UA127447C2 - Спосіб трансфекції рослин і скорочення подій випадкової інтеграції - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу трансфекції рослини й експресії в рослинах молекул РНК або поліпептиду. Зокрема, рослини, що мають знижену експресію й/або активність POLQ. трансфікують для того, щоб знизити події випадкової інтеграції.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ

У даному винаході запропоновані способи трансфекції рослини й експресії в рослинах молекул РНК або поліпептиду. Зокрема, рослини, що мають знижену експресію й/або активність

РОГО, трансфікують для того, щоб знизити події випадкової інтеграції. У винаході також запропоновані трансфіковані рослини та потомство рослин, одержаних способами, описаними у даному документі.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Генетична модифікація рослин шляхом трансфекції дозволяє вносити в їх ознаки зміни, такі як підвищена врожайність, стійкість до хвороб і шкідників, підвищена вегетативна біомаса, стійкість до гербіцидів, харчова цінність, стійкість до посухи та стресів, а також важливі для садівництва якості, такі як пігментація та зростання, й інші агрономічні характеристики для поліпшення сільськогосподарських культур. Крім того, генетичну модифікацію рослин використовують в якості системи для експресії рекомбінантних білків.

Трансфекція рослин нуклеїновою кислотою в даний час є стандартною практикою, яку можна проводити рядом різних способів, відомих в даній області техніки. Однак одним із недоліків існуючих способів трансфекції є те, що порівняно часто відбувається випадкова інтеграція ДНК в геном хазяїна. Випадкова інтеграція може мати непередбачені та/або шкідливі наслідки для організму-хазяїна. Крім того, інтеграція ДНК в геном рослин не завжди бажана, особливо коли генетично модифіковані (ГМО) рослини викликають екологічні та політичні проблеми. Таким чином, залишається потреба в розробці поліпшених систем для експресії трансгенів у рослинах.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Відповідно до одного аспекту у винаході запропонований спосіб скорочення випадкової інтеграції трансфікованих молекул нуклеїнової кислоти в рослинну клітину, зазначений спосіб включає забезпечення рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, при цьому експресія й/або активність РОГ О в зазначеній рослинній клітині знижена.

Відповідно до додаткового аспекту у винаході запропонований спосіб трансфекції рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, спосіб включає забезпечення рослинної клітини

Зо молекулою нуклеїнової кислоти, при цьому експресія й/або активність РОЇ СО) в зазначеній рослинній клітині знижена.

У переважних варіантах реалізації способи застосовують для спрямованого впливу на ген.

Зокрема, способи призначені для одержання рослинної клітини, яка в результаті генетичної рекомбінації несе у певній ділянці свого генома послідовність ДНК.

Відповідно до додаткового аспекту у винаході запропонований спосіб експресії в рослинній клітині молекули РНК або поліпептиду, спосіб включає забезпечення рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує зазначену молекулу РНК або поліпептид, при цьому експресія й/або активність РОГ О в зазначеній клітині-хазяїні знижена.

Відповідно до додаткового аспекту у винаході запропонований спосіб одержання рослини, що експресує молекулу РНК або поліпептид, спосіб включає забезпечення рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує зазначену молекулу РНК або поліпептид, при цьому експресія й/або активність РОГ О в зазначеній клітині-хазяїні знижена, й одержання рослини із зазначеної рослинної клітини.

Переважно молекулу нуклеїнової кислоти трансфікують в рослинну клітину, що має знижену експресію й/або активність Рої0). У деяких варіантах реалізації молекулу нуклеїнової кислоти трансфікують в рослинну клітину тимчасово. Переважно нуклеїнова кислота містить рослинну експресійну касету. Переважно рослинна експресійна касета містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид або молекулу РНК ії регуляторні послідовності, що керують експресією.

Переважно нуклеїнова кислота являє собою нуклеазу. Переважно нуклеїнова кислота є компонентом системи Стізрг/Сав.

У деяких варіантах реалізації молекула нуклеїнової кислоти вбудована у визначений сайт в хромосомі рослинної клітини шляхом генетичної рекомбінації (або, скоріше, шляхом сайт- специфічної генетичної рекомбінації або гомологічної рекомбінації). Переважно, така стабільна інтеграція призводить до експресії гетерологічного поліпептиду або молекули РНК. У деяких варіантах реалізації інтеграція є результатом гомологічної рекомбінації. У деяких варіантах реалізації така стабільна інтеграція руйнує або модифікує ендогенний ген. У деяких варіантах реалізації інтеграція є результатом сайт- специфічної рекомбінації.

У деяких варіантах реалізації зазначена рослинна клітина містить антисмисловий олігонуклеотид, специфічний для пре-мРНК, кодованої геном РОГО, або дволанцюгову бо молекулу РНКІ, специфічну для пре-мРНК, кодованої геном РОГ СО). У деяких варіантах реалізації рослинна клітина містить мутантний ген РОГО). У деяких варіантах реалізації в рослинній клітині ген РОГ О нокаутований.

Відповідно до додаткового аспекту у винаході запропонована рослина, одержана описаними у даному документі способами, та її нащадки (включаючи насіння). Переважно зазначена рослина та її нащадки містять молекулу нуклеїнової кислоти, стабільно інтегровану в геном шляхом генетичної рекомбінації (тобто сайт-специфічна, а не випадкова інтеграція).

У деяких варіантах реалізації, згаданих вище, зазначена рослинна клітина не є Агарійорвів

Іпа!апа.

Відповідно до додаткового аспекту у винаході запропонована рослина або рослинна клітина, в якій експресія й/або активність РОЇ О в зазначеній рослині або рослинній клітині знижена, і в якій зазначена рослина або рослинна клітина не є Агабідорзіз Іпа!апа. У винаході додатково запропоноване застосування зазначених рослин і клітин для трансфекції молекули нуклеїнової кислоти.

Відповідно до додаткового аспекту у винаході запропоноване застосування рослини або рослинних клітин, що мають знижену експресію й/або активність РОЇ О для одержання рослини, що експресує молекулу РНК або поліпептиду, в якій а) молекула нуклеїнової кислоти, що кодує зазначену молекулу РНК або поліпептиду, не інтегрована в хромосому рослинної клітини або б) молекула нуклеїнової кислоти, що кодує зазначену молекулу РНК або поліпептиду, інтегрована шляхом сайт-специфічної генетичної рекомбінації або гомологічної рекомбінації в хромосому рослинної клітини.

КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

Фігура 1: Рослини, дефіцитні за Ро! 86, насилу піддаються інтеграції Т-ДНК шляхом трансформації методом занурення квітки. Принцип трансформації методом занурення квітки: (1)

Квітучі рослини А. Іла/апа занурюють в суспензію, що містить клітини Адгобасіепит, після чого (2) рослині дають можливість утворювати насіння. (3) Насіння, маленький відсоток яких міг стати трансгенним (відзначений жовтим), висівають (4) на тверде середовище, що містить відповідний гербіцид як селективний маркер. р, Репрезентативні зображення пластин, що містять гербіцид фосфінотрицин (ФФТ), на які висівають насіння дикого типу (ліворуч) та насіння бер-5 (праворуч), зібрані після трансформації методом занурення квітки.

Зо Трансформовані пророщення, що мають стабільно інтегровану Т-ДНК, яка містить селективний маркер, стійкі до ФФТ. с, Експерименти із зануренням квітки проводили із застосуванням двох різних «обеззброєних» штамів Адгобрасіелит: |ВА1100 з додаванням бінарного вектора рСАМВІАТ301 ї АбІ1 з додаванням бінарного вектора рЗОМ3900. а, Репрезентативні зображення ембріонів, що розвиваються, тимчасово експресуючих інтрон-вмісний ССуєЄ репортерний ген (ди5А) під контролем промотору АСТТІ1 (синій) в стручках, що розвиваються.

Фігура 2: РоїЇ 9 необхідна для опосередкованої трансгенезом Агарідорзі5 трансформації коренів. Принцип трансформації коренів. Насіння пророщують в рідкій культурі (1) та в 10- денних проростках А. ІЛла/апа, що до цього культивувалися два-три дні на твердому середовищі та разом з клітинами Адгобасіегіит, збирають корені (2). Калусам/пагонам дають можливість сформуватися на твердому середовищі, що містить гербіцид ФФТ, і після трьох тижнів переносять на свіжі планшети, на яких паростки, що мають стабільно інтегровану Т-ДНК і в результаті цього мають маркер стійкості, можуть продовжувати зростання (3) б,

Репрезентативні зображення планшетів, що містять гербіцид фосфінотрицин (ФФТ), на якому вирощували корені дикого типу (ліворуч) та /еб-5 (праворуч), щоб дати можливість сформувати паростки. Паростки дикого типу (ліва панель) мають набуту стійкість до ФФТ, що вказує на стабільну інтеграцію Т-ДНК, а паростки /ер-5 (права панель) занепадають. с, За допомогою

ТАП-ПЛР для відновлення сполук Т-ДНК рослинний геном одержують продукти для більшості калусів дикого типу (верхня панель), а калуси Тер-5 не дають яких-небудь продуктів у ТА -ПЛР (нижня панель). й, Експлантат дикого типу, в якому стрілка вказує на бО5-позитивну ділянку, де

Адгобасіегшт доставив одну або більше Т-ДНК, що містять інтрон-вмісний репортерний ген си. е, О5-позитивні ділянки в експлантаті підрахували для дикого типу Со1-0, теб-2 і Тер-5. На один експеримент підраховували щонайменше 100 кореневих експлантатів. Її. Утворення зелених паростків, що вказує на стабільну інтеграцію Т-ДНК, підраховували для дикого типу Со1-

О, Тер-2 і тер-5.

Фігура 3: Філер ДНК відображає РоїЇ 96-залежне подовження мінімально парних молекул Т-

ДНК - геном АгаБбідорзі5. а, Передбачувана дія Ро! 89 при інтеграції Т-ДНК: Синтез ДНК за допомогою Рої, 89 стабілізує мінімально парні виступаючі 3' кінці ДНК, один кінець одержаний з

Т-ДНК, а інший - з генома Агабрійорзіз. Сполуки Т-ДНК-геном являють собою один із двох типів: - 5795 секвенованих сполук містять філерну ДНК, а - 4395 секвенованих алелей не містять бо філера. Ю, Схематичне зображення найбільшої загальної підпослідовності (ІС5). Для кожного філера (синій) визначають найбільшу загальну підпослідовність між філером і цільовою послідовністю. с, Зображення теплової карти ЇС55 для Т-ДНК з філерами розміром від 6 до 40 нуклеотидів. На лівій панелі нанесена псевдо-випадкова ймовірність (див. деталі в розділі

Методи), а в середній панелі відображений повний набір даних, у якому простір пошуку містить геномну послідовність Агарідорзіх по обидва боки інсерції Т-ДНК (від -120 пар основ до ж 160 пар основ по відношенню до сполуки), 160 пар основ послідовності Т-ДНК всередині інсерції (починаючи від сполуки) і 120 пар основ початкового оточення Т-ДНК, яке являє собою плазмідну ДНК. На правій панелі зображений диференціал даних понад імовірності, який в такий спосіб візуалізує надпредставленість (від жовтого до червоного) та недопредставленість (від блакитного до темно-синього). З цієї диференціальної теплової карти відсоток інтеграцій н-

ДНК, в яких їх родинні філери в 10 разів перевищують імовірність, становить 48,290. й,

Підкатегорія (п - 1653), як визначено в с, використана для нанесення ділянки з урахуванням сайту інтеграції (розмір сайту 5 пар основ). є, Зображення теплової карти філерів, що містять сполуки Т-ДНК, на якій філери, що містять сполуки нанесені відповідно до їх родинних відповідних до філерів послідовностей поблизу від сполук для візуалізації ступеня ідентичності послідовностей. ї, Зображення теплової карти сполук інтеграції Т-ДНК без філерів, у яких визначають ступінь ідентичності послідовностей між Т-ДНК і геномом Агабрідйорвів.

Фігура 4. Модель інтеграції Т-ДНК. а, Т-ДНК переважно захоплена на 3' кінці, де рої ОО може подовжувати від праймінгу шляхом мінімального спарювання основ. Наступне захоплення 5' кінця геномом призводить до інсерції одноланцюгової Т-ДНК в геном (ліве зображення). Однак у більшості випадків (6395) спостерігаються подвійні інтеграції, де обидві Т-ДНК інвертовані, що вказує на переважне захоплення З3' кінця Т-ДНК рослинним геномом. Б, після захоплення 3' кінця Т-ДНК, цикли праймінгу, що повторюються, подовження та перемикання праймер-матриці призводять до інсерції Т-ДНК з мозаїчно працюючими філерами, що несуть множинні інсерції матриці.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС РОЗКРИТИХ ВАРІАНТІВ РЕАЛІЗАЦІЇ ВИНАХОДУ

В цілому генетична рекомбінація в рослинах є в основному не гомологічною, або, скоріше, інтродукована ДНК випадковим чином вставляється у будь-яке положення на хромосомі.

Випадкова інтеграція може мати негативні наслідки, якщо інтродукована ДНК порушує, наприклад, експресію ендогенного гена. Крім того, експресія РНК або білка, кодованих випадковим чином інтегрованою ДНК, менше передбачувана, ніж при сайт-специфічній інтеграції, оскільки на експресію можуть впливати як ділянка інтеграції, так і кількість подій інтеграції. Однією з цілей способів, описаних у даному документі, є зниження (включаючи усунення або уникнення) або усунення випадкової інтеграції трансфікованої ДНК. Додатковою метою способів є забезпечення ефективного способу адресної взаємодії з геном.

У деяких випадках бажана тільки транзієнтна трансфекція ДНК в рослину. Можуть бути, наприклад, екологічні або політичні причини, щоб уникати або обмежувати застосування (стабільно) генетично модифікованих рослин. Крім того, в деяких ситуаціях бажана експресія може бути потрібна лише на короткий час. Однією з цілей способів, описаних у даному документі, є забезпечення способів і рослин, у яких молекула нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, трансфікована лише тимчасово, або, скоріше молекула нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, не вставлена в хромосоми рослини. У переважних варіантах реалізації трансфікована нуклеїнова кислота являє собою нуклеазу або компонент системи

Стіврг/Сав.

Відповідно до одного аспекту у винаході запропоновані способи трансфікування рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес. Трансфіковані рослинні клітини можна застосувати для експресії РНК або поліпептиду, що представляють інтерес. З таких трансфікованих рослинних клітин можна створити рослини. Запропоновані способи скорочення випадкової інтеграції трансфікованих молекул нуклеїнової кислоти.

Описані у даному документі способи включають забезпечення молекули нуклеїнової кислоти в рослинній клітині, де експресія РОГ СО) в рослинній клітині знижена. Як показано у прикладах, трансфекція рослин зі зниженою експресією РОГО призводить до усунення випадкової інтеграції трансфікованої молекули нуклеїнової кислоти.

У деяких варіантах реалізації переважними є способи, що забезпечують транзієнтну експресію РНК або поліпептиду, що представляють інтерес. В інших варіантах реалізації переважними є способи, що забезпечують стабільну, сайт-специфічну інтеграцію молекули нуклеїнової кислоти шляхом генетичної рекомбінації. Транзієнтна експресія відноситься до експресії молекули нуклеїнової кислоти, яка не інтегрована в хромосому хазяїна, але функціонує незалежно. Стабільна інтеграція відноситься до інтеграції нуклеїнової кислоти в бо ДНК хазяїна ковалентними зв'язками. «Генетична рекомбінація» робить можливим введення вибраної нуклеїнової кислоти в геном у певній ділянці та містить в собі як гомологічну рекомбінацію, так і сайт-специфічну рекомбінацію.

Нуклеїнову кислоту, що переважно представляє інтерес, не вставляють шляхом негомологічної рекомбінації. Розкриті у даному документі способи описані як створення клітин і рослин, у яких нуклеїнова кислота, що представляє інтерес, не інтегрована в хромосому рослинної клітини (тобто транзієнтна трансфекція) або інтегрована в хромосому рослинної клітини шляхом сайт-специфічної рекомбінації або гомологічної рекомбінації. Фахівцю повинно бути зрозуміло, що при здійсненні описаних тут способів можна одержати маленький відсоток рослинних клітин, у яких нуклеїнову кислоту, що представляє інтерес, вставили шляхом негомологічної комбінації. Однак фахівець може легко визначити та виключити такі рослинні клітини.

Будь-яку підходящу молекулу нуклеїнової кислоти можна застосувати для трансфекції рослинної клітини. Хоча переважною молекулою нуклеїнової кислоти є ДНК, трансфекція РНК також входить в обсяг винаходу. Наприклад, Ен зі співавт. описує спосіб трансфекції РНК в

Агарідорвів (Ап еї аї. Віозсі Віоїесппо! Віоспет, 2003 Оес, 67 (12): 2674-7).

Переважно молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид або молекулу РНК (наприклад, кодуюча поліпептид РНК або не кодуюча РНК, наприклад, довга не кодуюча РНК, мікроРНК, тРНК, рибосомна РНК, мякРНК і т.д.). Молекули нуклеїнової кислоти, що представляють інтерес, включають ті, які впливають на стійкість рослини до інсектицидів, стійкість до захворювань, стійкість до гербіцидів, вміст живильних речовин і целюлози, стійкість до абіотичного стресу, гени підвищення врожайності, гени стійкості до посухи, гени стійкості до холоду, стійкість до антибіотиків і маркерні гени.

Наприклад, в заявці 0520140130207 описані молекули РНК-інтерференції, які можуть експресуватися в рослинах, забезпечуючи тим самим стійкість до шкідників і патогенів.

Переважно трансфікована молекула нуклеїнової кислоти є гетерологічною. В даному описі гетерологічна нуклеїнова кислота (або гетерологічний ген) містить в собі нуклеїнову кислоту, що зазвичай не виявляється в рослині, наприклад, нуклеїнову кислоту з інших видів. Гетерологічна нуклеїнова кислота також містить в собі нативний для організму полінуклеотид, який був змінений яким-небудь чином (наприклад, мутував, доданий у декількох копіях, пов'язаний з не

Зо нативною промоторною або енхансерною послідовністю, і так далі). Гетерологічні рослинні гени відрізняються від ендогенних рослинних генів тим, що гетерологічні генні послідовності зазвичай з'єднані з нуклеотидними послідовностями, що містять регуляторні елементи, такі як промотори, які у природі не пов'язані з геном білка, кодованого гетерологічним геном, або з послідовностями рослинного гена в хромосомі, або пов'язані з тими ділянками хромосоми, де вони не зустрічаються у природі (наприклад, гени, що експресуються в локусах, де ген у нормі не експресується).

У деяких варіантах реалізації трансфікована молекула нуклеїнової кислоти являє собою нуклеазу. Переважні нуклеази включають нуклеази «цинкові пальці» (2ЕМ), ефекторні нуклеази, подібні до активаторів транскрипції (ТАГЕМ), нуклеази коротких паліндромних повторів, регулярно розташованих групами (СКІЗРК), мегануклеази та нікуючі ендонуклеази. Такі нуклеази можна застосовувати в способах редагування гена або генома.

Переважно, трансфікована молекула нуклеїнової кислоти є частиною системи Стгізрг/Сав, такої як Са5 нуклеаза та/або направляюча нуклеїнова кислота. Як відомо фахівцям, систему

Стізри/Сабє можна використовувати для редагування генів. Застосовуючи цю систему, гени можна редагувати, мутувати, заміняти або піддавати нокауту. Стгізрг/Саз/Саб5 також можна застосовувати для модуляції експресії генів за допомогою модифікованих «мертвих» білків Сав, зшитих з доменами активації транскрипції (див., наприклад, останні огляди методики в Стгізрг в

Кпагоаіа єї аї. Егопіег5 іп Ріапізсіеєпсе 2016 7: стаття 506 і Ма єї аі. РЕВ5 дошигпа! 2014 5186- 5193).

У переважних способах винаходу трансфікують молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білок Са5. Білок Са5 може бути білком Сазх типу І, типу Ії, типу Ії, типу ІМ, типу М або типу МІ.

Білок Са5 може складатися з одного або більше доменів. Необмежуючі приклади доменів включають домени розпізнавання направляючої нуклеїнової кислоти та/або зв'язування з нею, нуклеазні домени (наприклад, домени ДНКази або РНКази, КимсС, НМН), ДНК-зв'язуючий домен,

РНК-зв'язуючий домен, домени гелікази, домени білок-білкової взаємодії та домени димеризації. Домен розпізнавання направляючої нуклеїнової кислоти та/або зв'язування з нею може взаємодіяти з направляючою нуклеїновою кислотою. У деяких варіантах реалізації нуклеазний домен може містити одну або більше мутацій, що дають в результаті ніказу або «мертвий» фермент (тобто нуклеазний домен з нестачею каталітичної активності).

Переважні білки Са5 включають с2с1, С2с2, с203, Са51, Са51В, Саз52, Са53, Са54, Сав5,

Сазбе (Сазбр), Сазі, Сазбе, Сазбї, Са57, Сазва, Сазва1, Сазваг, Саз8бр, Сазвс, Са59 (С5п1 или

Свх12), Сав510, Савз10йд, Сав510, Са5104, Сави, Сава, СавзН, Ср, Сзу!, Свуг, Сзу3, Свеї (СавзаА),

Сзе2 (СазВ), СзеЗ (СазЕ), Свєе4 (СаО), Се5с1, Свс2, Сваб5, С5п2, Сбете2, Сет3, Сет, С5т5, б5тб, Ст, СтіЗ3, Стг4, Сто, Стгб, С5Б1, С502, С5р3, С5х17, Сех14, Сех10, Сех16, Сзах,

Сех3, Сехі!, Сех15, С5/И, Сві2, Св5і3, С5ї4 и Сшебб, а також їх гомологи або модифіковані варіанти.

У переважних способах винаходу адресно взаємодіюча послідовність Стізрг трансфікована.

Такі послідовності відомі фахівцям і включають РНК (направляючі РНК), сгРНК, їгастРНК і 5ОРНК. Адресно взаємодіюча послідовність Стгізрг зв'язується 3 комплементарною послідовністю в геномі рослини-хазяїна й адресно взаємодіє з білком Савз у відповідній ділянці.

Трансфекція системи Стгізрг/Саз в рослинну клітину зі зниженою експресією й/або активністю

РОГО знижує випадкову вставку компонентів Стієрг/Сає5 в геном рослини. Не бажаючи бути зв'язаними теорією, транзієнтна трансфекція компонентів Стізрг може знижувати не направлену дію та/або підвищувати специфічність системи Стгізрг/Са5. В інших варіантах реалізації винаходу запропоновані способи створення рослин, у яких компоненти Стгізрг (такі як фермент

Са5) є стабільно трансфектованими шляхом генетичної рекомбінації або гомологічної рекомбінації.

У деяких варіантах реалізації запропоновані способи транзієнтної трансфекції молекули нуклеїнової кислоти. Переважно молекула нуклеїнової кислоти для транзієнтної трансфекції містить рослинну експресійну касету. Підходяща рослинна експресійна касета містить 5'ї 3 регуляторні послідовності, функціонально пов'язані з нуклеотидною послідовністю, що кодує транскрипт. Термін «функціонально пов'язаний» відноситься до нуклеотидних послідовностей в одному фрагменті нуклеїнової кислоти, пов'язаних таким чином, що функцію однієї регулює інша. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю так, що він здатний регулювати експресію цієї кодуючої послідовності (тобто кодуюча послідовність перебуває під транскрипційним контролем даного промотору).

Переважно рослинна експресійна касета містить промотор, який стимулює експресію в рослинах і сигнал поліаденілювання. Приклади промоторів експресії нуклеотидної послідовності

Зо включають рослинні промотори, такі як промотор Самм з355 (Оаеї еї аїІ., 1985), Самм 195 (Гаулоп еї аї., 1987), поз (Ерегі еї аї., 1987), Аап (Уокер еї аї., 1987), сахарозосинтазу (Хапод і

ВиззеїЇ, 1990), а-тубулін, актин (Умапо еї аї., 1992), саб (Зц!іїмап еї аї., 1989), Сазе (Нидзреїй апа

Сгша, 1989) або пов'язані з комплексом К-гена (СпапаІєг еї аї., 1989). Можна також застосовувати тканиноспецифічні промотори, такі як промотори клітин кореня (Сопкіїйпо еї аї., 1990) та тканиноспецифічні енхансери (Фромм еї аї., 1986). Приклади рослинних векторів експресії включають докладно описані у: ВесКег, 0. еї аї., 1992, Мем ріапі Бріпагу месіог5 уУ/йп взеІестаріє таКегзв Іосаїей ргохітаї! їю ІНе Іеїї рогаеєг, Ріапі Мо). Віої. 20: 1195-1197; і Вемап, М. УМ., 1984, Віпагу Адгорасієтішт месіогзв Тог ріапі Ігапотоптаїйоп, Мисі. Асіа. Нев. 12:8711-8721; і Месіог5

Тог Сепе Тгапзотег іп Нідпег Ріапів; у: Тгапздепіс Ріапів5, Мої. 1, Епдіпеегіпд апа ІЛії2айоп, еав5.:

Кипоа і К. УМи, Асадетіс Ргез5, 1993, С. 15-38.

У деяких варіантах реалізації запропоновані способи, які забезпечують стабільну, сайт- специфічну інтеграцію молекули нуклеїнової кислоти шляхом генетичної рекомбінації. Сайт- специфічна інтеграція відноситься до інтеграції у певну ділянку генома, яка залежить від нуклеотидної послідовності в геномі. Це відрізняє її від випадкової інтеграції. В одному варіанті реалізації нуклеїнова кислота інтегрована в геном рослини шляхом гомологічної рекомбінації.

Відомі підходящі способи та вектори для індукування гомологічної рекомбінації. Наприклад, можна одержати вектор гомологічної рекомбінації, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, фланковану на її 5'- і 3'-кінцях нуклеотидними послідовностями, які гомологічні ендогенним рослинним послідовностям. Гомологічну рекомбінацію можна застосовувати, наприклад, для заміни на хромосомі гена дикого типу новим геном, що немає до нього відношення, інактивованим геном або модифікованою версією гена дикого типу (новим алелем). Гомологічну рекомбінацію можна також індукувати нуклеазами, такими як нуклеази "цинкові пальці" (2ЕМ), ефекторні нуклеази, подібні до активаторів транскрипції (ТАГЕМ), нуклеази коротких паліндромних повторів, регулярно розташованих групами (СКІ5РК), мегануклеази та нікуючі ендонуклеази.

Наприклад, нуклеїнова кислота може кодувати форму ендогенного поліпептиду, що мутувала, або молекули РНК. Мутації можуть призводити до посилення функції або втрати функції (наприклад, інактивуюча мутація). У деяких варіантах реалізації нуклеїнові кислоти можуть містити, наприклад, першу ділянку, другу ділянку та третю ділянку. Перша та третя бо ділянки по суті гомологічні гену, що представляє інтерес. Друга ділянка може містити мутуючі форми ендогенного гена або, наприклад, кодувати маркер. Переважно маркер являє собою позитивний маркер селекції, такий як ген стійкості до лікарських засобів, ген, що кодує поверхневий маркер, ген, що кодує флюоресцентний маркер, або ген, що кодує В- галактозидазу. Підходящі для рослин способи та вектори гомологічної рекомбінації відомі в даній області техніки й описані, наприклад, в заявці УМО2003027261.

В одному варіанті реалізації нуклеїнова кислота інтегрована в геном рослини шляхом сайт- специфічної рекомбінації. В рослинах протестовано декілька систем сайт-специфічної рекомбінації включаючи систему СтеЛох, систему БіІр/ьКЕТ і систему Е/К5. Рекомбінази виявляють свої ефекти шляхом стимуляції рекомбінації між двома рекомбінуючими ділянками.

У випадку сге сайт рекомбінації є сайтом Г ох, а у випадку Рір сайт рекомбінації є сайтом Нії. Ці сайти рекомбінації містять паліндроми, розділені асиметричною послідовністю. Рекомбінація між цільовими сайтами, розташованими паралельно (так звані «прямі повтори») на одній і тій самій лінійній молекулі ДНК, призводить до видалення проміжної послідовності ДНК у вигляді кільцевої молекули. В описаних у даному документі способах для трансфекції молекули нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, фланкованої відповідною розпізнаваною послідовністю разом з підходящою рекомбіназою (наприклад, РіІр, Сте, або К рекомбіназа), можна застосовувати рослини та рослинні клітини, що несуть в своєму геномі стабільні розпізнавані послідовності (наприклад, сайт ЕКТ, ох або К5). Трансфекція призводить до стабільної інтеграції молекули нуклеїнової кислоти.

При транзієнтній або стабільній трансфекції трансфікована молекула нуклеїнової кислоти може містити селективні або скриновані маркери. «Маркерні гени» являють собою гени, які надають певний фенотип клітинам, що експресують маркерний білок, і таким чином дають можливість відрізнити трансфіковані клітини від клітин, у яких маркер відсутній. Такі гени можуть кодувати селективний або скринований маркер, залежно від того, чи наділяє маркер ознакою, яку можна «відібрати» хімічними засобами, тобто за допомогою селективного агента (наприклад, гербіциду, антибіотика або тому подібного), або ж це просто ознака, яку можна визначити шляхом спостереження або тестування, тобто, «скринінгу» (наприклад, зелений флюоресціюючий білок). Селективні маркерні гени включають гени, що кодують стійкість до антибіотиків, які, наприклад, кодують неоміцин фосфотрансферазу І (МЕО) і гігроміцин

Зо фосфотрансферазу (НРТ), а також гени, що наділяють стійкістю до гербіцидних сполук. Гени стійкості до гербіцидів зазвичай кодують модифікований цільовий протеїн, нечутливий до гербіциду, або фермент, який розщеплює або нейталізує гербіцид в рослині, перш ніж той почне діяти. (Див. ЮОеріоскК, еї аї., (1987) ЕМВО 3. 6:2513-2518; ОебріоскК, еї а!., (1989) Ріапі Рпузвіої. 91:691-704; Еготт, єї аї., (1990) 8:833-839; Согдоп-Катт, еї а!., (1990) 2:603-618). Наприклад, стійкість до гербіцидів гліфосату або сульфонілсечовини одержують за допомогою генів, що кодують мутантні цільові ферменти, З-фосфатсинтазу (ЕРБР5) й ацетолактатсинтазу (АЇ 5).

Багато прикладів підходящих маркерних білків відомі в даній області техніки та можуть бути застосовані у практиці здійснення даного винаходу. У переважних варіантах реалізації способів винаходу наявність селективного або скринованого маркера перевіряють в трансфікованих рослинних клітинах або регенерованих із них рослинах. «Трансфекція» у даному документі визначається як процес уведення нуклеїнової кислоти в рослинну клітину та містить в собі термін «трансформація». Рослинні клітини та частини рослин включають окремі клітини та тканини з пилку, насінинозачатків, листків, ембріонів, коренів, кінчиків кореня, пильовиків, квіток, фруктів, пагонів, стебел і насінин; а також пилок, насінинозачатки, листки, ембріони, корені, кінчики кореня, пильовики, квітки, фрукти, стебла, паростки, черенки, кореневі паростки, насіння, протопласти, калус і таке інше. Трансфекція може відбуватися у природніх або штучних умовах із застосуванням різних загальновідомих в даній області техніки способів. Підходящі способи включають вірусну інфекцію, електропорацію, ліпофекцію та бомбардування частинками. Приклади подібних методик описані у Ра57Кому5Кі еї аІ.,, ЕМВО 4). 3: 2717-2722 (1984), Роїгукиз вї а!., Мої. Сеп. Сіепеї. 199: 169-177 (1985), Веїсн е! аї.,

Віотесппоіоду 4: 1001-1004 (1986), і Ківїп еї аІ., Маїшге 327: 70-73 (1987). Трансфекція включає введення нуклеїнової кислоти в клітини рослин фізичними або хімічними способами або за допомогою вірусної інфекції. Однак фахівцю в даній області техніки повинно бути зрозуміло, що цей процес не містить в собі введення нуклеїнової кислоти шляхом схрещування.

Застосувавши стандартні методики, відомі в даній області техніки, з трансфікованих клітин можна регенерувати цілу рослину. На додаток до трансфекції культивованих іп міго рослинних клітин, тканин або органів, можна також трансфікувати цілу живу рослину. Для введення генів у рослинні клітини широко застосовують систему передачі, опосередковану Адгобрасіегішт, за допомогою якої можна ввести ДНК в тканини цілої рослини. Підходящі процеси містять в собі бо занурення саджанців, листків, коренів, насінинозачатків і так далі в суспензію Адгобасіегійт, що можна підсилити вакуумною інфільтрацією, а також для деяких рослин застосовують занурення квітучої рослини в розчин Адгорасіегішт (занурення квітки), після чого запліднюють трансформовані гамети.

Успішно трансфікованим клітинам, які переважно ідентифікують шляхом селекції або скринінгу та культивують у відповідному середовищі, що сприяє регенерації, потім дадуть можливість регенерувати в рослину. «Регенерація» відноситься до процесу вирощування рослини з рослинної клітини (наприклад, рослинного протопласта або експлантата), і такі способи загальновідомі в даній області техніки.

У переважному варіанті реалізації молекулу нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, трансфікують за допомогою системи Т-ДНК Адгорасіегішт. Підходящі штами Аадгобасіегійт включають І! ВА4404, ЕНАТО1, С58, ЕНА1ТО5, АСІ 1 або 5М3101. Т-ДНК може являти собою модифіковану плазміду Ті або штучний вектор, одержаний з плазміди Ті (що викликає пухлину плазміди), до яких у даному документі відноситься позначення «Т-ДНК вектор». Плазміда Ті являє собою кільцеву молекулу ДНК, що містить ділянку Т-ДНК їі ділянку міг (вірулентний).

Ендогенна ділянка Т-ДНК містить гени для біосинтезу ауксину (айх), цитокініну (цита) й опіну (ос5), фланковані за правою та лівою межами. Межі являють собою недосконалі прямі повтори, що мають 24 пари основ. Гени вірулентної ділянки відповідальні за перенос Т-ДНК у рослинні клітини. Наприклад, ендонуклеаза МігО2 за допомогою МігО!1 робить розріз на межах Т-ДНК, вивільняючи одноланцюгову копію Т-ДНК, Т-нитка, яку транспортує в рослинні клітини транспортна система, кодована мігВ. Білок МігЕ2 зв'язує Т-нитку в клітині-хазяїні, і комплекс входить в ядро рослинної клітини.

У деяких варіантах реалізації нуклеїнову кислоту, що представляє інтерес, вставляють в область Т-ДНК плазміди Ті. Переважно видаляються гени аийх, суї й ос5 плазміди Ті (тобто плазміда «обеззброєна»).

У деяких варіантах реалізації використовують штучний вектор, одержаний з плазміди Ті.

Застосування для введення ДНК у рослинну клітину опосередкованих Адгобасіегічт рослинних векторів інтеграції загальновідоме в даній області техніки. Див., наприклад, способи, описані у

Егаїієу еї аї., (1985), Кодег»5 еї аї., (1987) ії. 0.5. Раї. Мо 5,563,055, спеціально включені у даний документ за допомогою посилання повністю. У деяких варіантах реалізації один або більше

Зо генів плазміди Ті мутовані для посилення ефективності трансформації, наприклад, як у штамах

Адгобасіегішт, де експресія гена міг і/або його індукція змінена через присутність мутанта або химерних генів Міга або міг (наприклад. Спеп і М/папе5, 1991, 9. ВасіегіоїЇ. 173: 1139-1144; і

Зспеегеп-Стоої еї аї., 1994, 9. Васієтіої. 176: 6418-6246). В іншому варіанті реалізації штам

Адгорасіегійт може містити додаткову копію гена міг, таку як супер ген міг, одержаний з ртіво542.

У переважному варіанті реалізації використовують бінарну систему Т-ДНК. У бінарній системі Т-ДНК і необхідні для передачі Т-ДНК в рослинні клітини гени міг перебувають на різних плазмідах. «Бінарна плазміда» містить нуклеїнову кислоту, що представляє інтерес, і переважно рослинний маркер, фланкований з лівої та правої сторони Т-ДНК. Бінарна плазміда також зазвичай містить одну або більше точок початку реплікації що дають можливість реплікації в Е.соїї й Адгорасіегішт, і бактеріальний селективний маркер. «Плазміда-помічник» містить гени міг з плазміди Ті. Вектори бінарної системи Т-ДНК доступні на комерційній основі.

Розкрита також бінарна векторна система, де Т-ділянка розташована на хромосомі штаму

Адгобасіегішт (див., наприклад, ЕР-В 176 112).

У переважних варіантах реалізації способів даного винаходу способи включають надання рослинної клітини з молекулою нуклеїнової кислоти, зазначена молекула містить нуклеотидну послідовність, що представляє інтерес, фланковану за правою межею (ПМ) послідовністю, одержаною з послідовності Т-ДНК Адгобасіегіит, і за лівою межею (ЛМ) послідовністю Т-ДНК, одержаною з послідовності Т-ДНК Адгобасіегішт. Як обговорювалося у даному документі, молекула нуклеїнової кислоти може додатково містити регуляторні послідовності для стимулювання експресії в рослинах іабо маркерних генах. Переважно в способах запропонований також домен міг, одержаний з плазміди Ті. Домен міг може бути присутнім на тій самій молекулі нуклеїнової кислоти, яка описана вище, або може бути запропонований у вигляді окремого вектора, наприклад, плазміди-помічника. Фахівцю в даній області техніки повинно бути зрозуміло, що повний домен міг із плазміди Ті не є необхідним.

Не бажаючи бути зв'язаними теорією, автори даного винаходу вважають, що незахищений 3 кінець одноланцюгової Т-ДНК (ліва межа) зазвичай є субстратом для опосередкованої РОГ СО реакції репарації, яка призводить до випадкової інтеграції. Зниження РОГ О в рослинній клітині знижує або усуває випадкову інтеграцію Т-ДНК, не виявляючи при цьому дії на генетичну 60 рекомбінацію та транзієнтну експресію. Відповідно очікується, що зниження РОГО буде знижувати або усувати випадкову інтеграцію, якщо в рослинну клітину трансфіковане будь-яке джерело нуклеїнової кислоти, яке призводить до присутності в ядрі одноланцюгової ДНК з незахищеним 3' кінцем.

У принципі для трансфекції можна застосовувати всі рослини. Переважні трансгенні рослини вибирають, наприклад, з сімейств Асегасеає, Апасагадіасеає, Аріасеає, Авіегасеає,

Вгаззісасєає, Сасіасєає, Сиситбїасеає, Ерпотбіасєає, Рарасєає, Маїмасєає, МутрНаєасеавє,

Рарамегасеає, Возасєає, бЗаїїсасеає, боЇапасєає, Агесасеає, Вготеїїасєає, Сурегасеєає,

Іідасеає, І ПШасєеає, Огспідасеає, Степіапасєає, Іаріасєає, Мадпоїйїасєає, Вапипсшіасєає,

Сапю|іасєає, Вибріасєае, Зсгорпшціагіасеає, СагуорнуІІасеєає, Егісасеає, Роіудопасеєає, Міоіасеає,

Уипсасеае або Роасеаеє та переважно з рослин, вибраних із групи сімейств Аріасеає,

Авієгасєає, Вгаззісасеає, Сиситбіасеає, Рарасєає, Рарамегасєає, Возасєає, 5ЗоіІапасєавє,

Пасеає або Роасеае. Переважними є культурні рослини, такі як рослини, переважно вибрані з групи родів бавовна, диня, цикорій, папайя, слива, арахіс, рапс, канола, соняшник, сафлор, маслина, кунжут, фундук, мигдаль, авокадо, лавр, гарбуз, льон, соя, фісташка, огірочник, кукурудза, пшениця, жито, овес, сорго та просо, тритікале, рис, ячмінь, маніок, картопля, цукровий буряк, баклажан, люцерна, а також багаторічні трави та кормові рослини, олійна пальма, овочі (кочанні овочі, коренеплідні овочі, бульбові овочі, стручкові овочі, овочі, що плодоносять, цибулинні овочі, листові овочі та стеблові овочі), гречка, топінамбур, кормові боби, віка, сочевиця, карликова квасоля, люпін, конюшина та люцерна, згадавши лише деякі з них. Переважно рослина являє собою Согп, Оїїбеєд Каре, Сапоїа, Соцоп, Роїаю, 5оуреап,

Зидаг Веєї, Здцазіп, СапіаІоцмире, Кісе, Ріах, Кадаїісспіо, Рарауа, АГама або У/пеаї. Найбільше переважними рослинами є Согп, Сойоп, Зоубеап, Сапоїа або Кісе. У переважному варіанті реалізації рослинна клітина не є Агабрійорзів ІНа/апа.

Рослини, як і всі багатоклітинні еукаріоти, експресують полімеразу тета, яку кодує ген

РОГОРОЇ ( 9 ). У даному винаході РОГ СО) і полімераза тета використовуються взаємозамінно.

РОГО містить центральний домен, який в рослин має приблизно 800 залишків, і полімеразний домен, який належить до сімейства ДНК-полімераз «А» (див, наприклад, Уоизеїадей апа ууоса

ОМА РРераїї 2013 12:1-93. Полімеразний домен містить 5 «мотивів» (див. Фігуру 2А в

Уоизеїладепй апа Ууоод4). В цих ділянках послідовності в рослин особливо зберігають свою гомологічність, зокрема в мотивах 2, 5 і 6.

Ілюстративна послідовність РОГ О з рослин являє собою «геліказу та полімеразу, що містить білок ТЕВІСНІ» з Агабідорбвів Іпайійапа. Білкову послідовність з 2154 амінокислот можна знайти у базі даних МОВІ під реєстраційним номером ВАБУОЗ3700.1. Послідовність ТЕВІСНІ була також опублікована в Іпадакі еї аї. (Ріапі Сеї! 18 (4), 879-892 (2006)). Гени РОГО в інших рослинах можна ідентифікувати, наприклад, за допомогою пошуку вирівнювання ВІ А5Т з послідовністю

РОГО з Агарідорзі5 (пайапа. Наприклад, гени РОГО з наступних ілюстративних рослин перераховані у базі даних МСВІ під наступними реєстраційними номерами: рис Огула зайуа: ХР 015619406 картопля бо/апит (шрегозит: ХР 006356662 соя Суусіпе тах: ХР. 003545584 цукровий буряк Веїа ушдагіз: ХР 010667709 томат боїапит Іусорегвит: ХР 010325163 банан Миза аситіпа!га Код послідовності: теї|їХМ 009385225.1) яблуко Ма/шз х дотевіїса: Код послідовності: геї | ХМ 008380001 1 виноград М/їх міпіїега Код послідовності: теПХМ 010650232.11 рапс Вгазвіса пари Код послідовності: геї | ХМ 013882859.1 апельсин Слгизв х зіпепвіз Код послідовності: ге!|ХМ 006476088.2 кукурудза 2еа таух Код послідовності: ЛОК40086

Сімейство програм ВІ А5Т, які можна застосовувати для пошуку подібності за базою даних, включає: ВГАЗТМ для запиту нуклеотидних послідовностей за базою даних нуклеотидних послідовностей; ВГАЗТХ для запиту нуклеотидних послідовностей за базою даних білкових послідовностей; ВІАЗТР для запиту білкових послідовностей за базою даних білкових послідовностей; ТВІ АТМ для запиту білкових послідовностей за базою даних нуклеотидних послідовностей; і ТВІАБТХ для запиту нуклеотидних послідовностей за базою даних нуклеотидних послідовностей.

Альтернативно для ідентифікації гена РОГ СО) з певних видів рослин можна застосовувати стандартні молекулярні методики. Наприклад, для ідентифікації бажаного полінуклеотиду в

КДНК або бібліотеці геномної ДНК з бажаних видів рослин можна застосовувати олігонуклеотидні зонди, засновані на послідовності ТЕВІСНІ. Зонди можна застосовувати для гібридизації з послідовностями геномної ДНК або кДНК, щоб виділити гомологічні гени в рослинах, що представляють інтерес.

Альтернативно, ген РОС) можна легко ампліфікувати зі зразків нуклеїнової кислоти із застосуванням звичайних методик ампліфікації. Наприклад, ПЛР можна використовувати для ампліфікації послідовностей генів безпосередньо з мРНК, з кКДНК, з геномних бібліотек або бібліотек КДНК. ПЛР й інші способи ампліфікації іп міго також можуть бути корисні, наприклад, для клонування послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують білки, які треба експресувати, для створення нуклеїнових кислот, які використовують в якості зондів для детекції наявності бажаної мРНК в зразках, для секвенування нуклеїнової кислоти або для інших цілей. Підходящі для ідентифікації гена РОГО в рослинах праймери та зонди можна створити на основі послідовності ТЕВІСНІ. Загальний огляд ПЛР див. у протоколах ПЛР: А Спціде тю Меїпоа5 апа

Арріїсайопв (Іппі5, М, СеМапа, О., Зпіп5Ку, у. апа МУпніїє, Т., ед5.), Асадетіс Ргезв, Зап Оівдо (1990).

У рослинних клітинах, які застосовують в описаних у даному документі способах, експресія й/або активність РОГО знижується. Зниження експресії РОГО може відбуватися на рівні нуклеїнових кислот або білків. Переважно обсяг функціональної експресії РОГО знижений щонайменше на 3095, 4095, 5095, 60905, 7090, 8095, 9095, 9595 або 10095 у порівнянні з відповідною рослинною клітиною дикого типу. Переважно експресія й/або активність знижена щонайменше на 5095 у порівнянні з відповідною рослинною клітиною дикого типу, більше переважно експресія й/або активність знижена щонайменше на 70965.

У деяких варіантах реалізації експресію РОГ О) визначають шляхом вимірювання експресії нуклеїнової кислоти РОЇ СО. Підходящі способи включають ПЛР в режимі реального часу, кількісну ПЛР, нозерн-блотинг, секвенування генів, зокрема секвенування РНК, і методики виявлення експресії генів, наприклад, аналіз на мікрочипах. У переважних варіантах реалізації експресію визначають, вимірюючи рівень білка РОГ О. Підходящі способи включають ЕГІЗА, імуноцитохімію, проточну цитометрію, вестерн-блотинг, протеоміку та мас-спектрометрію.

Переважно експресію РОГО визначають за допомогою імуноферментного аналізу. Підходящі імуноаналізи включають радіо-імуноаналіз, ЕГІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз), імуноаналіз «сендвіч», імунорадіометричний аналіз, гель-дифузійну реакцію преципітації,

Зо імунодифузійний аналіз, реакцію преципітації, реакцію аглютинації (наприклад, реакція аглютинації в гелі, реакція гемаглютинації та т.д.), реакцію зв'язування комплемента, імунофлюоресцентний аналіз, аналіз із білюом А й імуноелектрофорез.

У деяких варіантах реалізації активність РОГ О відноситься до здатності РОЇ СО) зв'язувати

ДНК, зокрема хроматин. Таку активність можна виміряти будь-яким способом, відомим фахівцю в даній області техніки, таким як імуноблотинг хроматинових фракцій з антитілом РОГО, як описано у Регпапае?-Уїааї! єї аІ., 2014 Маште Соттипісаїйопв 5.

У деяких варіантах реалізації активність РОГО відноситься до його здатності діяти як полімераза. Таку активність можна виміряти, наприклад, за допомогою методу подовження праймера, описаного в Нода еї аї. Мисієїс Асіа5 Кев5. 2012 Маг; 40(6): 2611-2622, за допомогою аналізу ММЕ), як описано Кепі еї аї. Маї 5ігисії Мої Віої. 2015 Маг; 22(3): 230-237. 7Ппап еї а. (Маї зЗігисі Мої Віо!. 2015 Арг; 22(4): 304-311) описує додаткові аналізи для вимірювання активності

РОГ О. Як зрозуміло фахівцю в даній області техніки, зниження активності РОЇ О відноситься до зниження активності по відношенню до активності дикого типу РОЇ О з того самого організму.

Придушення РОГ СО) можна досягти шляхом інтродукції мутації, яка руйнує ген, зменшуючи експресію РОГ О, шляхом повного придушення експресії або шляхом приведення продукту гена у не функціональний стан. Наприклад, мутація може являти собою точкову мутацію, інсерцію або делецію, і мутація може перебувати в кодуючій (наприклад, у екзоні РОГ О) або не кодуючій частині гена РОГ О (наприклад, в Уоизеїгадей ії Ууоса (ОМА Кераїг, МоїЇште 12, Івзце 10, 2013,

Раде 871) пропонують структурні порівняння членів сімейства РОГО й обговорюють місце розташування каталітичних доменів. Переважні мутації руйнують полімеразний домен РОГ О, як показано на Фігурі 2 в Моизеїгадейпй і Ууоод, які тим самим включені у даний документ за допомогою посилання. Переважно мутант РОГО знижує експресію й/або активність щонайменше на 5055 у порівнянні з геном дикого типу.

Мутації в гені РОГ О можна створити будь-яким зі способів, загальновідомих для фахівця в даній області технікию, включаючи методи випадкового мутагенезу, такі як опромінення, випадкову інсерцію ДНК (наприклад, за допомогою транспозонів Т-ДНК), або за допомогою хімічного мутагена. Крім того, згідно з певними аспектами винаходу ген РОГ О можна мутувати із застосуванням сайт-спрямованого мутагенезу. У деяких варіантах реалізації ген РОГО мутований або зруйнований із застосуванням гомологічного вектора рекомбінації або цільової бо нуклеази, такої як нуклеази "цинкові пальці" (2ЕМ), ефекторні нуклеази, подібні активаторам транскрипції (ТАГЕМ), нуклеази коротких паліндромних повторів, регулярно розташованих групами (СКІ5РЕК) або мегануклеази. Переважно використовують систему СКІЗРЕ/Сав. Ці способи відомі в даній області техніки, і фахівець буде здатний визначити такі способи як підходящі в світлі розкриття даного винаходу. Відомо декілька методик скринінгу специфічних мутантних алелей, наприклад, ОеєіІвіїеадепе (Оє!Іеїв-а-депе; Гі еї аї., 2001, Ріапі 927: 235-242) застосовує аналіз полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для скринінгу мутантів з делецією, викликаною мутагенезом швидких нейтронів, ТІССІМО (цільові індуковані місцеві ушкодження в геномах; МеоСайПшит еї аї., 2000, Маї Віоїесппо! 18:455-457) ідентифікує ЕМ5-індуковані точкові мутації та т.д.

У переважному варіанті реалиації в рослинній клітині є мутантний ген РОГО гена, переважно мутантними є обидва алеля. У переважних варіантах реалізації мутація являє собою «нокаут» алеля, тобто функціональний білок не виробляється.

У деяких варіантах реалізації для зниження експресії або активності РОГ О використовують систему СКІ5РК/Са5. Система СКІ5ЗРК/Са5х заснована на РНК нуклеазі Са59, що направляється, з прокаріотичної адаптивної імунної системи СКІЗРК типу !!/ (короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами) (див., наприклад, Веїай) еї аї., Ріапі

Меїподз 9:39, 2013). Ця система містить три компоненти: Білок Са59, сІтРНК і їгастРНК. СтТРНК і іїгасгтРНК зазвичай запропоновані у вигляді однієї молекули РНК, що відноситься до РНК (направляюча РНК). Направляючу РНК можна експресувати за допомогою малих ядерних РНК промоторів, таких як ОЗ і Об. Описані також рослинні кодон-оптимізовані версії Сав59, й їх можна експресувати в рослинах або за допомогою конститутивних промоторів (наприклад, промотор 355), або за допомогою тканиноспецифічного або індукованого промотору.

Ця система містить Са59, адресно взаємодіючі з конкретним локусом генома за допомогою

ОРНК. Канонічна довжина 9РНК становить 20 пар основ, однак для адресної взаємодії з рослинними локусами можна застосовувати 19-22 пар основ. ФРНК призначена для зв'язування з цільовою послідовністю, у даному випадку з геном РОГ О. Сайт зв'язування вибирають таким чином, щоб цільова ДНК супроводжувалася послідовністю РАМ (мотивом, що прилягає до протоспейсеру). В цій системі часто використовують білок із Сабз9 бгеріососсив руодепезвз, зрСавз9, оскільки він має коротку РАМ послідовність розпізнавання МО. Тому при використанні

Зо ЗрСаз9, можна розробити підходящі 9ФРНК, скринуючи в геномному локусі РОГ О послідовність (М)19е-2М00. Також для визначення підходящих цільових сайтів доступний онлайн-інструмент

СВІБРА Оезідп Тоої (пир:/Лооів.депоте-епдіпеегіпд.огоу, Неп еї аї).

Додаткову інформацію відносно використання системи СКІЗБРЕ/Са59 для індукції мутацій в рослин можна знайти в І оу/дегеї аї. Ріапі Рпузіоіоду 2015 169:971-985 апа ВеїНа) єї а. 2013 Ріапі

Меїтоаз 9:39.

Зниження експресії РОГО можна також досягти за допомогою «інгібуючої молекули нуклеїнової кислоти», присутність яких в клітині призведе до деградації або гноблення функції, транскрипції або трансляції її цільового гена специфічним до послідовності чином. Ілюстративні молекули нуклеїнової кислоти включають аптамери, 5іРНК, штучні мікроРНК, інтерферуючі РНК або РНКІ, малі інтерферуючі РНК, рибозими, антисмислові олігонуклеотиди й експресовані касети ДНК, що кодують зазначені молекули нуклеїнової кислоти.

У деяких варіантах реалізації молекула нуклеїнової кислоти є антисмисловим олігонуклеотидом. Антисмислові олігонуклеотиди (АОМ) зазвичай інгібують свою ціль, зв'язуючи цільову МРНК і просторово блокуючи експресію шляхом перешкоджання рибосомі. АЛОМ можуть також інгібувати свою ціль шляхом зв'язування з цільовою мРНК, формуючи в такий спосіб гібрид ДНК-РНК, який може бути субстратом для РНКази Н. АОМ можна також створити як складені структури двох або більше олігонуклеотидів, модифіковані олігонуклеотиди, олігонуклеозиди, міметики олігонуклеотидів або їх ділянки або частини. Такі сполуки в даній області техніки відносяться також до гібридів або гапмерів. Способи конструювання та модифікації таких гапмерів описані, наприклад, у публікації патенту США Мо 20110092572 і 20100234451. ДОМ» зазвичай містять від 12 до 80, переважно від 15 до 40 нуклеотидних основ.

Переважно АОМ містять ділянку з принаймні 8 нуклеотидних основ, на 10095 комплементарну цільовій мРНК.

В іншому способі нуклеїнову кислоту можна транскрибувати в рибозим або каталітичну РНК, яка впливає на експресію мРНК. Див. патент США Мо 6423885. Можна сконструювати рибозими для специфічного спарювання з цільовою РНК і розщеплення фосфодіефірного кістяка у певній ділянці з метою функціональної інактивації цільової РНК. Гетерологічні нуклеїнові кислоти можуть кодувати рибозими, сконструйовані для розщеплення певних транскриптів мРНК, тим самим запобігаючи експресію поліпептиду. Рибозими типу «голівка молотка» розщеплюють

МРНК в ділянках, позначених фланкуючими ділянками, які формують комплементарні пари основ з цільовою МРНК.

Переважно молекула нуклеїнової кислоти є молекулою дволанцюгової РНКІ, специфічної для МРНК, кодованої геном РОГО. Переважно молекула містить фрагмент гена РОГО, що мовчить в структурі переверненого повтору. Перевернені повтори розділені спейсером, часто інтроном. Конструкт РНКі запускають підходящим промотором і трансфікують в рослину.

Транскрипція трансгена призводить до утворення молекули РНК, яка складається, формуючи дволанцюгову шпилькову РНК. Рослина розпізнає цю структуру дволанцюгової РНК і розрізає на маленькі РНК (довжиною близько 21 нуклеотидів), що називаються малими інтерферуючими

РНК (5іРНК). 5іРНК утворюють сполуки з білковим комплексом (КІЗС), який продовжує безпосереднє руйнування мРНК цільового гена. Конструкт може бути перетворений в конструкт, що містить послідовність, яка функціонально пов'язана з регуляторною ділянкою та послідовністю термінації транскрипції й яка транскрибується в РНК, здатну утворювати дволанцюгову РНК. Способи застосування РНКІ для інгібування експресії гена відомі фахівцям в даній області техніки. Див., наприклад, патент США Мо 5034323; 6326527; 6452067; 6573099; 6753139; і 6777588. Див. також МО 97/01952; УМО 98/53083; МО 99/32619; УМО 98/36083; і публікацію патенту США 20030175965, 20030175783, 20040214330 і 20030180945. 5іРНК, спрямовані на РОЇ О людини, були описані в Сессаїді еї аІ. Маїиге. 2015 Реб 12; 518(7538): 258- 262.

Методики вірус-індукованого придушення генів (МІС5) є варіацією методик РНКІ, в якій задіяний ендогенний противірусний захист рослин. Інфікування рослин рекомбінантними вірусами МІС5, що містять фрагменти ДНК хазяїна, призводить до посттранскрипційного придушення цільового гена. В одному варіанті реалізації можна застосовувати систему МО5 на основі вірусу погремковості тютюну (ВПТ). МІО5 системи на основі вірусу погремковості тютюну, описані, наприклад, у Вацісотрбе, Ситгт. Оріп. Ріапі Віої. 2: 109-113 (1999); и, єї аї, Метод 30: 296-303 (2003); Наїсіїй, еї аі, Те Ріапі удоигпаї 25: 237-245 (2001); і пат. США Мо 7229829.

У деяких варіантах реалізації активність РОС знижена в результаті забезпечення рослинною клітиною зі зв'язувальною РОЇ С) молекулою. Переважно активність РОГО знижена щонайменше на 3095, 4095, 5095, 60905, 70905, 8095, 9095, 9595 або 10095 у порівнянні з відповідною

Зо рослинною клітиною дикого типу. Переважно молекула, що зв'язує РОЇ О, зв'язується з РОГ О й інгібує його ферментну активність і/або його здатність зв'язувати ДНК.

Переважно молекула, що зв'язує РОГО, є маленькою молекулою. Додаткові зв'язувальні агенти включають антитіла, а також не імуноглобулінові зв'язувальні агенти, такі як одержані завдяки фаговому дисплею сполучні пептидів, й імітатори антитіл, наприклад, афітіла, тетранектини (СТІ О), аднектини (монотіла), антикаліни, САКР (анкірини), авімери, іМаб, пероксисоми, пептидні аптамери, домени Куниця, аптамери й афіліни. Термін "антитіло" включає, наприклад, антитіла як природнього, так і штучного походження, поліклональні та моноклональні антитіла, химерні антитіла та повністю синтетичні антитіла та їх фрагменти, такі як, наприклад, фрагменти Раб", Каб)2, Ем або Раб, або інші імуноглобулінові фрагменти, що розпізнають антиген.

Переважно молекула, що зв'язує РОГ О, є антитілом до РОГО або його фрагментом, що зв'язує антиген. Антитіла, що розпізнають РОГО, доступні на комерційній основі (див., наприклад, Х3-0588У7 |АВХІ від "Абмарт" (Абтагі|, який вироблений з використанням білка

ТЕВІСНІ).

Антитіла, які зв'язують конкретний епітоп, можна створити способами, відомими в даній області техніки. Наприклад, поліклональні антитіла можна одержати стандартним способом імунізації ссавця (наприклад, кроликів, мишей, пацюків, овець, кіз). Поліклональні антитіла потім містяться в сироватках імунізованих тварин й їх можна виділити за допомогою стандартних процедур (наприклад, афінної хроматографії, імунопреципітації, ексклюзійної хроматографії й іонообмінної хроматографії). Моноклональні антитіла можна одержати стандартним методом імунізації ссавця з наступним виділенням з плазми крові В-клітин, що виробляють відповідні моноклональні антитіла, та гібридизацією з клітиною мієломи (див., наприклад, МігпеїЇ, еї аї., 1980). Скринінг для розпізнавання епітопу можна провести за допомогою стандартних методів імуноаналізу, включаючи методи ЕГІЗА, радіоіїмунологічні аналізи, імунофлюоресценцію, імуногістохімію та вестерн-блотинг (А!,5зибеї, еї аї!.,, 1992). Для одержання антитіл можна також застосовувати методи відбору антитіл іп мйго, такі як фаговий дисплей антитіла (див., наприклад, Зспігтапп еї а!., 2011). Переважно для підвищення локалізації в ядрі до антитіла додають сигнал ядерної локалізації.

В обсяг даного винаходу також входить рослина або рослинна клітина, що не зустрічається 60 у природніх умовах, у якій експресія й/або активність РОГ О в зазначеній рослині або рослинній клітині знижена, як описано у даному документі, при цьому рослина або рослинна клітина не є

Агабрідорвів Іпалапа. У переважному варіанті реалізації рослина або рослинна клітина експресує «інгіібуючу молекулу нуклеїнової кислоти» РОЇО, як описано у даному документі. У переважному варіанті реалізації рослина або рослинна клітина має мутований РОГО, як описано у даному документі. Зазначені рослини та рослинні клітини є корисними для виконання способів, описаних у даному документі. Відповідно, в обсяг даного винаходу також входить застосування рослини або рослинної клітини для трансфекції молекули нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес.

В обсяг даного винаходу також входять рослинні клітини та рослини, зроблені способами, які описані у даному документі. Зазначені рослини та рослинні клітини мають перевагу, оскільки містять молекулу нуклеїнової кислоти, але в їх геномі події випадкової рекомбінації нуклеїнової кислоти обмежені або відсутні. У переважних варіантах реалізації зазначені рослинні клітини та рослини мають знижену експресію й/або активність РОГ СО), як описано у даному документі.

В обсяг даного винаходу також входить потомство рослинних клітин і рослин, зроблених способами, які описані у даному документі. В даному описі термін «потомство» означає потомство (включаючи насіння) будь-якого покоління батьківської рослини, одержане відповідно до описаних у даному документі способів, де потомство містить молекулу нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес.

Визначення

У даному описі «містити» і його дієвідміни використовують в необмежуючому змісті, що означає, що поняття, які слідують за словом, включені, але поняття, не згадані окремо, не виключені. Крім того, дієслово «складатися» можна замінити на «складаються головним чином 3», що означає, що сполука або сполуки, або допоміжна сполука, як визначено у даному документі, може містити додатковий() компонент(и) до окремо згаданих, при цьому зазначений) додатковий) компонент(и) не змінює унікальні характеристики винаходу.

Однина в даному описі відноситься до одного або більше ніж одного (тобто щонайменше одного) граматичного об'єкта. Наприклад, "елемент" означає один елемент або більше ніж один елемент.

Всі посилання на патенти та літературу, наведені в даній заявці, включені за допомогою

Зо посилання у всій повноті.

В даному описі гомологічна рекомбінація (НК) відноситься до безпомилкової репарації розриву із застосуванням неушкодженої матриці (зазвичай сестриної хроматиди).

В даному описі НОК (репарація за гомологією) відноситься більше широко до застосування гомологічних послідовностей для прямої репарації за матрицею. Розрив також може бути відновлений, якщо він фланкований гомологічними послідовностями, й у цьому випадку режим репарації називається З5А, для одноланцюгового відпалу; результат у цьому випадку схильний до помилок.

Всі інші репарації, що не є НЕ, НОР або 554А, зазвичай називаються з'єднаннями кінців (Е.).

Оскільки ЕдУ не використовує гомологію для прямої репарації, його спочатку називали не гомологічним з'єднанням кінців (МНЕ./). Для найвідомішого шляху ЕуУ, який був відкритий першим, необхідні і/або білки КО70О, КОВО, І Іс4, і його називають МНЕ) або класичний МНЕ.) (СМНЕ))). Еу, який не є СМНЕУ (який проявляється в клітинах, дефіцитних за СМНЕ))), називають «альтернативним» Е. або ак) Оскільки в цьому типі Еу/ часто на з'єднаннях продукту репарації виявляють відрізки ідентичних основ, його також називають мікро-гомологічно- опосередкованим ЕУ або ММЕ..

В даному описі ТМЕУ (рої! тета-опосередкований Еу)) відноситься до опосередкованої РОГ ОО репарації, прийнятої в даній області техніки. Не бажаючи зв'язувати себе теорією, автори даного винаходу припускають, що більшість ак-Е) репарацій фактично опосередковане ТМЕ..

Винахід далі пояснений у наступних прикладах. Ці приклади не обмежують обсяг винаходу, але служать просто для ілюстрації винаходу.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1: Трансфекція Т-ДНК

Рівень техніки

Адгобасіепит ште?!асіепо є збудником захворювання корончатий гал в дводольних рослин.

Частина ДНК патогена, Т-ДНК, переноситься в рослинні клітини, де вона інтегрується в геномі, будучи прикладом генетичного переносу між царствами. Гени, розташовані на Т-ДНК, трансформують рослинні клітини у пухлинні клітини, що синтезують живильні речовини, які бактерія може використовувати в якості джерела вуглецю й азоту, створюючи в такий спосіб бо для себе екологічну нішу". Здатність цього патогена передавати ДНК широко використовують у біотехнологіях як засіб інсерції чужорідних генів у рослини. Незважаючи на те, що зараз багато відомо про взаємодію між Адгобасіелит і рослинними клітинами та процесами, що призводять до інтеграції Т-ДНК в геном хазяїна, фактичний механізм інтеграції залишається невідомим'.

Вже два десятиліття назад висунули гіпотезу, що Адгобасіелит використовує ферменти репарації дволанцюгового розриву (0568) хазяїна для каталізації інтеграції Т-ДНК, що призвело до генетичного дослідження ключових білків різних шляхів репарації О583. Участь в інтеграції Т-

ДНК канонічного не гомологічного з'єднання кінців і факторів гомологічної рекомбінації вивчено, але з обмеженими та мінливими результатами". Навіть коли різні шляхи були одночасно зроблені неможливими, інтеграція Т-ДНК залишалася можливою??, що припускає участь невідомого шляху, який ще належить ідентифікувати.

Одна потенційно інформативна особливість інтеграції Т-ДНК, яка може говорити про механізм інтеграції, - це тип геномного "шраму", так звана «філерна ДНК», що часто зустрічається в ділянках інтеграції Т-ДНК. Філерні ДНК -- це вставки послідовностей ДНК, які іноді містять ділянки, ідентичні послідовностям, що присутні у безпосередньому оточенні сайту інтеграції! 17, Автори даного винаходу помітили вражаючу схожість композиції філерної ДНК у подіях інтеграції Т-ДНК з продуктами репарації схильного до помилок ЮО5В в нематоди с. еІедапз і мухи 0. те/аподавіег. У цих видів пов'язані з реплікацією, а також викликані нуклеазою

ОВ можуть репаруватися за шляхом альтернативного з'єднання кінців, який критично залежить від полімерази тета А-сімейства (Рої 6), й у деяких випадках результатом є філеро- подібні вставки"?-7ї, Ця відмінна риса Ро! 8-опосередкованого з'єднання кінців еволюційно консервативна, та її також можна виявити в сайтах репарації в ДНК-вставках в клітинах ссавців!»1б6, Кодуючі Ро! 9 гени можна знайти в геномах усіх багатоклітинних еукаріот, включаючи модельну рослину Агарійорвіз ІНа/апа, в якій ген називається Тебіспі! "18,

Для вирішення питання, чи відповідальний Рої 6 за синтез філерної ДНК в рослинах й /рзо їасіо за каталізацію інтеграції Т-ДНК, автори даного винаходу трансформували рослини дикого типу (СоІ-0) та два нокаутних алеля Ро! 8 (Теб-5 і Тер-2'У) методом занурення квітки. Автори даного винаходу виявили, що трансформація рослин дикого типу СоІ-0О відбувалася нормально, тоді як від рослин Теб-2 і Тер-5 не вдалося одержати жодного трансформанта (Фіг. 1а-с).

Щоб виключити ймовірність того, що ці результати з'явилися внаслідок неочевидного

Зо морфологічного дефекту квітки, який запобіг проникненню Адгобасіегпит у жіночі гаметофіти (цільові клітини для трансформації), автори даного винаходу проаналізували транзієнтну експресію Т-ДНК в цих клітинах. З цією метою автори даного винаходу застосували Т-ДНК, що експресує маркер СИ5::інтрон під контролем промотору АСТІ1, який експресується в насінних зачатках/ насінинах, що розвиваються"?2о, Після інфікування Адгобасієгйт автори даного винаходу виявили, що Т-ДНК-опосередкована транзієнтна експресія в рослинах дикого типу та мутантах Рої 9 не розрізнялася (Фіг. 1). Таким чином, Т-ДНК може досягати ядер цільової тканини, але її інтеграція повністю залежить від функціонуючого Рої 8.

Раніше було висунуте припущення, що інтеграція Т-ДНК в клітинах кореня може відрізнятися від інтеграції Т-ДНК у квітках-"". Якщо при трансформаціях квітки в Агабійорзіз можливі тисячі сполук Т-ДНК в рослинному геномі, то в трансформантів, одержаних в ході трансформації кореня, виявлена тільки обмежена їх кількість, що робить неможливим апріорний прогноз. Отже, автори даного винаходу інфікували Со1!-0 і дефіцитні за рої 9 корені штамом Адгобасіепит, що доставляє Т-ДНК, яка забезпечує стійкість до гербіциду фосфінотрицину (ФФТ), і використовували в якості маркера стабільної інтеграції утворення зелених пагонів на селекційних планшетах, що містять ФФТ. Як очікувалося, в СоІ-0 автори даного винаходу виявили - 8095 успішну трансформацію, але частота трансформації в дефіцитних за рої! 8 коренях була значно знижена (Фіг. 2а-р, У; фактично, в жодного з 853 калусів зелені пагони не розвилися. Регенерація пагонів з калуса при не селективних умовах в коренях, дефіцитних за рої О, була не порушена. Автори даного винаходу відзначили, що інфіковані дефіцитні за рої 6 корені не формували калус, але вони не росли та гинули через декілька тижнів, що підтверджує, що формування калуса може бути результатом транзієнтної експресії не інтегрованої Т-ДНК.

Дійсно, при дослідженнях ТАЇ--ПЛР, спрямованих на клонування та валідацію інтеграції ТА-ДНК, були одержані продукти тільки в ДНК, виділеної з інфікованих калусів СоІ-О, але не в ДНК, виділеної з інфікованих калусів 7еб-5 (Фіг. 2с). Щоб підтвердити ефективність доставки Т-ДНК і транзієнтної експресії в дефіцитні за рої 6 корені, автори даного винаходу показали успішну експресію кодованого Т-ДНК гена Сиусє:інтрон в інфікованих коренях /еб-2 і Тер-5 (Фіг. 2а-еє).

Виходячи з цих даних автори даного винаходу зробили висновок, що для трансформації клітин кореня, як й у випадку гамет квітки, успішність інтеграції Т-ДНК залежить від роботи рої 9.

Т-ДНК переносять в рослинні клітини у вигляді одноланцюгової молекули ДНК (55ДНК), при бо цьому бактеріальний білок Мігр2 ковалентно приєднується до 5' кінця". Цей кінець звуть правою межею Т-ДНК (ПМ). 3' кінець Т-ДНК, ліва межа (ЛМ), залишається незахищеною, що робить її відмінним субстратом для ро! б-опосередкованої реакції репарації: іп мійго синтез ДНК за допомогою рої 9 стабілізує два мінімально парні З виступаючих кінця ДНК". Ця біохімічна властивість роЇ 98 разом з її продемонстрованою роллю в репарації фізіологічних розривів генома дає можливість припустити дивовижно простий механізм інтеграції Т-ДНК в геном рослини: ненавмисне захоплення Т-ДНК при репарації спонтанних геномних ОВ (Фіг. За).

Крайня чутливість мутантних за рої 89 рослин до індукованих О5В агентів!" говорить на користь важливої ролі рої 8 в репарації геномних розривів. У підтримку впливу ендогенних О5В на сайти захоплення Т-ДНК говорять дані, що заподіяний ДНК додатковий збиток геному шляхом або іонізуючої радіації, або ектопічної експресії ендонуклеаз, стимулює та направляє інтеграцію Т-

ДНЯ,

Щоб досліджувати особливості дії ро! 9 /л м/мо, автори даного винаходу провели систематичний аналіз »10,000 продуктів його дії: сполук Т-ДНК/ рослинного генома, що утворюються в рослинних клітинах дикого типу при інтеграції шляхом занурення квітки!"!. Майже в 7095 усіх подій інтеграції одна або обидві сполуки містять філерну ДНК здебільшого невідомого походження. В недавньому дослідженні з використанням суворих критеріїв провели мапування походження 1695 філерів послідовностей, розташованих в межах 10 кілобаз від інсерції Т-ДНК, або у фланкуючих ділянках генома, або в самій Т-ДНК". Однак одержані раніше дані дозволили припустити, що філери можуть відображати молекулярну мозаїку існуючих композицій з множини більше дрібних сегментів, які мають різне походження "о. Автори даного винаходу систематично аналізували колекцію з - 5000 філерів із застосуванням принципу найбільшої загальної підпослідовності (С5), який визначає найбільше довгу можливу ділянку ідентичності між філером і досліджуваною послідовністю (Фіг. 30). Автори даного винаходу виявили, що «6095 філерів мають щонайменше один збігіз ДНК в межах 1-- пар основ у сполуки. В - 2095 з них автори даного винаходу визначили додаткові ділянки, мапуючи інші фланкуючі позиції. Матриці що використовуються для синтезу філера, за перевагою перебувають поряд із сполукою (Фіг. 3р-а), і задіяні як Т-ДНК, так їі рослинний геном (Фіг. За).

Багато філерів мають складені композиції з декількома ділянками, які можна з вірогідністю відстежити, але іноді між ними зустрічаються нуклеотиди невідомого походження. Таке

Зо розташування сегментарних послідовностей забезпечує перевірку /л у/уо припущення, що рої 9 може сприяти репарації, роблячи можливим один або більше циклів праймерного перемикання матриці, функції, яка може сприяти утворенню комплементарних кінців, що стимулюють розпад.

Щоб перевірити, чи дійсно взаємодія праймер-матриці стимулює філери, автори даного винаходу створили теплові мапи, за якими побудували утримуючі філери сполуки за їх родинним відповідним до філерів послідовностям поблизу від сполуки. Такий підхід візуалізує ступінь ідентичності послідовності між передбаченим 3'-кінцем, який утворює сполуку, тобто праймером, і послідовністю безпосередньо вище матриці, яка задіяна в синтезі філерів. Щоб уникнути можливої двозначності при інтерпретації, автори даного винаходу обмежили аналіз лише тими випадками (п - 589), в яких філер має тільки один прикордонний збіг у фланкуючій області. Автори даного винаходу дійсно виявили значну надлишковість співпадаючих основ (Фіг.

Зе): 6695 філерів мають щонайменше 1 нуклеотидний праймер, 5795 містять щонайменше 2 збіги між праймером і матрицею, а 4795 мають З праймерних нуклеотиди на 3'-кінці. В сукупності ці результати дозволяють припустити, ї) що філер ДНК являє собою продукт рої 98 подовження 3' кінця геномного розриву, що є мінімально парною основою з 3'-кінця Т-ДНК, або навпаки, і її), що за складну композицію філерів відповідає здатність цієї полімерази робити перемикання праймер-матриці.

Становить інтерес те, що теплова мапа, яка відображає ступінь мікрогомології сполук ТАДНК без філерів (які також вимагають для свого формування рої 6), дуже схожа на теплову мапу праймер-матриці сполук, що містять філери (Фіг. Зе, 7). Це спостереження підтверджує ідею, що мікрогомологія репарації О5В не відображає трохи підвищену стабільність при спарюванні не комплементарних ниток 55ДНК, але, навпаки, відображає біохімічну властивість полімерази переважно подовжувати 3'-кінець, парний невеликій кількості комплементарних основ.

Сукупно результати авторів даного винаходу говорять про концептуально простий механізм інтеграції Т-ДНК в рослинні геноми: рослинний рої 6-опосередкований шлях репарації замість з'єднання кінців геномного розриву з'єднує кінці екзогенно забезпечених молекул Т-ДНК.

Результат аналогічний і в зародкових клітинах, і в соматичних клітинах. Більшість інтеграцій Т-

ДНК (6395) мають інвертовану конфігурацію репарації, де до однієї зі сторін рослинного генома приєднана 3' ЛМ Т-ДНК, що говорить про те, що 3' кінець Т-ДНК є переважним субстратом.

Здатність рої 9 розширювати мінімально парні 3' кінці забезпечує пояснення механізму 60 приєднання лівої межі Т-ДНК до рослинного генома, а його толерантність до перемикання праймер-матриці може пояснювати існування мозаїчності філерів (дів. Фіг. 4). Менш ясне питання, як 5 права межа Т-ДНК приєднується або до рослинного генома (у випадку однокопійної інтеграції), або до іншої 5 межі Т-ДНК (у випадку інвертованої орієнтації репарації). Однак докладний аналіз сполук ПМ Т-ДНК/ рослинний геном підтверджує дуже схожий механізм приєднання: тут також виявлені філери, що вказують на дію рої! 98. Можливо, що цій реакції передує перехід одноланцюгової Т-ДНК у дволанцюгову конфігурацію, ініційований або геномним захопленням 3'-кінця Т-ДНК, або ще невідомим механізмом2»26,

Цікаво, що О5В, який захоплює 3' кінець Т-ДНК на одній зі сторін, захищений від 5'-резекційної дії ковалентно приєднаного бактеріального білка МігО2. На закінчення, цей 5' кінець може потребувати додаткової ферментативної обробки, що може пояснювати знижену ефективність інтеграції в рослинах, що несуть мутації у різних ферментах, що обробляють ДНК 4-9.

Крім надання розуміння механізму інтеграції Т-ДНК в рослинах, дані авторів даного винаходу впливають на біотехнологічні шляхи створення трансгенних культур: адресно взаємодіючий ро! 6 буде повністю виключати небажану випадкову інтеграцію в технологіях спрямованого впливу на ген, при цьому не впливаючи на НК -- у всіх вивчених до теперішнього часу видів рої 86 для НЕ не потрібен. Абсолютна залежність від рої 9 інтеграції Т-ДНК у гаметофіти, а також у корені Агабійорзіхз разом з численними проявами відмінних ознак впливу рої 9 на інтеграцію Т-ДНК у всіх вивчених вищих рослинах, включаючи культурні види, такі як рис, томат, полуниця або тютюн, має у перспективі широке застосування?" 95,

Методи

Лінії рослин й умови росту

Інформація про мутантів з інсерцією була одержана на веб-сайті 5ІспАЇ за адресою пер'//зідпа!.заІК.еди. тер-5 (ЗАЇ К 018851) і тер-2 (ЗАЇ К 035610) були одержані з колекції 5АЇ К

Т-ДНК"У. Алелі 7тер-5 і їер-2 були описані раніше!"". Рослини вирощували на грунті при 20 "С в циклі 16 годин освітлення/8 годин темряви.

Трансформація методом занурення квітки

Дикий тип (екотип СоІ-0) і мутантні рослини Агабійорзіз були трансформовані із застосуванням обеззброєного штаму Адгобасіелит |ВА1100397, що несе бінарний вектор роСАМВІА1301, методом занурення квітки, як описано ранішезз. Трансгенне насіння відібрали на

Зо твердому середовищі МА без сахарози з додаванням 100 мкг/мл ністатину, 100 мкг/мл тиментину (щоб вбити всі Адгобасіегійт, що залишилися, і запобігти розвитку інфекції) та 15 мкг/мл гігроміцину для відбору подій інтеграції. Альтернативно, рослини трансформували із застосуванням А. йте?/асієпе штаму АдіІ, що несе бінарний вектор реЮМ3900. Трансгенне насіння відібрали на твердому середовищі МА без сахарози з додаванням 100 мкг/мл ністатину, 100 мкг/мл тиментину (щоб вбити всі Адгобасіелит, що залишилися, і запобігти розвитку інфекції) та 15 мкг/мл фосфінотрицину для відбору подій інтеграції. Щоб визначити транзієнтні події, рослини, що цвітуть, піддали зануренню квітки в штам Ад/обасіелит Аді!І, що несе р1і301 АСТІ1І1, який створювали шляхом клонування фрагмента в 850 пар основ з генома Со1-0, що містить промотор АСТ11, у бінарний вектор рСАМВІАТ301, з якого витягали маркер стабільної інтеграції та його промотор (послідовність доступна за запитом). Через 6 днів квіти збирали та забарвлювали протягом ночі у фосфатному буфері (рН :- 7,3), що містить 1 мМ КзЕе (СМ) ії 1 мМ КаБе (СМ)6, 10 мМ Ма» ЕДТА, 0,195 ДСН, 0,195 Тритон Х-100 їі 2 мМ циклогексиламонієвої солі. Після цього квітки очищали 7095 етанолом.

Трансформація коренів

Трансформації кореня виконували на дикому типі (СоІ-0) та мутантних рослинах А. /Па/апа, як описано ранішез»5, із застосуванням обеззброєного штаму А. ште/асіепв | ВА110092, що несе бінарний вектор рРСАМВІАЗ30О1. Після двох днів спільного культивування частину кореневих експлантатів негайно забарвлювали у фосфатному буфері (рН - 7,3), що містить 1 мМ

КзБе(СМ)є і 1 мМ К»аБе(СМ),, 10 мМ Ма» ЕДТА, 0,195 ДСН, 0,195 Тритон Х-100 і 2 мМ циклогексиламонієвої солі, а частину кореневих експлантатів, що залишилася, переносили на тверде середовище, що містить 10 мкг/мл ФФТ для селекції трансформантів і 500 мкг/мл карбеніциліну та 100 мкг/мл ванкоміцину, щоб вбити Адгобасіегит, що залишилися.

Ампліфікація інсерційних сполук

Рослинний матеріал подрібнювали у порошок в Тізх5цеї узег (Кеїсії, Хан, Німеччина) в рідині

Мо2. ДНК виділяли, як описано ранішез". 1 мкл виділеної ДНК використовували для ПЛР в загальному об'ємі 20 мкл. Полімераза Тад і буфери були зроблені в місцевій лабораторії.

Сполуки Т-ДНК геном виділяли за допомогою ТАЇ-ПЛРЗ8, застосовуючи вироджений праймер

Арг (МЕТССаАБМСАМАМ,АА) З» ї специфічні вкладені праймери:

роз3301 кореня, ЛМ роз3301 кореня, ЛМ кореня, ЛМ кореня, ПМ кореня, ПМ кореня, ПМ

Визначення геномних інсерцій Т-ДНК

Всі Т-ДНК послідовності, що підтверджували інтеграцію, скачали з ЕМА/ЗепВапк (реєстраційні номери І М484267 через І М515397)". Щоб визначити сполуки Т-ДНК інсерції, проводили МедавіА5Т пошук між кожною послідовністю й еталонним геномом Аг/ларідорвів (ТАІК10) і відповідною бінарною плазмідою. Потім аналізували зворотний комплемент послідовності у послідовностях, де Т-ДНК була присутня в 3'-ділянці. Щоб зосередитися на високоякісних сполуках послідовностей, автори даного винаходу включали тільки послідовності, де була показана ідеальна відповідність 3' кінцю Т-ДНК, а також 5' геномній ділянці (2 20 пар основ, без не відповідності, без розриву) за відповідним кращим збігом ВІ АТ. Послідовності, в яких Т-ДНК їі геномні збіги ВГА5Т не перекривалися, позначали як філерну інтеграцію, а послідовності, які перекривалися або з'єднувалися зі збігами ВІ А5Т, позначали як не філерну інтеграцію. Філери, що містили не інформативні основи, видаляли. Після застосування таких фільтрів для подальшого аналізу залишилося 10 616 подій інсерції Т-ДНК.

Походження філерів

Щоб визначити походження філерів, автори даного винаходу використовували алгоритм найбільшої загальної підпослідовності ((С5). Алгоритм визначає найбільшу загальну послідовність між філером (запит) й іншою послідовністю (об'єкт). Для кожного філера (26 пар основ і х 40 пар основ) автори даного винаходу визначали І! С5 в Т-ДНК й еталонному геномі

Агабрідорвіх, в обох напрямках ланцюгів, відповідно до положення геномної сполуки Т-ДНК, яке визначали за його відповідним кращим збігом ВІАБТ. Автори даного винаходу шукали плазмідну послідовність Т-ДНК й еталонний геном 25-6400 основ від сполуки в обох напрямках.

Щоб обчислити надлишковість знайдених довжин ЇС5, автори даного винаходу визначили псевдовипадкову ймовірність знаходження /С5 певної довжини для даного філера у послідовності ДНК. З цією метою автори даного винаходу перетасовували ДНК об'єкта для кожного філера та шукали І С5 (10-100 разів для кожного філера). Потім був створений розподіл імовірності псевдовипадкових довжин ЇС5 для кожного розміру філера (26 пар основ і х 40 пар основ). Надлишковість між імовірним розподілом і фактичним розміром знайденого розміру Ї С5

Зо розраховували як фракцію філерів, що мають довжину ЇС5 на правому кінці ймовірного розподілу мінус фракція очікуваних філерів. Автори даного винаходу відзначали окремі філери як надлишкові, якщо фактичний розподіл його довжини ЇС5 було щонайменше в десять разів більше, ніж імовірне.

Щоб визначити, чи походить філер із Т-ДНК плазміди, що дає, автори даного винаходу застосовували І С5 з додаванням того, що ділянку використовували тільки у тому випадку, якщо

ЇС5 мала довжину 2 13 пар основ. Щоб визначити можливе походження філерів у геномі

Агабрідорвівх, автори даного винаходу застосовували ВГ А5Т із відтинаючим значенням Е 107.

Приклад 2: Гомологічна рекомбінація

Приклад 1 показує, що для стабільної випадкової інтеграції Т-ДНК необхідний функціонуючий Ро! 89. Даний приклад демонструє, що для стабільної інтеграції шляхом гомологічної рекомбінації функціональний Рої/ї 9 не потрібен.

Готували конструкт Т-ДНК, що містить близько б пар основ, гомологічних ендогенному локусу протофорфіриноген оксидази (РРО) Агабрійорвів. Гомологічна ділянка містить дві точкові мутації, які підтверджують стійкість до гербіциду бутафеніцилу при інтеграції шляхом гомологічної рекомбінації в локусі РРО (див. опис мутацій в Напіп еї аї., Ріапі У 2001). Крім того,

Т-ДНК кодує фермент Саз59 (кодон-оптимізований Са59-АгеСав59 Агарідорзі5 (Райзег еї аї. Ріапі 79:348-359 2014)) і направляючу РНК, яка направляє фермент Саз9 в локус РРО. Експресією

Саз59 керує убіквітиновий промотор, а направляюча РНК перебуває під контролем промотору Об (АШБб).

Рослини дикого типу (Со1-0) та два алеля з нокаутом за Ро! 6 (тер-5 і Тер-2'"У) перетворювали трансформацією методом занурення квітки. Стабільну інтеграцію Т-ДНК шляхом гомологічної рекомбінації вимірювали за стійкістю до бутафеніцилу. Рівень стабільної інтеграції в сайт- специфічному локусі між рослинами дикого типу й мутантами за Рої 9 буде аналогічним.

Приклад 3: Трансфекція лінеаризованою плазмідою

Готували плазміду, що містить близько б пар основ, гомологічних ендогенному локусу протофорфіриноген оксидази (РРО) Агабідорзів. Гомологічна ділянка містить дві точкові мутації, які підтверджують стійкість до гербіциду бутафеніцилу при інтеграції шляхом гомологічної рекомбінації в локусі РРО (див. опис мутацій в Напіп еї аї., Ріапі У 2001). Крім того, плазміда кодує фермент Са59 (кодон-оптимізований Са59-АгеСаз9 Агарідорзіз (Райизег еї аї. Ріапі 79:348-359 2014)) і направляючу РНК, яка направляє фермент Са5з9 в локус РРО. Експресія

Са59 перебувала під контролем убіквітинового промотору, а направляюча РНК перебувала під контролем промотору б (АШб). Плазміда також містить унікальний сайт рестрикції. Плазміду лінеаризували шляхом розщеплення у відповідному сайті рестрикції.

Протопласти одержували з дефіцитних за УМ і Рої О рослин (тер-5 і Тер-г), а лінеаризовану плазміду трансформували у протопласти за стандартним протоколом трансформації РЕС. Для селекції стабільних подій інтеграції шляхом гомологічної рекомбінації колонії підтримували в середовищі, що містить бутафеніцил. Рівень стабільної інтеграції в сайт-специфічному локусі між рослинами дикого типу та мутантами за Ро! 8 буде аналогічним.

Приклад 4: Трансфекція рослин томату

Даний приклад продемонструє зниження випадкової інтеграції в культурні рослини, а саме томат (боїапит /усорегвит). Ген РОГО з томатів ідентифікували з бази даних МСВІ за реєстраційним номером ХР 010325163 на основі пошуку ВІ А5Т з використанням послідовності

Теріснпі.

Дефіцитні за РоїЇ О мутанти томату створювали шляхом використання Рої О як мішені для

Зо СКІ5БРК і самозапилення для створення у наступному поколінні гомологічних мутантів. Коротко, готували конструкт Т-ДНК, що кодує селективний за канаміцином маркер, фермент Са59 (рослинний кодон-оптимізований Са5з9-рсоСа»59 (їі еї аі. 2013 Маї Віоїесппо! 31:688-691)) і направляючу РНК, яка направляє фермент Са59 в локус РОГ О. Експресія Са59 перебувала під контролем промотору 355, а направляюча РНК перебувала під контролем промотору ОЗ (Аїи3).

Сім'ядолі експлантатів томатів трансформували шляхом занурення в суспензію Адгобасіепит, вибирали за стійкістю до канаміцину та проводили скринінг за мутаціями РОГО. Скринінг саджанців за мутаціями РОГО проводять із застосуванням аналізу Зигмеуог (Моуїа5 2013 Аппи

Вем Ріапі Віо! 64:327-350), і саджанці, що містять у РОГ) інактивуючі мутації, вирощували та проводили самозапилення для створення гомозиготних мутантів у наступному поколінні.

Вплив РОГО на випадкову інтеграцію демонстрували за допомогою пухлинного аналізу, проведеного на рослинах томату дикого типу та на мутантах томатах, дефіцитних за Рої о.

Коротко, Адгорасіегішт вставляли в отвір у стеблі рослин томатів дикого типу та дефіцитних за рої Я рослин томатів. Випадкову інтеграцію вимірювали шляхом вимірювання утворення пухлини. В рослинах томату УУТ з'являлися пухлини, що вказують на події випадкової інтеграції, а в дефіцитних за рої О рослинах томату пухлини не з'являлися.

Приклад 5: Створення культурних рослин, дефіцитних за рою

Культурні рослини, наприклад, пшеницю, сою, рис, бавовну, кукурудзу або рапс, що має мутацію в одному або декількох генах рої (наприклад, в одному або декількох гомологічних генах), ідентифікували або створювали шляхом (випадкового) мутагенезу або цілеспрямованого нокауту (наприклад, із застосуванням специфічної для послідовності нуклеази, такої як мегануклеази, нуклеази "цинкові пальці", ТАГЕМ, Стізрг/ Са59, Стіврг/ Ср і так далі). Зниження експресії й/або активності РОЇ підтверджували за допомогою кількісної ПЛР, вестерн-блотингу або подібними методами.

Культурні рослини, наприклад, пшеницю, сою, рис, бавовну, кукурудзу або рапс, трансформували конструктом, що кодує інгібуючу рої) молекулу нуклеїнової кислоти або зв'язуючу рої) молекулу (наприклад, кодуючу рої) шпилькову РНК, антитіло та так далі, під контролем конститутивного або індуцибельного промотору). Зниження експресії й/або активності РОЮ підтверджували за допомогою кількісної ПЛР, вестерн-блотингу або подібними методами. бо Приклад 6: Трансфекція дефіцитних за рою рослин з геном селективного маркера

Рослина з Прикладу 5, що має знижену експресію РОС), а також відповідну рослину, що має експресію рос) дикого типу, трансформували геном селективного маркера (наприклад, баг, див) із застосуванням Адгобасіегішт, відповідно до загальновідомих в даній області техніки способів.

Проводять скринінг трансформантів за експресією гена селективного маркера.

Трансформанти зі зниженою експресією ро) демонстрували транзієнтну експресію гена селективного маркера, тоді як трансформанти з експресією рої дикого типу демонстрували стабільну експресію гена селективного маркера.

Геномну інтеграцію гена селективного маркера оцінювали за допомогою, наприклад, саузерн-блотингу геномної ДНК, виділеної з трансформованих рослин з експресією рої дикого типу або зниженою. Наявність гена селективного маркера можна визначити в геномній ДНК рослин з роїО дикого типу, тоді як рослини зі зниженою експресією рої) демонстрували меншу інтеграцію гена селективного маркера або навіть її відсутність.

Приклад 7: Цільова інсерція шляхом гомологічної рекомбінації в дефіцитних за рою культурних рослинах

Дефіцитні за Ро рослини з Прикладу 5 і відповідні рослини, що мають експресію рою дикого типу, трансформували нуклеїновою кислотою, що представляє інтерес, для цільової інтеграції шляхом гомологічної рекомбінації. Нуклеїнова кислота, що представляє інтерес, містить послідовності, гомологічні геномній ДНК в цільовому сайті генома. Необов'язково рослину котрансформували за допомогою експресійного конструкта для послідовності специфічної нуклеази, здатної індукувати розрив ДНК на цільовому сайті для посилення гомологічної рекомбінації. Проводили скринінг рослин за інтеграцією нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, за допомогою, наприклад, саузерн-блотингу або ПЛР. Рослини, що мають експресію ро) дикого типу, демонстрували випадкову інсерцію нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, а також цільову інсерцію шляхом гомологічної рекомбінації в цільовому сайті. Рослини зі зниженою експресією ро) демонстрували меншу інсерцію нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, або навіть її відсутність, але демонстрували при цьому цільову інсерцію шляхом гомологічної рекомбінації нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, в цільовому сайті.

Посилання 1. СсеМміп, 5. В. Ріапі ргоївіп5 іпмоїмейд іп Адгобасівегійт-теаіагей депеїїс ігапетоптаїйоп. Аппи

Неум РНуїораїйно! 48, 45-68 2. Пи, у. ега/. Тпе разез ої стомп даї! Шштогідепевів. / Васіепіо! 182, 3885-3895 (2000).

З. Тіпіапа, В. ТНе іпівдгайоп ої Т-ОМА іпіо ріапі депотев5. ТПепав Ріапі осі. 1, 178-184 (1996). 4. СаїІедо, М. Е., Вієсуага, 9У.-мМ., Оаоцада!І-СоНегеї!, 5., щдаїїші, М. 5 М/не, С. І. Ки80 ріауз а гоЇє іп поп-потоіодоив5 гесотрбіпаїйоп риї іб5 пої гедцігей Тог Т-ОМА іпіедгайоп іп Агарідорзів. Р/апі

У. 35, 557-65 (2003). 5. Епевзпег, у. є Ви, А. В. Ки80- апа ОМА Іідазе ІМ-аеїйсіепі ріапі5 аге зепвійме о іопігіпа гадіаноп апа аеїесіїме іп Т-ОМА іпівдгайоп. Р/апі у. 34, 427-400 (2003). б. Мап АнНікит, Н. еї а). Тне Агабідорзіз АШ'ІС4 депе із гедцігейд гог їІйе гераїг ої ОМА датаде,

Бшї пої тог Ше іпівдгайоп ої Адгобасієпит Т-ОМА. Мисівїс Асіах Нев. 31, 4247-55 (2003). 7. М, 9. ег а. Іпмоїметепі ої КОВО іп Т-ОМА іпіедгайогп іп ріапі сеїІ5. Ргос Маїї Асаабсі И5 А 102, 19231-19236 (2005). 8. Мевзвіїгі, І., Моїтє, Е., СаМедо, М. Е. 6 МУніїє, С. І. Мийіріе позі-сеїЇ тесотбіпайоп раїйжаув асі іп Адгобасієгіит теадіаїеа їгапоіогтаїйогп ої ріапі сеїІ5. Р/алі У. (2013). доі:10.1111/р).12398 9. Ражк, 5.-У. еї а/. Адгорасіейцт Т-ОМА іпіеагайоп іпіо Ше ріапі депоте сап оссиг м/йпоці

Ше асіїміу ої Кеу поп-потоіодоиз епа-іоіпіпа ргоївїп5. Рі/іалі 4. (2015). доі:10.1111/р).12779 10. М/іпає!5, Р., Ое Виск, 5., Мап ВоскКвіавєі!еє, Е., Ое І оозе, М. 8 ОерісКег, А. Т-ОМА іпіедгайоп іп Агабідорзі5 спгото5зотев. Ргезепсе апа огідіп ої йег ОМА зедиепсез. Р/алі РНузіо! 133, 2061- 5оО 2068 (2003). 11. КІвіпроейіпу, М. еї а/. Пе 5штисішта! Теаїштеб5 ої Шоизапаз ої Т-ОМА іпзепіоп 5іїе5 аге сопвібієпі мій а аоибіе-зітапа БгеаК гераійї Базей іпвепіоп тесПпапізєт. Мо/. Р/апі (2015). доі:10.1016/.тоір.2015.08.011 12. Спап, 5. Н., Ми, А. М. 5 МеМеу, М. Юиаї гоЇез ог ОМА роїутегавзе іНеїа іп анегпаїме епа- |оіпіпд гераїг ої аоиріє-5ігапа Бгеакз іп Огозорпіїа. Рг о5 Степеї. 6, е1001005 (2010). 13. Роеєтіпк, 5. Е., мап Зспепавеї, В. 5 Ті)ївієтпап, М. Роїтутегазе Іеїа-тедіаївй епа оіпіпд ої геріїсайоп-аззосіаїєа ОМА Бгеакз іп С. єієдап5. Сепоте Нез. (2014). дої:10.1101/941.170431.113 14. Кооіє, МУ. еї а). А Роіутегазе ТНеїа-дерепдепі гераїї раїйпжау 5ирргеззе5 ехівпвіме депотіс іпбіабіїйу аї епдодепоиз 14 ОМА 5ійез. Ма! Соттип. 5, 3216 (2014).

15. Маїєо5-Соте, Р. А. еї а/ Маттаїйап роіутегазе 9 рготоїез аМегпайме МНЕ) апа вирргев5з5ез гесотрбіпайоп. Маштге (2015). аоі10.1038/пате14157 16. Моизеїгаден, М. у. еї а). Меспапізт ої Зирргезвіоп ої Спготозотаї! Іпеїарійу Бу ОМА

Роїутегазе РОГ О. Рі о5 Сепеї. 10, е1004654 (2014). 17. Іпадакі, 5. еї а/. Агарідорзіз ТЕВІСНІ, м/йй Неїїсазе апа ОМА роїутегазе дотаїп5, ів гедцігей гог гедшіаїес сеї! аїмівіоп апа дінегепіайоп іп тегізіетв. Р/іапі Се// 18, 879-92 (2006). 18. Моизеїгаден, М. У. 5 Мосс, В. ОЮ. ОМА роїутегазе РОГ О апа сеїІшаг деїгепзе адаіпзі ОМА датаде. ОМА Нераїг (Ат5у). 12, 1-9 (2013). 19. Оевієих, С., Сіоцай, 5. 9. 6 Вепі, А. Е. ГЕетаїе гергодисіїме ііз5цез аге пе ргітагу їагуєї ої

Адгорасієегійт-тедіаїва ігапотогтаїййоп Бу Ше Агарідорвів Пога!-дір теїпоа. Р/алі РНузіо! 123, 895- 904 (2000). 20. Ниапа, 5., Ап, У. О., Меромеї, У. М., МеКіппеу, Е. С. 5 Меаднег, В. В. ТнНе Агабрідорзів

АСТІ11 асіїп депе ів зігопдіу ехргезб5ей іп іїїз5цев ої Ше етегдіпа іппогезсепсе, роїПеп, апа демеІоріпу омшев5. Р/алі Мої. Віо!. 33, 125-39 (1997). 21. Ое Виск, 5., Родеміп, М., Мої", у., Уасобв, А. є ОерісКег, А. Те Т-ОМА іпівдгайоп рацет іп

Агарідорвзів ігапетогптапів і5 підніу дегептіпед Бу Ше гапвіопнвеа їагдеї сеї. Р/алі У. 60, 1934-45 (2009). 22. Кепі, Т., Снапагатошіу, с., МеОємій, 5. М., Ог7детіг, А. У. б. Ротегапіг, В. Т. Меснапізт ої тістопотоіоду-тедіаїей епа-|оіпіпд рготоїєд Бу питап ОМА роїутегазе 9. Маї. бігисі. Мої.

Віої. (2015). адої10.1038/пвтр.2961 23. Копіег, Е., Сагдоп, с., РопІтап, М., Сі, ЕК. 5 Зспівдег, О. Еппапсетенпі ої ігапетоптайп гаїе5 іп піднег ріапів Бу Іом/-дозе ітаадіайноп: Аге ОМА гераїг зубзієтв5 іпмоїмеай іп Те іпсогрогайоп ої еходепоив ОМА іпіо Ше ріапі депоте? Р/алі Мо!. Віо!. 12, 189-499 (1989). 24. Заїотоп, 5. 5 Рисніа, Н. Сарійге ої депотіс апа Т-ОМА з5едиєпсев ашгіпа доибів-вігапа

Бгеак гераїг іп зотаїс ріапі сеїїз. ЕМВО У. 17, 6086-95 (1998). 25. ТГлйга, Т., ЕгапКктап, І/. ВА., Маіїдуа, М. а Сійоу5Ку, М. Зйе-зресіїс іпіеагайоп ої

Адгобасієтійт їштеїасієпе Т-ОМА міа доибіве-5ігапаєай іпіептедіаїев5. Р/апі РНузіо! 133, 1011-1023 (2003). 26. Спіпоп, М. 0. в Оце, О. Тагдеїей іпіеагайноп ої Т-ОМА іпіо Те їобрассо депоте аї доцбріе-

Зо вігапаєйд Бгеакв: пему/ іпбзідніз оп Ше теспапівт ої Т-ОМА іпієдгайоп. Р/алі РНузіо! 133, 956-965 (2003). 27. пи, О.-Н., Ватт, К., Еатеп5, А. Ї., Оєппі5, Е. 5. 5 Ораднуауа, М. М. Тгапздепе зігисіцгез зидаеві Шаї тийПіріе теспапіств аге іпмоїмейд іп Т-ОМА іпівдгайоп іп ріапів. Р/алі 5сі. 171, 308-22 (2006). 28. Тпотав, С. М. в допев, у). О. МоїІесшіаг апаїузів ої Адгобасієїйшт Т-ОМА іпіведгайоп іп тай гемеаЇб5 а гоїє Тог Іей рогдег зедиєпсе потоіоду іп тові іпіедгайоп емепіб. Мо/ Сепеї

Сепотісв 278, 411-420 (2007). 29. Оовиті, Т., Виї2-Ноіав, у. У., Мейеих, А. Е., ОісКептап, А. 5 Зпціаєм, М. Ітріетепіїпа гемегзе депеїйсз5 іп Нозасеає: апа|увзі5 ої Т-ОМА Папкіпуд зедиепсез ої іпзепіопа! тшапі Іїпез іп Те аіріоїд зігамбрегту, Егадапа мезса. Ррузіо!. Ріапі. 140, 1-9 (2010). 30. Біпдег, К., ЗПіроїейн, У. М., Гї, У. в Така, Т. Еоптаїйоп ої сотріех ехігаспготозота! Т-ОМА вігисіигез іп Адгобасівет ит Штеїасієпз-іпіесієй ріапів. Р/апі РНузіо!. 160, 511-22 (2012). 31. Аіопзо, .). М. еї а. Сепоте-м/іде іпзепіопа! тиїадепевів ої Агарідорзів ІНнаійапа. бсіепсе 301, 653-7 (2003).

З2. Веїегерегдеп, А., ОиїК-Нав, А. 0., Зспіїрегооті, В. А. 4 НосуКаав, Р. У. Сопійдаїйме Тгапвтег ру Ште Мігшепсе Зувієт ої Адгобасієтіцт іштеїасіепв. осіепсе (80-. ). 256, 1324-1327 (1992). 33. Сіоцо9п, 5. У. 5 Вепі, А. Р. Ріога! аїр: а в5ітрійей тетйоай ог Адгобасієгійт-теаіаїва їапетоптаїйоп ої Агарідорзів ІпаїІапа. Р/апі у 16, 735-743 (1998). 34. Іао, с. В., Бієїп, Р. А. 6 І цам/д, А. А. А ОМА Ігапеіоптаїйоп-сотреїепі Агарідорзів депотіс Іїбгагу іп Адгобасієтішт. Віотеснппої. (М У) 9, 963-967 (1991). 35. Ое Раїег, 5., Ріпав, 9. Е., НосуКаав, Р. у. у. б мап дег 7ааї, В. 9. 7ЕМ-теаіаївд депе

Тагдеїїпу ої ШТе Агарідорві5 рогорогрпугіподеп охідазе депе Іпгошдп Адгобрасієгійт -теаіаїеа Погаї дір ігапотоптаїйоп. Р/алі Віотесппої. у. 11, 510-5 (2013). 36. Мегацпві, А. б. еї а). МігВ/04-дерепаеєпі ргоївіп ігапзіосайоп їот Адгобасієгійт іп ріапі сеїв. бсіепсе (80-. ). 290, 979-982 (2000). 37. Ое Раїег, 5., Мешероот, ГІ. МУ., Ріпав, у. Е., НоосуКаа;, Р. 9. б мап дег 7ааї, В. 9. 7ЕМ- іпдисед тшиїадепевзів апа депе-їагдеїпо іп Агарідорвів годи Адгобасієгпшт-теаіаїеа Пога! аїр їапетоптаїйоп. Р/алі Віоїтеснпої! 7, 821-835 (2009).

38. іш, М. с., МіївиКамжа, М., Оозиті, Т. 5 МУ/піцієтї, А. Е. ЕнНісієпі ізоЇайоп апа тарріпд ої

Агарідорвів ІНайійапа Т-ОМА іпзеп |псіїоп5 Бу Шептаї! азуттеїйтс іпіеПасейд РСВ. Ріалі / 8, 457-

Claims (15)

463 (1995). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб скорочення випадкової інтеграції трансфікованих молекул нуклеїнової кислоти в рослинну клітину, причому зазначений спосіб включає трансфекцію рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, при цьому експресія й/або активність РОЇ СО) в зазначеній рослинній клітині знижена у порівнянні з рослинною клітиною дикого типу.

2. Спосіб трансфекції рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, де зазначений спосіб скорочує випадкову інтеграцію трансфікованої молекули нуклеїнової кислоти в рослинну клітину, причому спосіб включає трансфекцію рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, при цьому експресія й/або активність РОГ О в зазначеній рослинній клітині знижена у порівнянні з рослинною клітиною дикого типу.

3. Спосіб експресії молекули РНК або поліпептиду в рослинній клітині, де зазначений спосіб скорочує випадкову інтеграцію трансфікованої молекули нуклеїнової кислоти в рослинну клітину, причому спосіб включає трансфекцію рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує зазначену молекулу РНК або поліпептид, при цьому експресія й/або активність РОГО в зазначеній рослинній клітині знижена у порівнянні з рослинною клітиною дикого типу.

4. Спосіб одержання рослини, яка експресує молекулу РНК або поліпептид, де зазначений спосіб скорочує випадкову інтеграцію трансфікованої молекули нуклеїнової кислоти в рослинну клітину, причому спосіб включає трансфекцію рослинної клітини молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує зазначену молекулу РНК або поліпептид, при цьому експресія й/або активність РОГО в зазначеній рослинній клітині знижена у порівнянні з рослинною клітиною дикого типу, й одержання рослини із зазначеної рослинної клітини.

5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що зазначена молекула нуклеїнової кислоти інтегрована шляхом сайт-специфічної генетичної рекомбінації або гомологічної Зо рекомбінації в хромосому рослинної клітини.

6. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена рослинна клітина містить антисмисловий олігонуклеотид, специфічний для пре-мРНК, кодованої геном РОГО, або дволанцюгову молекулу РНКІ, специфічну для мРНК, кодовану геном РОЇ О.

7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що рослинна клітина має один або більше мутованих алелей РОГ О, таким чином, що експресія й/або активність РОГ О знижена щонайменше на 70 95 у порівнянні з геном дикого типу.

8. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена рослинна клітина не є Агабрідорвзіх Іпа/апа.

9. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4 або 6-8, який відрізняється тим, що зазначена молекула нуклеїнової кислоти транзієнтно трансфікована в рослинну клітину.

10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що зазначена транзієнтно трансфікована молекула нуклеїнової кислоти кодує нуклеазу.

11. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що зазначена транзієнтно трансфікована молекула нуклеїнової кислоти кодує компонент системи СКІЗРЕ/Сав.

12. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що зазначена транзієнтно трансфікована молекула нуклеїнової кислоти містить рослинну експресійну касету.

13. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що експресія РОГ О у зазначеній рослинній клітині знижена за допомогою мутації одного або більше алелей РОГ О з використанням опромінення, хімічного мутагену, випадкової інтеграції з використанням транспозону, сайт-спрямованого мутагенезу, гомологічного вектора рекомбінації або цільової нуклеази.

14. Спосіб за будь-яким із пп. 1-12, який відрізняється тим, що експресія РОГ О у зазначеній рослинній клітині знижена шляхом забезпечення рослинної клітини з інгібуючою РОЇГО молекулою нуклеїнової кислоти, при цьому зазначена інгібуюча РОГО молекула нуклеїнової кислоти безпосередньо націлена на РОГ О.

15. Спосіб за будь-яким із пп. 1-12, який відрізняється тим, що активність РОЇ СО у зазначеній рослинній клітині знижена шляхом забезпечення рослинної клітини зі зв'язуючою РОГО молекулою, при цьому зазначена зв'язуюча РОЇО молекула зв'язується й інгібує його ферментну активність і/або його здатність зв'язувати ДНК.