CN103524611A - 南方根结线虫食道腺特异基因Msp40及其编码蛋白和其应用 - Google Patents

南方根结线虫食道腺特异基因Msp40及其编码蛋白和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种南方根结线虫食道腺特异基因Msp40及其编码蛋白和其作为潜在RNA干扰靶标基因的应用。该Msp40基因编码的蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与线虫致病力相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的编码基因作为潜在的RNA干扰靶标基因，可用来制备dsRNA或RNA干扰载体，通过植物体内及体外RNA干扰线虫Msp40表达，从而显降低线虫致病力，同时也为抗线虫转基因植物的培育奠定了基础。

Description

南方根结线虫食道腺特异基因Msp40及其编码蛋白和其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种南方根结线虫（Meloidogyne incognita）食道腺特异基因及其编码蛋白和其作为潜在RNA干扰靶标基因的应用。
背景技术
根结线虫（Meloidogyne spp.）是一类固着型内寄生植物病原线虫。根结线虫寄主范围广，适应性强，对农业生产危害严重，造成巨大经济损失。在我国以南方根结线虫（M.incognita）分布最广，危害最大，严重威胁我国南方露地及北方保护地农业生产安全。轮作及化学防治等传统的线虫防治方法，存在特异性差、副作用大、防效有限等突出问题。而RNA干扰作为一种新的防治策略及技术，为抗线虫基因工程带来新的突破。通过构建RNA干扰载体，导入植物中表达线虫寄生致病相关基因的双链RNA（dsRNAs）或小干扰RNA(siRNAs)，经口针取食进入线虫体内，引发系统性RNA干扰反应，导致线虫寄生、发育、代谢、运动等相关功能出现障碍甚至死亡，从而使转基因植物实现对寄生线虫的抗性。相关研究表明，食道腺在根结线虫与寄主互作致病过程中发挥重要作用。多数推测的寄生致病相关基因均在线虫食道腺表达，编码产生分泌蛋白，再经由口针穿刺和注射进入植物细胞内，发挥寄生致病相关的复杂功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种南方根结线虫（Meloidogyne incognita）食道腺特异基因Msp40及其编码蛋白和其作为潜在RNA干扰靶标基因的应用。
本发明的一个目的是提供一种蛋白，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与线虫致病力相关的由序列2衍生的蛋白质。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
所述线虫致病力的判断指标具体为寄主单株根结数目或线虫卵数。
编码上述蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。
上述基因为如下1）-4）中任一种的DNA分子：
1）序列表中SEQ ID №：1第75-1019位的核苷酸序列；
2）编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；
3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
上述严格条件也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
其中，序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列全长1217bp，第1-74位核苷酸为5’非翻译区，第1023-1217位核苷酸为3’非翻译区，第75-1019位核苷酸为开放阅读框，编码SEQ ID №.2所示氨基酸序列，将该具有序列表中SEQ ID №：1中第75-1019位的核苷酸序列的片段命名为Msp40。
含有下述1）或2）所述核酸片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌也是本发明保护的范围：
1）编码所述蛋白的核酸分子全长或其任意片段；所述核酸分子可以是DNA，也可以是RNA；
2）所述的编码基因全长或其任意片段。
上述重组载体具体为克隆载体、表达载体中或RNA干扰载体。
扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种dsRNA，所述dsRNA具有下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID №：3所示的核苷酸序列；
2）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
3）与1）或2）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
本发明的还一个目的是提供一种RNA干扰载体，所述载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为X正向—连接区—X反向；X正向为SEQ ID No.1中第289-646位核苷酸所示，X反向为X正向的反向互补片段；
或所述载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为Y正向—连接区—Y反向；Y正向为SEQ ID No.1中第721-1013位核苷酸所示，Y反向为Y正向的反向互补片段。
所述X正向—连接区—X反向片段具有序列表中SEQ ID №.4所述的核苷酸序列；所述Y正向—连接区—Y反向片段具有序列表中SEQ ID №.5所述的核苷酸序列。
所述出发载体具体为pCAMBIA3301。
具体的，所述RNA干扰载体由下述方法制备得到的：将具有SEQ ID №：4或SEQ ID№：5所示核苷酸序列的DNA片段连接入pCAMBIA3301载体骨架中即得。
具体的所述载体骨架将pCAMBIA3301载体经NcoⅠ和BstEⅡ酶切后制得。
本发明的还一目的是提供所述蛋白、所述编码核酸分子、所述编码基因、所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、所述引物对、所述dsRNA、或所述的RNA干扰载体在如下1）-5）至少一种中的应用：
1）防治线虫对植物的侵害；
2）降低线虫的致病力或降低线虫的侵染力；
3）制备具有线虫抗性的转基因植物；
4）抑制靶基因的表达；
5）鉴定靶基因的功能；
所述靶基因为Msp40或其同族基因。
所述防治线虫对植物的侵害具体指降低线虫寄主植物的根结数。
所述降低线虫的致病力具体指降低线虫的卵数。
所述线虫具体为南方根结线虫。
所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
本发明的又一个目的是提供一种制备具有线虫抗性的转基因植物的方法，包括将下述1）-4）任一核酸片段导入目的植物中，得到转基因植物：
1）根据所述蛋白的编码基因全长或其任意片段制备得到的dsRNA；
2）所述的dsRNA；
3）具有序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列的核酸片段
4)具有序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列的核酸片段
所述转基因植物对线虫的抗性强于所述目的植物。
所述1）-4）任一核酸片段是通过所述的重组载体导入目的植物；所述的重组载体具体为前述的RNA干扰载体。
所述转基因植物对线虫的抗性强于所述目的植物具体体现在所述转基因植物被线虫侵染后的单株根结数目少于所述目的植物。
所述线虫具体为南方根结线虫。
所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
本发明的再一目的是提供一种降低线虫的侵染力或致病力的方法，包括如下步骤：使出发线虫食取权利要求6所述dsRNA，得到的目的线虫的侵染力或致病力低于出发线虫。
具体的，所述线虫为南方根结线虫。
附图说明
图1为FITC诱导南方根结线虫二龄幼虫取食情况图。
图2为浸泡诱导南方根结线虫二龄幼虫取食对线虫活力影响情况图。
图3为体外干扰后南方根结线虫二龄幼虫Msp40基因表达情况图，以tubulin作为内参基因。
图4为体外干扰后南方根结线虫二龄幼虫接种番茄与接种未干扰对照组产生根结数统计分析图。
图5为体外干扰后南方根结线虫二龄幼虫接种番茄与接种未干扰对照组产生卵粒数统计分析图。
图6为TS1RNAi及TS2RNAi干扰载体构建示意图。
图7为转TS1RNAi与TS2RNAi拟南芥植株TS1、TS2与Col-0生态型WT接种南方根结线虫后产生根结数统计分析图。
图8为转TS1RNAi与TS2RNAi拟南芥植株TS1、TS2与Col-0生态型WT接种南方根结线虫后产生卵粒数统计分析图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1、南方根结线虫食道腺基因Msp40的获得
取接种南方根结线虫（报道过南方根结线虫的文献信息：殷友琴,杨宝君,王秋丽.根结线虫病的病原鉴定[J].植物保护学报,1989,(03)；公众可从中国农业大学获得该南方根结线虫。）45-60天的番茄根系，洗净后挑取卵块在无菌水中孵化3天，离心收集新鲜的二龄幼虫约l0-20μL。液氮冷冻，组织研磨器破碎样品，用Trizol（Invitrogen）法提取总RNA，Recombinant DNase I（Takara）消化基因组DNA，SuperScriptTMⅢReverse Transcriptase Kit（Invitrogen）反转录得到南方根结线虫二龄幼虫cDNA。以该cDNA为模板，以下列核苷酸序列为引物，进行PCR扩增：
上游引物Msp40cds_F2：5’-GGTCATTCTTATAACTAAAAACCTTCAAAC-3’
下游引物Msp40cds_R2：5’-GGAGGCATTTTTACTAAATTTCGA-3’
PCR扩增体系为：dH2O14.8μL，5×HF PCR buffer5.0μL，2.5mM dNTPs2.0μL，Msp40cds_F21.0μL，Msp40cds_R21.0μL，cDNA1.0μL，Phusion DNA polymerase（NEB）0.2μL，总体系25.0μL。
PCR扩增条件为：94.0℃预变性5min，94.0℃变性30s，58.0℃退火30s，72.0℃延伸1min，共35个循环，72.0℃保温10min后终止反应。
取全部扩增产物加入6×loading buffer于0.8%琼脂糖凝胶中电泳，采用Axygen小量胶回收试剂盒回收产物，与pMD18-T（Takara）载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，以前述引物进行PCR鉴定得到阳性克隆，阳性克隆以载体通用引物测定扩增序列。测序结果表明，上述PCR扩增得到的片段的序列为序列表中SEQ ID №：1的第1-1191位的核苷酸序列，其中SEQ ID №：1的第75-1019位的核苷酸序列为编码序列，编码序列表中SEQ ID №：2所示的氨基酸残基序列，共编码315个氨基酸，将该具有序列表中SEQ ID №：1中第75-1019位的核苷酸序列的片段命名为Msp40。
实施例2、南方根结线虫食道腺基因Msp40的RNA干扰分析
通过人工合成靶基因的dsRNA或siRNA，让线虫二龄幼虫通过取食途径摄取，从而引发内源基因的RNA干扰，称为体外RNA干扰（in vitro RNAi）技术；
一、Msp40体外RNA干扰对线虫致病力影响
1.dsRNA的制备
使用
Figure BDA0000393884380000051
RNAi Kit（Ambion）严格按实验说明人工合成dsRNA。dsRNA合成和纯化试剂盒
Figure BDA0000393884380000052
RNAi Kit（Cat#1626）购自Ambion公司；小量RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit（Cat#74104）购自QIAGEN公司。
1）转录模板制备
a)以南方根结线虫二龄幼虫基因组cDNA为模板，构建针对序列表中SEQ ID №：1第289-644位核苷酸片段的dsRNA。选取Msp40的5’端保守部分设计引物，扩增356bp长度目标区域，保证了无其他与靶基因同源的基因存在，避免非靶效应。引物序列如下：
Msp40T7F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAAGATGCTGAGAGTGCAGAGGAG-3’
Msp40T7R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCTTGTCATCTTCCTCCTTTTTATCC-3’
引物序列中下划线部分为T7启动子序列，是在dsRNA合成过程中供T7RNA聚合酶识别用的。
扩增条件为：95℃预变性5min，前5个循环94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸35s；后30个循环94℃变性30s，67℃退火35s，72℃延伸35，最终72℃延伸10min后终止反应。
有机试剂抽提、沉淀纯化扩增产物。
b)上述扩增产物取5μL电泳检测，保证扩增产物浓度高、无非特异扩增和二聚体存在。
c)检测后的扩增产物加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀后12000rpm离心10min。
d)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），混匀后12000rpm离心10min。
e)取上清，加入2倍体积无水乙醇，1/10体积3M醋酸钠（RNase-free H2O配制）混匀，-20℃沉淀20min。
f)离心12000rpm离心10min，弃上清。
g)加入1mL75%乙醇（RNase-free H2O配制）重悬洗涤沉淀。
h)7500rpm离心5min，弃上清，工作台中风干，溶于适量TE（RNase H2O配制）。
i)分光光度计测OD260，稀释模板为1μg/μL，用于转录。
2)Msp40dsRNA合成与纯化：
使用Ambion公司
Figure BDA0000393884380000061
RNAi Kit（Cat#1626）试剂盒，操作严格按照实验说明。
a）取出10×T7Reaction Buffer于室温放置，其余反应成份置于冰上。在DEPC处理的0.2mL管内加入表1所述反应成份：
表1
Figure BDA0000393884380000062
轻轻吸打混匀。表1中Linear template DNA即为步骤1）制备的转录模板。
b）37℃温育4-6h，可延至16h。75℃5min，自然冷却至室温。
c)取1/400体积的反应产物于1%琼脂糖凝胶上检测。
d)在合成dsRNA反应管中，冰上配制表2所述的反应体系：
表2
Figure BDA0000393884380000071
37℃温育1h（不可超过2h）。
e)预热Elution Solution至95℃。转移dsRNA入一个1.5ml离心管。配制表3所述混合物，轻轻吸打混匀。
表3
Figure BDA0000393884380000072
f)取一滤芯（Filter Carterdge），安放于收集管；吸取500μL的上述混合物于滤柱内。16000g离心2min，弃滤液。吸附柱中加500μL Washing Solution，16000g离心2min，弃滤液，重复一次。16000g离心10-30s，去除痕量液体。将吸附柱转移到一个新的1.5mL离心管，加50-100μL预热至95℃的Elution Solution至吸附柱中。16000g离心2min，-20℃保存备用。
经测序，上述合成的dsRNA具有序列表中SEQ ID №：3所述的核苷酸序列。
2.线虫对dsRNA的摄取
在浸泡条件下，以章鱼胺为刺激剂诱导线虫二龄幼虫取食dsRNA（直接取食dsRNA）。以FITC为指示剂分析诱导取食情况，结果见图1和图2。图1显示，在荧光显微镜下观察，未添加刺激剂章鱼胺的对照组线虫，只在头部前端口针部位有微弱荧光（见图1中标记为章鱼胺-的图片）；而加入章鱼胺过夜诱导的处理组线虫，口针和中食道球部位可以看到明亮的荧光信号（见图1中标记为章鱼胺+的图片），表明处理组线虫大量取食。以中食道球是否有明显的荧光为标准，章鱼胺过夜诱导的处理线虫组与未诱导对照组相比较，统计进食率达93%。另外，处理组（见图2中标记为Oct+的图片）和对照组（见图2中标记为Oct-的图片）线虫都保持蠕动的波形体征，表明浸泡介质对线虫活力没有明显的影响。
3.半定量RT-PCR分析摄取dsRNA后线虫内源Msp40基因的转录产物
对浸泡后各组线虫的Msp40基因转录水平进行半定量RT-PCR分析。Msp40基因半定量引物为：
MSP40F：5’-CTGAAGATGCTGATGAGGG-3’
MSP40R：5’-GAATTATCACCACTTGAACTT-3’
扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环，72℃延伸10min后终止反应。
半定量RT-PCR分析结果见图3。图3结果显示，浸泡诱导取食dsRNA处理组线虫（泳道3和4）PCR扩增后，Msp40片段相对两个对照组（泳道1和2）亮度明显降低，而内参照基因β-tubulin在各体系材料中表达量近似，说明线虫取食dsRNA引发了内源Msp40转录产物的特异性降解。
4.摄取dsRNA后线虫侵染力变化
将体外RNA干扰处理后线虫接种寄主番茄，评价线虫侵染力变化情况，结果见图4和图5。
图4为三次重复试验的结果，其中，接种未处理线虫的两个对照组（CK1，CK2），平均每棵根上发育出根结数目分别为41.36和52.18。与两组对照组相比，接种dsRNA处理后线虫的处理组1（Tre1）的单株根结数目（平均每株23.13）分别减少了44.08%和55.67%；处理组2（Tre2）的单株根结数目（平均每株28.6）分别减少了30.85%和45.19%，均表现出显著性差异（*表示P<0.01），结果表明dsRNA处理后线虫的侵染力显著降低。
图5为将根系上的线虫卵块用1%次氯酸钠溶液洗净后统计卵粒数的结果，其中，两个对照组（CK1，CK2）每克根系上平均卵粒数为6514.97和7312.55，而接种dsRNA处理后线虫的两个处理组（Tre1，Tre2）分别为1387.79为1218.83个。和两组对照组相比，处理组1每克根上的平均卵粒数目分别减少了78.7%和81.02%；处理组2每克根上平均卵粒数目分别减少了81.29%和83.33%，均达到极显著差异（**表示P<0.001），结果显示dsRNA处理后线虫的平均卵粒数目显著减少，侵染力显著降低。
二、Msp40体内RNA干扰对线虫致病力影响
通过构建线虫靶基因的植物RNA干扰载体，遗传转化寄主植物，使线虫在寄生取食过程中从寄主植物细胞中吸取dsRNA或siRNA，从而引发内源基因的RNA干扰，称为体内RNA干扰（in vivo RNAi）技术。
1.植物RNA干扰载体TS1RNAi和TS2RNAi的获得以南方根结线虫二龄幼虫基因组cDNA为模板，构建针对序列表中SEQ ID №：1第289-646位和721-1013位核苷酸片段的植物RNA干扰载体，分别命名为TS1RNAi和TS2RNAi。扩增引物如下：
TS1RNAi正向插入引物为
P1F_BglII：5’-AGATCTAAGATGCTGAGAGTGCAGAGGAG-3’（下划线表示酶切位点BglII）
P1R_EcoRI：5’-GAATTCTCCTTGTCATCTTCCTCCTTTTTATCC-3’（下划线表示酶切位点EcoRI）
TS1 RNAi反向插入引物为
P1F_SalI：5’-GTCGACTCCTTGTCATCTTCCTCCT-3’（下划线表示酶切位点SalI）
P1R_BstEII-BamHI：5’-GGATCCGGTGACCAAGATGCTGAGAGTGCAG-3’（下划线依次表示酶切位点BamHI、BstEII）
TS2 RNAi正向插入引物为
P2F_BglII：5’-AGATCTCATGTAATGGGGATACTGC-3’（下划线表示酶切位点BglII）
P2R_EcoRI：5’-GAATTCAGCTGCTGCAAGTCTCTT-3’（下划线表示酶切位点EcoRI）
TS2 RNAi反向插入引物为
P2F_PstI：5’-CTGCAGAGCTGCTGCAAGTCTCTT-3’（下划线表示酶切位点PstI）
P2R_BstEII-BamHI：5’-GGATCCGGTGACCCATGTAATGGGGATACTGC-3’（下划线依次表示酶切位点BamHI、BstEII）
扩增程序均为：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35s，5个循环；94℃变性30s，64℃退火35s，72℃延伸35s，30个循环，72℃延伸10min后终止反应。
TS1RNAi的构建步骤（图6）：将TS1RNAi正向插入引物扩增得到的产物插入载体pSAT-RNAi（Dafny-Yelin,M.,Chung,S.M.,Frankman,E.L.,and Tzfira,T.(2007).pSAT RNA interference vectors:a modular series for multiple genedown-regulation in plants.Plant Physiol145,1272-1281.公众可从中国农业大学获得该载体）的BglII和EcoRI酶切位点间，得到中间载体Ⅰ；将TS1RNAi反向插入引物扩增得到的产物插入中间载体Ⅰ的SalI和BamHI酶切位点间，得到中间载体Ⅱ；将中间载体Ⅱ上NcoⅠ和BstEⅡ酶切位点间的片段经酶切，连接等过程克隆到植物过表达载体pCAMBIA3301的NcoⅠ和BstEⅡ酶切位点间，得到重组载体即为TS1RNAi。经测序证明，上述得到的重组载体TS1RNAi序列正确，所述重组载体TS1RNAi是将具有序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列插入到表达载体pCAMBIA3301的NcoⅠ和BstEⅡ酶切位点间得到的。
TS2RNAi的构建步骤（图6）：将TS2RNAi正向插入引物扩增得到的产物插入载体pSAT-RNAi的BglII和EcoRI酶切位点间，得到中间载体Ⅰ；将TS2RNAi反向插入引物扩增得到的产物插入中间载体Ⅰ的PstI和BamHI酶切位点间，得到中间载体Ⅱ；将中间载体Ⅱ上NcoⅠ和BstEⅡ酶切位点间的片段经酶切，连接等过程克隆到植物过表达载体pCAMBIA3301的NcoⅠ和BstEⅡ酶切位点间，得到重组载体即为TS2RNAi。经测序证明，上述得到的重组载体TS2RNAi序列正确所述重组载体TS1RNAi是将具有序列表中SEQ ID №：5的核苷酸序列插入到表达载体pCAMBIA3301的NcoⅠ和BstEⅡ酶切位点间得到的。
2.植物RNA干扰载体对线虫致病力影响
构建好的载体经农杆菌LBA4404介导转化拟南芥Col-0型，筛选得到稳定遗传株系，接种南方根结线虫评价体内RNA干扰对线虫致病力影响。结果见图7和图8。
图7显示，与接种Col-0型对照组（WT）相比，接种TS1RNAi的两个转基因株系(TS1)，根结数分别减少50.9%和40.5%，接种TS2RNAi的两个株系(TS2)分别减少45.1%和35.4%，均达到显著差异（**表示与对照组相比差异极显著）。
图8显示，每克根重的卵粒数目和对照株系相比，TS1RNAi两个株系分别减少19.79%和13.75%，TS2RNAi两个株系分别减少了18.20%和2.71%，均达到显著差异（**表示与对照组相比差异极显著；*表示与对照组相比差异显著）。
图7和图8结果表明，利用植物RNA干扰载体TS1RNAi和TS2RNAi对南方根结线虫Msp40基因的表达进行干扰，会导致线虫致病能力指标即寄主根结数及线虫卵数明显下降，说明Msp40基因在南方根结线虫与寄主互作致病过程中发挥重要功能，可作为潜在的RNA干扰靶标基因，且本发明制备的针对Msp40基因表达的植物RNA干扰载体TS1RNAi和TS2RNAi可用于植物防治线虫危害。
Figure IDA0000393884480000011
Figure IDA0000393884480000031
Figure IDA0000393884480000041
Figure IDA0000393884480000051
Figure IDA0000393884480000061

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下1）或2）的蛋白：
1）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与线虫致病力相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID №：1第75-1019位的核苷酸序列；
2）编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；
3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
4.含有下述1）或2）所述核酸片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌：
1）编码权利要求1所述蛋白的核酸分子全长或其任意片段；所述核酸分子可以是DNA，也可以是RNA；
2）权利要求2或3所述的编码基因全长或其任意片段。
5.扩增权利要求2或3所述的编码基因全长或其任意片段的引物对。
6.一种dsRNA，所述dsRNA具有下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID №：3所示的核苷酸序列；
2）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
3）与1）或2）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
7.一种RNA干扰载体，所述载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为X正向—连接区—X反向；X正向为SEQ ID No.1中第289-646位核苷酸所示，X反向为X正向的反向互补片段；
或所述载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为Y正向—连接区—Y反向；Y正向为SEQ ID No.1中第721-1013位核苷酸所示，Y反向为Y正向的反向互补片段。
8.根据权利要求7所述的RNA干扰载体，其特征在于：所述X正向—连接区—X反向片段具有序列表中SEQ ID №.4所述的核苷酸序列；所述Y正向—连接区—Y反向片段具有序列表中SEQ ID №.5所述的核苷酸序列。
9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、权利要求5所述引物对、权利要求6所述dsRNA、或权利要求7或8所述的RNA干扰载体在如下1）-5）至少一种中的应用：
1）防治线虫对植物的侵害；
2）降低线虫的致病力或降低线虫的侵染力；
3）制备具有线虫抗性的转基因植物；
4）抑制靶基因的表达；
5）鉴定靶基因的功能。
所述靶基因为权利要求2或3所述基因或其同族基因。
10.一种制备具有线虫抗性的转基因植物的方法，包括将下述1）-4）任一核酸片段导入目的植物中，得到转基因植物：
1）根据权利要求1所述蛋白的编码基因全长或其任意片段制备得到的dsRNA；
2）权利要求6所述的dsRNA；
3）具有序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列的核酸片段；
4)具有序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列的核酸片段；
所述转基因植物对线虫的抗性强于所述目的植物；
或一种降低线虫的侵染力或致病力的方法，包括如下步骤：使出发线虫食取权利要求6所述dsRNA，得到的目的线虫的侵染力或致病力低于出发线虫。
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