于脱色摇床轻轻摇动，大约20min，直至溴酚蓝变黄，浓盐酸为10mol/L，即稀释50倍，10ml到500ml)；

(3)去离子水洗2遍，加变性液置于脱色摇床轻轻摇动，约40min，直至溴酚蓝由黄变蓝，变性液：NaCl 1.5M(87.75g/L)，NaOH 0.5M(20g/L)。

(4)去离子水洗2遍，加中和液置于脱色摇床轻轻摇动，约30min，中和液：NaCl1.5M(87.75g/L)，Tris.cl 0.5M(60.57g/L)，浓HCl约23～25ml，调pH值为7.2。

E、转膜

(a)用长和宽均大于凝胶的板胶作为平台，放在塑料盘中，倒入20×SSC，剪一条与平台等宽，长度大于平台的滤纸，先将滤纸一端浸湿在塑料盘中，慢慢放在平台上，直到另一端也浸湿在20×SSC中，赶出滤纸和平台间的气泡。

(b)剪一张长和宽均略大于凝胶的尼龙膜，剪去左上角，完全浸湿在无菌水中，取出膜，再浸入20×SSC中，至少5分钟。

(c)电泳结束后，切掉凝胶的无用部分，并在左上角切去一角，以作为方位标记。将凝胶放在20×SSC中漂洗片刻。

(d)将凝胶倒放在平台上滤纸的中央，赶出胶和滤纸间的气泡，用Parafilm封口膜围绕凝胶周围，不要碰到凝胶上的样品。

(e)用20×SSC浸湿凝胶，将湿润的尼龙膜放在凝胶上面，使二者切角重合，赶出尼龙膜和凝胶间的气泡。

(f)用20×SSC浸湿5张与尼龙膜同样大小的滤纸，放在尼龙膜上面，赶出滤纸和尼龙膜间的气泡。

(g)剪一叠10cm厚，略小于滤纸的纸巾，放在滤纸上面，纸巾上放一块玻璃板，再压上500g的重物，转移过夜。

(h)揭去凝胶上方的纸巾、滤纸和Parafilm，翻转凝胶和尼龙膜，以凝胶一面在上放在一个塑料盘中，用铅笔在尼龙膜上标记凝胶加样孔的位置。

(i)从尼龙膜上剥离凝胶弃之，将尼龙膜浸泡在20×SSC中5min，取出尼龙膜，放在湿润的滤纸上，紫外交联固定DNA。

(j)用亚甲基蓝染色，直到看见清晰的DNA条带，蒸馏水冲洗脱色，用保鲜膜包好，放在4℃保存待用。

F、标记探针

Amersham公司随机引物标记试剂盒(货号为RPN1633)，RediprimeTMII RandomPrimer Labelling System。

(a)取待标记的DNA 25ng，加无菌水，使体积扩增至45μl。

(b)98℃，保温5分钟，变性DNA。

(c)离心，使DNA聚集在离心管管底，放在冰上。

(d)将变性的DNA加到标记混合物中，轻轻混匀，直到DNA和标记混合物形成的颗粒完全融解。

(e)加1μl Klenow(防止标记混合物中的Klenow失活)，离心。

(f)加5μlα-32P-dCTP，用枪轻轻吹打均匀，离心。

(g)37℃，反应30分钟；98℃，反应5分钟，变性已标记好的DNA探针，离心，放在冰上。

(h)取适量探针用于杂交，剩余的探针保存在4℃冰箱中。

G、杂交

Southern Blot缓冲液：50×Denhart’s 5ml，20×SSPE 12.5ml，10％SDS2.5ml，用ddH₂O定容至50ml。即终浓度分别为：5×Denhart’s，5×SSPE，0.5％SDS。

(a)预杂交：将杂交缓冲液倒入杂交管中，65℃预热15min，放入交联固定的膜，65℃预杂1～2小时。

(b)杂交：向杂交管中加入20μl标记好的探针，65℃杂交过夜。

(c)洗膜：用洗膜缓冲液2×SSC/2％SDS，在65℃/20min条件下洗膜两次；用0.2×SSC/0.2％SDS，在65℃/20min条件下洗膜一次。

(d)压磷屏：将洗好的膜从杂交管中拿出，转移至两层塑膜中，检测杂交信号强弱，将膜放入GE Healthcare公司生产的磷屏(货号为00146931)中，根据信号强弱压数小时或过夜；

(e)检测杂交信号：扫描磷屏

结果如图1所示,泳道1为表达载体对照，泳道2为实施例一的转基因植株，用HindⅢ酶切DNA后用杂交探针序列1只能杂交到一条带，说明pBI121载体在转基因植株中为单拷贝，因此比较容易得到纯合体。

实施例四 Northern检测SiRNA表达情况

A、Trizol试剂法提取棉花组织RNA

(1)将转基因棉花材料在研钵中用液氮研磨成粉末，每50～100mg棉花组织加入1ml RNAVzol，于离心管中匀浆至完全裂解；室温放置5min。

(2)在装有裂解物的离心管中加入0.2倍体积的氯仿(1ml Trizol加入0.2ml氯仿)，用振荡器充分振荡混匀30秒，室温放置2～3min。

(3)4℃，14000rpm，离心10min，吸取上层水相至一新的离心管中，每毫升Trizol可吸取约0.5～0.55ml。

(4)按每毫升最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次，混匀，室温沉淀10min。

(5)4℃，1,4000rpm，离心10min，在管底可见RNA沉淀。弃上清，每毫升最初的Trizol加入1ml 75％乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀。弃去液体。室温倒置晾干(5～10min)。

(6)加入适量的50％去离子甲酰胺溶解RNA沉淀，存放于-80℃备用。

B、siRNA Northern Blot

(1)相关试剂：30％丙烯酰胺(30％Acr/Bis)(配制：29g丙烯酰胺，1g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，加无菌水定容容至100ml，过滤除菌，避光保存)；10％过硫酸铵；N,N,N’,N’-四甲基乙二胺；尿素。

(2)RNA电泳

(a)17％聚丙烯酰胺凝胶的配制

	所需量
		尿素	12.6g
10×TBE	1.5ml
		30％Acr/Bis	17ml
ddH₂O	定容至30ml

上述成分在50ml离心管中加好后混匀，用热水加热离心管使尿素充分溶解，冰上冷却后浇入240μl 10％APS，轻轻混匀后再加入10μl TEMED，再次混匀后倒入准备好的胶板中，凝胶30min～1小时。

(b)RNA样品的处理

溶于50％去离子甲酰胺的RNA样品于100℃变性5min，冰上放置5min。变性后的RNA样品加入上样缓冲液，混匀后上样。

(c)聚丙烯酰胺凝胶电泳

0.5×TBE，先200V条件下电泳约30min，待样品完全进入PAGE胶后再调高电压至350V，继续电泳3.5个小时。

(3)转膜(转膜缓冲液为1×TBE)

(a)将含有RNA条带的凝胶切下，在转膜缓冲液1×TBE中浸洗30s，同时根据凝胶的大小准备相应大小的尼龙膜和两份厚滤纸，同样用转膜缓冲液1×TBE浸湿，然后按如下顺序叠放于半干转印槽中。从上至下依次为：厚滤纸-凝胶-尼龙膜-厚滤纸。

(b)盖上半干转印仪(BIO-RAD公司，型号Trans-Blot SD CELL)，转膜30～45min，转膜所需电流(mA)＝膜的面积(cm²)×3；

(c)转完后将膜放于湿润滤纸上，紫外交联固定，固定后的膜用保鲜膜封好置于4℃备用。

(4)探针标记

采用Ambion公司体外转录标记试剂盒(MAXIscript In vitro TranscriptionKit公司，货号AM1314)

(a)按照下表配制标记反应体系组分

组分	体积：20μl
		待标记的探针(～1μg,not<0.5μg)	5μl
ddH2O	5μl
		10×Transcription buffer	2μl
NTPs(ATP/GTP/CTP 10mM×3)	3μl
		α-32P-UTP	3μl
Transcriptional Enzyme mix	2ml

(b)混好后简单离心，37℃反应1小时；

(c)降解DNA模板：加入1μl DNase Ⅰ降解DNA模板，混匀，快速离心，37℃，保温15min。

(d)Carbonate buffer将RNA切成约50bp大小的片段：加入300μl 240mM碳酸盐缓冲液(Carbonate buffer),混匀，60℃反应，将探针切成20nt左右的小片段，反应时间(min)按如下公式计算：min＝[插入T载体中片段的长度(kb)-0.05]/[0.11×插入T载体中片段的长度(kb)×0.05]；

240mM碳酸盐缓冲液(Carbonate buffer)的配制：

组分	体积：40ml
		240mM Na₂CO₃	20ml
160mM NaHCO₃	20ml

(e)将标记好的探针放在4℃冰箱中保存备用。

(5)杂交

杂交缓冲液的配制：

杂交缓冲液:10.2ml	所需体积	终浓度
			Formamide	5ml	50％
20％SDS	3.5ml	7％
			1M NaHPO₄(pH 7.2)	0.5ml	50mM
5M NaCl	0.6ml	0.3M
			100×Denhardt’s solution	0.5ml	5×
鲑鱼精DNA(10mg/ml)	100μl	5×

100×Denhardt’s solution的配制：

Volume：500ml	所需量
		聚乙烯吡咯烷酮-360(PVP-360)	10g
160mM NaHCO₃	10g
		BSA(组分V)	10g

(a)预杂交：将杂交缓冲液倒入杂交管中40℃预热15min后放入交联固定的膜40℃预杂1～2小时；

(b)杂交：将标记好的探针放入杂交管中，40℃杂交过夜；

(c)洗膜：用洗膜缓冲液2×SSC/0.2％SDS，在50℃/15min条件下洗膜2～3次；

(d)压片：将洗好的膜从杂交管中拿出，转移至两层塑膜中，检测杂交信号强弱，将膜放入磷屏中，根据信号强弱压数小时或过夜；

(e)检测杂交信号：扫描磷屏。

结果如图2所示，说明转基因棉花植株可以产生SiRNA。

实施例五转基因棉花的抗病性检测

通过菌株侵染水培棉花来鉴定其抗病性。挑选饱满的棉种用15％的次氯酸钠浸泡30min后，无菌水冲洗2～3遍，再用无菌水浸泡催芽过夜后平铺在培养盒中保湿，待芽长至3cm，种于发芽盒中。将长出子叶的苗转移到盛满清水的塑料盒(高8～10cm)中，于25℃，光照16小时，黑暗8小时培养。待真叶长出时将清水换成1/3的MS培养液，每周更换一次培养液，1片真叶展平时接种。将-80℃保存的大丽轮枝菌V592菌株经PDA平板活化3～4天，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25℃，220rpm摇培5天，过滤，滤液5000g离心5min，，清水稀释孢子，血球计数板计数，将浓度调至1×10⁷个孢子/ml。将调好浓度的孢子悬浮液加入空塑料盒中，棉苗浸根40min后接种。之后用1/3的MS培养液25℃光照16小时，黑暗下继续培养棉苗8小时。每盒中种12株苗，每个品种3个重复,对照棉苗用清水浸泡40min。20后观察发病情况。

计算发病率和病情指数：

发病率＝发病数/调查总数×100％(见图6)

病情指数＝∑[病级数×该级病叶(穗、株)数]/(调查总数×最高病级数)×100(见图7)

发病分级标准：

0级植物健康没有症状；

1级0.1％-25％的叶片萎蔫；

2级25％-50％的叶片萎蔫；

3级50％-75％的叶片萎蔫；

4级75％-100％的叶片萎蔫或者死亡；

野生型棉花与本实施例的转基因棉花的发病分级标准统计图见图8。

通过上述方法的结果图，我们可以看出本实施例的转基因棉花相比于野生型棉花发病率、病情指数及发病分级都明显降低，说明本实施例的转基因棉花能够对大丽轮枝菌产生抗性。

Claims

1.一种培育抗黄萎病的棉花的方法，其特征在于，向棉花基因组中导入SEQ ID NO.1所示序列的基因及其反向重复序列的基因，所述SEQ ID NO.1所示序列的基因及其反向重复序列的基因如SEQ ID NO.2所示序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(3)筛选转化成功的农杆菌；

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增SEQ IDNO.1所示序列的基因使用的两对引物序列如下：

上游引物1：5’→3’方向：GGATCC TTCGTGTATTCGGAGTTCTG；

下游引物1：5’→3’方向：GAATTC GATTGCTCTGTTTGCTGGA；

上游引物2：5’→3’方向：GAGCTC TTCGTGTATTCGGAGTTCTG；

下游引物2：5’→3’方向：AGATCT GATTGCTCTGTTTGCTGGA。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中还具体包括如下步骤，

所述上游引物1及所述下游引物1以大丽轮枝菌基因组DNA为模板PCR扩增SEQ ID NO.1所示序列的基因，将PCR产物接到pGEM-T载体，获得载体pGEMT-VDH1i1；

使用所述上游引物2及所述下游引物2以大丽轮枝菌基因组DNA为模板PCR扩增SEQ IDNO.1所示序列的基因，将PCR产物连接到pGEM-T载体，获得载体pGEMT-VDH1i2；

将载体PSK-int-RNAi用BamHI和SacI酶切，获得SEQ ID NO.2所示序列的基因，将SEQID NO.2所示序列的基因连接到pBI121载体中，获得VdH1RNAi表达载体。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中具体通过电击转化的方法将所述含有SEQ ID NO.1所示序列的基因及其反向重复序列的基因的表达载体导入农杆菌感受态细胞。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中具体通过将农杆菌涂布于含有抗生素的平板上培养筛选转化成功的菌株。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的棉花组织为棉花无菌苗下胚轴。