CN101056534B - 抗线虫的转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了提供线虫抗性的组合物和方法。一方面提供了包含对一种或多种线虫食道多肽特异的抑制性核酸的转基因植物或细胞。另一方面提供了对至少两种不同的根结线虫具有抗性的转基因植物或细胞。

Description

抗线虫的转基因植物

背景技术

交叉参考相关申请   

本申请要求2004年10月13日提出的美国临时申请60/618,097和2005年8月2日提交的美国临时申请60/704,560的利益和优先权，其每一篇在合适的情况下以其全文引入作为参考。 

关于联邦资助的研究或开发的声明 

本文所公开的工作的方面部分受到批准号为2003-35302-13804的美国农业部授予的支持。美国政府在所主张的主题中有一定的权利。 

1.技术领域

本公开一般涉及控制植物寄生虫的组合物和促进根系生长的组合物，更特别涉及控制线虫病或促进根系生长的核酸组合物。 

2.相关技术 

线虫类是无脊椎动物的一个很大的群体，通常指蛔虫、蛲虫、线虫(eelworm)或线虫(nema)。某些线虫类是植物寄生虫，以茎、芽、叶为食，特别是根。植物寄生线虫类的一个重要的属是根结线虫(Meloidogyne spp.)。这些寄生线虫类感染了大范围的重要领域、蔬菜、水果和观赏植物。2001年，仅棉花一项，根结线虫就导致了两亿零50万美元的损失。 

治疗或预防根结线虫病害的已有方法包括使用化学品、杀虫剂和烟熏剂。播种前使用土壤烟熏剂控制根结线虫和其它植物寄生线非常有效。但是，大多数烟熏型杀线虫剂不再能够获得，而且也昂贵，难以适合流行条件下的应用。 

作物轮作也用于控制线虫病害。如果经济可行的话，洋葱、胡萝卜或莴苣与非寄主型作物如甜玉米和其它谷物轮作，能有效控制北方根结线虫。不幸的是，目前作物轮作对有机土壤的价值有限，因为多数生长的作物，包括土豆、豆类、芹菜、莴苣、洋葱和胡萝卜均易感疾病。 

也尝试过用覆盖作物控制线虫病害。生长在主要作物之间的覆盖作物可以提供替代的管理策略。已经表明黑麦草、大麦、燕麦、苏丹草、高羊茅、一年生黑麦草和小麦不是该线虫的宿主或者是很难寄生的宿主。但是，用覆盖作物的耗费高，因为覆盖作物占用了可以用来生长更有价值的作物的空间。 

也试图用生物控制生物体控制作物的线虫病害。市场上可以得到的生物控制生物体制剂有限，因为在能支持该控制生物体生长的区域才能应用。况且，用一种生物体控制另一种的结果不可预测，并受到多种因素如天气和气候的影响。 

另外，根结线虫(RKN)是作物由于植物寄生性线虫而减产的最主要原因。最重要的种类(南方根结线虫[M.incognita]，爪哇根结线虫[M.javanica]，花生根结线虫[M.arenaria]，北方根结线虫[M.hapla]，马铃薯根结线虫[M.chitwoodi])有广泛的宿主范围，限制了非宿主轮作的选择。虽然在各种作物中存在若干宿主抗性基因的实例，但宿主植物抗性的可用性明显受限于大多数我们的作物缺少适当的抗性基因座(Roberts，P.A.1992.Journal of Nematology 24：213-227)。另外，抗性还仅限于一些RKN种类或类群以及某些抗性基因有热敏感性，因而不适合炎热的产地。天然抗性基因的另一个局限性在于抗性的持久性，因为持续暴露于抗性栽培种如根结抗性番茄后，会发展出RKN打破抗性的种群。 

因此，需要控制、预防或减少植物中线虫病害的组合物和方法。 

还有一个影响作物的问题与根系发育差有关。植物的根系是植物的重要部分，提供了植物生存至关重要的许多功能。例如，根系为植物储存养分，过滤毒素，帮助调节植物生长，提供吸收水和养料的网络，并提供支撑植物和强化土壤的机械结构。根系较大的植物生长加快，耐逆性增加。增加或提高作物的根系生长特别有利，因为增加根系生长将增加作物产量。 

在多年生作物中，增加根系生长将增加再生长率，增加产量潜能，并增加植物越冬存活的可能性。一年生作物中，增加根系大小将在变化的环境条件下确保产量潜能。块根作物，增加根系生长意味着更高的产量。 

现有的根刺激剂通常包括肥料或植物激素，其用到植物上或植物附近的土壤中时，必须混合或配成特定浓度。过度应用这类刺激剂对植物有副作用，过少应用则达不到所需的结果。另外，应用植物激素有不想要的后果。例如，一种用作生根剂的植物激素是植物生长激素(auxin)或吲哚-3-乙酸(IAA)。IAA在植物的许多活性中发挥着重要作用，包括胚发育、叶子形成、向光性、向重力性、顶端优势、果实发育、脱离以及生根。 

因此，需要新的组合物和方法刺激或增强根系生长或发育。 

发明概述 

本发明的各个方面总体提供了抑制植物寄生虫分泌的蛋白质的表达的核酸构建体。在某些方面，蛋白质由线虫分泌，和任选调节：植物或细胞的基因表达，巨细胞的形成，线虫通过植物根组织的迁移，植物的细胞代谢，在植物细胞中引发信号转导，或形成取食管确保线虫从植物形成的巨细胞中取食。一方面，提供了对线虫，尤其是根结线虫分泌的食道腺细胞蛋白质特异的抑制性核酸。另一方面，提供了表达或含有一种或多种抑制性核酸(例如抑制性双股或单股RNA)的转基因细胞或植物，抑制或减少线虫食道腺细胞蛋白质的表达。 

另一方面，提供了包含抑制性RNA的转基因植物，其在3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多的线虫种类中，例如RKN种类，下调靶线虫寄生基因的转录。因此，本公开提供了对抗多个RKN种类导致的疾病的转基因植物。 

被公开的抑制性核酸所靶向的代表性食道腺细胞蛋白包括，一种或多种由SEQ ID NOs.1、2和5-51编码的蛋白质。在某些方面，当线虫进入转基因植物或转基因植物细胞，以转基因植物或转基因植物细胞为食，或与转基因植物或转基因植物细胞产生物理接触时，一种或多种抑制性核酸被递送至寄生线虫上。一旦抑制性核酸被寄生的线虫内化，抑制性核酸就干扰、减少或抑制靶食道腺细胞蛋白的表达，例如，通过直接或间接干扰、减少或抑制一种或多种编码一种或多种食道腺细胞蛋白的mRNA的翻译。 

还有一个方面提供了用异源核酸转染的植物细胞，所述异源核酸编码对于一种或多种线虫食道腺细胞蛋白特异的抑制性核酸，其中异源核酸表达的量足以减少或预防线虫病。在一个方面，转基因植物表达了抑制性核酸，并且抑制性核酸递送到以转基因植物为食或尝试以转基因植物为食的线虫中。通常，抑制性核酸被线虫内化。示例的抑制性核酸内化的方法包括摄取核酸或吸收核酸。 

还有一个方面提供了包含抑制性核酸的转基因植物，所述核酸对于一种或多种线虫寄生多肽具有特异性，其中抑制性核酸提供了对两种或多种线虫种类的抗性，例如两种或多种根结线虫。 

其它方面提供了刺激、促进或增强植物或树木根系生长或发育的 组合物。某些方面提供了编码线虫食道腺细胞分泌的蛋白质的核酸构建体，其中所述蛋白或其片段当被递送或与植物接触时，刺激或增强了根系发展。其它方面提供了含有一种或多种线虫食道腺细胞蛋白或其片段的组合物，当与植物或植物细胞接触时，刺激根系生长。还有的其它方面提供了转基因植物，其包含一种或多种线虫食道腺细胞蛋白或其片段、或者编码一种或多种线虫食道腺细胞蛋白或其片段的核酸，与非转基因植物或对照植物比较，足以刺激、增强或促进根系生长。 

代表性的线虫食道腺细胞蛋白(也称作食道蛋白)，包括一种或多种由SEQ ID NOs.1、2和5-51编码的蛋白或其组合。 

还有另一方面提供了被编码一种或多种线虫食道腺细胞蛋白的异源核酸转染的植物细胞，其中异源性核酸表达的量足以刺激、增强或促进根系生长或发育。 

下文伴随附图，提出了一种或多种实施方案的详细资料。本公开的其它特征、目的和优点从说明书、附图和权利要求将更为显见。 

附图简述 

图1A显示表达16D10 dsRNA的拟南芥(A.thaliana)接种南方根结线虫。注意到表达16D10 dsRNA的拟南芥的根上没有根结病(虫瘿)。 

图1B显示接种南方根结线虫的对照植物。 

图2显示表达16D10的转基因拟南芥植物的照片，与对照植物(空载体)比较，根系生长增强。 

图3显示了四种转基因拟南芥(Arabidopsis)T2纯合株L7、L10、L11、L17与对照株(L2，L3)比较，表明根系生长增强的柱状图。 

图4显示了用16D10 dsRNA(RNA1和RNA2)处理过的根结线虫的二期幼虫的RT-PCR分析，表明在处理过的线虫内，寄生基因16D10的转录本明显减少。间苯二酚(Res)用于帮助刺激dsRNA的摄取。单用 dsRNA或res，转录本没有减少。Mi-act-内部转录对照。 

图5显示了凝胶的照片，表明RNAi涉及线虫中的寄生基因8H11或31 H06的8H11或31 H06的下调表达。 

图6显示四种根结线虫用DIG标记的16D10探针进行的限制性内切酶消化的基因组DNA的DNA点杂交。Mi，南方根结线虫(M.incognita)；Mj，爪哇根结线虫(M.javanica)；Ma，花生根结线虫(M.arenaria)；Mh，北方根结线虫(M.hapla)。E，EcoRI；B，SamHI.M，80ng DIG-标记的分子量标记物(kb) 

图7是柱状图，显示了在表达16D10 dsRNA的转基因拟南芥上，四种线虫(Mi，南方根结线虫；Mj，爪哇根结线虫；Ma，花生根结线虫；Mh，北方根结线虫)的繁殖(每克根上的卵)相对于对照植物减少了。 

发明详述 

1.定义 

在解释本公开的各种实施方案之前，应当理解本发明其应用不受下文的说明中文法结构的细节和的内容安排的限制。其它实施方案也能以各种方式实施或进行。同样，也要体会本文所用的措辞和术语是为了叙述的目的，不应作为限制。 

贯穿本公开文本，参考了各种出版物、专利和已发表的专利说明书。在容许的情况下，这些出版物、专利和发表的专利说明书的公开文本在此以全文引作为参考全文，更完整地说明本领域的状况。除了另有说明，本公开文本包括属于本领域技术范围的植物育种、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。参见，例如Sambrook和Russell编著的，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3rd edition(2001)；Current Protocols In Molecular Biology[(F.M.Ausubel，等eds.，(1987)]；Plant Breeding：Principles and Prospects(Plant Breeding，VoI 1)M.D.Hayward，N.O.Bosemark，I.Romagosa；Chapman & Hall，(1993.)；Coligan，Dunn，Ploegh，Speicher和Wingfeld 编著的(1995)CURRENT Protocols in Protein Science(John Wiley &Sons，Inc.)；the series Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著(1995)]，Harlow和Lane编著的(1988)Antibodies，ALaboratory Manual，and Animal Cell Culture[R.I.Freshney，编著.(1987)]. 

除非另有说明，技术术语根据其常规用法使用。分子生物学中普通术语的定义可以在下列文献中找到：Lewin撰写的Genes VII(OxfordUniversity Press出版，2000)；Kendrew等人编著的The Encyclopedia ofMolecular Biology(Wiley-lnterscience.出版，1999)；Robert A.Meyers编著的Molecular Biology and Biotechnology，a Comprehensive DeskReference(VCH Publishers，Inc.出版，1995)；Ausubel等人(1987)Protocols in Molecular Biology，Green Publishing；Sambrook和Russell.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd.edition。 

为了促进理解本公开文本，特提供下列定义： 

“改变”靶基因在植物细胞中的表达，意思是应用本发明的方法后，靶基因在植物细胞中的表达水平不同于其在应用该方法前的表达水平。改变基因表达优选意味着靶基因在植物中的表达降低了，优选大大降低了，更优选该基因的表达检测不到。必需基因的表达改变，可以导致在植物细胞中或从其起源的植物的敲除突变表型。或者，改变表达可包括植物基因的表达上调。 

“反义RNA”是与靶基因mRNA具有互补序列的RNA链，并据认为通过与靶基因mRNA结合诱导RNAi。“有义RNA”具有与反义RNA互补的序列，并退火至其互补的反义RNA上形成siRNA。这些反义和有义RNA通常用RNA合成仪合成。在本发明中，这些DNA是用siRNA表达体系，从分别编码反义和有义RNA的DNA(反义和有义编码DNA)细胞内表达的。 

术语“生物样品”指来自任何动物的身体样品，如哺乳动物，举例，人。生物样品可以得自例如血管病、糖尿病或癌症患者。生物样品可以是生物体液如血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊膜液、乳汁、全血、尿液、脑脊液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液和组织培养介质，以及组织提取物如组织匀浆、细胞提取物，或全细胞或组织。生物样品可以是，例如，血清、血浆或尿。 

用在本文中，“缓冲物”指缓冲溶液，通过其酸-碱共轭组分的作用对抗pH的改变。 

当提到表达时，“控制序列”是指在特定宿主有机体中，表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合原核生物的控制序列，例如，包括启动子、任选操纵子序列、核糖体结合位点等。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸信号和增强子。 

术语“细胞”指能复制或分裂的膜包围生物学单位。 

术语“构建体”指包含本发明的一或多种多核苷酸序列的重组基因分子。 

用于在宿主生物体中转基因表达的基因构建体，以5′-3′方向包括：启动子序列；编码本文公开的抑制性核酸的序列；和终止序列。开放阅读框可以按照有义或反义的方向。构建体还可以包括可选择的标记基因和其它用于表达的调节元件。 

如本文所用，术语“控制元件”或“调节元件”这里可互换使用，意思是位于启动子序列内部或与其邻接，从而影响启动子活性的序列。控制元件可以是正和负控制元件。正控制元件需要结合调节元件，启动转录。已知有很多这种正和负控制元件。如本文所述，在异源性控 制元件加入到启动子，改变启动子活性的情况下，它们位于启动子序列内部或与其邻接，从而有助于启动子调节的表达可操作地连接的多核苷酸序列的活性。 

术语“异源性”指元件出现在它们通常不会出现的情况下。例如，启动子可以与异源性核酸序列连接，比如一个通常不与启动子可操作地连接的序列。当用于本文描述启动子元件时，异源性指启动子元件与通常在天然启动子中发现的不同，可以是序列、种类，或者是数量不同。例如，启动子序列中的异源性控制元件，可以是加入的不同启动子的控制/调节元件以增强启动子的控制，或者是相同启动子的附加控制元件。 

如本文所用，术语“同源性”分类为“直向同源(orthologues)”和“平行同源(paralogues)”。 

术语“宿主植物”指易患线虫病的植物。 

本文所用的短语“诱导表达”意思是通过将含有特定基因的细胞暴露在效应剂或诱导剂或相应条件下，增加特定基因的转录和/或翻译的量或速率。 

“诱导剂”是化学或物理试剂，当用于细胞群落时，将增加特定基因的转录量。它们通常是小分子，其作用对于具体的操纵子或基因群是特异性的，它们可以包括糖类、磷酸盐、醇、金属离子、激素、热、冷等。例如，异丙基(β)-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)和乳糖是tadI启动子的诱导剂，L-阿拉伯糖是阿拉伯糖启动子的适用诱导剂。 

术语“分离的”，用于描述本文公开的各种组合物时，是指物质已从其天然环境的成分中被鉴别和分离和/或回收。例如，分离的多肽或多核苷酸不再与至少一种其天然结合的成分相结合。其天然环境的 污染成分是通常干扰多肽或多核苷酸的诊断或治疗用途的物质，可包括酶和其它蛋白质的或非蛋白质的溶质。分离的物质包括重组细胞内的原位物质。但是，通常，分离的物质将通过至少一个提纯步骤而制备。 

“分离的”核酸分子或多核苷酸是已鉴定的与至少一种污染的核酸分子分离的核酸分子，所述污染核酸分子在天然来源中通常与其结合。分离的核酸可以是，例如，不与其天然结合的所有成分相结合。分离的核酸分子在形式或装配上与天然发现的不同。 

″IPTG″是化合物“异丙基(β)-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”，这里用作乳糖操纵子的诱导剂。IPTG与lac阻遏蛋白结合，在lac操纵子种产生构象变化，导致lac阻遏蛋白从乳糖操纵子上解离。由于不结合lac阻遏蛋白，可操作地连接的启动子被激活，下游基因被转录。 

术语“乳糖操纵子”指能被lac阻遏蛋白lad结合的核酸序列，如Jacob等，1961，J.MoI.Biol.，3：318-356所描述。当lac阻遏蛋白与乳糖操纵子结合时，启动子不激活。当lac阻遏蛋白被诱导从操纵子上解离时，启动子激活。 

术语“前导序列”指位于所关注的编码序列上游的核酸序列。本文描述的前导序列含有已知用于有效结合到核糖体上的特定序列，从而对某些多核苷酸提供了更高的启动翻译的效率。 

本文所用的术语“哺乳动物”指任何归类为哺乳动物的动物，包括人、家养和牧养动物，和动物园、运动场的动物或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。哺乳动物可以是，举例，人。 

术语“线虫食道腺或线虫食道腺细胞”指位于线虫的食道的三种大型的转录活性腺细胞，一种为背部的，两种为侧腹部的，是与植物 被植物寄生线虫感染和寄生有关的主要的分泌(寄生蛋白)来源，所述植物寄生线虫为垫刃目(Tylenchida)和滑刃目(Aphelenchida)。 

核酸序列或多核苷酸当其与其他核酸序列有功能联系时，是“可操作地连接”。例如，前序列或分泌性前导序列的DNA如果被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；启动子或增强子如果影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者核糖体结合位点如果其位置能使得促进翻译，则与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意思是被连接的DNA序列是邻近的，并且在分泌性前导序列的情况下，是邻近的和在阅读框中的。连接可以通过在便利的限制性位点进行连接来实现。如果这样的位点不存在，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸适配子(adaptor)或接头(linker)。 

术语“直向同源(orthologues)”指相同基因在多个物种中独立出现。独立出现的基因具有虽然相似但不一致的氨基酸序列，序列相似性的程度部分取决于物种从具有相同基因的共同祖先进化的距离。 

本文所用的术语“平行同源(paralogues)”指基因在同一物种中独立出现。独立出现的基因具有虽然相似但不一致的氨基酸序列，序列相似性的程度部分取决于产生独立出现的基因的基因复制事件的进化距离。 

术语“寄生蛋白，寄生多肽，食道多肽，或线虫食道腺细胞分泌多肽”指与植物的线虫寄生有关的主要分子；在植物寄生的线虫食道腺细胞表达、并通过其口针注射到宿主组织中介导植物寄生的寄生基因的产物。 

“核酸序列一致性百分比(％)”定义为，在比对序列并在必要时引入缺口以达到最大的序列一致性百分率后，候选核酸序列的核苷酸与参比核酸序列的核苷酸相一致的百分率。为判定核酸序列一致性 的百分比的目的而进行的比对，可以用本领域技术范围内的各种途径完成，例如，用可公开获得的计算机软件如BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。测定序列比对的适用参数，包括为了实现与待比较序列的最大限度全长比对所需的任何算法，可通过已知方法测定。 

为本文的目的，给定的核酸序列C与给定的核酸序列D相一致或相对的核酸序列一致性％(或者也可表达为给定的核酸序列C与给定的核酸序列D具有或包含一致或相对的一定的核酸序列一致性％)，计算如下： 

100乘以W/Z的分数 

其中W是通过序列比对程序在C和D的程序比对中被评价为相同匹配的核苷酸数量，其中Z是D中核苷酸的总数。应当了解核酸序列C的长度并不等于核酸序列D的长度，C与D的核酸序列一致性％并不等于D与C的核酸序列一致性％。 

术语“植物”用的是其最宽的含义。它包括但不仅限于，任何种类木本的、观赏或装饰性的、农作物或谷物、水果或蔬菜植物、和光合绿藻(如莱因衣藻[Chlamydomonas reinhardtii])。它也指主要分化为存在于植物发育任何阶段的结构的多个植物细胞。所述结构包括但不仅限于，水果、芽、茎、叶、花瓣等。术语“植物组织”包括分化和未分化的植物组织，包括存在于根、芽、叶、花粉、种子和根瘤，以及培养细胞(如单细胞、原生质体、胚、愈伤组织等)中的植物组织。植物组织可以是在植物(planta)中，在器官培养、组织培养或细胞培养中。术语“植物部分”用在本文中指植物结构、植物器官、或植物组织。 

非天然存在的植物指没有人类干预不会自然出现的植物。非天然存在的植物包括转基因植物和以非转基因方法如植物育种产生的植物。 

术语“植物细胞”指植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养细胞的形式，或者作为更高组织单位的一部分，如举例，植物组织、植物器官或整株植物。 

术语“植物细胞培养”指植物单位的培养，如举例原生质体，细胞培养的细胞，植物组织、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和各个发育阶段的胚的细胞。 

术语“植物材料”指叶、茎、根、花或花的各部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其它部分或产物。 

“植物器官”指植物清楚可见的结构和分化部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。 

“植物组织”指构成结构和功能单位的植物细胞群。包括不管是植物中或是培养中的任何植物组织。该术语包括但不仅限于，整株植物、植物器官、植物种子、组织培养以及构成结构和/或功能单位的植物细胞的任何群。该术语结合或不结合以上列举或者其它被本定义包含的任何特定类型的植物组织的应用，并没有意欲排除任何其它类型的植物组织。 

“质粒”的命名是小写“p”前缀和/或跟着大写字母和/或数字。本文的起始质粒或者有市售，可以不受限制地公开得到，或者能从已有质粒依照发表的程序构建。另外，与所述质粒等同的质粒是本领域已知的，并且对普通技术人员而言是显见的。 

本文所用的“多肽”通常指具有超过大约十个氨基酸的肽和蛋白。多肽可以是“外源性的”，意味着它们是“异源性的”，即对于要用 的宿主细胞是外来的，如通过细菌细胞产生的人类多肽。 

“灵长类”释义为表示哺乳动物一个目的任何动物，包括人类、猿、猴、和相关形式，如狐猴(lemurs)和跗猴(tarsiers)。 

术语“启动子”指调节性核酸序列，通常位于基因或蛋白编码序列的上游(5’)，其与各种元件结合，负责调节基因或编码蛋白的序列的表达。适合用于本公开的构建体中的启动子，在所用的植物中和宿主中的功能是表达本发明的多核苷酸。很多植物启动子是公众所知的。其包括组成型启动子、诱导型启动子、组织-和细胞-特异的启动子、以及发育调节启动子。示例的启动子和融合启动子描述于例如美国专利6,717,034中，在此全文引入作为参考。 

“纯化”意思是通过从组合物中除去(完全或部分)至少一种污染物，提高组合物中物质的纯度。“纯化步骤”可以是产生“基本纯净”的组合物的整个提纯过程的一部分。以组合物的总重量计，基本纯净的组合物含有至少约90重量％的所关注的物质，并能含有至少约95重量％。 

术语“调节元件”或“控制元件”指控制转录启动的DNA序列。控制或调节元件的实例包括但不限于，TATA盒、操纵子、增强子等。控制或调节元件包括负控制元件和正控制元件。负控制元件是为了激活要除去的。已知有很多这类负控制元件，例如操纵子/阻遏蛋白体系。例如，将IPTG与lac阻遏蛋白结合，从lac操纵子上解离，激活并许可转录。其它负控制元件包括大肠杆菌(E.coli)trp和λ系统。正控制元件是为了激活要添加的。已知有很多这类正控制元件。 

天然含有正负调节元件二者的启动子很罕见。metE启动子是一个例子。参见例如，Neidhardt，Ed.，1996，Escherishia coli and Salmonella，第二版，p1300-1309。已知的正和负控制元件的描述可以在，举例，该参考文献中找到。正和负控制元件在启动子内部或邻近启动子的位置安排以达到对启动子增加的调节是已知的，这记述在例如Escherishiacoli and Salmonella(Supra)，p1232-1245中。 

小RNA分子通常是长度少于200个核苷酸的单链或双链RNA分子。这样的分子通常少于100个核苷酸，并且长度通常在10-100个核苷酸内变化。在优选的形式中，小RNA分子具有11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个核苷酸。小RNA包括微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNAs)。miRNA是由Dicer-like酶裂解短的茎环状前体而生成；而siRNA是通过裂解长的双链RNA分子而产生。miRNA是单链，而siRNA是双链。 

术语″siRNA″意思是小干扰RNA，其是无毒性、长度短的双链RNA。一般而言，只要它没有表现出毒性，对siRNA的长度没有具体限制。″siRNAs″长度可以是15至49bp，优选15至35bp，更优选21至30bp。或者，要表达的siRNA的终转录产物的双链RNA部分可以是，例如，长度为15至49bp，优选15至35bp，更优选21至30bp。siRNA的双链RNA部分，其中两条RNA链的配对并不限于完全配对的链，可以含有由于错配(相应的核苷酸不互补)、膨出(在一条链上缺少相应的互补核苷酸)等而没有配对的部分。可以含有不配对部分至它们不干扰siRNA形成的程度。本文用的“膨出”优选包含1-2个不配对核苷酸，并且siRNA中两条RNA链配对的双链RNA区优选含有1-7个膨出，更优选1-5个。另外，这里用的“错配”包含在siRNA中两条RNA链配对的双链RNA区，优选数目有1-7个，更优选1-5个。在优选的错配中，核苷酸之一为鸟嘌呤，另一个是尿嘧啶。这种错配是由于编码有义RNA的DNA中，C至T、G至A或其混合的突变，但并不特别限于这些。另外，在本发明中，siRNA中两条RNA链配对的双链RNA区，可以含有膨出和错配二者，其总数优选1-7，更优选1-5。 

只要siRNA由于它的RNAi作用而能沉默、减少或抑制靶基因表达，则siRNA的末端结构可以是平头或粘性(突出)的。粘性(突出)的末端结构不仅限于3’突出端，也可以包括5’突出结构，只要其能诱导RNAi作用。另外，突出的核苷酸的数量不限于已经报道的2或3个，只要该突出端能诱导RNAi作用，可以是任何数目。例如，突出端由1-8个，优选2-4个核苷酸组成。在此，有粘性末端结构的siRNA的总长度表示为，配对双链部分和两端含有的一对突出单链的长度总和。例如，在有19bp双链RNA部分并在两段带有4个核苷酸突出端的情况下，总长度表示为23bp。另外，由于该突出序列对靶基因的特异性低，它并不必然与靶基因互补(反义)或相同(有义)。还有，只要siRNA能对靶基因保持其基因沉默作用，siRNA可以在，例如其一端的突出部分，含有低分子量RNA(可以是天然RNA分子如tRNA、rRNA或病毒RNA，或者人工RNA分子)。 

另外，″siRNA″的末端结构并不必然如上所述在两端是截断结构，而是可以有茎-环结构，其中双链RNA一侧的两端通过接头RNA而连接。双链RNA区(茎-环部分)的长度可以是，例如，15-49bp，优选15-35bp，更优选21-30bp长。或者，作为要表达的siRNA终转录产物的双链RNA区长度为，例如15-49bp，优选15-35bp，更优选21-30bp长。此外，对接头的长度没有具体限制，只要其长度不妨碍茎部分的配对。例如，为了茎部分的稳定配对和抑制编码该部分的DNA之间的重组，连接部分可以具有三叶草tRNA结构。即使该接头的长度妨碍了茎部分的配对，但也可能，例如，构建该接头部分包括内含子，使内含子在前体RNA加工为成熟RNA期间被切除，从而使茎部分配对。在茎-环siRNA的情况下，没有环结构的RNA的任一端(头或尾)可以具有低分子量RNA。如上所述，该低分子量RNA可以是天然RNA分子如tRNA、rRNA或病毒RNA，或者人工RNA分子)。 

“信号肽”指引导蛋白翻译后转运的短(15-60个氨基酸长度)肽链；通常引导该肽进入细胞的分泌途径。 

“转化的”、“转基因的”、“转染的”和“重组的”指宿主生物体如细菌或植物，其中引入了异源核酸分子。核酸分子可以稳定整合在宿主的基因组中，或者核酸分子也能作为染色体外的分子存在。这样的染色体外分子可以自我复制。应理解转化的细胞、组织或植物不仅包括了转化过程的最后产物，也包括了其转基因的后代。“非转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主指野生型生物体，如细菌或植物，其不含有异源核酸分子。 

“转化细胞”指通过例如分子生物技术，在细胞内引入了核酸分子的细胞。用在这里，术语转化包括了可能将核酸分子引入所述细胞，植物或动物细胞的所有技术，包括用病毒载体转染、用农杆菌(Agrobacterium)转化、用质粒载体、用电穿孔引入裸DNA、脂质转染、和粒子枪轰击，并包括瞬时的以及稳定的转化体。 

术语“转基因植物”指含有通常不会在这种类型的植物或树木中发现的重组基因材料，并通过人类的操作将其引入所述植物(或植物的亲本)中的植物或树木。因此，从通过转化导入了重组DNA的植物细胞生长而成的植物，是转基因植物，还有含有该引入的转基因(不管是有性产生或是无性产生)的该植物所有后代。应当理解术语转基因植物包括整株植物或树木以及植物或树木的部分，例如谷粒、种子、花、叶、根、果实、花粉、茎等。 

术语“翻译起始增强子序列”，用在这里，指能确定基因的翻译起始部位和效率的核酸序列(参见，例如，McCarthy等，1990，Trends inGenetics，6：78-85)。翻译起始增强子序列可延伸包括结合到相对于核糖体结合位点5’和3’方向的序列。核糖体结合位点定义为至少包括Shine-Dalgarno区和起始密码子，以及之间的任何碱基。另外，翻译起始增强子序列可以包括未翻译的前导序列和上游顺反子的末端，并进而含有翻译终止密码子。参见，例如，美国专利5,840,523。 

术语“载体”指用于把多核苷酸序列导入宿主细胞，从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。“载体”除了上述基因构建体之外，还可以包括遗传材料，例如，使其在一种或多种宿主细胞中复制的一种或多种核酸序列如复制起点、可选择的标记基因和其它本领域已知的遗传元件(如，将遗传材料整合在宿主细胞基因组中的序列，等)。 

2.具体实施方式

抗线虫的转基因植物 

已经发现，通过下调一种或多种线虫寄生基因来打断线虫的进食周期，是减少、预防或治疗植物线虫病的有效方法。线虫寄生基因指在食道腺细胞表达、编码从腺细胞运送并要通过线虫口针释入宿主组织的分泌蛋白的基因。特别是已经发现，干扰线虫分泌的与宿主植物中专门的取食细胞的形成有关的蛋白的表达，是减少、处理或治疗植物线虫病的有效方法。能够作为目标的(例如带有抑制性RNA)、编码分泌蛋白的代表性寄生基因包括，包括但不限于表2中列举的基因，或其片段。 

线虫病导致有价值的农作物的重大损失。根结线虫，根结线虫(Meloidogyne)种类，是在自然界最成功的寄生虫之一。它们寄生于各科植物的超过2000种植物，并代表着对世界范围内农作物产量的巨大威胁。这些活体营养病原体已经发展出了与其宿主高度相关的专门化的和复杂的取食关系。成功的线虫-宿主相互作用需要来自寄生虫的分子信号，以直接或间接修改植物根细胞成为精制的取食细胞，称为巨大细胞，这是线虫发育和繁殖所需营养的唯一来源。植物-寄生线虫在取食时通过能伸出的中空口针释放蛋白样的分泌物进入植物细胞。这些分泌物，共称为寄生虫质(parasitome)，由在大的、转录活性食道腺细胞表达的寄生基因编码(Davis，E.L.，R.Allen，和R.S.Hussey.1994.Developmental expression of esophageal gland antigens and theirdetection in stylet secretions of Meloidogyne incognita.Fundam.Appl. Nematol.17：255-262.；Hussey，R.S.，E.L.Davis，和T.J.Baum.2002.Secrets in secretions：genes that control nematode parasitism of plants.Braz.J.Plant Physiol.14：183-194.)。根结线虫类诱发以形成巨细胞的复杂的细胞修改，是宿主根细胞基因表达改变以及被通过线虫口针分泌的分子信号所引发的表现型改变的结果。 

一种实施方案提供了包含一种或多种抑制性RNA的植物或细胞，所述RNA对一种或多种线虫寄生基因的一种或多种mRNA特异。例如，本公开提供了表达一种或多种抑制性RNA的转基因植物，所述RNA在一种或多种抑制性RNA被线虫吸收或摄取时，下调线虫寄生基因的表达。转基因植物可以设计为表达抑制性RNA，所述RNA至少在两种不同的线虫种类中，例如，两种不同的RKN种类中，下调靶寄生基因的转录。另一种实施方案提供了含有抑制性RNA的转基因植物，所述RNA在3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多的线虫种类中，例如RKN种类中，下调靶寄生基因的转录。因此，本公开提供了对抗多种RKN种类导致的疾病的转基因植物。 

另一种实施方案，提供了含有抑制性RNA的转基因植物，所述RNA对于一种或多种线虫寄生基因特异，其含量能有效提供植物对抗所有的RKN种类的抗性，例如在Jepson，S.B.1987.Identification ofroot-knot nematodes(Meloidogyne species).C.A.B.International，Oxford，United Kingdom.p1-265中提到的RKN种类，在许可的情况下，全文引入作为参考。 

另一种实施方案提供了含有或表达一种或多种抑制性核酸的转基因植物或转基因细胞，所述核酸对于至少一部分编码寄生线虫的一种或多种分泌性多肽的核酸是特异的。抑制性核酸通常是抑制性小RNA或微小RNA，其对编码线虫食道腺细胞蛋白或多肽的mRNA特异。本领域技术人员应该体会，抑制性核酸可以是RNA、DNA或其组合。抑制性核酸可以是单链或多链，并可以是反义的或酶的。在一种实施方 案中，抑制性核酸干扰、抑制或减少靶mRNA的翻译。例如，抑制性核酸可以与靶mRNA结合，诱导或促进靶mRNA的降解或物理性阻止细胞翻译机器将靶mRNA翻译成功能蛋白。对分泌性多肽的抑制可以与对照比较，例如，不含或不表达抑制性核酸的植物或细胞。“对照”指材料的样品，已知其与含有本公开的抑制性核酸的样品在各方面都相同，只除了对照样品不含有或不表达抑制性核酸。 

术语“食道腺细胞蛋白或多肽”指由线虫寄生基因编码的分泌性多肽。在一种实施方案中，要被下调的食道腺细胞蛋白或多肽通常是调节至少一种宿主植物基因表达的分泌蛋白。在公开的组合物和方法中被下调的示例性线虫多肽，包括但不限于由SEQ ID NOs 1、2或5-51或者其片段编码的多肽或其片段。分泌性多肽可以直接或间接增加或减少宿主基因的表达。例如，当食道腺细胞蛋白或多肽结合到宿主植物核酸(包括基因组DNA，RNA和mRNA)上时，可发生直接调节。例如，当多肽与一种或多种其它蛋白或因子结合，形成复合体时，可以发生间接调节。然后，该复合体可以与宿主植物核酸结合，或者促进或者抑制转录或翻译。分泌蛋白的下调缓解或减少了至少一种与线虫病有关的症状。线虫病的示例性症状包括但不限于，产生虫瘿、巨细胞、枯斑(lesion)、矮小(stunting)、养分和水分缺乏、梢枯(dieback)、以及植物感染的线虫数量。转基因植物或细胞中，线虫病水平的减少或抑制可以与对照植物或细胞中线虫病的水平相比较。在一种实施方案中，抑制性核酸减少、抑制、减轻、治疗或预防了线虫病。 

在另一种实施方案中，待下调的食道腺细胞蛋白或多肽由与巨细胞形成有关的寄生基因所编码。在另外的实施方案中，靶寄生基因编码涉及线虫通过根组织迁移的的多肽或核酸，改变细胞代谢、在受体细胞中引起信号转导、或形成能使线虫从巨细胞取食的取食管。另外，食道腺细胞蛋白或多肽能导致细胞壁改变，并可能在细胞外空间与信号转导受体相互作用，影响细胞代谢、细胞周期、选择性蛋白降解、局部防御反应以及在植物细胞核内部调节活性。 

食道腺细胞蛋白或多肽调节的植物基因实例，包括但不限于与已知称为巨细胞的线虫专门取食细胞的形成有关的基因。例如，线虫寄生基因16D 10编码与稻草人样(scarecrowlike)转录调节子结合的蛋白。能被线虫食道腺细胞多肽调节的代表性植物基因，包括但不限于WUN1，POX，CAT，GST，Mia-1，Mia-2，Mia-3，Mia-4，CHS1-CHS3，LOX，几丁质酶，胰蛋白酶抑制剂，甜味诱发蛋白(Miraculin)，HMGR，TSW12，LEAU，LEMMI9，C6-19，C27-45，TASU，UBC DB#103，RPE，ISDGh，IPPP，LPPL，mUCp，内膜蛋白，20s蛋白酶体，DAP脱羧酶，GRP，ENOD40，ATA01或其组合(Gheysen，G.and Fenoll，C.2002.Annual Review of Phytopathology 40：191，许可的情况下，全文引入作为参考)。通常，植物基因直接或间接涉及根细胞生长、根细胞分裂或被寄生线虫摄取的特定营养物的产生。基因可以在根细胞或植物的任何其它细胞中表达。 

一种实施方案中，当抑制性核酸递送到线虫中时，与对照比较，线虫的靶分泌蛋白的表达被减少、受抑或阻断。递送抑制性核酸可以，举例，由于线虫食用转基因植物或细胞而使线虫与抑制性核酸接触的时候完成。线虫可以在取食期间摄取抑制性核酸，或者核酸可以通过主动运输或被动扩散跨越线虫的细胞膜而运输。应该理解，抑制性核酸可以与诱导或促进线虫摄取抑制性核酸的药剂组合或交替递送。诱导剂的实例包括但不限于间苯二酚(3-羟基苯酚)。 

在一种实施方案中，转基因植物或转基因细胞表达抑制性核酸的量足以在抑制性核酸递送到线虫中时，在线虫中调节线虫食道腺细胞多肽或蛋白的表达。抑制性核酸在转基因植物或细胞中的表达水平，可以用本领域已知的方法控制，例如用带有强启动子或组成型活性启动子、高拷贝数载体等。植物或细胞可以是被稳定或瞬时转染。 

寄生线虫的实例包括但不限于，根结线虫(Meloidogyne spp.)类 的成员，也称作根结线虫(root-knot nematode)。代表性的种包括但不限于花生根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、北方根结线虫、马铃薯根结线虫和禾谷类根结线虫(M.naasi)。 

代表性的宿主植物的系统科包括爵床科(Acanthaceae)，槭树科(Aceraceae)，猕猴桃科(Actinidiaceae)，龙舌兰科(Agavaceae)，番杏科(Aizoaceae)，苋科(Amaranthaceae)，番荔枝科(Annonaceae)，伞形科(Apiaceae)，夹竹桃科(Apocynaceae)，天南星科(Araceae)，五加科(Araliaceae)，棕榈科(Arecaceae)，马兜铃科(Aristolochiaceae)，凤仙花科(Balsaminaceae)，金刀木科(Barringtoniaceae)，落葵科(Basellaceae)，小檗科(Berberidaceae)，桦木科(Betulaceae)，紫葳科(Bignoniaceae)，红木科(Bixaceae)，木棉科(Bombacaceae)，紫草科(Boraginaceae)，黄杨科(Buxaceae)，刺果藤科(Byttneriaceae)，仙人掌科(Cactaceae)，云实科(Caesalpiniaceae)，美人蕉科(Cannaceae)，山柑科(Capparaceae)，忍冬科(Caprifoliaceae)，番木瓜科(Caricaceae)，石竹科(Caryophyllaceae)，木麻黄科(Casuarinaceae)，木麻黄科(Casuarinaceae)，卫予科(Celastraceae)，藜科(Chenopodiaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，金粟兰科(Chloranthaceae)，鸭跖草科(Commelinaceae)，旋花科(Convolvulaceae)，山茱萸科(Cornaceae)，榛木科(Corylaceae)，景天科(Crassulaceae)，葫芦科(Cucurbitaceae)，柏科(Cupressaceae)，桫椤科(Cyatheaceae)，莎草科(Cyperaceae)，四数木科(Datiscaceae)，五桠果科(Dilleniaceae)，薯蓣科(Dioscoreaceae)，川续断科(Dipsacaceae)，柿科(Ebenaceae)，杜鹃花科(Ericaceae)，大戟科(Euphorbiaceae)，蝶形花科(Fabaceae)，大风子科(Flacourtiaceae)，荷包牡丹科(Fumariaceae)，龙胆科(Gentianaceae)，牻牛儿苗科(Geraniaceae)，苦苣苔科(Gesneriaceae)，银杏科(Ginkgoaceae)，草海桐科(Goodeniaceae)，藤黄科(Guttiferae)，血皮草科(Haemodoraceae)，金缕梅科(Hamamelidaceae)，蝎尾蕉科(Heliconiaceae)，田基麻科(Hydrophyllaceae)，金丝桃科(Hypericaceae)，鸢尾科(Iridaceae)，胡桃科(Juglandaceae)，灯心草科(Juncaceae)，唇形科(Labiatae)，唇形科(Lamiaceae)，樟科(Lauraceae)，百合科(Liliaceae)，亚麻科(Linaceae)，半边莲科(Lobeliaceae)，马钱科(Loganiaceae)，千屈菜科(Lythraceae)，木兰科(Magnoliaceae)，金虎尾科(Malpighiaceae)，锦葵科(Malvaceae)，竹芋科(Marantaceae)，野牡丹科(Melastomataceae)，楝科(Meliaceae)，防己科(Menispermaceae)，含羞草科(Mimosaceae)，桑科(Moraceae)，芭蕉科(Musaceae)，苦槛蓝科(Myoporaceae)，杨梅科(Myricaceae)，肉豆蔻科(Myristicaceae)，桃金娘科(Myrtaceae)，紫茉莉科(Nyctaginaceae)，木犀科(Oleaceae)，柳叶菜科(Onagraceae)，兰科(Orchidaceae)，Othnaceae，酢浆草科(Oxalidaceae)，芍药科(Paeoniaceae)，露兜树科(Pandanaceae)，罂粟科(Papaveraceae)，胡麻科(Pedaliaceae)，商陆科(Phytolaccaceae)，松科(Pinaceae)，胡椒科(Piperaceae)，海桐花科(Pittosporaceae)，车前科(Plantaginaceae)，悬铃木科(Platanaceae)，白花丹科(Plumbaginaceae)，禾本科(Poaceae)，川薹草科(Podostemaceae)，花荵科(Polemoniaceae)，远志科(Polygalaceae)，马齿苋科(Portulacaceae)，报春花科(Primulaceae)，山龙眼科(Proteaceae)，石榴科(Punicaceae)，毛茛科(Ranunculaceae)，木犀草科(Resedaceae)，鼠李科(Rhamnaceae)，蔷薇科(Rosaceae)，茜草科(Rubiaceae)，芸香科(Rutaceae)，杨柳科(Salicaceae)，檀香科(Santalaceae)，无患子科(Sapindaceae)，瓶子草科(Sarraceniaceae)，虎耳草科(Saxifragaceae)，玄参科(Scrophulariaceae)，菝葜科(Smilacaceae)，茄科(Solanaceae)，梧桐科(Sterculiaceae)，安息香科(Styracaceae)，柽柳科(Tamaricaceae)，杉科(Taxodiaceae)，坚果番杏科(Tetragoniaceae)，山茶科(Theaceae)，假轮叶科(Theophrastaceae)，瑞香科(Thymelaeaceae)，椴树科(Tiliaceae)，旱金莲科(Tropaeolaceae)，时钟花科(Turneraceae)，香蒲科(Typhaceae)，榆科(Ulmaceae)，荨麻科(Urticaceae)，败酱科(Valerianaceae)，马鞭草科(Verbenaceae)，堇菜科(Violaceae)，葡萄科(Vitaceae)，泽米苏铁科(Zamiaceae)，姜科(Zingiberaceae)，或蒺藜科(Zygophyllaceae)。 

根据本公开能被抑制性核酸转染的宿主植物的通用名，包括但不限于番茄、茄子、土豆、甜瓜、黄瓜、胡萝卜、莴苣、朝鲜蓟、芹菜、葫芦(甜瓜、西瓜等)、大麦、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆类、紫花苜蓿、烟草、柑桔、苜蓿、胡椒、葡萄、咖啡、橄榄或茶。 

本领域技术人员应当理解，本公开包括五十种或更多种已知的根结线虫的任何种类。 

另一种实施方案提供了具有抑制性核酸的组合物，所述核酸对于编码由一种或多种SEQ ID NOs.1、2或5-51或其片段或同源物的多肽的mRNA或其片段有特异性，当递送到线虫时，例如当线虫以表达或含有抑制性核酸的植物或细胞为食时，核酸的量足以抑制由一种或多种SEQ ID NOs.1、2或5-51编码的多肽或其同源片段。组合物可以含有一种或多种杀线虫剂、杀虫剂、杀真菌剂或其组合。代表性的杀线虫剂包括但不限于三氯硝基甲烷、溴代甲烷、1，3-二氯丙烯、甲基二硫代氨基甲酸钠、四硫代碳酸钠；以及氨基甲酸盐如2-甲基-2-(甲基硫代)丙醛O-甲基氨基甲酰基肟(aldicarb)、2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃酚(benzofuranol)甲基氨基甲酸盐(carbofuran)、甲基2-(二甲基氨基)-N-[[(甲基氨基)羰基]氧基]-2-氧代硫代乙烷亚胺(oxamyl)、2-甲基-2-(甲基磺酰基)丙醛O-[(甲基氨基)羰基]肟(aldoxycarb)、0，0-二乙基O-[4-(甲基亚硫酰基)苯基]硫代磷酸酯(fensulfothion)、O-乙基S.S-二丙基二硫代磷酸酯(ethoprop)、和乙基-3-甲基-4-(甲基硫代)苯基(1-甲基乙基)氨基磷酸酯(phenamiphos)。 

另一种实施方案提供了含有编码对mRNA或其片段特异性的抑制性核酸的核酸的细胞，所述核酸，其中mRNA编码的食道腺细胞蛋白或多肽能够直接或间接调节：根细胞基因表达、线虫通过根组织的迁移、细胞代谢、信号转导，或者与线虫从巨细胞取食的取食管的形成有关，或者至少一种与巨细胞形成有关的植物基因。另外，食管腺细胞蛋白或多肽或食道多肽能导致细胞壁改变，并与信号转导受体在细胞外间隙中可能相互作用，影响细胞代谢、细胞周期、选择性蛋白降解、局部防御反应以及调节植物细胞核内部活性。该细胞可以是原 核或真核细胞，并且通常是植物细胞，尤其是根细胞。 

另一种实施方案提供了为植物提供线虫抗性的方法，是将植物与对于一种或多种线虫食道腺细胞蛋白特异的一种或多种抑制性核酸接触，所述核酸的量足以减少线虫病，其中一种或多种食道腺细胞蛋白调节：植物或细胞的基因表达、巨细胞的形成、线虫通过植物根组织的迁移、植物的细胞代谢、在植物细胞内引发信号转导、或形成能使线虫从植物中形成的巨细胞取食的取食管。一个方面提供了对线虫尤其是根结线虫分泌的食道腺细胞蛋白特异的抑制性核酸。抑制性核酸可以喷洒到植物上或以其它方式递送到植物，使得抑制性核酸能与寄生线虫接触。 

另一个实施方案提供了含有抑制性核酸例如siRNA或微小RNA的转基因植物或植物细胞，当所述抑制性核酸递送到取食植物或植物细胞的线虫中时，其下调根结线虫的食道腺细胞蛋白。RNA干涉是本领域已知的。参见例如，Kreutzer等的国际PCT公开WO 00/44895；Zernicka-Goetz等的国际PCT公开WO 01/36646；Fire的国际PCT公开WO 99/32619；Plaetinck等的国际PCT公开WO 00/01846；Mello和Fire的国际PCT公开WO 01/29058；Deschamps-Depaillette的国际PCT公开WO 99/07409；Li等的国际PCT公开WO 00/44914；和Trick等的US20040098761。 

在一种实施方案中，线虫不是大豆胞囊线虫。 

另一种实施方案中，抑制性核酸并不直接致死胚胎或成年线虫，或者并不与线虫繁殖能力有关，反而是抑制线虫从转基因植物或植物细胞取食或获取养分的能力。 

在一些实施方案中，抑制性双链RNA(dsRNA)来自“外源模板”。这样的模板可以是植物或线虫核苷酸序列的全部或部分，它可以是 DNA基因序列，或者是从寄生线虫中分离的mRNA通过例如逆转录酶产生的cDNA。当该模板是DNA基因序列的全部或部分时，优选其来自基因的一个或多个或所有的外显子。当dsRNA来自内源性或外源性模板时，对于可以合成其的方式没有限制。例如，siRNA可以化学合成，通过体外转录产生；用RNase III家族的酶(如Dicer，RNase III)消化长链dsRNA产生；从siRNA表达质粒或病毒载体在细胞内表达；或者从PCR衍生的siRNA表达盒在细胞内表达。 

然后，体外制备的SiRNA通过转染、电穿孔或其它方法，被直接导入细胞。或者，可以转染在细胞内表达siRNA的基于DNA的载体和盒。RNAi可以用手工和/或自动程序，在体外或体内合成。体外合成可以是化学或酶法，例如采用克隆的RNA聚合酶(如T3，T7，SP6)，用于转录内源性DNA(cDNA)模板、或二者的混合物。 

在体内，dsRNA可以用本领域公知的重组技术合成(例见，Sambrook，等，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Third Edition(2001))。例如，细菌细胞可以用表达载体转化，所述载体包含dsRNA将从其衍生的DNA模板。或者，可以用表达载体或其它方式转化需要抑制基因的表达的细胞，例如植物细胞。模板的一个或多个拷贝的双向转录，可以通过该表达载体或不同的表达载体编码的转化的细胞的内源性RNA聚合酶，或者克隆的RNA聚合酶(T3，T7，SP6)来编码。表达构建体的使用和生产是本领域已知的(参见WO98/32016；美国专利5,593,874，5,698,425，5712,135，5,789,214和5,804,693)。基因表达的抑制可以通过以下来靶定：器官、组织或细胞类型中的特定转录；环境条件(如温度，化学品)；和/或在发育阶段或年龄的工程化的转录，特别是例如dsRNA在植物细胞体内合成时。dsRNA还可以用已知的基因递送系统递送到特定组织或细胞类型中。这些系统的成分包括种子特异性凝集素启动子和来自APETALA3的花特异性的启动子。列举这些载体只是为了说明有很多市售的和公知的载体可为本领域技术人员所用。 

如果在细胞之外合成，RNA可以在导入细胞之前提纯。提纯可以是用溶剂(如苯酚/氯仿)或树脂提取、沉淀(例如在乙醇中)、电泳、色谱或其组合。但是，提纯可导致dsRNA的丢失，并因此可能完全不能进行或只能最低限度进行。RNA可干燥储存或溶解在水溶液中，水溶液可含有缓冲液或盐以促进退火和/或稳定RNA链。 

适用的dsRNA也能含有一个或多个修饰的碱基，或有修饰的主链，以增加稳定性或为了其它原因。例如，可以修饰天然RNA的磷酸二酯连接以包含至少一个氮或硫杂原子。此外，也能用含有稀有碱基如肌苷或修饰碱基如三苯甲基化碱基的dsRNA，只提这两例。应当理解，本领域技术人员已经了解，在RNA上已经进行了各种各样的修饰，用于多种目的。此处使用的术语dsRNA包括这种化学、酶或代谢修饰的dsRNA形式，前提是前从内源性模板衍生得到。 

双链结构可以通过自身互补的RNA单链或两条分开互补的RNA链形成。RNA双链体的形成可以在植物细胞之内或之外启动。 

dsRNA至少一条链的序列含有与靶mRNA的至少一部分互补的区，足以使dsRNA与靶mRNA特异性杂交。在一个实施方案中，siRNA与靶mRNA的至少一部分基本一致。“一致性”，如本领域所知，是两种或多种多核苷酸(或多肽)序列之间根据序列比较确定的关系。本领域中，一致性也意味着多核苷酸序列之间的序列关联度，通过所述序列的链间匹配确定。一致性可以很容易地计算出(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，N.J.，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.， M Stockton Press，New York，1991)。由于有很多测定两条核苷酸序列之间的一致性的方法，该术语已被技术人员所熟知(Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988).通常用于测定序列之间一致性的方法包括但不限于在Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988))中公开的那些。设计优选的测定一致性方法，在待测序列之间给予最大的匹配。测定一致性的方法在计算机程序中被编码。测定两条序列之间的计算机程序法包括但不限于，GCG程序包(Devereux，J.，等，NucleicAcids Research 12(1)：387(1984))，BLASTP，BLASTN，and FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215：403(1990))。本领域中执行该方法的另一个广为人知的软件包是CLUSTAL程序。它比较两条多核苷酸的序列，并通过在任一条适当的序列中通过插入间隔找出最佳比对。最佳比对的一致性也能用诸如BLASTx的软件包计算。该程序比对了相似序列的最大的一段，并对匹配度(fit)分配了适合的值。对于任何一种比较模式，都可以找到数个相似的区域，每个都有不同的分值。本领域技术人员应理解，长度不同的两条多核苷酸可以对较长的片段进行全长比较。或者可以比较小区域。通常比较同样长度的序列用于进行有用的比较。 

在一个实施方案中，抑制性核酸与至少一部分靶mRNA具有100％序列一致性。但是，也可用具有70％、80％或超过90％或95％序列一致性的抑制性核酸。从而可容许由于基因突变、株系多态性或进化趋异可以预期的序列变异。 

RNA双链体区域可以有能与靶基因基因转录体的一部分杂交的核酸序列(如400mM NaCI，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃下杂交12-16小时；随后清洗。) 

虽然dsRNA的最佳长度可根据靶基因和实验条件而变化，但RNA双链区可至少是19，20，21-23，25，50，100，200，300，400或更多碱基长度。 

靶基因是编码分泌蛋白的线虫基因，特别是调节下述作用的分泌蛋白：植物或细胞的基因表达，巨细胞形成，线虫通过植物根组织的迁移，植物的细胞代谢，引发植物细胞中的信号转导，或形成能让线虫从在植物中形成的巨细胞取食的取食管。一个方面提供了对线虫，特别是根结线虫分泌的食道腺细胞蛋白特异的核酸。通常，dsRNA或抑制性核酸与靶基因整体基本一致，即基因的编码部分。但是，dsRNA或抑制性核酸可以与靶基因的部分基本一致。该部分的大小取决于具体靶基因，并可由本领域技术人员通过改变dsRNA大小并观察是否抑制了基因的表达来测定。 

根生长增强的植物 

一个实施方案提供了含有或表达一种或多种核酸的转基因植物或转基因细胞，所述核酸编码寄生线虫的一种或多种线虫食道腺细胞多肽或其片段。较之非转基因植物或对照植物，一种或多种线虫食道腺细胞多肽或其片段在植物或植物细胞中的表达，促进、刺激或增强了转基因植物的根生长。根包括种子根、不定根、一级侧根、二级侧根等，饲养根，初生根，次生根，和粗根。 

用于公开的实施方案的线虫食道腺细胞多肽或其片段能增加根的大小、根的数量、根的表面积和根系的整体质量。能用本公开的组合物和方法产生的块根作物，比不用本公开的组合物和方法的块根作物要大。本公开的组合物和方法产生的其它作物能够抗旱、抗腐蚀(erosion)或增大的环境应力。环境应力包括诸如降雨量、温度和湿度的气候改变。 

线虫食道腺细胞多肽或其片段包括但不限于，由SEQ ID NOs 1、 2或5-51，其片段或其组合编码的多肽。线虫食道腺细胞多肽或其片段可直接或间接增进、刺激或加强根生长。例如，在线虫分泌性多肽与包括基因组DNA、RNA和mRNA的宿主植物核酸结合时，可发生直接调节。间接调节可发生在例如，多肽与一种或多种其它蛋白或因子结合形成复合物时。然后该复合物能与宿主植物核酸结合，或促进或抑制转录或翻译。 

在一个实施方案中，转基因植物或转基因细胞表达的线虫食道腺细胞多肽或其片段的量，是有效刺激、增强或促进根生长或发育的量。或者，线虫食道腺细胞多肽或其片段可以直接递送到植物。线虫食道腺细胞多肽或其片段在转基因植物或细胞中的表达水平可以用本领域已知的方法控制，例如用带有强启动子或组成型活性启动子的载体、高拷贝载体等。植物或细胞能被稳定或瞬时转染。 

线虫的实例包括但不限于，根结线虫(Meloidogyne spp.)类的成员，也称作根结线虫(root-knot nematode)。代表性的种类包括但不限于花生根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、北方根结线虫和禾谷类根结线虫。 

代表性的宿主植物的系统科包括爵床科，槭树科，猕猴桃科，龙舌兰科，番杏科，苋科，番荔枝科，伞形科，夹竹桃科，天南星科，五加科，棕榈科，马兜铃科，凤仙花科，金刀木科，落葵科，小檗科，桦木科，紫葳科，红木科，木棉科，紫草科，黄杨科，刺果藤科，仙人掌科，云实科，美人蕉科，山柑科，忍冬科，番木瓜科，石竹科，木麻黄科，木麻黄科，卫予科，藜科，藜科，金粟兰科，鸭跖草科，旋花科，山茱萸科，榛木科，景天科，葫芦科，柏科，桫椤科，莎草科，四数木科，五桠果科，薯蓣科，川续断科，柿科，杜鹃花科，大戟科，蝶形花科，大风子科，荷包牡丹科，龙胆科，牻牛儿苗科，苦苣苔科，银杏科，草海桐科，藤黄科，血皮草科，金缕梅科，蝎尾蕉科，田基麻科，金丝桃科，鸢尾科，胡桃科，灯心草科，唇形科(Labiatae)，唇形科(Lamiaceae)，樟科，百合科，亚麻科，半边莲科，马钱科，千屈菜科，木兰科，金虎尾科，锦葵科，竹芋科，野牡丹科，楝科，防己科，含羞草科，桑科，芭蕉科，苦槛蓝科，杨梅科，肉豆蔻科，桃金娘科，紫茉莉科，木犀科，柳叶菜科，兰科，Othnaceae，酢浆草科，芍药科，露兜树科，罂粟科，胡麻科，商陆科，松科，胡椒科，海桐花科，车前科，悬铃木科，白花丹科，禾本科，川薹草科，花荵科，远志科，马齿苋科，报春花科，山龙眼科，石榴科，毛茛科，木犀草科，鼠李科，蔷薇科，茜草科，芸香科，杨柳科，檀香科，无患子科，瓶子草科，虎耳草科，玄参科，菝葜科，茄科，梧桐科，安息香科，柽柳科，杉科，坚果番杏科，山茶科，假轮叶科，瑞香科，椴树科，旱金莲科，时钟花科，香蒲科，榆科，荨麻科，败酱科，马鞭草科，堇菜科，葡萄科，泽米苏铁科，姜科或蒺藜科。 

能根据本公开被编码RKN食道腺细胞分泌性多肽的核酸转染的宿主植物的通用名，包括但不限于番茄、茄子、土豆、甜瓜、黄瓜、胡萝卜、莴苣、朝鲜蓟、芹菜、葫芦(甜瓜、西瓜等)、大麦、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆类、紫花苜蓿、烟草、柑桔、苜蓿、胡椒、葡萄、咖啡、橄榄或茶。 

本领域技术人员应该理解，本公开包括分泌改变宿主基因表达的蛋白的任何线虫。例如，一种实施方案提供了含有编码根结线虫成员分泌的蛋白的核酸的转基因植物或细胞，其中分泌的蛋白刺激、增强或促进根生长或发育。 

另一种实施方案提供了包含具有序列SEQ ID NOs.1、2或5-51或其片段或其同源物的核酸的组合物。当该组合物被递送到植物或植物细胞时，刺激、促进或增强根生长或发育。 

还有一种实施方案提供了包含一种或多种由SEQ ID NOs.1、2或5-51或者其同源物被递送到植物或植物细胞时所编码的多肽或其片段的组合物。 

这里公开的根刺激组合物可任选含有生长增强剂、肥料、一种或多种杀线虫剂、杀虫剂、杀真菌剂或其组合。代表性的杀线虫剂包括但不限于三氯硝基甲、溴甲烷、1，3-二氯丙烯、甲基二硫代氨基甲酸钠、四硫代碳酸钠；以及氨基甲酸盐如2-甲基-2-(甲基硫代)丙醛O-甲基氨基甲酰基肟(aldicarb)、2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃酚甲基氨基甲酸盐(carbofuran)、甲基2-(二甲基氨基)-N-[[(甲基氨基)羰基]氧基]-2-氧代硫代乙烷亚胺(oxamyl)、2-甲基-2-(甲基磺酰基)丙醛O-[(甲基氨基)羰基]肟(aldoxycarb)、0，0-二乙基O-[4-(甲基亚硫酰基)苯基]硫代磷酸酯(fensulfothion)、O-乙基S，S-二丙基二硫代磷酸酯(ethoprop)、和乙基-3-甲基-4-(甲基硫代)苯基(1-甲基乙基)氨基磷酸酯(phenamiphos)。 

另一种实施方案提供了含有一种或多种编码线虫分泌性多肽或其片段的细胞，例如植物细胞，其中线虫分泌性多肽直接或间接刺激、增强或促进根生长或发育。细胞可以是原核或真核，并通常是植物细胞，特别是根细胞。 

还有一种实施方案提供了为植物提供抗干旱的方法，是将植物接触有效刺激、促进或增强根发育的量的一种或多种线虫食道蛋白或编码线虫食道蛋白的核酸。组合物可以喷洒在植物上、施用在植物周围的土壤中或以其它方式递送给植物，使该组合物与植物接触。 

植物转化技术 

本公开的DNA分子和RNA分子用常规重组DNA技术整合到植物或细菌细胞。通常，本公开的DNA或RNA分子包含在转化载体中。可使用本领域已知的众多这类载体系统，如质粒。表达系统的成分可以修饰用以，比如，增加导入的RNA片段的表达。例如，可以采用截断序列、核苷酸取代或其它修饰。可用本领域已知的表达系统在适当的条件下，实际转化任何植物细胞。包含本发明DNA分子的转基因优 选是稳定转化并整合到宿主细胞的基因组中。转化的细胞优选再生进入整株植物。转化技术的详细说明在本领域技术人员的知识范围内。 

报道基因或筛选标记基因可包括在表达盒中。本领域已知的适用报道基因的实例可以在例如下列这些文献中找到：Jefferson等(1991)in Plant Molecular Biology Manual，ed.Gelvin等(Kluwer AcademicPublishers)，pp.1-33；DeWet等(1987)MoI.Cell.Biol.7：725-737；Goff等等(1990)EMBO J.9：2517-2522；Kain等(1995)Bio Techniques19：650-655；和Chiu等(1996)Current Biology 6：325-330. 

用于选择转化细胞或组织的筛选标记基因可包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。适用的筛选标记基因包括但不限于，编码下列物质抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等(1983)EMBO J.2：987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella等(1983)Nature 303：209-213；Meijer等(1991)Plant MoI.Biol.16：807-820)；潮霉素(Waldron等(1985)Plant MoI.Biol.5：103-108；Zhijian等(1995)Plant Science108：219-227)；链霉素(Jones等(1987)MoI.Gen.Genet 210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等(1996)Transgenic Res.5：131-137)；博来霉素(HiIIe等(1990)Plant MoI.Biol 7：171-176)；磺酰胺(Guerineau等1990)Plant MoI.Biol.15：127-136)；溴苯腈(bromoxynil)(Stalker等(1988)Science 242：419423)；草甘膦(Shaw等(1986)Science233：478481)；草胺膦(phosphinothricin)((DeBlock等(1987)EMBO J.6：2513-2518). 

在转基因事件的回收中可提供用处但在终产物中可能不需要的其它基因包括但不限于，例如GUS(b-葡萄糖苷酸酶(glycoronidase)；Jefferson(1987)Plant MoI.Biol.Rep.5：387)，GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie等(1994)Science 263：802)，荧光素酶(Riggs等(1987)Nucleic Acids Res.15(19)：8115和Luehrsen等(1992)MethodsEnzymol.216：397-414)和编码花青素产物的玉米基因(Ludwig等 (1990)Science 247：449). 

包含与所关注的异源核酸序列可操作地连接的启动子序列的表达盒，可用于转化任何植物。以这种方式，可获得遗传修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。 

转化规程以及将核苷酸序列导入植物的规程可以根据转化靶向的植物类型或植物细胞而改变，即单子叶或双子叶。将核酸序列导入植物细胞和将序列插入植物基因组的方法包括，显微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4：320-334)，电穿孔(Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606，农杆菌介导的转化(Townsend等，U.S.Pat.No.5,563,055；Zhao等WO US98/01268)，直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3：2717-2722)，和弹道颗粒加速(例见，Sanford等，U.S.Pat.No.4,945,050；Tomes等(1995)″Direct DNATransfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment，″inPlant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；和McCabe等(1988)Biotechnology 6：923-926).还参见Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等(1987)Particulate Science andTechnology 5：27-37(洋葱)；Christou等(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Dafta等(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；Tomes的美国专利5,240,855；Buising等的美国专利5,322,783和5,324,646；Tomes等(1995)″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cellsvia Microprojectile Bombardment，″in Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等(1984)Nature(London)311：763-764；Bowen等的美国专利5,736,369(谷类)；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等(1985)in The Experimental Manipulation of OvuleTissues，ed.Chapman等(Longman，N.Y.)，pp.197-209(pollen)；Kaeppler等(1990)Plant Cell Reports 9：415-418 and Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(whisker介导的转化)；D′Halluin等(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Reports12：250-255 and Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(稻子)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(借助于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的玉米)；这里的所有文献均全文合并作为参考。 

已转化的细胞可依照常规技术长成为植物。例见，McCormick等(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后这些植物生长，并与相同的转化株或不同的植株授粉，形成具有可识别的组成型表达所需表现型特征的杂交株。可以生长两代或多代以确保所需表现型特征的组成型表达被稳定保持和继承，然后收获种子确保已经实现所需表现型特征的组成型表达。 

可以用化学调节启动子通过施用外源化学调节剂调节基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导启动子(其中施用化学品诱导基因表达)，或者化学抑制启动子(其中施化学品抑制基因表达)。化学诱导启动子本领域已知，包括但不限于，被苯磺酰胺除草剂安全剂活化的玉米1n2-2启动子，被用作出土前除草剂的疏水亲电化合物活化的玉米GST启动子，和被水杨酸活化的烟草PR-1启动子。其它感兴趣的化学调节启动子包括类固醇响应启动子(例见糖皮质激素诱导启动子，描述于Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2)：247-257)以及四环素诱导和四环素抑制启动子(例见Gatz等(1991)MoI.Gen.Genet. 227：229-237，以及美国专利，814,618和5,789,156)，这里全文引入作为参考。 

组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和其它组成型启动子，公开于WO 99/43838和美国专利6,072,050；核心CAMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant MoI.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant MoI.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(U.S.Pat.No.5,659,026)等。其它组成型启动子包括，例如，美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142。 

在需要低水平表达时，可用弱启动子。通常，“弱启动子”指在低水平驱动编码序列表达的启动子。低水平指大约1/1000转录至约1/100,000转录至大约1/500,000转录的水平。或者，可以认识到弱启动子也包括仅在一些细胞而不在其它细胞表达，而产生总体低水平表达的启动子。在启动子以无法接受的高水平表达的情况下，可以删除或修饰启动子的部分序列，降低表达水平。 

这样的弱组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子(WO 99/43838和美国专利6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其它组成型启动子包括，例如，美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142。 

可以用“组织偏爱的”启动子在特定组织内靶向基因表达。组织偏爱的启动子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等(1997)MoI.Gen.Genet.254(3)：337-343；Russell等(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341； Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等(1994)Plant CellPhysiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3)：495-505。需要的话，这样的启动子可以修饰为弱表达。 

“种子偏爱的”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的启动子如种子储存蛋白启动子)以及“种子萌发”启动子(种子萌发期间有活性的启动子)二者。见Thompson等(1989)BioEssays 10：108，这里合并作为参考。所述种子偏爱的启动子包括但不限于，Cim1(细胞分裂素诱导信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合成酶)；和ce1A(纤维素合成酶)。γ-玉米蛋白是优选的胚乳特异性启动子。Glob-1是优选的胚特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于，豆类β菜豆蛋白、napin、β伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于，玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、糯性蛋白(waxy)、shrunken1、shrunken 2、球蛋白1等。 

叶子特异性启动子本领域已知。例见，Yamamoto等(1997)PlantJ.12(2)：255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等(1993)Plant MoI.Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。 

根偏爱的启动子是已知的，并可从文献的很多现有启动子中选择，或者从各种相容的品种中重新分离。参见，例如，Hire等(1992)PlantMoI.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller 和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(在法国菜豆的GRP1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根癌农杆菌的甘露碱合成酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等(1991)Plant Cell 3(1)：11′-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见美国专利5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。 

叶绿体靶向的序列在本领域已知，并包括叶绿体的小亚单位核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)(de Castro Silva Filho等(1996)PlantMoI.Biol.30：769-780；Schnell等(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-(烯醇式丙酮)莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao等(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(chorismatesynthase)(Schmidt等(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；和捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999).还参见Von Heijne等(1991)Plant MoI.Biol.Rep.9：104-126；Clark等(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等(1986)Science 233：478-481. 

转化叶绿体的方法本领域已知。例见，Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606.该方法依靠粒子枪递送含有选择标记的DNA，并通过同源重组将DNA靶向到质体基因组上。另外，通过细胞核编码并由质粒定向的RNA聚合酶的组织偏爱表达，反式激活沉默的质体-bome转基因，而实现质粒转化。这样的体系已在McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中得以报告。 

所关注的要靶向到叶绿体上的核酸可通过植物细胞核和该细胞器官之间密码子使用的差异而优化在叶绿体中的表达。在这种方式中，所关注的核酸可以用叶绿体偏爱的密码子合成。例见，美国专利5,380,831，本文合并作为参考。 

依照本公开的转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，并包括但不限于任何线虫宿主植物。 

构建植物表达盒的要求 

在转基因植物中用于表达的核酸序列首先装配在位于可在植物中表达的适当的启动子之后的表达盒中。表达盒还能包含转基因表达需要的或选择的任何其它序列。这样的序列包括但不限于，转录终止子、提高表达的外来序列如内含子、关键序列、和用于将基因靶定到特定细胞器和细胞区室中的序列。然后这些表达盒能容易地转移到下文所述的植物转化载体中。下文说明典型的表达盒的各种成分。 

启动子 

表达盒中所用的启动子的选择决定了转基因在转基因植物中的空间和时间表达模式。所选的启动子在特定细胞类型(如叶表皮细胞，叶肉细胞，根皮层细胞)或者特定的组织或器官(如根、叶或花)中表达转基因，该选择反映了基因产物想要蓄积的部位。或者，所选的启动子在各种诱导条件下驱动基因表达。 

启动子的强度，即启动转录的能力不同。根据所用的宿主细胞体系，可以用本领域已知的众多适用启动子的任何一种。例如，对于组成型表达，可以用CaMV 35S启动子、水稻肌动蛋白(actin)启动子、或泛素(ubiquitin)启动子。例如，对于可调节的表达，可以用来自烟草或拟南芥的化学可诱导的PR-1启动子(例见，美国专利5,689,044)。 

适用的启动子类别是损伤诱导的。据记述许多启动子都在损伤部位表达。优选的这类启动子包括下列文献所述者：Stanford等MoI.Gen.Genet.215：200-208(1989)，Xu等Plant Molec.Biol.22：573-588(1993)，Logemann等Plant Cell 1：151-158(1989)，Rohrmeier & Lehle，Plant Molec.Biol.22：783-792(1993)，Firek等Plant Molec.Biol.22：129-142(1993)，和Warner等Plant J.3：191-201(1993). 

合适的组织特异性表达模式包括绿色组织特异性、根特异性、茎特异性和花特异性。适合在绿色组织中表达的启动子包括调节参与光合作用的基因的许多启动子，其中很多已从单子叶植物和双子叶植物中被克隆。适用的启动子为来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth & Grula，Plant Molec.Biol.12：579-589(1989))。适合根特异性表达的启动子是de Framond所述者(FEBS 290：103-106(1991)；EP0 452 269和来自T-1基因的根特异性表达启动子。茎特异性的适用启动子在美国专利5,625,136中有记述，并且其驱动玉米trpA基因的表达。 

转录终止子 

有多种转录终止子可用于表达盒。其负责终止超出转基因的转录和其正确的多聚腺苷酸化。合适的转录终止子是那些已知在植物中发挥功能者，包括CaMV 35S终止子、tm1终止子、胭脂碱(nopaline)合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。这些既用于单子叶植物也用于双子叶植物。 

提高或调节表达的序列 

已发现来自转录单位内的许多序列能提高基因表达，这些序列可以与基因结合使用，增加它们在转基因植物中的表达。例如，各种内含子序列如玉米Adh1基因的内含子已经表现出能提高表达，特别是在单子叶植物的细胞中。另外，还已知病毒衍生的众多非翻译的前导序 列能提高表达，这些在双子叶植物的细胞中尤其有效。 

编码序列的最优化 

所选基因的编码序列可进行基因工程改变编码序列，用以在所关注的作物品种中最佳表达。修饰编码序列以实现在特定作物品种中的最佳表达的方法已是众所周知(例见Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3324(1991)；和Koziel等，Bio/technol.11：194(1993))。 

另一种实施方案提供了直接转化到质体基因组中的RNA分子。质体转化技术详尽地记述在美国专利5,451,513、5,545,817和5,545,818；PCT申请WO 95/16783；和McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305之中。叶绿体转化的基本技术涉及将侧翼带有选择标记连同所关注的基因的克隆质体DNA区域导入适当的靶组织，如用生物导弹(biolistics)或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)。1-1.5kb的侧翼区，称为靶序列，促进了与质体基因组的同源重组，并进而使质体基因组的特定区域被替换或修饰。起初，叶绿体16S rRNA和rps12基因中赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的点突变，被用作转化的选择标记(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.，and Maliga，P.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8526-8530；Staub，J.M.，和Maliga，P.(1992)PlantCell 4，39-45)。这些标记之间存在的克隆位点使得产生了导入外来DNA分子的质体靶定载体(Staub，J.M.，and Maliga，P.(1993)EMBO J.12，601-606)。用显性选择标记，编码壮观霉素解毒酶氨基葡萄糖苷-3’-腺苷转移酶的细菌aadA基因，替换隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因，可得到转化频率显著增加(Svab，Z.，and Maliga，P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，913-917)。以前，该标记已经被成功地用于高频率转化绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的质体基因组(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)Nucl.Acids Res.19：4083-4089)。本领域已知有其它用于质体转化的选择标记，并包含在本发明的范围内。 

构建植物转化载体 

植物转化领域的普通技术人员已知，多种转化载体可用于植物转化，并且本公开有关的基因能与任何这类载体结合应用。载体的选择取决于选择的转化技术和转化的目标品种。对于某些目标品种，优选不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常规用的选择标记包括npt11基因，其赋予了对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Messing & Vierra.Gene 19：259-268(1982)；Bevan等，Nature 304：184-187(1983))，bar基因，赋予了对除草剂草铵膦(phosphinothricin)的抗性(White等，Nucl.Acids Res 18：1062(1990)，Spencer等Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990))，hph基因，赋予了对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger &Diggelmann，MoI Cell Biol 4：2929-2931)，manA基因，在存在甘露糖时允许阳性选择(Miles and Guest(1984)Gene，32：41-48；U.S.Patent No.5,767,378)，和dhfr基因，赋予了对氨甲蝶呤的抗性(Bourouis等，EMBOJ.2(7)：1099-1104(1983))，和EPSPS基因，赋予了对草甘膦的抗性(U.S.Pat.Nos.4,940,935 and 5,188,642)。 

许多载体可用于应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化。它们通常带有至少一个T-DNA边缘序列，并包括如pBIN19的载体(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))。适合农杆菌转化的典型载体包括二元载体(binary vector)pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB 10及其潮霉素选择衍生物。(例见，美国专利5,639,949)。 

不使用根癌农杆菌的转化避免了所选的转化载体对T-DNA序列的需求，因此除了如上述含有T-DNA序列的载体之外，利用了缺乏这些序列的载体。不依靠农杆菌的转化技术包括借助于粒子轰击、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择主要取决于对要转化的品种的优先选择。适合非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG 19和pSOG35。(例见，美国专利5,639,949)。 

转化技术 

一旦所关注的DNA序列被克隆到表达系统中后，它即被转化到植 物细胞中。转化的方法和植物再生的方法在本领域中是公知的。例如，Ti质粒载体被用于递送外源DNA，以及直接摄取DNA、脂质体、电穿孔、显微注射和微弹(microprojectile)。另外，农杆菌属的细菌可以用来转化植物细胞。 

转化双子叶植物的技术在本领域中是公知的，并包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及通过原生质体或细胞直接摄取外源基因材料。这通过PEG或电穿孔介导的摄取、粒子轰击介导的递送或显微注射实现。在各种情况下，转化细胞用本领域已知的标准技术，可以再生为整株植物。 

大多数单子叶植物品种的转化现在变得有些常规。优选的技术包括用PEG或电穿孔技术将基因直接转移进原生质体中、粒子轰击进入愈伤组织或有组织的(organized)结构中、以及农杆菌介导的转化。 

用本领域已知的方法，经过转化事件的植物生长、繁殖和育种，产生出具有所需特性的后代，并获取带有所需特征的种子。该方法产生包含本发明RNA片段的植物细胞，其中所述靶基因在所述植物细胞中的表达被所述RNA片段改变，并产生从该植物细胞衍生的植物及其后代、以及源于该植物的种子。 

本公开的抑制性核酸或RKN食道腺细胞分泌多肽可单独使用或作为试剂盒的组分，所述试剂盒具有至少一种进行体外或体内将RNA导入到对象中所必需的试剂。适用的组分是dsRNA和促进dsRNA导入的媒介。这样的试剂盒也可包括使用说明书，使试剂盒的用户实施本发明。 

另一种实施方案通过将包含双链结构的RNA(所述双链结构具有与靶mRNA的至少一部分互补的核苷酸序列)导入线虫的宿主植物，提供了对抗线虫病害的方法；并任选验证靶mRNA的表达抑制。 

一种实施方案通过将植物内或植物上的寄生线虫与dsRNA接触，所述dsRNA具有与编码线虫分泌蛋白(例如食道腺细胞蛋白)的mRNA至少部分互补的序列，提供了一种治疗或预防线虫病害的方法；其中分泌蛋白调节植物的基因表达。 

还有一种实施方案提供了例如含有表达构建体的植物细胞，该构建体编码形成了双链结构的RNA，所述双链结构具有与编码线虫分泌蛋白(例如食道腺细胞蛋白)的靶mRNA的至少部分互补的核苷酸序列，以及提供了含有所述细胞的转基因植物。 

另一种实施方案中，RNA片段包含在两种不同的RNA分子中。这种情况下，RNA片段在导入所述细胞之前混合，例如在允许其形成双链RNA分子的条件下。在另一种实施方案中，RNA片段依次导入所述细胞。优选，导入每种RNA分子之间的时间间隔短，优选少于一小时。 

还有一种实施方案，RNA片段包含在一种RNA分子中。用一种RNA分子，两个互补RNA片段紧密接近，使得有利于配对和双链形成。这样的情况下，RNA分子优选能够折叠，使包含于其中的所述RNA片段构成双链区。这样，RNA片段的互补部分能互相识别，彼此配对，并形成双链RNA分子。在另一种实施方案中，RNA片段在导入细胞之前，在使它们能形成双链RNA分子的条件下孵育。另外还有一种实施方案，RNA分子包含有义RNA片段和无义RNA片段之间的接头。该接头优选包含由含有功能基因如选择标记基因的表达盒编码的RNA序列。在另一种实施方案中，接头包含由调节序列编码的RNA序列，如包含内含子加工信号。 

另一种实施方案提供了一种dsRNA构建体，其具有与所述dsRNA可操作连接的启动子，并还可包括所述的dsRNA分子。启动子可以是异源性启动子，例如组织特异性启动子、发育调节启动子、组成型启动子、趋异或可诱导启动子。终止信号也可任选包括在DNA分子中。 

单一RNA分子或两种不同的RNA分子优选能够形成双链区，其中RNA片段的互补部分彼此识别，互相配对，并形成双链RNA分子。 

另一种实施方案以原料、丸粒、颗粒、片状等形式提供了所公开的转基因植物材料。这里公开的抑制性核酸可以是源自上述转基因植物的种子和种子产物。另一种实施方案提供了一种含有所公开的抑制性核酸的组合物，能涂在种子上。该涂料可以配制成使抑制性核酸在种子成熟和根发育时，能保持抑制线虫分泌蛋白。 

其它的实施方案提供了含有所公开的线虫食道腺细胞蛋白或其片段的嵌合或融合蛋白。本文所用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与外源多肽连接的线虫食道腺细胞蛋白或其片段。“外源多肽”是与线虫食道腺细胞蛋白或其片段不显著同源的多肽。外源多肽可以融合到线虫食道腺细胞蛋白或其片段的N-端或C-端。 

融合蛋白可包括对配体有高亲和力的部分(moiety)。例如，融合蛋白可以是GST融合蛋白，其中线虫食道腺细胞蛋白或其片段融合到GST的C-端。这样的融合蛋白可以易于多肽的提纯。或者，该融合蛋白可以在其N-端含有异源信号序列。在某些宿主细胞中，蛋白的表达、分泌或运送可通过使用异源信号序列而增加。例如，在植物细胞中，本发明的多肽可以与叶绿体转运肽融合。叶绿体转运肽使多肽从植物细胞的细胞质运输到叶绿体中，从而增加根发育。已经编码了融合的部分(如GST多肽)的表达载体可以从市场上得到。编码线虫食道腺细胞蛋白或其片段的核酸可以克隆到这样的表达载体之中，使融合部分符合读框地连接到多肽上。 

下面仅是示范性实施例。应当理解本发明不受限于这些实施例。本公开的其它重要应用可以被本领域普通技术人员容易地认识到。可被本领域普通技术人员潜在认识到的其它用途也是本公开的部分。 

本文提到的参考文献，根据适用的法律所允许的最大限度全文引入。 

实施例 

实施例1：线虫和植物 

根结线虫品种在温室生长的番茄(Lycopersicon esculentum cv.Marion或Better-Boy)的根上繁殖。根结线虫的卵按所述方式收集(Hussey and Barker，1973)。经过孵卵，在25-μm孔筛上将寄生前的二期幼虫(pre-J2)收集在塑料碗中的去离子水中。通过根混合和筛选，收集南方根结线虫的不同寄生期(Ding等1998)。用于原位杂交的南方根结线虫的混合寄生期(MS)，在如De Boer等(1998)所述的卵接种后13-15天收集。相似地，从感染的大豆(Glycine max)的根上收集大豆胞囊线虫(heterogera glycines)的pre-J2和MS。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)在大肠杆菌(E.coli)的OP50上培养(Brenner，1974)。从生长室生长的烟草(Nicotiana tabacum cv.Petite Havana SR1)和拟南芥生态变种Col-O上，收集一月龄的宿主植物叶子。 

实施例2：核酸操作 

密集(packed)的线虫Pre-J2用液氮冷冻在1.5ml微量离心管中，并用底部光滑的金属杆研磨。冷冻的线虫片段与0.5ml提取液(100mMNaCl，100mM Tris-HCl[pH8.0]，50mM EDTA，1％十二烷基硫酸钠，4mg/ml蛋白酶K和10μg/ml RNase)混合，并在37℃孵育1小时。DNA用苯酚/氯仿提取，然后用异丙醇沉淀(Sambrook等，1989)。DNA在H₂O中再悬浮。烟草和拟南芥的基因组DNA用标准技术提取(Dellaporta 1993)。 

用Dynabeads mRNA DIRECT试剂盒(Dynal，Lake Success，NY)， 从研磨的植物组织提取和纯化mRNA，用10μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水洗脱，并用逆转录(RT)-PCR SMART PCR cDNA合成试剂盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，依照制造商的说明书，转换成第一链cDNA。RT-PCR反应含有下列成分：5×第一链缓冲液4.0μl，20mMDTT 2.0μl，10mM 50×dNTP 2.0μl，10μM 3′-CDS引物1μl，分离的mRNA 10μl，和Superscript II逆转录酶(200单位/μl，Gibco BRL，Rockville，MD)1μl。反应在42℃孵育1小时。 

实施例3：分离16D10cDNA克隆 

编码分泌性信号肽的16D10克隆在南方根结线虫的腺细胞特异性cDNA文库的随机测序期间被鉴别(Huang等，2003)，并命名为16D10。pGEM-T Easy载体中的16D10全长双链cDNA序列，通过在测序反应中用T7和SP6引物得到。如SignalP所预测的，16D10cDNA(364bp)的最长开放阅读框编码包括了30aa N-端疏水信号肽的43aa的推导的蛋白(Nielsen等，1997)。虽然13aa(GKKPSGPNPGGNN，M_x 1，223Da)(SEQ ID NO：52)的成熟16D10肽没有提供明显的BLASTX相似性，但它确实含有拟南芥CLV3-样蛋白功能结构域的保守C-端13aa基序(KRLVPSGPNPLHN)(SEQ ID NO：54)的8aa(K-PSGPNP--N)(SEQ IDNO：53)(Cock和McCormick，2001)，以及按PROSITE预测的cAMP/cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点[KKpS](Hofmann等，1999)。 

实施例4：在根结线虫品种中的基因组克隆 

从南方根结线虫16D10的cDNA序列最末端5’-和3’-端设计的一对基因特异性引物16D10GF(5′-GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTC-S′)(SEQ ID NO：55)和16D10GR(δ′-CAGATATAATTTTATTCAG-S′)(SEQ ID NO：56)，用于从南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫的200ng基因组DNA扩增相应的基因组序列(或最高同源性的序列)。PCR产物从1.2％琼脂糖凝胶上切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。提纯的产物克隆到pGEM-T Easy载体 (Promega，Madison，W1)中测序。根结线虫品种的16D10同源物在核苷酸水平享有超过95％的一致性，并且推定的cDNA编码的推导出的蛋白与南方根结线虫16D10的蛋白一致。 

实施例5：Southern印迹分析 

每个样品，10μg基因组DNA以50单位的EcoRI或BamHI(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)完全消化，在0.7％(w/v)琼脂糖凝胶中分离，转移到Hybond-N尼龙膜上(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，并用标准规程(Sambrook等，1989)进行印迹。用T7和SP6引物从pGEM-T Easy载体的插入物扩增相应的全长cDNA，产生16D10探针。凝胶纯化的PCR产物以PCR-DIG探针合成体系(RocheApplied Science，Indianapolis，IN)用PCR标记。大约15ngDIG-标记的探针/ml用于每个杂交。在室温(RT)下，杂交在DIG Easy Hyb液(RocheApplied Science，Indianapolis，IN)中，于40℃进行16h，随后用2×SSC/0.1％SDS液清洗2次，每次5分钟。然后在68℃用0.5×SSC/0.1％SDS液清洗膜两次，每次30分钟。在1％阻断试剂中孵育膜1小时后，膜用绵羊抗-DIG碱性磷酸酶(AP)结合物的1∶10,000稀释溶液孵育30分钟。未结合的抗体通过用马来酸清洗缓冲液(100mM马来酸，150mM NaCl，pH7.5，和0.3％Tween 20)清洗两次，每次15分钟而清除。膜在AP检测缓冲液(100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl，和50mMMgCl₂)中孵育10分钟，然后加入化学发光底物3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3，2’-(5’-氯)三环[3.3.1.1^3，7]癸}-4基)苯基磷酸二钠(CSPD)(Roche Applied Science)1∶50稀释液，随后将膜密封在两片透明薄膜中并将其暴露在X-线薄膜下1.5小时。含有南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫基因组DNA与16D10 cDNA杂交的印迹，显示16D10以3-4个拷贝或同源物存在于四种重要的农业根结线虫种类中(图6)。没有检测到与大豆胞囊线虫H.glycines、非寄生自由生存的线虫秀丽隐杆线虫、和植物(烟草和拟南芥)的基因组DNA的杂交。 

实施例6：序列分析 

在国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)，用BLAST程序PSI-BLASTP和BLASTX，进行序列相似性检索(Altschul等，1998)。用ClustalW1.8产生了根结线虫16D10基因组DNA序列的多重序列比对(Jeanmougin等，1994)。对于分泌和切割位点的信号肽的预测借助于SignalP程序进行(Nielsen等，1997)。 

实施例7：原位杂交 

通过不对称PCR(Huang等，2003)，16D10cDNA克隆的特定正向和反向引物，用于合成洋地黄毒甙(DIG)标记的有义和反义cDNA探针(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)等。原位杂交用南方根结线虫以福尔马林固定的、通透化的寄生前幼虫和混合的寄生期进行(De Boer等，1998；Huang等，2003)。在线虫内杂交的cDNA探针以碱性磷酸酶结合的抗DIG抗体和底物检测，并且标本用复合型光学显微镜观察(DeBoer等，1998)。原位mRNA杂交揭示，16D10在南方根结线虫的寄生早期，在两种侧腹食道腺细胞中强烈表达。 

实施例8：免疫荧光分析 

按照Goverse等(1994)之前叙述的方法，提纯的16D10多克隆抗血清用来以间接免疫荧光法定位16D10在南方根结线虫的寄生前J2、混合寄生期的切片中的表达。在新鲜配制的含2％多聚甲醛的PBS缓冲液(80mM Na₂HPO₄，20mM NaH₂PO₄，100mM NaCI，pH7.4)中在40℃固定5天后，线虫在PBS缓冲液中洗三次，在去离子水中洗一次。固定的线虫被切成切片，孵育在37℃每ml含有0.6mg蛋白酶K(RocheApplied Science，Indianapolis，IN)的磷酸缓冲盐水(PBS)缓冲液中1小时。以PBS洗过一次后，部分消化的线虫放在-80℃冰箱中20分钟，在干冰状冷甲醇中孵育3分钟，然后在干冰状冷丙酮中孵育15分钟。线虫用如前所述(Goverse等，1994)的用蛋白酶抑制剂改良的封闭液(10％山羊血清，0.02％NaN₃，1mM苯甲基磺酰氟，1×PBS)清洗一次， 在4℃下孵育3天，然后立即用于荧光免疫。封闭过的线虫等分放入96孔Multiscreen板(Millipore，Bedford，MA)的孔中，搅拌在ELISA稀释剂(0.05％Tween，0.02％NaN₃，1％BSA，1×PBS)中1∶250稀释的16D10纯化的多克隆抗体，室温下在潮湿的舱中过夜。线虫切片用PBST(1^χ×PBS，0.5％Triton X-100)洗三次，每次5分钟，并在室温下黑暗中，1∶1000稀释的荧光素异硫氰酸盐(FITC)-结合的山羊抗兔IgG(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在Tris-盐水-BSA(0.15M NaCl，0.01MTris，pH7.2，0.2％Triton X-100，3％BSA)中搅拌3小时。切片在PBST中洗两次，用蒸馏水洗一次。处理的切片在15-μl水滴中被转移到事先用5μl 0.1％聚-L-赖氨酸(Sigma Chemical)包被的Multitest玻片(ICN-Flow，Horsham，PA)上的单个孔中。切片在玻片上空气干燥，用抗淬灭剂(500mM碳酸盐缓冲液中0.02mg/ml苯二胺，pH8.6，与无荧光的甘油混合)的3μl小滴覆盖，并用盖玻片。标本在Olympus荧光显微镜下观察。阴性对照由免疫前的兔血清组成。提纯的16D10抗血清结合到寄生前和寄生J2的侧腹腺细胞及其细胞质扩展和膨胀壶腹(expanded ampullae)内的分泌颗粒上，其位于掌部的泵室(pumpchamber)后方。在任何的线虫标本上均没有观察到与免疫前的兔血清的特异标记。 

实施例9：蛋白提取 

通过研磨置于液氮的微量离心管中200μl提取缓冲液[100mMTris-HCI，pH7.0，150mM NaCl和1×全蛋白酶抑制剂(completeprotease inhibitors)(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)]内的南方根结线虫和大豆胞囊线虫的寄生前J2和混合寄生期，提取线虫蛋白。通过研磨置于液氮的微量离心管中200μl提取缓冲液[50mM Tris-HCI，pH7.0，150mM NaCl，1×全蛋白酶抑制剂(Roche Applied Science)]内的转基因幼苗和根组织，提取植物蛋白(0.5g)。13,000rpm离心10分钟后，从组织匀浆中回收上清液。用BSA作为标准，评价所有的蛋白浓度(用Bio-Rad Protein Assay Kit II)。作为阳性对照，从Sigma-Genosys，TX合成的16D10肽(GKKPSGPNPGGNN，纯度＞95％)(SEQ ID NO：52) 用于免疫检测分析(见实施例12-13)。 

实施例10：采集口针分泌物 

按照Davis等(1994)的叙述，在体外产生和采集南方根结线虫J2的口针分泌物。寄生前J2在室温的潮湿舱中，在0.4％间苯二酚(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培育6小时。口针分泌物通过添加等体积的0.1M Tris-NaOH，pH11.0而溶解。溶解的口针分泌物用StrataClean(Stratagene，La JoIIa，CA)浓缩。短时间里，通过在诱引混合物(460ml)上清液中悬浮1.5ml珠子并将其在恒定的混合下孵育1小时，溶解的分泌蛋白被俘获。珠子被离心，重新悬浮在2×SDS-PAGE样品缓冲液中，煮沸3分钟释放吸附的蛋白。浓缩的口针分泌物用提纯的16D10抗血清，用于酶联免疫吸附分析(ELISA)和免疫印迹分析(见实施例11-13)。两种分析均在口针分泌物中，以及南方根结线虫J2和混合寄生期的总提取物中，鉴别到了16D10。 

实施例11：生产抗血清 

用Eurogentec，Inc.(Herstal，Belgium)的合成的成熟(即不带N-端信号肽)16D10肽(GKKPSGPNPGGNN)(SEQ ID NO：52)免疫两只兔子制备16D10抗血清。用肽抗原从15ml最终粗制血清中亲和纯化抗血清。肽亲和纯化的16D10多克隆抗血清，用在免疫荧光显微镜法(Goverse等，1994)中定位南方根结线虫标本中16D10的表达，并用在口针分泌物和转基因植物表达的或体外翻译的16D10中16D10的免疫检测。 

实施例12：Western斑点印迹分析 

蛋白质样品(2μl)点到Hybond ECL硝酸纤维素上。使硝酸纤维素膜空气干燥20分钟。膜在封闭液(2％脱脂奶粉，1×Tris-缓冲盐水-Tween[TBS-T：20mM Tris-HCl，pH7.4，0.8％NaCl，0.1％Tween 20])中37℃孵育过夜，然后用纯化的16D10多克隆抗血清(1∶2,000)处理，继之以抗兔IgG(全分子)碱性磷酸酶结合物(1∶30,000)(Sigma)处理。膜在1×TBS-T缓冲液中室温下洗三次，室温下在底物溶液中(10ml AP 缓冲液[100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl]中，45μl硝基蓝四唑[NBT]溶液和35μlδ-溴-氯-S-吲哚基-磷酸盐toluidinium[BCIP]溶液)孵育直至出现颜色。 

实施例13：ELISA分析 

对Pratt等(1986)的方法修改后进行ELISA。Dynatech Immulon板包被有下列来源的硼酸盐水(0.2M硼酸钠，75mM NaCl，pH8.5)稀释的蛋白，4°下过夜：1000×浓缩的南方根结线虫J2的口针分泌物2μl，南方根结线虫pre-J2、南方根结线虫MS、大豆胞囊线虫pre-J2和MS的总提取蛋白10μg，或BSA (Sigma Chemical)10μg作为阴性对照。用100ng合成的16D10肽(纯度＞95％，Sigma-Genosys，TX)包被孔，作为阳性对照。用清洗缓冲液(10mM Tris.HCI，pHδ.0，0.5M NaCl)洗孔三次，以PBS(32.9mM Na₂HPO₄，1.77mM NaH₂PO₄，0.14M NaCl，pH7.4)的1％BSA室温下封闭30分钟。用清洗缓冲液洗一次后，每个包被的孔用被PBS的0.5％BSA液1∶1,000稀释的纯化16D10多克隆抗血清在室温下孵育1小时。阴性对照包括省略用初级多克隆抗体孵育，和用兔免疫前血清孵育。洗孔三次，用碱性磷酸酶-结合的山羊抗兔抗体(Sigma Chemical)1∶5,000稀释，在室温下孵育1小时，在加入磷酸盐比色底物之前清洗三次。底物对-硝基苯磷酸盐根据制造商的说明书，在碱性磷酸酶缓冲液(1M二乙醇胺，0.5mM MgCl₂，pH9.8)中制备，并在用3N NaOH停止反应前，于室温下在处理过的孔中孵育30分钟。在ELISA读数器上测定405nm和490nm下的吸光度。 

实施例14：构建质粒 

用导入Kpn\或Xba\限制性位点(下划线处)和终止/启动密码子(斜体字)的引物16D10SF(5’-CGGGGIACCLAGATGTTTACTAATTCAATTAA-S′)(SEQ IDNO：57)或16D10F(5′CGGGGTACCTAGATGGGCAAAAAGCCTAGTG-3′)(SEQ IDNO：58)和16D10R(5′-GCTCTAGATCAATTATTTCCTCCAGG-3′)(SEQ ID NO：59)，从全长cDNA克隆扩增带有或不带有信号肽序列的16D10编码区，克隆到二元载体pBIX的位于CaMV 35S启动子的控制下的Kpn\和Xba\位点，分别产生pBIX(16D10S)和pBIX(16D10)，并通过测序证实。pBIX从pBI101(BD Biosciences，Palo Alto，CA)衍生而来，含有nos启动子-nptll-nos终止子盒、35S启动子-gusA-nos终止子、和带有具备Kpn\和Xba\位点的多接头的第二35S启动子。从拟南芥基因组，用导入Kpn\限制性位点(下划线者)的引物C3K(5′GGGGTACCATGGATTCTAAAAGCTTTG-S′)(SEQ ID NO：60)和C3R(5′-CCACTAGGCTTTTTGCCAAGGAACAAGAAGCAG-S’)(SEQID NO：61)作为信号序列，以及从16D10 cDNA，采用以Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，使用为成熟肽编码序列导入Xba\限制性位点(下划线者)的引物C3F(5’-CTTCTGCTTCTTGTTCCTTGGCAAAAAGCCTAGTGG-S′)(SEQ IDNO：62)和16D10X(5′GCTCTAGATCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQID NO：63)，通过PCR扩增生成clv3和16D10杂交表达序列。然后将以上两种产物用于在融合PCR(fusion PCT)反应中彼此引发。得到的片段克隆到pBIX以产生pBIX(C3S-16D10)，并通过测序验证。 

实施例15：转化烟草毛状根 

质粒pBIX(16D10)、pBIX(16D10S)和作为对照的空载体pBIX，通过电穿孔(Shen and Forde，1989)转移到发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)ATCC 15834中，并用发根农杆菌介导的子叶转化(Christey，1997)，转化到烟草中(Nicotiana tabacum cv Petite Havana SR1)。从带有100mg/L卡那霉素和timentins(230.8mg/L替卡西林二钠加上7.69mg/L克拉维酸钾)的含有0.8％Noble琼脂的Gamborg′s B-5板上，生成了转化的毛状根。24℃下，黑暗中培养单个毛状根稍(约0.5cm)3周，单个毛状根体系的2-3个根接受GUS-染色(Jefferson等，1987)。经PCR分析证实有卡那霉素抗性并且GUS阳性而没有细菌污染的根系，用于建立毛状根体系。每两周将根稍在Gamborg′s B-5平板上进行次培养(subculture)，用于在没有激素的Gamborg’s B-5板上进行根生长分 析，切过的根在原来的平板上于24℃黑暗中保持培养用于分析。为了分析根生长，平板在黑暗中水平培养，研究5个来自各转基因体系的毛状根，每个重复三次。采用与在转基因拟南芥的方法中相同的程序，等对按照所述方法(Does等，1991)鉴别的带有单个转基因拷贝的转基因毛状根或愈伤组织进行有关的RT-PCR和免疫印迹分析。16D10在毛状根细胞的细胞质中的表达增进了根生长率约65％[在16D10转基因体系中，2周后平均根长度为5.20±0.61cm(n＝90)，比较之下，对照体系为3.15±0.34cm(n＝90)]，在第5周产生了茂盛的侧根，并在根被切下进行次培养之处形成愈伤组织。16D10表达的RT-PCR分析显示，愈伤组织中稳态mRNA水平高于毛状根。用纯化16D10抗血清进行的免疫印迹分析揭示，16D10在毛状根和愈伤组织二者中产生。在对照载体转化的毛状根中没有检测到16D10的表达。 

实施例16：拟南芥Floral-dip转化 

质粒pBIX(16D10)、pBIX(C3S-16D10)和作为对照的空载体pBIX，以电穿孔(Shen和Forde，1989)导入根癌农杆菌C58C1中，并通过floral dip法(Clough和Bent，1998)，转化到拟南芥野生型Col-O植株中。卡那霉素抗性、GUS染色(Jefferson等，1987)和16D10的分离(segregate)，与PCR分析结合，证实转基因纯合T₂系的产生。反向PCR(Does等，1991)以基因组中的单个转基因拷贝鉴别纯合系，用于分子和根生长分析。每个转基因系的30株植物，每个重复三次，以16h有光(24℃)/8h黑暗(20℃)的周期，体外培养在带有3％蔗糖的MS平板上，平板保持垂直以便根生长分析。 

产生了四种转基因拟南芥T₂纯合子系，其含有在35S启动子控制下的16D10单个拷贝，没有信号肽。还产生了来源于空白转化载体的两种转基因系作为对照。RT-PCR和免疫印迹分析证实，16D10在所有的16D10转基因系中表达，但是不在对照系中表达。与对照比较，16D10在拟南芥细胞的细胞质中的表达增加了初生根的长度达85％[四种16D10转基因系(n＝90/系)，平均54.01±8.75mm，两个对照系(n＝90/ 系)为29.20±4.50mm]，并且侧枝和不定根的数量分别增加了1.4倍和2.08倍(图2和图3)。初生根生长的增加与侧根数量的增加和不定根数量的增加密切相关。3天内根稍生长率的测定显示，仅在16D10根的分生区有长度增加(20％)，表明细胞数量而不是细胞大小的增加促进了根生长。 

实施例17：互补实验 

由于成熟16D10肽13aa(GKKPSGPNPGGNN)(SEQ ID NO：52)含有拟南芥CLV3-样蛋白功能区保守C-端13aa基序(KRLVPSGPNPLHN)(SEQ ID NO：54)的8aa(K-PSGPNP-N)(SEQ ID NO：53)(Cock和McCormick，2001)，以拟南芥CLAVATA3信号肽编码南方根结线虫16D10的质粒pBIX(Clv3S-16D10)，借助于根癌农杆菌C58C1介导的floral-dip转化(Clough和Bent，1998)，被转移到拟南芥clv3突变株clv3-1(中间体)、clv3-2和clv3-6中，用于功能互补实验。作为对照，质粒pBIX(16D10)和pBIX也被导入到clv 3突变体中。还产生了三种转基因T₂纯合系用于各自的构建体。按照Fletcher等(1999)的记述，研究16D10转化的clv3系的表现型(花和茎尖分生组织)并与载体转化系、拟南芥野生型生态型Col-O以及clv3突变株后代相比较。虽然16D10含有拟南芥CLV3-样蛋白的功能结构域，但16D10在拟南芥clv3突变株的质外体或细胞质中的表达并没有恢复野生型表型，表明16D10没有作为CLV3-样蛋白的功能。 

实施例18：组织学分析 

拟南芥的初生根被固定和脱水(Dolan等，1993)，用低黏度包埋(Low Viscosity Embedding)试剂盒(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)依照制造商的说明书包埋在Spurrs树脂中。用Reichert-Jung Ultracut E切片机制作薄切片(0.4μM)，并用1％甲苯胺蓝染色。根分生组织之内和之上的根横切片和根稍的纵切片表明，与野生型比较，在转基因系中，平均细胞大小以及细胞类型和细胞层的数量没有不同。在我们的转基因植物中，根形态学也没有改变，增进生 长伴随着加速根系发育。因此，16D10的异位表达提高了根生长率并诱导侧根萌发，可能是通过刺激分生组织中的细胞分裂，增加细胞产生率而不改变分生组织的构成。 

实施例19：相关RT-PCR 

对从等量植物组织中提取的mRNA进行逆转录(RT)-PCR。上述的16D10基因特异性引物16D10F和16D10R用在后续的PCR扩增中。在对照中，从拟南芥野生型生态型Col-O中均一表达的UBQ10基因(基因库登记号NM_202787)设计引物UBQ1(5′-GATCTTTGCCGGAAAACAATTGGAGGATGGT-S′)(SEQ ID NO：64)和UBQ2(5′-CGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAACAGG-S′)(SEQ ID NO：65)，用于扩增转基因拟南芥系的483bp独有序列。引物ActF(5′-CCGGTCGTGGTCTTACTGAT-S’)(SEQ ID NO：66)和ActR(5′-GCACCGATTGTGATGACTTG-S’)(SEQ ID NO：67)从烟草(N.tabacum cv)Petite Havana SR1均一表达的肌动蛋白基因(基因库登记号U60494)中设计，用于从转基因烟草毛状根中扩增烟草肌动蛋白(Tob104)基因的独有序列。PCR含有下列成分：10×BD Advantage 2PCR缓冲液5μl，10mM dNTP混合物1.0μl，5′引物1.5μl，3′引物1.5μl，cDNA 2μl，水38μl和50×BD Advantage 2聚合酶混合物1.0μl(BDBiosciences，Palo Alto，CA)。PCR循环的组成为：94℃下初始变性步骤2分钟，随后是35个循环的94℃下1分钟、55℃下30秒、72℃下40秒和最后10分钟72℃下的延伸步骤。每个RT-PCR反应的10微升等分试样在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，转移到尼龙膜上，用相应的DIG-标记的DNA探针杂交。RT-PCR分析表明，16D10转录本在16D10转基因烟草的毛状根和拟南芥系中稳定存在，但在载体转化的对照系中缺乏。 

实施例20：酵母双杂交筛选 

酵母双杂交筛选中采用了MATCHMAKER酵母双杂交系统II(BDBiosciences，Palo Alto，CA)。编码16D10成熟肽的cDNA被按阅读框克 隆进入pGBKT7的GAL4-结合结构域(BD)，产生pGBKT7(16D10)并表达作为诱饵以在pGADT7的GAL4活化结构域(AD)中筛选从番茄根组织的mRNA构建的番茄根cDNA文库。12个全长编码SCL的cDNAs(AtSCLI，AtSCL3，AtSCL5，AtSCL6，AtSCLQ，AtSCL13，AtSCL14，AtSCL21，AtSCR，AtSHR，AtRGA，AtGAI)，用各基因的基于基因库数据库(Bolle，2004)中相应序列的特定引物，从拟南芥根组织mRNA制成的根cDNA库进行扩增，并按阅读框克隆在pGADT7中。各构建体用pGBKT7(16D10)导入酵母菌株AH109。编码AtSCL6和AtSCL21特定区域的cDNA克隆在pGADT7之中，然后与pGBKT7(16D10)共同转化到菌株AH109中。包括cDNA文库筛选、阳性克隆的选择和β-半乳糖苷酶活性分析的所有程序，依照MATCHMAKER酵母双杂交系统II(BD Biosciences，Palo Alto，CA)的规程进行。两种拟南芥SCL蛋白AtSCL.6和AtSCL.21，与16D10在酵母中相互反应。结构域分析表明，16D10与AtSCL.6和AtSCL21的SAW结构域特异性相互反应，但16D10与SCL蛋白的其余结构域没有相互反应，显示了SCL转录因子是RKN寄生植物期间分泌的16D10的推定靶标。 

实施例21：浸透(Soaking)得到RNAi 

16D10的42bp和271bp序列用下列引物从全长cDNA克隆分别扩增：16D10T7F1(5′TAATACGACTCACTATAGGGCCTCAAAAATACCATAAAG-3′)(SEQ ID NO：68)和16D10T7R1(5′TAATACGACTCACTATAGGGGAAATTAACAAAGGAAACC-S′)(SEQ ID NO：69)，和16D10T7F2(5′TAATACGACTCACTATAGGGGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-S)(SEQ ID NO：70)和16D10T7R2(5′TAATACGACTCACTATAGGGTCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQ ID NO：71)，各自引入RNA引物位点T7(下划线者)。用MEGAscript RNAi试剂盒(Ambion，Austin，TX)，按照制造商的说明书，以凝胶纯化的PCR产物用作模板，在体外的单一反应中合成16D10 RNA的有义链和反义链，不同的是反应孵育16小时以增加RNA产率。生成的双链(ds)RNA的数量和质量通过标准程序(Sambrook等，1989)估计和定量。dsRNA产物用乙醇沉淀，并重新悬浮在没有核酸酶的水中，浓度为10-15μg/μl。 

大约10,000条新孵化的南方根结线虫J2浸在含有1mg/ml 16D10dsRNA、1％间苯二酚、0.13mg/ml FITC异构体I、0.05％明胶和3mM亚精胺的¹/₄M9缓冲液(10.9mM Na₂HPO₄，5mM KH₂PO₄，4JmM NH₄Cl，和2.2mM NaCl)中，并在旋转器上室温下黑暗中孵育4小时。间苯二酚(Res)用来帮助刺激摄取dsRNA。对照样品在同样的但没有间苯二酚或dsRNA的溶液中孵育。浸透后，线虫通过离心法用不含核酸酶的水彻底清洗5次，用Olympus荧光显微镜观察，处理过的线虫大约100％摄取FITC，这是摄取dsRNA的标记。用从等量处理过的J2的mRNA合成的cDNA第一条链作为模板，用南方根结线虫组成型表达的肌动蛋白基因(基因库登记号BE225475)片段扩增的284bp作为对照，以相关RT-PCR分析(relative RT-PCR)对转基因J2进行分析，确定16D10转录体的沉默。根结线虫二期幼虫摄取短的或全长16D10 dsRNA，导致了处理过的线虫中16D10转录本显著减少(图4)，为用RNAi在根结线虫体内靶定16D10提供了直接证据。 

南方根结线虫的J2还按上述方法用对8H11(SEQ ID NO：17)或31H06(SEQ ID NO：33)特异的1mg/ml dsRNA浸透。相关RT-PCR分析揭示，根结线虫二期幼虫摄取8H11和31 H06 dsRNA，导致了处理过的线虫中这两种附加的寄生基因的转录本显著减少(图5)。 

实施例22：植物内(In planta)递送RNAi 

用下列分别导入Xho\、Kpn\、Cla\或Xba1限制性位点(下划线处)的基因特异性引物，从全长cDNA克隆扩增16D10的有义或反义cDNAs(42bp或271bp)：16D10Xho1(δ′-CCGCTCGAGGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-S’)(SEQ ID NO：72) 和16D10Kpn1(5′-CGGGGTACCTCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQID NO：73)，16D10Clal(5′-CCATCGATTCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQ ID NO：74)和16D10Xba1(5-GCTCTAGAGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-3′)(SEQ ID NO：75)，16D10Xho3(5′-CCGCTCGAGCCTCAAAAATACCATAAAG-3′(SEQ IDNO：76)和16D10Kpn2(5′-CGGGGTACCGAAATTAACAAAGGAAACC-S)(SEQ ID NO：77)，16D10Cla2(5′-CCAICGAIGAAATTAACAAAGGAAACC-S′)(SEQ IDNO：78)和16D10Xba3(5’-GCICIAGACCTCAAAAATACCATAAAG-S′)(SEQ ID NO：79)。PCR产物凝胶提纯，分别用限制性酶Xho\和Kpn1，或者Cla\和Xba\消化。消化的PCR产物克隆到Xho-Kpn\位点中，或pHANNIBAL的Cla\-Xba\位点中，分别生成pHANNIBAL(16D10#1)和pHANNIBAL(16D10#2)。pHANNIBAL-衍生的质粒的有义和反义16D10cDNA被亚克隆为Not\片段进入二元载体pART27(Gleave，1992)中，产生高度有效的含内含子的“发夹”RNA(ihpRNA)沉默构建体(Wesley等，2001)。pART27衍生的构建体用电穿孔转化到根癌农杆菌C58C1中。转化体在含有利福平(50mg/L)、庆大霉素(25mg/L)和壮观霉素(100mg/L)的LB培养基上进行选择，然后通过上述floral-dip转化导入拟南芥生态型Col-O中。产生了在CaMV35S启动子下，组成型转录16D10特异性ihpRNA的转基因同源T2系，用于根结线虫，根结线虫(Meloidogyne)种类的抗性分析。 

实施例23：抗性分析 

从pART27衍生的构建体转化生成的拟南芥转基因系的种子，在70％(v/v)中表面消毒1分钟，在3％(v/v)的次氯酸钠中表面消毒5分钟，然后在无菌蒸馏水中洗5次。消毒的种子在Gamborg′s B-5培养基上发芽和生长3周。消毒南方根结线虫虫卵，然后按记载的方法(Sijmons等，1991)，以每株植物约500个卵接种到根部附近。接种后3周，分析感染的根部上的虫瘿数量和大小，接种后8周，感染的根部用酸性品红按记载(Hwang等，2000)染成红色，并分析每克根的虫卵数量。表达 16D10 dsRNA的转基因拟南芥系对四种主要的根结线虫种类有抗性-南方根结线虫，爪哇根结线虫，花生根结线虫和北方根结线虫。根虫瘿分析显示，16D10dsRNA转基因拟南芥系上虫瘿的数量(和大小)，与载体转化系比较，减少了63-90％(图1A、1B和表1)。线虫繁殖分析揭示，与对照植物比较，16D10 dsRNA转基因系每克根的RKN虫卵数量减少了70-97％(图7)。 

表1 

与对照植物比较，接种了四种根结线虫种类(南方根结线虫，爪哇根结线虫，花生根结线虫和北方根结线虫)的表达16D10dsRNA的转基因拟南芥上虫瘿的产生。 

实施例24：16d10序列数据 

16D10基因组DNA序列(840bp) 

GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGGT 

TAGCCAATATTAATTCTTTTGAAATTTTCTTTGCTTCCATAAAT 

TAAAAAAAATTGTTTTTAAGTGAGGGAATGTGGATTAAGCATC 

TTTCTTATTTTTAAAATTTTTGATAGAGTGTAGCGACAGTCAA 

TCAAAATATTTTGATTTTTTTAAAGTTAAAAATTAAGGATGAT 

AAAGAAGTTTAAAATGTAGGTGGAAATATAAGTATACCGAAA 

AACATCTTTTATTTTTAAGTTTAAACAAGCAGTAAAACTTTGT 

CTGGTTTTATCACCGGGCAACTGTAAGGGAAGCTTTAATAAA 

AATTTTGTAAGATACGAAAATCATTGTCCCCAGTAGCTTGAGT 

GATCGAAGCGCCTGGTTGCCATTAAGTTTTTTGCTTGAGACTT 

ATATAACAAGTATATATCAAACCGGATTATAAAGTTAAAGAAC 

AGAAAAAATTTCACGGAATAAATATTGGCTAACCACTCAATTT 

ATTTAATTATTCTTCAATCAAAAAATGTTTACTAATTCAATTAA 

AAATTTAATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTT 

TTGTCTGTCTCATTTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCA 

AATCCTGGAGGAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACG 

TTTAAATTAAACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAG 

CTAATTTTGATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTG 

AATTTACTGAATAAAATTATATCTGAAAAAAA(SEQ ID NO：1) 

(粗体是一个476-bp内含子序列) 

16D10 cDNA序列(364bp) 

GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGTTA 

ATTATTCTTCAATCAAAAAAATGTTTACTAATTCAATTAAAAATTT 

AATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTG 

TCTCATTTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCAAATCCTG 

GAGGAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAAT 

TAAACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTTT 

GATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTGAATTTACT 

GAATAAAATTATATCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAA 

AAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：2) 

用于制作16D10 RNAi构建体的16D10 cDNA序列区 

GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGTTA

ATTATTCTTCAATCAAAAAAATGTTTACTAATTCMTTAAAAATTTA

ATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTGT

CTCATTTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCAAATCCT

GGAGGAAATAAT7GAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAA

TTAAACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTT

TGATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTGAATTTAC 

TGAATAAAATTATATCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 

AAA(SEQ ID NO：2)[粗体42-bp序列用于构建 

pHANNIBAL(16D10#1)，下划线的271-bp序列用于构建 

pHANNIBAL(16D10#2)] 

pHANNIBAL(16D10#1)： 

(a)构建体：(Xho\+42bp 16D10有义链序列+Kpn\＝54bp)+Pdk内含子+(C/al+42bp 16D10反义链序列+Xba\＝54bp) 

Xho1 

CICGAGGGCAAAAAGCCT AGTGGGCCAAATCCTGGAGGAAAT 

AATTGAGGIACC...............Kpn\....................................................Pdk内含子...................................................................................... 

C/al 

ATCGATTCAATTATTTCCTCCAGGATTTGGCCCACTAGGCTTT 

TTGCCICIAGA    Xba1 

SEQ ID NO：3) 

(b)PCR检测：引物H1 F1 & H1 R1(234bp PCR产物) 

引物H1 F2&H1 R2(273bp PCR产物) 

pHANNIBAL(16D10#2) 

(1).构建体#2：(Xho\+271bp 16D10有义链序列+Kpn\＝ 283bp)+Pdk内含子+(C/al+271bp 16D10反义链序列+Xba\＝283bp) 

Xho\ 

CTCGAGCCTCAAAAATACCATAAAGTTAATTATTCTTCAATCA 

AAAAAATGTTT ACTAATTCAATT AAAAATTT AATT ATTT 

ATTTAATGCCTTTATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTGTCTCAT 

TTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCAAATCCTGGAG 

GAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAATTA 

AACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTTT 

GATGGTTTCCTTTGTTAATTTC  GGTACC

               Kpn\-----------------Pdk内含子-------------------- 

C/al 

ATCGATGAAATTAACAAAGGAAACCATCAAAATTAGCTTAATT 

TAAATTCCATTATTTCCCATTTATCGTTTAATTTAAACGTTTTT 

CTTCAATCATTTTTCTTCAATTATTTCCTCCAGGATTTGGCCCA 

CTAGGCTTTTTGCCTGCATCCACAAATGAGACAGACAAAAGCA 

TTAAAGTAACCATTAAAGGCATTAAATAAATAATTAAATTTTT 

AATTGAATTAGTAAACATTTTTTTGATTGAAGAATAATTAACTT 

TATGGTATTTTTGAGG TCTAGA(SEQ ID NO：4) 

                    XaI 

表2 

[0329] 

[0330] 

[0331] 

[0332] 

[0333] 

[0334] 

[0335] 

[0336] 

[0337] 

[0338] 

[0339] 

[0340] 

[0341] 

[0342] 

[0343] 

[0344] 

[0345] 

[0346] 

[0347] 

[0348] 

[0349] 

[0350] 

[0351] 

[0352] 

[0353] 

[0354] 

Claims (12)

1.一种组合物，其包含：对编码由寄生基因16D10编码的多肽的mRNA具有特异性的抑制性dsRNA，当抑制性dsRNA被线虫摄取时，所述抑制性dsRNA的量足以抑制由寄生基因16D10编码的多肽的表达，以及其中抑制性dsRNA靶向所述mRNA的核苷酸区，所述抑制性dsRNA由SEQ ID NOs：3或4的核苷酸序列编码。

2.权利要求1的组合物，其中由寄生基因16D10编码的多肽调节：植物或细胞的基因表达，巨细胞的形成，线虫通过植物根组织的迁移，植物的细胞代谢，在植物细胞内引发信号转导，或形成使线虫从植物中形成的巨细胞取食的取食管。

3.权利要求2的组合物，其中基因表达的调节发生在根细胞中。

4.权利要求1的组合物，其中线虫是根结线虫属的成员。

5.一种载体，包含与编码抑制性dsRNA的核酸可操作连接的启动子，所述抑制性dsRNA对编码由16D10寄生基因编码的线虫食道腺细胞多肽的mRNA具有特异性，其中抑制性dsRNA由SEQ ID NOs：3或4的核苷酸序列编码。

6.一种为植物提供线虫抗性的方法，包括：在植物内表达对由16D10寄生基因编码的线虫食道腺细胞蛋白特异的dsRNA，其中抑制性dsRNA由SEQ ID NOs：3或4的核苷酸序列编码。

7.权利要求6的方法，其中所述线虫是根结线虫属的成员。

8.一种为植物提供对超过一个种的线虫抗性的方法，包括：在植物中表达一种或多种抑制性dsRNA，所述抑制性dsRNA对编码由16D10寄生基因编码的一种或者多种线虫食道腺细胞蛋白的mRNA具有特异性，所述抑制性dsRNA的量足以减少线虫病害并且提供对超过一个种的线虫的抗性，其中抑制性dsRNA由SEQ ID NOs：3或4的核苷酸序列编码。

9.权利要求8的方法，其中一种或多种线虫食道腺细胞蛋白直接或间接调节：植物或细胞的基因表达，巨细胞的形成，线虫通过植物根组织的迁移，植物的细胞代谢，在植物细胞内的信号转导，或形成使线虫从植物中形成的巨细胞取食的取食管。

10.权利要求6或9的方法，其中所述线虫是根结线虫属的成员。

11.权利要求8的方法，其中植物对至少两种不同的根结线虫病害具有抗性。

12.权利要求8的方法，其中植物对南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫引起的线虫病害具有抗性。

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