CN109196105B - 转染植物和减少随机整合事件的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于转染植物的方法和用于在植物中表达RNA或多肽分子的方法。特别地，转染具有降低的POLQ表达和/或活性的植物以减少随机整合事件。本公开还提供了通过本文公开的方法产生的转染植物和植物后代。

Description

转染植物和减少随机整合事件的方法

发明领域

本公开提供了用于转染植物的方法和在植物中表达RNA或多肽分子的方法。特别地，转染具有降低的POLQ表达和/或活性的植物以减少随机整合事件。本公开还提供了通过本文公开的方法产生的转染植物和植物后代。

发明背景

通过转染对植物进行基因改造允许改变性状，例如增加产量，抗病虫害，增加营养生物量，除草剂耐受性，营养质量，干旱和胁迫耐受性，以及园艺品质如色素形成和生长，以及作物改良的其他农艺特性。此外，基因修饰的植物已被用作表达重组蛋白的系统。

用核酸转染植物如今是一种常见的做法，其可以通过本领域已知的许多不同方法来进行。然而，现有转染方法的一个缺点是在宿主基因组中产生相对大量的随机DNA整合事件。随机整合可对宿主生物体产生不可预测和/或有害的影响。此外，将DNA整合到植物基因组中并不总是可取的，特别是当基因改造(GMO)的植物引起环境和政治问题时。因此，仍然需要开发用于植物中表达转基因的改良系统。

发明简述

本公开一方面提供了用于减少转染的核酸分子在植物细胞中随机整合的方法，所述方法包括向植物细胞提供核酸分子，其中所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。

本公开另一方面提供了用核酸分子转染植物细胞的方法，所述方法包括向植物细胞提供核酸分子，其中所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。

在优选的实施方案中，所述方法用于基因打靶。具体地，所述方法用于通过基因重组产生在其基因组中的特定位点携带DNA序列的植物细胞。

本公开另一方面提供了用于在植物细胞中表达RNA分子或多肽的方法，所述方法包括向植物细胞提供编码所述RNA分子或多肽的核酸分子，其中所述宿主细胞中的POLQ表达和/或活性降低。

本公开另一方面提供了用于产生表达RNA分子或多肽的植物的方法，所述方法包括向植物细胞提供编码所述RNA分子或多肽的核酸分子，以及由所述植物细胞产生植物，其中所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。

优选地，将核酸分子转染到具有降低的PolQ表达和/或活性的植物细胞中。在一些实施方案中，将核酸分子瞬时转染到植物细胞中。优选地，核酸包含植物表达盒。优选地，植物表达盒包含编码多肽或RNA分子的核酸序列和驱动表达的调控序列。优选地，核酸是核酸酶。优选地，核酸是Crispr/Cas系统组分。

在一些实施方案中，核酸分子通过基因重组在特定位点整合到植物细胞的染色体(或者更确切地说，通过位点特异性基因重组或同源重组)。优选地，这种稳定整合导致异源多肽或RNA分子的表达。在一些实施方案中，整合是同源重组的结果。在一些实施方案中，这种稳定整合破坏或修饰内源基因。在一些实施方案中，整合是位点特异性重组的结果。

在一些实施方案中，所述植物细胞包含对由POLQ基因编码的前mRNA具有特异性的反义寡核苷酸，或对由POLQ基因编码的mRNA具有特异性的双链RNAi分子。在一些实施方案中，植物细胞具有突变的POLQ基因。在一些实施方案中，植物细胞具有POLQ基因的敲除。

本公开另一方面提供了通过本文公开的方法产生的植物及其后代(包括种子)。优选地，所述植物和后代包含通过基因重组(即，位点特异性整合和非随机整合)稳定整合到基因组的核酸分子。

在上述的一些实施方案中，所述植物细胞不是拟南芥的。

本公开另一方面提供了植物或植物细胞，其中所述植物或植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低，并且其中所述植物或植物细胞不是拟南芥的。本公开还提供了所述植物和细胞用于转染核酸分子的用途。

本公开另一方面提供了具有降低的POLQ表达和/或活性的植物或植物细胞用于产生表达RNA分子或多肽的植物的用途，其中a)编码所述RNA分子或多肽的核酸分子未整合到植物细胞染色体，或者b)编码所述RNA分子或多肽的核酸分子通过位点特异性基因重组或同源重组整合到植物细胞的染色体。

附图简述

图1：Polθ缺陷型植物通过浸花法转化对T-DNA整合是难以控制的。a，浸花法转化策略：(1)将开花的拟南芥植物浸入含有农杆菌细胞的悬浮液中，然后(2)使植物产生种子。(3)将小百分比可能已经转基因(描绘为黄色)的种子播种于(4)含有适当除草剂作为选择标志物的固化培养基。b，含有除草剂膦丝菌素(PPT)的平板(其上播种了浸花法转化后收集的野生型(左)和teb-5(右)种子)的代表性图像。已稳定整合的含有选择标志物的T-DNA的转化苗是PPT抗性的。c，使用以下两种不同的卸甲农杆菌菌株进行浸花法实验：补充有二元载体pCAMBIA1301的LBA1100和补充有二元载体pSDM3900的AGL1。d，在发育的长角果中瞬时表达ACT11启动子(蓝色)控制下的含有内含子的GUS报告基因(gusA)的发育胚胎的代表性图像。

图2：Polθ是根转化介导的拟南芥转基因所必需的。a，根转化策略。使种子在液体培养物中萌发(1)，并收集10天龄的拟南芥苗的根，在固化培养基上预培养2-3天，并与农杆菌细胞共培养(2)。在含有除草剂PPT的固化培养基上形成愈伤组织/芽，并且在三周后将其转移到新鲜平板上，其上的芽已稳定整合T-DNA而获得抗性标志物，可以继续生长(3)。b，含有除草剂膦丝菌素(PPT)的平板(其上生长野生型(左)和teb-5(右)根以允许芽形成)的代表性图像。野生型芽(左图)已获得PPT抗性，指向稳定的T-DNA整合，而teb-5芽(右图)正在恶化。c，用于回收T-DNA-植物基因组连接的TAIL-PCR产生大多数野生型愈伤组织的产物(上图)，而teb-5愈伤组织在TAIL-PCR中未产生任何产物(下图)。d，野生型根外植体，其中箭头指向GUS阳性斑点，其中农杆菌已递送一个或多个含有含内含子的GUS报告基因的T-DNA。e，计数野生型Col-0，teb-2和teb-5每个外植体的GUS阳性斑点。每次实验计数至少100个根外植体。f，计数野生型Col-0，teb-2和teb-5绿芽的形成，表明T-DNA的稳定整合。

图3：填充物DNA反映了最小配对的T-DNA-拟南芥基因组分子的Polθ依赖性延伸。a，所提出的Polθ在T-DNA整合中的作用：通过Polθ的DNA合成使最小配对的3'突出DNA末端稳定，一端由T-DNA提供，另一端由拟南芥基因组提供。T-DNA-基因组连接点是以下两种类型中的一种：约57％的测序连接点含有填充物DNA，而约43％的测序等位基因不含填充物。b，最长公共子串(LCS)分析的示意图。对于每种填充物(蓝色)，确定填充物和靶序列之间最长可能的序列同一性区段。c，具有6至40nt大小填充物的T-DNA的LCS的热图代表。在左图中，绘制了伪随机概率(对于方法，参见方法部分)，而中间图反映了完整的数据集，其中搜索空间包含T-DNA插入物两侧的基因组拟南芥序列(相对于连接点-120bp至+160bp)，插入物内(从连接点开始)160bp的T-DNA序列和120bp的T-DNA原始侧翼，即质粒DNA。右图显示数据超概率差异，从而可视化过度呈现(黄色到红色)和呈现不足(浅蓝色到深蓝色)。根据该差异热图，T-DNA整合的百分比被确定为48.2％，其中它们的同源填充物相对于概率过度呈现超过10倍。d，在c中确定的子类别(n＝1,653)用于绘制相对于整合位点的位置(5bpbin大小)。e，含有T-DNA连接点的填充物的热图代表，其中含有填充物的连接点绘制成它们在连接点附近的同源填充物匹配序列，以显示序列同一性程度。f，没有填充物的T-DNA整合连接点的热图代表，其中在T-DNA和拟南芥基因组之间确定序列同一性程度。

图4.T-DNA整合的模型。a，T-DNA在3'末端优先被捕获，其中polθ可以通过最小碱基配对从引发延伸。随后5'末端通过基因组捕获在基因组中产生单个T-DNA插入物(左图)。然而，在大多数情况下(63％)，观察到双重整合，其中两个T-DNA处于反方向，这指向植物基因组优先捕获T-DNA3'末端。b，在捕获T-DNA的3'末端后，引发，延伸和引物-模板转换的迭代循环将导致T-DNA插入，其中修补工作填充物携带多个模板化的插入。

公开实施方案的详细描述

通常，植物中的基因重组大部分是非同源的，或者更确切地说，引入的DNA随机插入染色体的任何位置。如果引入的DNA破坏例如内源基因的表达，则随机整合可能具有有害作用。此外，相比通过位点特异性整合，通过随机整合的DNA编码的RNA或蛋白质的表达更不可预测，因为整合位点和整合事件的数量都会影响表达。本文公开的方法的目的之一是减少(包括消除或避免)或消除转染DNA的随机整合。该方法的另一个目的是提供用于基因打靶的有效方法。

在某些情况下，在植物中仅需要瞬时转染DNA。例如，可能存在环境或政治原因来避免或限制(稳定的)基因改造植物的使用。另外，在某些情况下，可能仅短期需要所期望的表达。本文公开的方法的目的之一是提供其中仅瞬时转染目的核酸分子的方法和植物，或者更确切地说，目的核酸分子不插入植物染色体中。在优选的实施方案中，转染的核酸是核酸酶或Crispr/Cas系统组分。

本公开的一个方面提供了用目的核酸分子转染植物细胞的方法。转染的植物细胞可用于表达目的RNA或多肽。可以从这种转染的植物细胞产生植物。提供了用于减少转染的核酸分子的随机整合的方法。

本文公开的方法包括向植物细胞提供核酸分子，其中植物细胞中的POLQ表达降低。如实施例中所证明的，转染具有降低的POLQ表达的植物导致消除转染的核酸分子的随机整合。

在一些实施方案中，所述方法优选用于目的RNA或多肽的瞬时表达。在其他实施方案中，所述方法优选用于核酸分子通过基因重组的稳定的位点特异性整合。瞬时表达是指未整合到宿主染色体中，但独立地起作用的核酸分子的表达。稳定整合是指核酸通过共价键整合到宿主DNA中。“基因重组”允许在限定的位点特异性位置引入选定的核酸的基因组中，并且包括同源重组和位点特异性重组。

优选地，不通过非同源重组插入目的核酸。本文公开的方法被描述为产生细胞和植物，其中目的核酸未整合到植物细胞染色体中(即，瞬时转染)，或通过位点特异性基因重组或同源重组整合到植物细胞的染色体中。本领域技术人员应当理解，当实施本文公开的方法时，可能产生小百分比的植物细胞，其中通过非同源组合插入目的核酸。然而，技术人员可以容易地鉴定和忽视这种植物细胞。

任何合适的核酸分子可用于转染植物细胞。尽管DNA是优选的核酸分子，但RNA转染也包括在本发明中。例如，An等描述了拟南芥中的RNA转染方法(An等，BiosciBiotechnol Biochem.2003 Dec；67(12)：2674-7)。

优选地，核酸分子包含编码多肽或RNA分子(例如，多肽编码RNA或非编码RNA，如长的非编码RNA，miRNA，tRNA，核糖体RNA，snoRNA等)的核酸序列。目的核酸分子包括影响植物杀虫剂抗性，疾病抗性，除草剂抗性，营养和纤维素含量，非生物胁迫抗性，产量增强基因，耐旱基因，耐寒基因，抗生素抗性和标志物基因的那些核酸分子。例如，US20140130207描述了可以在植物中表达以提供对害虫和病原体的抗性的RNAi分子。

优选地，转染的核酸分子是异源的。如本文所用，异源核酸(或异源基因)包括植物中通常未发现的核酸，例如来自另一物种的核酸。异源核酸还包括已以某种方式改变(例如，突变，以多拷贝添加，与非天然启动子或增强子序列连接等)的生物体天然的多核苷酸。异源植物基因与内源植物基因的区别在于，异源基因序列通常与包含诸如启动子的调节元件的核苷酸序列连接，所述核苷酸序列未被发现天然地与由异源基因编码的蛋白质的基因相关或与染色体中的植物基因序列相关，或者所述核苷酸序列与自然界中未发现的染色体部分(例如，在基因通常不表达的基因座中表达的基因)相关。

在一些实施方案中，转染的核酸分子是核酸酶。优选的核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，聚集的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)核酸酶，大范围核酸酶和切口核酸内切酶。此类核酸酶可用于基因或基因组编辑的方法中。

优选地，转染的核酸分子是Crispr/Cas系统的一部分，例如Cas核酸酶和/或引导核酸。如技术人员所知，Crispr/Cas系统可用于基因编辑。可以使用此系统编辑、突变、替换或敲除基因。Crispr/Cas也可用于通过使用与转录激活结构域融合的修饰的“死”Cas蛋白来调节基因表达(对于Crispr技术的最新综述，参见，例如，Khatodia等，Frontiers inPlant Science 2016 7：article 506，以及Ma等，FEBS Journal 2014 5186-5193)。

在本发明的优选方法中，转染编码Cas蛋白的核酸分子。Cas蛋白可以是I型，II型，III型，IV型，V型或VI型Cas蛋白。Cas蛋白可包含一个或多个结构域。结构域的非限制性实例包括引导核酸识别和/或结合的结构域，核酸酶结构域(例如，DNase或RNase结构域，RuvC，HNH)，DNA结合结构域，RNA结合结构域，解旋酶结构域，蛋白质-蛋白质相互作用结构域和二聚化结构域。引导核酸识别和/或结合的结构域可以与引导核酸相互作用。在一些实施方案中，核酸酶结构域可包含产生切口酶或“死”酶(即，核酸酶结构域缺乏催化活性)的一个或多个突变。

优选的Cas蛋白包括c2c1、C2c2、c2c3、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cash、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1或Csx12)、Cas10、Cas10d、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966，以及它们的同源物或修饰形式。

在本发明的优选方法中，转染Crispr靶向序列。此类序列是技术人员已知的，并且包括gRNA(向导RNA)，crRNA，tracrRNA和sgRNA。Crispr靶向序列与宿主植物基因组中的互补序列结合，并将Cas蛋白靶向相应位点。

在具有降低的POLQ表达和/或活性的植物细胞中转染Crispr/Cas系统，减少了Crispr/Cas组分随机插入植物基因组。虽然不希望受理论束缚，但Crispr组分的瞬时转染可降低脱靶效应和/或提高Crispr/Cas系统的特异性。在其他实施方案中，本公开提供了用于产生植物的方法，其中通过位点特异性基因重组或同源重组稳定转染Crispr组分(例如Cas酶)。

在一些实施方案中，该方法提供核酸分子的瞬时转染。优选地，用于瞬时转染的核酸分子包含植物表达盒。合适的植物表达盒包含与编码转录物的核酸序列可操作地连接的5'和3'调控序列。术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的结合，使得一个核酸序列的功能由另一个核酸序列调控。例如，当启动子能够调控该编码序列的表达时(即，编码序列处于启动子的转录控制下)，启动子与该编码序列可操作地连接。

优选地，植物表达盒包含驱动植物表达的启动子和多腺苷酸化信号。用于表达核酸序列的示例性启动子包括植物启动子，例如CaMV 35S启动子(Odell等，1985)，CaMV 19S(Lawton等，1987)，nos(Ebert等，1987)，Adh(Walker等，1987)，蔗糖合成酶(Yang和Russell，1990)，α-微管蛋白，肌动蛋白(Wang等，1992)，cab(Sullivan等，1989)，PEPCase(Hudspeth和Grula，1989)，或与R基因复合物相关的那些启动子(Chandler等，1989)。还可以使用组织特异性启动子，例如根细胞启动子(Conkling等，1990)和组织特异性增强子(Fromm等，1986)。植物表达载体的实例包括以下详述的那些载体：Becker，D.等，1992，Newplant binary vectors with selectable markers located proximal to the leftborder,Plant Mol.Biol.20:1195-1197；和Bevan，M.W.，1984，Binary Agrobacteriumvectors for plant transformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721；以及Vectors forGene Transfer in Higher Plants；in:Transgenic Plants,Vol.1,Engineering andUtilization,eds.:Kung and R.Wu,Academic Press,1993,S.15-38。

在一些实施方案中，所述方法提供了核酸分子通过基因重组的稳定的位点特异性整合。位点特异性整合是指在基因组的限定区域，依赖于基因组中的核酸序列的整合。这与随机整合不同。在一个实施方案中，核酸通过同源重组整合到植物基因组。用于诱导同源重组的合适方法和载体是已知的。例如，可以制备包含目的核酸分子的同源重组载体，所述目的核酸分子的5'和3'端的侧翼为与内源植物序列同源的核酸序列。同源重组可用于利用例如无关的新基因，失活基因或野生型基因的修饰形式(新等位基因)取代染色体的野生型基因。同源重组也可以由核酸酶诱导，例如锌指核酸酶(ZFN)，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，聚集的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)核酸酶，大范围核酸酶和切口核酸内切酶。

例如，核酸可以编码突变形式的内源多肽或RNA分子。突变可以是功能获得或功能丧失(例如，失活突变)。在一些实施方案中，核酸可包含例如第一区域，第二区域和第三区域。第一区域和第三区域与目的基因基本同源。第二区域可以包含突变形式的内源基因，或者例如编码标志物。优选地，标志物是阳性选择标志物，例如药物抗性基因、编码表面标志物的基因、编码荧光标志物的基因、或编码β-半乳糖苷酶的基因。用于植物的合适的同源重组方法和载体是本领域已知的，并且描述于例如WO2003027261中。

在一个实施方案中，核酸通过位点特异性重组整合到植物基因组。已经在植物中测试了几种位点特异性重组系统，包括Cre/lox系统，Flp/FRT系统和R/RS系统。重组酶通过促进它们的两个重组位点之间的重组来发挥其作用。在cre的情况下，重组位点是Lox位点，并且在Flp的情况下，重组位点是Frt位点。这些重组位点包括由不对称序列分开的反向回文。在同一线性DNA分子上平行排列的靶位点(所谓的“直接重复序列”)之间的重组导致介于中间的DNA序列作为环状分子而切除。在本文公开的方法中，在其基因组中携带稳定识别序列(例如，FRT，lox或RS位点)的植物和植物细胞连同合适的重组酶(例如，Flp，Cre或R重组酶)，可用于转染侧翼为相应的识别序列的目的核酸分子。转染导致核酸分子的稳定整合。

对于瞬时或稳定转染，选择性或筛选性标志物可包括在待转染的核酸分子中。“标志物基因”是赋予表达标志物蛋白的细胞不同的表型，因而使转染的细胞与不具有该标志物的细胞相区别的基因。这些基因可以编码选择性或筛选性标志物，这取决于标志物是否赋予可通过化学方法即通过使用选择剂(例如，除草剂，抗生素等)“选择”的性状，或者其是否只是一个可以通过观察或测试即通过“筛选”(例如，绿色荧光蛋白)鉴别的性状。选择性标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因以及赋予除草化合物抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码对除草剂不敏感的经修饰的靶蛋白，或编码在除草剂发生作用之前使植物中的除草剂降解或解毒的酶。(参见DeBlock等，(1987)EMBO J.6：2513-2518；DeBlock等，(1989)PlantPhysiol.91：691-704；Fromm等，(1990)8：833-839；Gordon-Kamm等，(1990)2：603-618)。例如，通过使用编码突变靶酶，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因，已经获得了对草甘膦或磺酰脲除草剂的抗性。合适的标志物蛋白的多个实例是本领域已知的，并且可以用于本发明的实践中。在该方法的优选实施方案中，筛选转染的植物细胞或其再生植物中是否存在选择性或筛选性标志物。

“转染”在本文中定义为将核酸引入植物细胞的过程，并且其包括术语“转化”。植物细胞和植物部分包括来自花粉，胚珠，叶，胚，根，根尖，花药，花，果实，茎，芽和种子的单细胞和组织；以及花粉，胚珠，叶，胚，根，根尖，花药，花，果实，茎，芽，接穗，初生主根，种子，原生质体，愈伤组织等。可以使用本领域熟知的各种方法在自然或人工条件下进行转染。合适的方法包括病毒感染，电穿孔，脂质转染和粒子轰击。Paszkowski等，EMBO J.3：2717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)，Reich等，Biotechnology4：1001-1004(1986)，和Klein等，Nature 327：70-73(1987)描述了这些技术的实例。转染包括通过物理或化学方法或通过病毒感染将核酸引入植物细胞中。然而，技术人员清楚，该方法不包括通过杂交或相交引入核酸。

可以使用本领域已知的标准技术将转染的细胞再生成完整的植物。除了转染体外培养的植物细胞，组织或器官外；还可以转染整个活植物。农杆菌介导的转移是用于将基因引入植物细胞的广泛适用的系统，因为DNA可以被引入整个植物组织中。合适的方法包括将幼苗，叶，根，子叶等浸入农杆菌悬浮液中(其可以通过真空渗入加强)，以及对于一些植物，将开花植株浸入农杆菌溶液(浸花法)中来增强，之后培育转化的配子。

成功转染的细胞优选通过选择或筛选鉴定并在支持再生的适当培养基中培养，然后允许其再生成植物。“再生”是指从植物细胞(例如植物原生质体或外植体)培育植物的过程，并且这些方法是本领域熟知的。

在优选的实施方案中，通过农杆菌T-DNA系统转染目的核酸分子。合适的农杆菌菌株包括LBA4404，EHA101，C58，EHA105，AGL1或GV3101。T-DNA可以是修饰的Ti质粒或衍生自Ti质粒(肿瘤诱导质粒)的人工载体，在本文中统称为“T-DNA载体”。Ti质粒是包含T-DNA区和vir(毒性)区的环状DNA分子。内源T-DNA区包含侧翼为右边界和左边界的用于生长素(aux)，细胞分裂素(cyt)和冠瘿碱(opine,ocs)生物合成的基因。边界是具有24个碱基对的不完全直接重复。毒性区的基因负责将T-DNA转移到植物细胞中。例如，在VirD1辅助下的VirD2内切核酸酶切割T-DNA的边界，释放单链的T-DNA拷贝，即T链，其通过virB编码的转运系统转运到植物细胞。VirE2蛋白结合宿主细胞中的T链，并且复合物进入植物细胞核。

在一些实施方案中，将目的核酸插入Ti质粒的T-DNA区。优选地，去除Ti质粒的aux，cyt和ocs基因(即，质粒被“卸甲”)。

在一些实施方案中，使用衍生自Ti质粒的人工载体。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞是本领域熟知的。参见，例如，Fraley等(1985)，Rogers等(1987)和美国专利第5,563,055号(其全部内容通过引用明确并入本文)所述的方法。在一些实施方案中，突变Ti质粒的一个或多个基因以提高转化效率，例如农杆菌菌株，其中vir基因表达和/或其诱导由于突变或嵌合virA或virG基因的存在而改变(例如Chen和Winans，1991，J.Bacteriol.173：1139-1144；和Scheeren-Groot等，1994，J.Bacteriol.176：6418-6246)。在另一个实施方案中，农杆菌菌株可包含额外的virG基因拷贝，例如来源于pTiBo542的超virG基因。

在优选的实施方案中，使用T-DNA二元系统。在二元系统中，将T-DNA转移到植物细胞中所需的vir基因和T-DNA位于不同的质粒。“二元质粒”包含目的核酸，优选植物标志物，其左右两侧是T-DNA边界序列。二元质粒通常还包含允许在大肠杆菌和农杆菌中复制的一个或多个复制起点，以及细菌选择性标志物。“辅助质粒”包含来自Ti质粒的vir基因。T-DNA二元系统载体可商购获得。还公开了二元载体系统，其中T区位于农杆菌菌株的染色体(参见例如EP-B 176 112)。

在本文公开的方法的优选实施方案中，所述方法包括向植物细胞提供核酸分子，所述分子包含目的核酸序列，其侧翼为来自农杆菌T-DNA序列的右边界序列(RB)和来自农杆菌T-DNA序列的左边界序列(LB)。如本文所讨论，核酸分子可以进一步包含调控序列来驱动植物中的表达和/或标志物基因。优选地，在该方法中还提供了来自Ti质粒的vir结构域。该vir结构域可以存在于上述的同一核酸分子，或者可以由单独的载体例如辅助质粒提供。技术人员清楚的是，来自Ti质粒的完整vir结构域并不是必要的。

虽然不希望受理论束缚，但我们认为单链的无保护的T-DNA 3'端(左边界)通常是POLQ介导的修复反应的底物，其导致随机整合。植物细胞中POLQ的降低减少或消除了T-DNA的随机整合，同时使基因重组和瞬时表达不受影响。因此，当用任何来源的核酸转染植物细胞时，预期POLQ的降低会减少或消除随机整合，这导致具有无保护的3'端的单链DNA存在于细胞核中。

原则上，所有植物都可用于转染。优选的转基因植物为例如选自以下的植物：槭科，漆树科，伞形科，菊科，十字花科，仙人掌科，葫芦科，大戟科，豆科，锦葵科，睡莲科，罂粟科，蔷薇科，杨柳科，茄科，棕榈科，凤梨科，莎草科，鸢尾科，百合科，兰科，龙胆科，唇形科，木兰科，毛茛科，忍冬科(Carifolaceae)，茜草科，玄参科，石竹科，杜鹃花科，蓼科，堇菜科，枸杞科或禾本科，并且优选选自伞形科，菊科，十字花科，葫芦科，豆科，罂粟科，蔷薇科，茄科，百合科或禾本科的植物。优选的是作物植物，例如有利地选自以下属的植物：棉花，哈密瓜，菊苣，木瓜，李子，花生，油菜，油菜，向日葵，红花，橄榄，芝麻，榛子，杏仁，鳄梨，海湾，南瓜，亚麻籽，大豆，阿月浑子，琉璃苣，玉米，小麦，黑麦，燕麦，高粱和小米，小黑麦，水稻，大麦，木薯，马铃薯，甜菜，茄子，苜蓿和多年生草和饲料植物，油棕，蔬菜(芸苔，根茎类蔬菜，块茎蔬菜，豆荚蔬菜，结果蔬菜，洋葱蔬菜，叶类蔬菜和茎类蔬菜)，荞麦，菊芋，蚕豆，紫菜，小扁豆，矮豆，羽扇豆，三叶草和苜蓿等。优选地，植物是玉米，油菜，油菜，棉花，马铃薯，大豆，甜菜，南瓜，哈密瓜，稻，亚麻，菊苣，番木瓜，苜蓿或小麦。最优选的植物是玉米，棉花，大豆，油菜和稻。在优选的实施方案中，植物细胞不是拟南芥的。

与所有多细胞真核生物一样，植物表达由POLQ(Polθ)基因编码的聚合酶θ。在本公开中，POLQ和聚合酶θ可互换使用。POLQ包含在植物中具有约800个残基的中心结构域和属于DNA聚合酶的“A”家族的聚合酶结构域(参见，例如，Yousefzadeh和Wood,DNA Repair2013 12:1-9)。聚合酶结构域包含5个“基序”(参见Yousefzadeh和Wood的图2A)。植物之间的序列同源性在这些区域中非常保守，特别是在基序2、5和6中。

来自植物的示例性POLQ序列是来自拟南芥的“含有解旋酶和聚合酶的蛋白TEBICHI”。2154个氨基酸的蛋白质序列可在NCBI数据库登录号BAD93700.1下找到。TEBICHI序列还发表于Inagaki等(Plant Cell 18(4)，879-892(2006))中。可以例如通过与来自拟南芥的POLQ序列进行BLAST比对搜索来鉴定其他植物中的POLQ基因。例如，来自以下示例性植物的POLQ基因在NCBI数据库中的以下列登录号下列出：

水稻Oryza sativa：XP_015619406

马铃薯Solanum tuberosum：XP_006356662

大豆Glycine max：XP_003545584

甜菜Beta vulgaris：XP_010667709

番茄Solanum lycopersum：XP_010325163

香蕉Musa acuminata序列号：ref|XM_009385225.1|

苹果Malus x domestica：序列号：ref|XM_008380001.1|

葡萄Vitis vinifera序列号：ref|XM_010650232.1|

油菜Brassica napus序列号：ref|XM_013882859.1|

橘子Citrus x sinensis序列号：ref|XM_006476088.2|

玉米Zea mays序列号：AQK40086

可用于数据库相似性搜索的BLAST系列程序包括：针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN；针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX；针对蛋白质数据库序列的蛋白质查询序列的BLASTP；针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列的TBLASTN；以及针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。

可选择地，标准分子技术可用于鉴定来自特定植物物种的POLQ基因。例如，基于TEBICHI序列的寡核苷酸探针可用于鉴定来自所需植物物种的cDNA或基因组DNA文库中的所需多核苷酸。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离目的植物物种中的同源基因。

可选择地，可以使用常规扩增技术方便地从核酸样品中扩增POLQ基因。例如，PCR可用于直接从mRNA，cDNA，基因组文库或cDNA文库扩增基因的序列。PCR和其他体外扩增方法也可用于，例如，克隆编码待表达蛋白质的核酸序列，使核酸用作探针来检测样品中期望的mRNA的存在，用于核酸测序，或用于其他目的。可以基于TEBICHI序列产生用于鉴定植物中POLQ基因的合适引物和探针。关于PCR的一般概述，参见PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications(Innis，M，Gelfand，D.，Sninsky，J.和White，T.编)，AcademicPress，San Diego(1990)。

在本文所述方法中使用的植物细胞的POLQ表达和/或活性降低。POLQ表达的降低可以在核酸或蛋白质水平上发生。优选地，与相应的野生型植物细胞相比，功能性POLQ表达的量减少至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％。优选地，与相应的野生型植物细胞相比，表达和/或活性降低至少50％，更优选地，表达和/或活性降低至少70％。

在一些实施方案中，通过测量POLQ核酸的表达来确定POLQ表达。合适的方法包括RT-PCR，定量PCR，Northern印迹，基因测序特别是RNA测序，以及基因表达谱分析技术，例如微阵列。在优选的实施方案中，通过测量POLQ蛋白的水平确定表达。合适的方法包括ELISA，免疫细胞化学，流式细胞术，蛋白质印迹，蛋白质组学，以及质谱法。优选地，在免疫测定中确定POLQ表达。合适的免疫测定包括例如放射免疫测定，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫测定，免疫放射测定，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散测定，沉淀反应，凝集测定(例如凝胶凝集测定，血细胞凝集测定等)，补体结合测定，免疫荧光测定，蛋白A测定，以及免疫电泳测定。

在一些实施方案中，POLQ活性是指POLQ结合DNA，特别是染色质的能力。这种活性可以通过技术人员已知的任何方法测量，例如，如Fernandez-Vidal等(2014,NatureCommunications 5)所述通过用POLQ抗体免疫印迹染色质级分。

在一些实施方案中，POLQ活性是指其充当聚合酶的能力。这种活性可以通过，例如Hogg等(Nucleic Acids Res.2012年3月；40(6)：2611-2622)所述引物延伸测定，Kent等(Nat Struct Mol Biol.2015年3月；22(3)：230-237)所述MMEJ测定来测量。Zhan等(NatStruct Mol Biol.2015年4月；22(4)：304-311)描述了其他测定来测量POLQ活性。如技术人员所清楚的，POLQ活性的降低是指与来自相同生物体的野生型POLQ的活性相比的活性降低。POLQ的下调可以通过以下引入破坏基因的突变来实现：通过降低POLQ表达，通过完全消除表达，或通过使基因产物无功能。例如，突变可以是点突变，插入或缺失，并且突变可以位于POLQ基因的编码(例如，POLQ外显子)或非编码部分(例如，在POLQ启动子区)中。Yousefzadeh和Wood(DNA Repair，Volume 12，Issue 10,2013，第871页)提供了POLQ家族成员的结构比较，并讨论了催化结构域的位置。优选的突变破坏了POLQ聚合酶结构域，如Yousefzadeh和Wood的图2所示，该文献在此通过引入并入。优选地，与野生型基因相比，POLQ突变体使表达和/或活性降低至少50％。

POLQ基因的突变可以通过本领域技术人员熟知的任何方法来完成，包括随机诱变方法，例如辐射，随机DNA整合(例如，通过转座子或T-DNA)，或通过使用化学诱变剂。此外，在某些方面，可以使用定点诱变方法来突变POLQ基因。在一些实施方案中，使用同源重组载体或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶(ZFN)，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，聚集的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)核酸酶或大范围核酸酶)突变或破坏POLQ基因。优选地，使用CRISPR/Cas系统。这些方法在本领域中是已知的，并且技术人员将能够根据本公开确定这些适当的方法。已知几种筛选特定突变等位基因的技术，例如，Deleteagene(Delete-a-gene；Li等，2001，Plant J 27：235-242)使用聚合酶链式反应(PCR)测定来筛选通过快速中子诱变产生的缺失突变体。TILLING(基因组中靶向诱导的局部损伤；McCallum等，2000，NatBiotechnol 18：455-457)鉴定EMS诱导的点突变等。

在优选的实施方案中，植物细胞具有突变的POLQ基因，优选两个等位基因都是突变的。在优选的实施方案中，突变是“敲除”等位基因，即不产生功能性蛋白质。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统用于降低POLQ表达或活性。CRISPR/Cas系统基于来自II型原核CRISPR(聚集的规则间隔的短回文重复序列)适应性免疫系统的RNA引导的Cas9核酸酶(参见，例如，Belahj等，Plant Methods 9：39,2013)。该系统包括三个组分：Cas9蛋白，crRNA和tracrRNA。crRNA和tracrRNA通常作为向导RNA单一被RNA分子提供，称为gRNA(向导RNA)。可以使用小核RNA启动子如U6或U3表达向导RNA。还描述了Cas9的植物密码子优化形式，并且其可以通过组成型启动子(例如35S启动子)或组织特异性或诱导型启动子在植物中表达。

该系统涉及通过gRNA将Cas9靶向特定基因组基因座。gRNA的标准长度为20bp，然而，为了靶向植物基因座，可以使用19-22bp。设计gRNA来结合靶序列，在这种情况下结合POLQ基因。选择结合位点使得靶向的DNA之后是PAM序列(前间区序列邻近基序)。来自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白SpCas9经常用于该系统，因为它具有短的PAM识别序列NGG。因此，如果使用SpCas9，合适的gRNA可以通过筛选POLQ基因组基因座的序列(N)_19-22NGG来设计。在线CRISPR设计工具也可用于识别合适的靶位点(http:// tools.genome-engineering.org,Ren等)。

关于使用CRISPR/Cas9系统诱导植物突变的进一步的信息可以在Lowder等(PlantPhysiology 2015 169:971-985)和Belhaj等(2013 Plant Methods 9:39)中找到。

POLQ表达的降低也可以使用“抑制性核酸分子”来实现，所述“抑制性核酸分子”在细胞中的存在以序列特异性方式引起其靶基因的降解或抑制其靶基因的功能、转录或翻译。示例性核酸分子包括适体，siRNA，人工microRNA，干扰RNA或RNAi，dsRNA，核酶，反义寡核苷酸，以及编码所述核酸分子的DNA表达盒。

在一些实施方案中，核酸分子是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸(AON)通常通过结合靶mRNA并通过阻碍核糖体来空间阻断表达而抑制其靶标。AON还可以通过结合靶mRNA而形成可以作为RNase H的底物的DNA-RNA杂合体来抑制其靶标。AON也可以作为两种或更多种寡核苷酸，修饰的寡核苷酸，寡核苷，寡核苷酸模拟物或其区域或部分的复合结构产生。此类化合物在本领域中也称为杂合体或间隔体。设计和修饰这种间隔体的方法描述于例如美国专利公开号20110092572和20100234451中。AON通常包含12至80个核碱基，优选15至40个核碱基。优选地，AON包含一段与靶mRNA具有100％互补性的至少8个核碱基。

在另一种方法中，核酸可以转录成核酶或催化RNA，其影响mRNA的表达。参见，美国专利号6,423,885。可以设计核酶以特异性地与靶RNA配对并在特定位置切割磷酸二酯骨架，从而在功能上使靶RNA失活。异源核酸可以编码设计用于切割特定mRNA转录物而阻止多肽的表达的核酶。锤头状核酶在由侧翼区域决定的位置切割mRNA，所述侧翼区域与靶mRNA形成互补碱基对。

优选地，核酸分子是对由POLQ基因编码的mRNA特异性的双链RNAi分子。优选地，该分子包含在反向重复序列结构中待沉默的POLQ基因片段。反向重复序列由间隔物，通常是内含子隔开。RNAi构建体由合适的启动子驱动并转染到植物中。转基因的转录导致RNA分子自身回折而形成双链发夹RNA。这种双链RNA结构被植物识别并切割成小RNA(约21个核苷酸长)，被称为小干扰RNA(siRNA)。siRNA与蛋白质复合物(RISC)结合，后者继续指导靶基因的mRNA的降解。构建体(其包含与调控区和转录终止序列可操作地连接并且转录成可以形成双链RNA的RNA的序列)可被转化入。使用RNAi抑制基因表达的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如，美国专利号5,034,323；6,326,527；6,452,067；6,573,099；6753139；和6,777,588。也参见WO 97/01952；WO 98/53083；WO 99/32619；WO 98/36083；以及美国专利公开20030175965，20030175783，20040214330和20030180945。Ceccaldi等(Nature.2015年2月12日；518(7538):258–262)中描述了针对人POLQ的siRNA。

病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术是RNAi技术的变体，其利用植物的内源-抗病毒防御。用含有宿主DNA片段的重组VIGS病毒感染植物导致靶基因的转录后基因沉默。在一个实施方案中，可以使用基于烟草脆裂病毒(TRV)的VIGS系统。基于烟草脆裂病毒的VIGS系统描述于，例如Baulcombe(Curr.Opin.Plant Biol.2:109-113(1999)；Lu等(Methods 30：296-303(2003)；Ratcliff等(The Plant Journal 25：237-245(2001)；以及美国专利号7,229,829。

在一些实施方案中，通过向植物细胞提供POLQ结合分子来降低POLQ活性。优选地，与相应的野生型植物细胞相比，POLQ活性降低至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％。优选地，POLQ结合分子结合POLQ并抑制其酶活力和/或其结合DNA的能力。

优选地，POLQ结合分子是小分子。另外的结合剂包括抗体以及非免疫球蛋白结合因子，例如源自噬菌体展示的肽结合剂和抗体模拟物，例如亲和体，四连蛋白(CTLD)，adnectin(单体)，抗运载蛋白(anticalin)，DARPin(锚蛋白)，avimer，iMab，微体，肽适体，Kunitz结构域，适体和affilin。术语“抗体”包括，例如天然存在的和非天然存在的抗体，多克隆和单克隆抗体，嵌合抗体和完全合成的抗体及其片段，例如Fab'，F(ab')2，Fv或Fab片段，或识别其他抗原的免疫球蛋白片段。

优选地，POLQ结合分子是POLQ抗体或其抗原结合片段。识别POLQ的抗体是可商购的(参见，例如使用TEBICHI蛋白产生的来自Abmart的X3-Q588V7[ABX])。

结合特定表位的抗体可以通过本领域已知的方法产生。例如，多克隆抗体可以通过免疫哺乳动物(例如兔，小鼠，大鼠，绵羊，山羊)的常规方法制备。然后多克隆抗体包含于免疫动物的血清中，并且可以使用标准方法(例如，亲和层析，免疫沉淀，尺寸排阻层析和离子交换层析)来分离。单克隆抗体可以通过免疫哺乳动物，然后分离产生目的单克隆抗体的血浆B细胞并与骨髓瘤细胞融合的常规方法来制备(参见，例如Mishell等，1980)。可以使用标准免疫测定方法进行识别表位的筛选，包括ELISA技术，放射免疫测定，免疫荧光，免疫组织化学和蛋白质印迹(Ausubel等，1992)。抗体选择的体外方法，例如抗体噬菌体展示，也可用于产生抗体(参见，例如Schirrmann等，2011)。优选地，将核定位信号添加到抗体中以增加向细胞核的定位。

本公开还包括非天然存在的植物或植物细胞，其中所述植物或植物细胞中的POLQ表达和/或活性如本文所公开的那样降低，其中所述植物或植物细胞不是拟南芥。在优选的实施方案中，如本文所述，植物或植物细胞表达POLQ“抑制性核酸分子”。在优选的实施方案中，如本文所述，植物或植物细胞具有突变的POLQ。所述植物和植物细胞可用于实施本文公开的方法。因此，本公开还包括植物或植物细胞用于转染目的核酸分子的用途。

本公开还包括通过本文公开的方法产生的植物细胞和植物。所述植物和植物细胞是有利的，因为它们包含核酸分子，但它们的基因组具有有限的或没有核酸的随机重组事件。在优选的实施方案中，如本文所述，所述植物细胞和植物具有降低的POLQ表达和/或活性。

本公开还包括通过本文公开的方法产生的植物的后代。如本文所用，术语“后代”表示根据本文所述的方法制备的亲本植物的任何一代的后代(包括种子)，其中后代包含目的核酸分子。

定义

如本文所用，“包含”及其动词变化以其非限制性含义使用，表示包括该词后面的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，动词“由...组成”可以由“基本上由......组成”代替，意指本文定义的化合物或附属化合物可以包含具体指定的组分之外的另外的组分，所述另外的组分不改变本发明的独特特征。

本文使用的冠词“一个/一种”是指该冠词的语法对象的一个/一种或多于一个/一种(即至少一个/一种)。举例来说，“一个/一种元件”表示一个/一种元件或多于一个/一种元件。

本说明书中引用的所有专利和参考文献都通过引用整体并入本文。

如本文所用，同源重组(HR)是指使用未损伤的模板(通常是姐妹染色单体)的无错断裂修复。如本文所用，HDR(同源驱动修复)更广泛地指使用同源序列利用模板来指导修复。如果它的侧翼是同源序列，那么断裂也可以修复，在这种情况下，修复模式被称为单链退火SSA；这个结果很容易出错。

所有其他非HR，HDR或SSA的修复通常被称为末端连接(EJ)。因为EJ不使用同源性来指导修复，所以它最初被称为非同源末端连接(NHEJ)。最早发现的最著名的EJ途径需要a.o.(蛋白质KU70和KU80和LIG4)，并且被称为NHEJ或经典NHEJ(cNHEJ)。不是cNHEJ的EJ(在缺乏cNHEJ的细胞中显示)被称为“替代”EJ或alt-EJ。因为这种类型的EJ经常在修复产物的连接处显示相同碱基的区段，所以也被称为：微同源介导的EJ或MMEJ。

如本文所用，TMEJ(pol-θ介导的EJ)是指由POLQ介导的修复。本领域已公认。虽然不希望受理论束缚，但我们提出大多数alt-EJ修复实际上是TMEJ介导的。

在以下实施例中进一步解释本发明。这些实施例不限制本发明的范围，而仅用于阐明本发明。

实施例

实施例1 T-DNA转染

背景

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是双子叶植物中冠瘿病的致病因子。病原体的一段DNA即T-DNA被转移到植物细胞中并整合到基因组，使其成为跨界基因转移的一个例子。位于T-DNA上的基因将植物细胞转化为合成营养素的肿瘤细胞，细菌可以将这样的营养素用作碳源和氮源，从而为自身创造生态位²。这种病原体的DNA传送能力在生物技术中作为将外源基因插入植物的手段已进行了大量探索。尽管现在对农杆菌和植物细胞之间的相互作用以及导致T-DNA整合到宿主基因组中的过程了解很多，但实际的整合机制仍然是未知的¹。早在二十年前，假设了农杆菌利用宿主双链断裂(DSB)修复酶来催化T-DNA整合，从而导致对不同DSB修复途径的关键蛋白进行了基因研究³。由于其参与T-DNA整合，已经研究了典型的非同源末端连接和同源重组因子，但得到有限且不同的结果^4-7。即使当不同的途径无法联合时，T-DNA整合仍然是可能的^8,9，这提示未知途径的参与尚待确定。

提示整合机制的T-DNA整合的一个潜在信息特征是一种基因组瘢痕，即所谓的“填充DNA”，其经常存在于T-DNA整合的位点。填充DNA是DNA序列的插入片段，其有时含有与整合位点最接近的侧翼中存在的序列相同的节段^10,11。我们注意到，T-DNA整合事件中填充DNA组成与线虫类的秀丽隐杆线虫(C.elegans)和蝇类的黄果蝇(D.melanogaster)中易错DSB修复的产物具有惊人的相似之处。在这些物种中，复制相关的以及核酸酶诱导的DSB可以通过替代的末端连接途径修复，该途径关键取决于A家族聚合酶θ(Polθ)，在某些情况下，结果是以类似填充物的插入^12-14。Polθ介导的末端连接的这一标签特征在进化上是保守的，在哺乳动物细胞中也一样，可以在修复位点找到DNA插入物^15,16。Polθ编码基因可以在所有多细胞真核生物的基因组中找到，包括模式植物拟南芥，其中该基因被称为Tebichi^17,18。

为了解决Polθ是否负责植物中的填充DNA合成以及事实上催化T-DNA整合的问题，我们通过浸花法转化而转化了野生型(Col-0)植物和Polθ的两个敲除等位基因(teb-5和teb-2¹⁷)。我们发现野生型Col-0植物的转化正常发生，而来自teb-2和teb-5的植物未能回收单一转化体(图1a-c)。

为了排除这些结果是由阻止农杆菌穿透并到达雌配子体(用于转化的靶细胞)的非显而易见的花的形态学缺陷导致的可能性，我们测定了T-DNA在这些细胞中的瞬时表达。为此，我们使用在ACT11启动子控制下表达标志物GUS::内含子的T-DNA，其在胚珠/发育的种子中表达^19,20。在用农杆菌感染后，我们发现在野生型和Polθ突变植物中T-DNA介导的瞬时表达是难以区分的(图1)。因此，T-DNA可以到达靶组织细胞核，但对于其整合完全取决于功能性Polθ。

先前已经提出，根细胞中的T-DNA整合可能与花中的T-DNA整合不同²¹。虽然拟南芥花转化体可利用数千个T-DNA-植物基因组连接，但对于通过根转化获得的转化体仅确定了有限的数量，使得先验预测不可能。因此，我们用农杆菌菌株(其递送对除草剂草丁膦(PPT)具有抗性的T-DNA)感染Col-0和polθ-缺陷的根，并在含有PPT作为稳定整合标志物的选择平板上形成绿芽。正如预期的那样，我们发现Col-0约80％成功转化，但polθ缺陷根的转化频率大大降低(图2a-b，f)；事实上，853个愈伤组织都没有发育出绿芽。在非选择性条件下愈伤组织的芽再生在polθ-缺陷根中未受损。我们注意到，感染的polθ-缺陷根确实形成愈伤组织，但是它们没有长出，并且在几周后恶化，这表明愈伤组织形成可以由未整合的T-DNA的瞬时表达引起。实际上，针对克隆和验证T-DNA整合的TAIL-PCR测定仅在从感染的Col-0愈伤组织提取的DNA中产生产物，而在来自感染的teb-5愈伤组织提取的DNA中则没有产生产物(图2c)。为了证实polθ-缺陷根中T-DNA递送和瞬时表达的熟练程度，我们在感染的teb-2和teb-5根中成功表达了T-DNA编码的GUS::内含子基因(图2d-e)。从这些数据我们得出结论，对于根细胞转化，成功的T-DNA整合取决于功能性polθ，花的配子也是这种情况。

将T-DNA作为单链DNA(ssDNA)分子以及与其5'末端共价连接的细菌VirD2蛋白一起传送给植物细胞¹。这一端被称为T-DNA的右边界(RB)。T-DNA3'末端，左边界(LB)，是不受保护的，使其成为polθ介导的修复反应的良好底物：在体外，通过polθ的DNA合成使两个最小配对的3'突出的DNA末端稳定²²。polθ的这种生物化学特性及其已被证明的在修复生理基因组断裂中的作用，为T-DNA整合到植物基因组提出一种非常简单的机制：在自发基因组DSB的修复过程中无意捕获了T-DNA(图3a)。polθ突变植物对DSB诱导剂的极端敏感性¹⁷论证了polθ在修复基因组断裂中的重要作用。为了支持内源DSB作为T-DNA捕获位点，已经发现通过电离辐射或通过内切核酸酶的异位表达对基因组造成额外的DNA损伤，刺激并指导了T-DNA整合^23,24。

为了研究体内polθ作用的特征，我们系统地分析了其作用的>10,000种产物：由通过浸花法在野生型植物细胞中整合所产生的T-DNA/植物基因组连接点¹¹。所有整合事件中几乎70％的一个或两个连接点含有大部分来源不明的填充DNA。最近的一项调查，使用严格的标准，将16％填充物的来源映射到位于T-DNA插入10kb内的序列，要么在基因组侧翼，要么在T-DNA本身中¹¹。然而，早期的报告提供了这样的线索，填充物可能反映了是由不同来源的多个较小片段组成的分子拼缀物¹⁰。我们使用最长公共子串(LCS)策略系统地分析了一系列约5,000个填充物，确定了填充物和受试序列之间最长可能的同一性区段(图3b)。我们发现约60％的填充物与连接点100bp内的DNA具有至少一处匹配。在这些中的约20％，我们确定了映射到其他侧翼位置的额外节段。用于填充物合成的模板主要靠近连接点(图3b-d)，并且T-DNA和植物基因组都被使用(图3d)。许多填充物具有复杂的组成，其中具有可以可靠追踪的多个区段，但有时散布着来源不明的核苷酸。这些节段的序列排列为polθ可以通过允许引物-模板转换的一个或多个循环(可能有助于产生促进分辨率的互补末端的特征)来促进修复的提议提供了体内验证。

为了检查填充物是否确实受到引物-模板相互作用的刺激，我们生成了热图，其中我们将含有填充物的连接点绘制到其在连接点附近的同源填充物匹配序列上。该方法显示了产生连接点的预测的3'末端(即引物)与紧邻用于填充物合成的模板上游序列之间的序列一致性程度。为了避免解释中可能存在的歧义，我们将分析仅限于那些填充物在侧翼中只有一个连续匹配的情况(n＝589)。我们确实发现了匹配碱基显著的过度出现(图3e)：66％的填充物具有至少1个核苷酸引物，57％含有至少2个引物和模板之间的匹配，47％在3'末端处有3个引发核苷酸。这些结果共同表明i)填充DNA是polθ将与T-DNA 3'末端具有最小碱基配对的基因组断裂的3'末端延伸的产物，，或反之亦然，和ii)该聚合酶的引物-模板转换能力是填充物的组成复杂的原因。

有趣的是，描绘没有填充物的T-DNA连接点(其形成也需要polθ)的微观同源程度的热图，与含填充物的连接点的引物-模板热图非常相似(图3e，f)。该现象支持这样的设想，即DSB修复中的微观同源性不反映配对非互补ssDNA链的略微增加的稳定性，而是反映聚合酶优先延伸与少量互补碱基配对3'末端的生物化学性质。

总的来说，我们的结果获得了T-DNA整合到植物基因组中的概念上简单的机制：植物的polθ介导的修复途径，不是连接基因组断裂的末端，而是将末端连接到外源提供的T-DNA分子。结果在生殖细胞和体细胞中相似。大多数T-DNA整合(63％)具有反向重复构型，其中植物基因组的任一侧连接到T-DNA的3'LB，论证了T-DNA的3'末端是优先底物。polθ延伸最小配对的3'末端的能力为T-DNA左边界与植物基因组的连接提供了机制解释，而其对引物-模板转换的耐受性可以解释拼缀填充物的存在(参见图4)。关于T-DNA的5'右边界如何与植物基因组(对于单拷贝整合)或另一个T-DNA 5'边界(对于反向重复方向)连接的问题还不太清楚。然而，RB-T-DNA/植物基因组连接的详细分析表明了非常相似的连接机制：此处也发现了指示polθ作用的填充物。可能是单链T-DNA向双链构型的转化先于通过T-DNA3'末端的基因组捕获或通过尚未知的机制引发这一反应^25,26。一个有趣的概念是，在任一侧捕获T-DNA 3'末端的DSB，通过共价连接的细菌VirD2蛋白而免受5'切除活性。为了解决这个问题，该5'末端可能需要额外的酶处理，这可以解释在携带各种DNA加工酶突变的植物中降低的整合效率^4-9。

除了提供对植物中T-DNA整合的机制理解外，我们的数据对开发转基因作物的生物技术策略具有深远的影响：靶向polθ将完全消除基因打靶方法中不需要的随机整合，同时不影响HR---polθ不是迄今为止所检查的所有物种的HR所必需的。在拟南芥配子体和根中T-DNA整合对polθ的绝对依赖性，以及在研究的所有高等植物(包括作物物种如水稻、番茄、草莓或烟草)中T-DNA整合时polθ特征的充分显现，展现出广泛的实用性^27-30。

方法

植物株系和生长条件

插入突变体信息获自SIGnAL网站http://signal.salk.edu。从收集的SALK T-DNA获得teb-5(SALK_018851)和teb-2(SALK_035610)³¹。teb-5和teb-2等位基因先前已有描述¹⁷。使植物在土壤中于20℃下在16小时光照/8小时黑暗循环中生长。

浸花法转化

使用携带二元载体pCAMBIA1301的卸甲农杆菌菌株LBA1100³²，通过如前所述的浸花法³³转化野生型(生态型Col-0)和突变拟南芥植物。在缺乏蔗糖并补充有100μg/mL制霉菌素、100μg/mL特美汀(以杀死任何剩余的农杆菌并防止感染)和用于选择整合事件的15μg/mL潮霉素的MA固体培养基上选择转基因种子。或者，使用携带二元载体pSDM3900³⁵的根癌农杆菌菌株AglI³⁴转化植物。在不含蔗糖并补充有100μg/mL制霉菌素、100μg/mL特美汀(以杀死任何剩余的农杆菌并防止感染)和用于选择整合事件的15μg/mL膦丝菌素的MA固体培养基上选择转基因种子。为了检测瞬时事件，通过携带pCAMBIA1301_ACT11的农杆菌菌株AglI对开花植物实施浸花法，pCAMBIA1301_ACT11通过将来自含有ACT11启动子的Col-0基因组的850bp的片段克隆到二元载体pCAMBIA1301而制备，其中稳定的整合标志物及其启动子已被去除(可根据要求提供序列)。6天后，收集花并在含有1mM K₃Fe(CN)₆和1mM K₄Fe(CN)₆,10mM Na₂EDTA，0.1％SDS，0.1％Triton X-100和2mM X-gluc的磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)中染色过夜。然后，使用70％乙醇清洁花朵。

根转化

如前所述³⁶，使用携带二元载体pCAMBIA3301的卸甲根癌农杆菌菌株LBA1100³²对野生型(Col-0)和突变的拟南芥植物进行根转化。共培养两天后，将部分根外植体立即在含有1mM K₃Fe(CN)₆和1mM K₄Fe(CN)₆,10mM Na₂EDTA，0.1％SDS，0.1％Triton X-100和2mM X-gluc的磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)中染色，而将其余的根外植体转移到含有用于选择转化体的10μg/mL PPT以及用于杀死剩余的农杆菌的500μg/mL羧苄青霉素和100μg/mL万古霉素的固体培养基中。

插入连接的扩增

在液氮下，在TissueLyser(Retch，Haan Germany)中将植物材料破碎成粉末。如前所述³⁷分离DNA。将1μL分离的DNA用于PCR，总体积为20μL。Taq聚合酶和缓冲液由内部制备。使用简并引物AD2(NGTCGASWGANAWGAA)³⁸和特异性嵌套引物，通过TAIL-PCR³⁸分离T-DNA-基因组连接：

T-DNA基因组插入的确定

从ENA/GenBank(登录号LN484267至LN515397)下载所有T-DNA整合确认序列¹¹。为了确定T-DNA插入连接点，在每条序列和拟南芥参考基因组(TAIR10)以及相关的二元质粒之间进行MegaBLAST搜索。对于T-DNA存在于3'区域的序列，进一步分析该序列的反向互补序列。为集中于高质量的测序连接点，我们只包括其中T-DNA的3'末端以及5'基因组区与相应最佳BLAST命中之间具有完美匹配(≥20bp，无错配，无间隙)的序列。其中T-DNA和基因组BLAST命中不重叠的序列被指定为填充物整合，而具有重叠或连接BLAST命中的序列被指定为非填充物整合。含有非信息型碱基的填充物被除去。在应用这些过滤器后，留下10,616个T-DNA插入事件用于进一步分析。

填充物的来源

为了确定填充物的来源，我们采用了最长公共子串(LCS)算法。该算法确定填充物(查询)和另一序列(受试者)之间的最长公共序列。对于每种填充物(≥6bp和≤40bp)，我们确定了相对于通过其各自最佳BLAST命中确定的T-DNA基因组连接位置，T-DNA和拟南芥参考基因组中两个链方向的LCS。我们在两个方向上从连接点开始搜索T-DNA质粒序列和参考基因组25-6,400个碱基。为了计算找到的LCS长度的过度呈现，我们测定了对于DNA序列中给定填充物找到特定长度的LCS的伪随机概率。为此，我们对受试者的每个填充物的DNA进行改组并搜索LCS(每种填充物10-100次)。然后为每个填充物尺寸(≥6bp且≤40bp)创建伪随机LCS长度的概率分布。概率分布与实际找到的LCS大小之间的过度呈现计算为在概率分布的右翼具有LCS长度填充物的分数减去预期填充物的分数。当其LCS长度的实际分布是概率的至少十倍时，我们将单个填充物标记为过度呈现的。

为了确定填充物是否源自T-DNA起源质粒，我们使用了LCS，并且仅在LCS长度≥13bp时才使用该位置。为了鉴定拟南芥基因组中可能的填充物来源，我们使用截止E值为10^-4的BLAST。

实施例2：同源重组

实施例1证明了功能性Polθ是T-DNA的稳定、随机整合所必需的。本实施例证明，功能性Polθ不是通过同源重组稳定整合所必需的。

制备T-DNA构建体，其与内源拟南芥基因座原卟啉原氧化酶(PPO)具有约6kb的同源性。同源区含有两个点突变，其在PPO基因座处通过同源重组整合时赋予对除草剂butafenicil的抗性(对于突变的描述，参见Hanin等，Plant J 2001)。另外，T-DNA编码Cas9酶(拟南芥密码子优化的Cas9-AteCas9(Fauser等，Plant J 79：348-359 2014))和向导RNA，其将Cas9酶定向至PPO基因座。Cas9的表达由泛素蛋白启动子驱动，并且向导RNA由U6(AtU6)启动子控制。

通过浸花法转化来转化野生型(Col-0)植物和Polθ的两个敲除等位基因(teb-5和teb-2¹⁷)。通过针对butafenicil的抗性测量T-DNA通过同源重组的稳定整合。野生型和Polθ突变植物之间的位点特异性基因座的稳定整合水平将是相似的。

实施例3：用线性化质粒转染

制备质粒，其与内源拟南芥基因座原卟啉原氧化酶(PPO)具有约6kb的同源性。同源区含有两个点突变，其在PPO基因座处通过同源重组整合时赋予对除草剂butafenicil的抗性(对于突变的描述，参见Hanin等，Plant J 2001)。另外，质粒编码Cas9酶(拟南芥密码子优化的Cas9-AteCas9(Fauser等，Plant J 79：348-359 2014))和向导RNA，其将Cas9酶定向至PPO基因座。Cas9的表达由泛素蛋白启动子控制，并且向导RNA由U6(AtU6)启动子控制。该质粒还含有唯一的限制性位点。通过用合适的限制性位点消化使质粒线性化。

由WT和Polθ缺陷型植物(teb-5和teb-2)制备原生质体，并且通过标准PEG转化方案将线性化质粒转化到原生质体中。将菌落保持在含有butafenicil的培养基中，以选择通过同源重组的稳定整合事件。野生型和Polθ突变植物之间的位点特异性基因座的稳定整合水平将是相似的。

实施例4：番茄植物的转染

本实施例将证明在作物植物即番茄(Solanum lycopersum)中的随机整合减少。基于使用Tebichi序列的BLAST搜索，从NCBI数据库中将来自番茄的POLQ基因鉴定为登录号XP_010325163。

通过使用CRISPR靶向Polθ基因座并自花授粉以在下一代中产生纯合突变体来产生Polθ缺陷型番茄突变体。简言之，制备编码卡那霉素选择性标志物、Cas9酶(植物密码子优化的Cas9-pcoCas9(Li等，2013 Nat Biotechnol 31：688-691))和向导RNA的T-DNA构建体，所述向导RNA将Cas9酶定向至POLQ基因座。Cas9的表达由35S启动子控制，并且向导RNA由U3(AtU3)启动子控制。通过浸入农杆菌悬浮液中来转化番茄子叶外植体，以卡那霉素抗性来选择，并筛选POLQ突变。使用Surveyor测定法(Voytas 2013 Annu Rev Plant Biol64：327-350)筛选组培苗的POLQ突变，并使含有POLQ失活突变的苗生长并自花授粉以在下一代中产生纯合突变体。

使用对野生型番茄植物和Polθ缺陷型番茄突变体进行的肿瘤测定证明了POLQ对随机整合的影响。简而言之，将农杆菌插入野生型番茄植物和pol-θ缺陷型番茄植物茎的孔中。通过测量肿瘤形成来测量随机整合。WT番茄植物将发展出肿瘤，这指示随机整合事件，而polθ缺陷型番茄植物则不会发展出肿瘤。

实施例5：polQ缺陷型作物植物的产生

具有一个或多个polQ基因(例如在一个或多个同源基因中)突变的作物植物，例如小麦、大豆、水稻、棉花、玉米或芸苔属植物，通过(随机)诱变或靶向敲除(例如使用序列特异性核酸酶，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALEN、Crispr/Cas9、Crispr/Cpf1等)来鉴定或产生。通过Q-PCR、蛋白质印迹等确认PolQ表达和/或活性的降低。

作物植物，例如小麦、大豆、水稻、棉花或芸苔属植物，用编码polQ抑制性核酸分子或polQ结合分子(例如，在组成型或诱导型启动子的控制下编码polQ发夹RNA、抗体等)的构建体转化。通过Q-PCR、蛋白质印迹等确认PolQ表达和/或活性的降低。

实施例6：用选择性标志物基因对polQ缺陷型作物植物的转染

根据本领域熟知的方法，使用农杆菌用选择性标志物基因(例如bar、gus)转化实施例5中具有降低PolQ表达的植物，以及相应的具有野生型polQ表达的植物。

筛选转化体的选择性标志物基因的表达。具有降低的polQ表达的转化体显示选择性标志物基因的瞬时表达，而具有野生型polQ表达的转化体显示选择性标志物基因的稳定表达。

选择性标志物基因的基因组整合通过以下来评估，例如从具有野生型或降低polQ表达的转化植物中分离的基因组DNA的Southern印迹。可以在polQ-野生型植物的基因组DNA中检测到选择性标志物基因的存在，而具有降低的polQ表达的植物显示较少或甚至没有选择性标志物基因的基因组整合。

实施例7：在polQ缺陷型作物植物中通过同源重组的靶向插入

用目的核酸转化实施例5的PolQ缺陷型植物和相应的具有野生型polQ表达的植物，以通过同源重组进行靶向整合。目的核酸包含与基因组靶位点处基因组DNA同源的序列。任选地，所述植物用序列特异性核酸酶的表达构建体共转化，所述序列特异性核酸酶能够在靶位点诱导DNA断裂以增强同源重组。通过例如Southern印迹或PCR筛选植物中目的核酸的整合。具有野生型polQ表达的植物显示出目的核酸的随机插入以及在靶位点处通过同源重组的靶向插入。具有降低的polQ表达的植物显示出较少或甚至没有目的核酸的随机插入，但确实显示出目的核酸在靶位点处通过同源重组的靶向插入。

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Claims (15)

1.在植物细胞中减少转染的核酸分子的随机整合的方法，所述方法包括提供植物细胞，其中与野生型植物细胞相比，所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低，并用核酸分子转染所述植物细胞。

2.用核酸分子转染植物细胞的方法，所述方法包括提供植物细胞，其中与野生型植物细胞相比，所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低，并用核酸分子转染植物细胞，其中所述核酸分子的随机整合被减少。

3.在植物细胞中表达RNA分子或多肽的方法，所述方法包括提供植物细胞，其中与野生型植物细胞相比，所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低，并用编码所述RNA分子或多肽的核酸分子转染植物细胞，其中所述核酸分子的随机整合被减少。

4.产生表达RNA分子或多肽的植物的方法，所述方法包括提供植物细胞，其中与野生型植物细胞相比，所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低，并用编码所述RNA分子或多肽的核酸分子转染植物细胞并由所述植物细胞产生所述植物，其中所述核酸分子的随机整合被减少。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸分子通过位点特异性基因重组或同源重组整合至植物细胞的染色体中。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述植物细胞包含对由POLQ基因编码的前mRNA具有特异性的反义寡核苷酸，或对由POLQ基因编码的mRNA具有特异性的双链RNAi分子。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述植物细胞具有一个或多个突变的POLQ等位基因，使得与野生型基因相比，POLQ表达和/或活性降低至少70％。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述植物细胞不是拟南芥。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将所述核酸分子瞬时转染到植物细胞中。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述瞬时转染的核酸分子编码核酸酶。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述瞬时转染的核酸分子编码CRISPR/Cas系统组分。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述瞬时转染的核酸分子包含植物表达盒。

13.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中通过使用辐射、化学诱变剂、使用转座子的随机整合、定点诱变、同源重组载体或靶向核酸酶来突变一个或多个POLQ等位基因来降低所述植物细胞中的POLQ表达。

14.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中通过向植物细胞提供POLQ抑制性核酸分子来降低所述植物细胞中的POLQ表达。

15.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中通过向植物细胞提供POLQ结合分子来降低所述植物细胞中的POLQ活性。

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