JPH04144685A - ＯＲＳＶ遺伝子の↓ｃＤＮＡ - Google Patents

ＯＲＳＶ遺伝子の↓ｃＤＮＡ

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JPH04144685A
JPH04144685A JP1306626A JP30662689A JPH04144685A JP H04144685 A JPH04144685 A JP H04144685A JP 1306626 A JP1306626 A JP 1306626A JP 30662689 A JP30662689 A JP 30662689A JP H04144685 A JPH04144685 A JP H04144685A
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dna
gene
virus
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ringspot virus
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Yoshikatsu Isomura
佳功 磯村
Yoshitomo Matsumoto
松本　悦知
Masaaki Chatani
正明 茶谷
Masato Ikegami
正人 池上
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Eneos Corp
Original Assignee
Nippon Oil Corp
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Publication date
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    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、オドントグロッ丈ム　リンクスポット　ウィ
ルス（Ｏｄｏｎｃｏｇｔｏｓ口＋１％　ｒｉ？＆ｇａｐ
ｏｔ　　ｖｉｒｕｓ；０Ｒ５Ｖ）の遺伝子に対応するＤ
ＮＡ及びその断片、並びにそれらの相補鎖に関する。
本発明ｔ；、特にオドントグロッサム　リングスポット
ウィルスの遺伝子に対応する単離され又はクローン化さ
れた環状ヱたは４Ｉ状の１）ＮＡ及びその断片、並びに
そｎらの相補鎖に関する。
本発明のオドントグロッサム　リングスポット　ウィル
スの遺伝子に対応するＤＮＡ及びその断片、並びにそれ
らの相補鎖ニ、植物に使用して有用なベクターを構築す
る際の素材として有用であり、更ＶＣマたラン科檀物の
ウィルス抵抗性株の炸裂に使用されて有用である。
また本発明のオドントグロッサム　リングスポット　ウ
ィルスの遺伝子に対応するＤＮＡ及びその断片、並びに
それらの相補＃ＩｔＸ、ウィルスの遺伝子なスクリーニ
ングする際のプローブとして有用である。
更にヱだ、本発明のオドントグロッサム　リングスポッ
ト　ウィルスの遺伝子に対応するＤＮＡ及びその断片並
びにそれらの相補＠は、それを過当な発現ベクターに組
込んで宿主細胞で発現することにより、ウィルス関連タ
ンパク實及びペプチドを製造するに使用でき、更にその
フィルス関連タンパク質及びペプチドに、ウィルス及び
ウィルスの遺伝子をスクリーニングするための試薬とし
であるいはそのウィルス及びウィルスの遺伝子をスクリ
ーニングするだめの試薬作製のたのの試薬として有用で
ある。
〔従来の技術〕
オドントグロッサム　リングスポット　ウィルス（Ｏｄ
ｏ％ｔｏｇｔｏｓハｍ　　ｒｉｎｇｓｐｏｔ　　＊１ｒ
ｓｓ；０Ｒ５Ｖ）Ｉｔ＠。
カドレア、シンビジウム、デンドコビウム、オドントグ
ロツサムなどのラン科値物に王に感染する棒状のＲＮＡ
ウィルスであり、ウィルス粒子自体にすてに単離されて
いる。
（農学研究、Ｖｏｗ、　６０　、　Ｎｏｖ、　２　、５
３−６７．１９８３）しかしながら、その遺伝子そのも
のは単離されて２らず、その遺伝子の塩基配列をはじめ
遺伝子の構造に関する情報は全く知られていない。従っ
て、その遺伝子を利用することは全く不可能であつ１≧ 一般に、ウィルスからのＤＮＡ遺伝子は遺伝子組換え技
＠ｙｃ′ｊ６いて、動物分野を中心に広くベクターとし
て開発利用されている。しかし、植物の場合その植物ウ
ィルスの大半はその遺伝子としてＲＮＡをもつものであ
り、すぐさまその植物ウィルスの遺伝子ＲＮＡを遺伝子
組換えに用いることは技術上困難である。そこで七のＲ
ＮＡを調型にしてｃＤＮＡに置き換える必要がある。
現在ｆでＫ［物遺伝子組換え用ベクターとしての利用の
可能性のあるものとして知られ℃いるのは１例えばトマ
トやタバコなどの双子葉類植物に膿瘍を作るアグロバク
テリウム−ツメファシェンスＣＡｇｒｏｂαｃｃ−デｉ
ｓ％ｔｓｔｎａｆα−ｃｉａｎｓ　）が有している核外
遺伝子のｒｓ　　プラスミド、キャベツや白菜などに病
気を起こすカリフラワーモサイクウイルスからのＤＮＡ
遺伝子などである。
（物ウィルスは殆どすべてがＲＮＡウィルスであり、し
かもその壇殖罷シ極めて扁く℃、タバコ　モサイク　ウ
ィルスＩＬどではダラム率僅のウィルスを得ることも容
易である。このことＤ）ら植物細胞がＲｔＶ　、４の複
製に適し１こ何らかの生理的条件を１肩えていることが
考えられるっしたがって、Ｒ４’ｉＡウィルスを用いた
／？−ＶＡベクター系は植物でを工極め℃有用であると
思われる。しＰＬ、促米櫃物に対するベクターといえば
Ｔｉプラスミドと同義と思わするぐらい、それ以外に有
用なベタターが存在していなり）つたが、ｒｓプラスミ
ドｔ；植物細胞の染色体に組み込１れる２わ、その発現
ｔト極ので低いという間ｄがある。−万ＲＮ　Ａウィル
スにより構築されたＲＮＡベクターを工、染色体とＹ工
独！し℃自己増殖するベクターであり、それρ）らの発
現量はＴｉプラスミドを用いた場合よりも遥ρ・ｉｃＡ
いことが期待される。
ｒｓプラスミドによる外米遺伝子の導入は、以上のよっ
たことからもっばら植物ｌｆ橿という視点からのみ１じ
らｎ、貞桑耐性遺伝子の導入などがその話題の中心とな
ってさた。
しかし、自己複製能をもった植物の新しいベクターとし
てのＲＮＡベクターの導入は、動物ホルモンなどの有用
タンパク質を生＃：する場としての種物ａ胞ｆたは植物
体？見直すことになる。
また、大腸菌を用いた有用タンパク質の生産を工実用友
階に人って多くの困難（直面している。その一つは、外
米タンパク質の発現量が大きいと封入体としてその発現
タンパク質が閉じ込のられてしまうことがあることであ
る。大腸−は一個の細胞で生命を維持し又いるので、大
量の異物タンパク質が生Ｍされると、そのことは大腸菌
にとって好ｆしくｔいＤ）うである。従って、できるだ
けその影４１を除くたのにその発現タンパク質を封入体
に閉じ込のてし１つことは大腸−にとっては非常に合目
的であるのである。このため大ｇｋ菌を宿主とした物質
生産を考える場合、これは避けて通れないデメリットで
ある。
これに反し、植物体は大さな寛容性をもっている。例え
ば、一つの葉が枯れてし１ったとしても植物体全体への
影響に七ｎはど太き（ない。このような１物の性質を考
えると異極タンパク質が多量に生産されても、変成不溶
化さセるよ５ｔｇ力な排除機構は働かない。
七ｎゆえに、オドントグロッサム　リングスポット　ウ
ィルスの遺伝子に対応するｃＤＮＡをＲＮＡベクターと
することは、それ自体極め℃意味のあることである。ヱ
た、この、ＤＮＡの中にはウィルスの外被タンパク質遺
伝子が含まれており、こｔをＴｓプラスミドに連結し植
物細胞の染色体に組み込むことによりウィルス抵仇性品
樵の作出が期侍しつる。
〔課題の解決〕
オドントグロツサム　リングスポット　ウィルスの心１
遺伝子を単離することに成功すると共に、七の単離さｎ
たＲＮＡ遺伝子を鋳型として七ｎに相補的なり　Ｎ　Ａ
　（ｃＤＮ、４　）を作表し、さらにそれをクローニン
グし、久にそのクローニングさｔたＣＤＮＡを使用して
オドントグロツサム　リングスポット　ウィルスの遺伝
子を発現することに成功した。さらにその（Ｈｌ）ＮＪ
Ｋ−は過当な制限酵素切断部［があることも見出した。
そし℃、そのクローニングさｎたにＤＮＡをもとにオド
ントグロツサム　リングスポット　ウィルスの遺伝子に
対応する。Ｌ）ＮＡの１基部列を決定し、その塩基配列
ρ・ら得られる矧見を利用するとともに、遺伝子ｉＩ！
ｉ換え技術等を利用して新しいベクター及び形質転換体
の作出、あるいはウィルスなどの慎知がｔしうることを
兇出し總（発明の開示） 本発明＆Ｌラン科に属するカドレア、ンンビジワム、デ
ンドロビウム、オドントグロツサム等から、特に単離さ
れるオドントグロツサム　リングスポット　ウィルスの
遺伝子に対応するＤＮＡ及びその断片、並びにそれらの
相補鎖Ｄ　ｉＶ　Ａ　ｖＣ関する。
本発明で意図するオドントグロッサム　リングスポット
ウィルスを工必ずしもラン科櫃物のみＤ・ら率ＩＩＭさ
れるものに限らず、以下に詳述するような理由からその
ウィルスとし℃の特性を有するものであれば、そのすべ
てを含みうろことができる。
本発明に係わるオドントグロツサム　リングスポットウ
ィルスは、その感染ｆｆ：に重大な影響を受けないで天
然に変異することがＯＴ能であり、ヱた人工的にも適当
なニトロンウレア等のｆＡ剤の処理あるいを工紫外巌又
は放射−の処理により、ｆ異させ０ことかできる。
更に、本発明によって開示されていΦ七の塩基配タリに
ついての情報を利用し℃、そのウィルスの遺伝子の一部
を置換しｆこつ、削除したり、あるいＶＸＲ加したり、
あるいは、池のウィルス、ｉａ陶、動植物の遺伝子を加
えたりすることがでさ、そのようなもののうちには、依
然としてオドントグロツサム　リングスポット　ウィル
ス様の性質を保持することができるものがあり得るので
ある。
本発明のオドントグロップム　リングスポット　ウィル
スの遺伝子に対応するＤＮＡＩ工、代表的にｉ工区１に
示される塩基配タリを有する二本鎖Ｌ）ＮＡのうちの任
意の一部あるいに全部を有するものである。図１に示さ
れた配列のうち、上段ｖｃ記載の配列がオドントグロッ
サム　リグンスポットウイルスのゲノムの十頼ＲＮＡに
対応する。１）ＮＡ浦であヱた。このよ５なり　Ｎ　Ａ
のうちには、丁ドントグロッサム　リングスポット　ウ
ィルス遺伝子のうちの３３Ａタンパク質あるいヤニ外被
（コードンタンパク質の遺伝子のいずｎｐ’ある（褐工
両万を富むものが挙げられる。更に本発明は上記二本鎖
ＤＮＡのうちの単にウィルスＲＮＡに相補的なりＮＡ鎖
のみでな（、もう一方のＤＮＡ＠をも色合するものであ
る。
更にまた１本発明は、図１で示さｎるＤＮＡの塩基配列
のうちの任意の一部からなるＤＮＡｗｆｒ片をも色合す
る。こるいを工そのａａ個を組み合わせて用いることに
より第１図で示される塩基配列を有するＤＮＡから綽導
されるものである。
ここで使用できる制限＃素とし′″Ｃは１例えば蛋白質
・核酸−ａｐＪＥ　Ｖｏｌ、３０４１３．ｐ、１４２９
　１４４５（１９８５）Ｋ−示されているようなものな
どを挙げることができる。さらに、例えばこのよったＤ
ＮＡ断片とじては、図１で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡを、制限酵素Ｃ１α■で処理し、２ケ所を開裂させ
、そうして得られる約３，８７ＫｂｐのＩ）ｆｉｔ肩析
片、約Ｌ５８ＫｈｐのＤＮＡ断片及び約０．５６Ｘｂｐ
のＤＮＡ断片であってよい。また別の例としては、図２
に示したようにして各種制限酵素を作用させて得られる
ものがあげられる。
このように図１で示される４基部列を有するＤＮＡに適
当な制限酵素を作用させて得られるＤＮＡ断片を二その
制限酵素が有する認ｌｌｓ位の特異性と１図１で示され
る塩基配列とρ）らいかなる配列を有するものであるか
は明らかである。さらに本発明を工、このよ５にして得
られたＤ　ｒＶ　Ａ断片に、化学的な方法で塩基を付加
したつ、除去したりしたもの及び化学的な方法で合成さ
れたＤＮＡ断片をｔＴｍしたものをも包含している。す
なわち、上記したようにして得られたＤ　Ｎ　Ａ　＃片
をエキソヌクレアーゼにより短縮化したつ、あるいは撞
々のＤＮＡ断片にオリゴヌクＶオチド又はポリヌクＶオ
チドを付加することにより延長したりしたものをも包含
している。
本発明はさらに図１に示された塩基配列の任意の一部あ
るいは全部のＤＮＡｇのいずｒＬＤ’をプローブとして
用い℃、それに対してノ・イブリダイズする遺伝子をも
包含するものである。
このよ５な遺伝子としては、実質的にオドントグロツサ
ム　リングスポット　ウィルス遺伝子中の全あるいは各
遺伝子と同一あるいに類似の機能を有するものがあげら
れ、さらにその遺伝子に対応するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ又はそ
の断片、あるいはそれらの相補鎖１）　ｉＶ　Ａであっ
てよいものである。
本発明のオド／トグロツサム　リングスポット　ウィル
スの遺伝子に対応するＤ　Ｎ　Ａ　ｈ速本ウィルスの感
染を受けた損物体ρ・らそのウィルス粒子を率離し、矢
にそのウィルス粒子からウィルスＲＮＡを分離し、次に
そのウィルスＲＮＪを鋳型にし℃逆転写＃素を作用させ
ることにより得ることができる。久にこのようにして得
られたＤＮＡＴｔＺ、適当なりローユングベクターに組
み込まれて適当な宿主中に導入されて増すことができる
。このようにして得られたクローニングＤＮＡは、それ
を適当な制限＃累を使用して断片化した後、マキサムギ
ルバート法とかあるいにチエインターミネーション法等
の方法でその塩基配夕１ｊを解析することができる。
このようにして−旦解明されたそのＤＮＡの塩基配列は
。
その細見を利用してその任意の一部又は全部の塩基配列
を待つＤＮＡを調製しそれをプローブとして用いて、天
然に存在する遺伝子から得られる遺伝子ライブラリーあ
る（・は／ヨツトガン遺伝子ライブラリーを検索し℃、
ｔｒたな表頁的にオドントグロツサム　リングスポット
　ウィルスの機能を有するＲ　ｉＶ　Ａあるいを工それ
に対応するｃｌ）ＮＡなどを容易に椴得できる。
したがって、本発明に、オドントグロツサム　リングス
ポット　ウィルス遺伝子、又はその対応６ＤＮＡ、さら
にはそれらの核酸断片を検知するための分析法をも提供
する。
ヱた、不発明は、このようにして検知さｎたオドントグ
ロツサム　リングスポット　ウィルス遺伝子に対応する
ＤＮＡ又はその断片あるいはそれらの相補鎖ＤＮＡをク
ローニングする方法及び、そうして得らｎたＤＮＡ又は
その断片あるいはそれらの相補鎖ＤＮＡｖｃも関する。
本発明ハ、またオドントグロツサム　リングスポットウ
ィルスの遺伝子に対応するＤＮＡ又（工その断片、ある
いはそれらの相補鎖な組み込んでなる遺伝子ｉｊｉ換え
ベクターにも関する。
本発明に、さらに図１で示さｎる塩基配列を有する二本
−７）ＮＡのうちの任意の一部あるい（工全部を含有す
るＤＮＡ及びその断片、並びくそｎらの相補鎖を組み込
んでなる遺伝子組換えベクターに関する。
本発明の遺伝子組換えベクターは前記不発明の万ドント
グロツサム　リングスポット　ウィルスの遺伝子に対応
するＤ　ＮＪ又にその断片あるいはそれらの相補鎖を、
当業者に広（知られていたり、当業界において広く使用
せられていに９、あるいは市販されており、容易に人手
することのでさる池の生物の基本的なベクターの単独あ
るいｔ工それらかも過当に調製されたベクターに組み換
えて得られる〕・イブリッドＤＮＡであることができる
。
このような池の生物の基本的なベクターとして１工、例
えば犬＆噛プラスミドベクター、コスミドベクター、フ
ァージベクター、枯草画用プラスミドベクター、スタフ
ィロコッカス白米のプラスミドベクター、？Ｊ＃母用ベ
クメー、複数の宿主細胞にＳいて目律壇殖できるンマト
ルベクターなどをめげることができる。これらベクター
は適当なプロモーター、制限酵素切断部位１選別用のマ
ーカーケ待つが、適宜それに必要な機能をさらに加えた
ものであってもよい。
ここでこの人腸函プラスミドベクターとして１工、例え
ば１、ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２Ｂ、ｐＵ
ｃ１９、ｐＵＣｌ　１８、ｐＵＣ１１９、ｐＭＢ９、ｐ
ｘｃ７などをあげることができ、さらにこのコスミドベ
クターとし℃ヲ鼠例えばｐＡＹ２６６２、ｐｌｉｃ７９
、ｐＪｃ７２０などかあげられる。
上記ファージベクターとしては、例えばλｇｔｌｌ、λ
ｇｇ・λＣ１λｇｔ”λＢζ　λ１０５９、ＥＭＢＬ３
．４、λｒＥｓ−λＢ’、　シｇｏ＝ｙ４Ａ、　シャｏ
ン２８、λＬ４７−１，７−？ロン８．７ヤロ／１７．
７τロ／２０、ジャロン３．イ、ンτロン１６Ａ、シイ
Ｃｌ７１３Ａ、’／ヤｏ　／１４−４．７ギロンＬ５Ａ
などがあり５らｎる。
ヱたこのｉ車重用プラスミドベクターとしＣ）工、劉え
Ｖ工、ｐＵＢｌｌｏ、ｐＵＢ１１２、ｐＨＹ３００ＰＬ
ｔ（ｐＴ、４１０６０、ｐＴＡ１０１５、ｐＴＡＩＯ２
０、ｐＴ−４１０５０、ｐＴＰ４、ｐｒｐ５などがあげ
らｎる。
さらに、スタフィロコッカス由来のプラスミドベクター
としては、例えば、ｐｓＡＯ５０１，ｐｃ１９４、ｐｃ
２２１、ｐＣ２２３、ｐＵＢｌｌｏ、ｐｔｊＢｌｌｚ、
などρ）あげられる。
上記８母用ベクターとしてを工、例えば、ＹＲｐ７、Ｙ
ｌｐ３２、ＹＥｐ１３、ｐＹ（、１１ｐｙｃ２、Ｙｌｐ
ｌ、ｐＪ　ＤＢ２４８、ｐＪＤＢ２１９、ｐＪＤＢ２４
８、ｐＤＢ２４８、ｐＧＫ−１，２、ｐＬＣ５４４、ｐ
ＦＹ、’に１’；ｌ、　ｐ　Ｆ　Ｙ　Ｍ　２２５などの
Ｙｌｐ蟹ベクター、ＹＥ−ｐ塁ベクター、ＹＲｐベクタ
ーＹＣｐ＠プラスミドベクターＹＲＭｐ型ベクターなど
がうえらぶことかできる。
さらにヱたこのシャトルベクターとしては、例えば、ｐ
ＦＹＭ２２５、ＹＲｐ７、Ｙ　Ｉ　ｐ　５　白米７５　
スミト、ｐＴＡ１３０２、あるいに上記ベクターのうち
１．Ｗａｆ）宿主域を有するもの、さらには新しく制限
＃索などを用いて適当なプロモーター、その他の制御配
列などを組み込んだり、あるいに互いのベクターを組み
合わせたものなどがあげられる。
これら本発明のハイブリッドＤＮＡは、本発明の第１図
で示される塩基配列な頁する二本＠ＤＮＡを、好１しく
に過当な１ケ所あるいは複数ケ所で切断し５る制限＃累
で処理した後、これを同一の制限＃素で開裂させた上記
慣の生物の基本的なベクターに組み込むことにより製造
できる。
ｆだ１本発明のハイブリッドＤＮＡは、例えば精製した
フィルスより抽出したＲＮＡを調型にして得られたｃＤ
ＮＡを、ＤＮＡ結合酵素、例えばＴ４　　ＤＮＡ＋）ガ
ーゼにより処理してその両端にＥ６ｏＲＫアダプターを
敗り付け、久ニこれを上記他の生物の基本的なベクター
、例えばｐＵＣ１１８をＥｃＯＲ１分解後アルカリホス
ファターゼ処理したものと混合し、次にＤＮＡ結合酵素
、例えばＴ＋ＤＮＡリガーゼにより結合１化させること
により得ることができる。
上記アルカリホスファターゼ処理は、池の脱リン酸化酵
累処環で代用することも可能であり、その処理はＤ　Ｊ
Ｖ　Ａの５′−禾漏の脱リン酸化をすることにより自己
環化を防止することができて、好ヱしいものである。
なお、この方法で使用できる制限＃素としては、例えば
ＥＣｔ）Ｒｌ、　Ａ６ｅ１．　Ｐｓｔｌ、ＨｉｎｄＩＩ
［、Ｍｉｓ、　Ｘｂａ　ｌ、ＥｃａＲＶ及びＡｐａ（な
どがあげられるが、また蛋白質核酸＃ふメｏｔ、３０．
／＆ｉ１３．ｐ−１４２５１４４５（１９８５）Ｋ記載
されたものあるいを工その池の公知のものが使用し５こ
のようにして得られた本発明のバイブリドＤＮＡ６１、
それぞれ適当な宿主細胞に導入することができる。
例えば、大腸菌プラスミドベクターとのハイブリッドＤ
ＮＡの場合は、大腸菌に、枯草菌用プラスミドベクター
とのハイブリッドＤＮＡｃＩ）場合ＶＣは、枯草菌に、
スメフィロコツカス由来のプラスミドベクターとのハイ
ブリッドＤＮＡの場合にはスタフィロコッカス園に、酵
母用ベクターとのハイブリッドＤ　ｌｖＡ　ｆ）場合に
を工酵母函に、そして更に複数の宿主域を有する７ヤト
ルベクターとのハイブリッドＤＮＡ１７）場合には適宜
適当な宿主に、公知の方法に従って導入することができ
る。
このよ５なハイブリッドＤＮＡの宿主への導入法として
は、例えば大腸１や枯草陶の場合は、公知の方法を通用
して例えば、ＣａＣ％処理により宿主細胞をコンピテン
ト細胞とした後に形質転換する。
また、酵母の場合には細胞壁溶解酵素、例えばグルスラ
ーゼ、ヘリカーゼ、ザイモリアーゼ等で処理してプロト
プラスト化した後、例えば、ＰＥＧ及びＣａ　　存在下
に形質等、又は還元剤、例えば２−メルカプトエタノー
ル等で処理して形質転換させる方法があげられる。
このようにして得られた形質転換体は適当な桑畑耐性あ
るいは栄養要求性を利用して選び出されたり、あるいは
コロニーハイブリダイゼーション法を用いて選び出すこ
とができる。
さらにまた本発明のハイブリッドＤＮＡは、七のうちに
更＜ｍｔの外米逼伝子ゲ組み込んでなるものであっても
よい。
このような外米遺伝子の成算とし℃／よりイルス、催物
、動物、＃Ｉ困、１類などの生切体あるいは、化学合成
したものであって工い。
本発明において使用することのできる外米遺伝子として
は、また種物を形質転換させるのに使用しつるものが好
ましく、そのようなものとしてＣ工、害虫又は寄生虫に
対する耐性付与遺伝子、病ぷ体に対する耐性何与遺伝子
、除草鋼抵抗性あるいは耐性に関４する遺伝子、その成
長性に影響を与える遺伝子、産業上有用なタンパク質又
はペプチド。
あるいはその他の物質をその体内で産生さぜるための遺
伝子、などがあげられる。
ここで、害虫又は寄生虫に対する耐性付与遺伝子として
は、昆虫又は線虫に対する殺虫性毒素産生遺伝子、ブロ
ティナーゼインヒビター誘導遺伝子、リボゾーム不活性
化りンパク質屋生遺伝子などかあげられる。
除草剤抵抗性あるいは耐性に関４する遺伝子とじ℃）耘
バラコート耐性遺伝子、スルフロン耐性遺伝子、スルホ
ナミド耐性遺伝子、グリホセート耐性遺伝子、などがあ
げられる。
また病原体に対する耐性付与遺伝子としてはウィルス耐
性付与遺伝子、各種？Ｉａ菌産生毒素に対する耐性付与
遺伝子。
カナマイシン耐性などに関与する遺伝子などＤ・あげら
れる。
また、その成長性に影４１？与える遺伝子としては、例
えば高温、低温、水不足あるいは肥料又は栄養素に対す
る改良された耐性を付与するような遺伝子があげられる
。
さらにまた催物で通常見出さｎる酵素、貯蔵タンパク質
などを制御している遺伝子があげられる。また、その他
植物に導入されて有用あるとさする遺伝子をあげること
ができる。
本発明のハイブリッドＤＮＡを用いての形質転換方法に
つい℃、さも九−つの具体すｊをあげて詳しく説明する
。
例えは本発明のハイブリッドＩＪ　ｌ’ＶΔか、第１図
のＤＮＡの両端ＫＥｃｏＲＩアタ′ブタ−をＴ４ＤＮＡ
　リガーゼにより結合したものと、大ｆＩｋ菌プラスミ
ドのｐＵＣ１１８のＥｃｏＲ１ｊ＋解物とを、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼで結合したハイブリッドＤＮＡである場合、
このハイブリッドＤＮＡでもって公知の方法により、大
腸１ｉ／Ｊ！［１０９株を形質転換し、久にアンピシリ
ン５０μ）／ｖを含有する寒天培地（２ｘＴＹの表面に
１００　ｔｗｈＭ　　ＩＰＴＧ及び２％　＄−ｇ！Ｌｆ
含む）の５えに生じたコロニーに対し、ブルーホワイト
セレクション法（１αＣ−Ｚ遺伝子の発現の有無による
選抜法）を施こして白色のコロニーのみを選別する。
このようにして得られたコロニーは、プラスミドｐＵＣ
１１８のＥｃＯＲ１部位に第１図で示されるよ５な塩基
配列を有するり、’ｉ、４が挿入３ｎたハイブリッドＩ
）　ｔＶ　Ａで形質転換４ｆｉ、た大′ｗ５菌ノリ１０
９株である。こ・ノ）形質転換体ｎ・ら公兄の方法、・
てよりハイブリッドυ１Ｖ−４を分離することり・でき
る。
なお、以上のような手法を繰り返すことｌこより、オド
ントグロッサム　リングスポット　ウィルス遺伝子の全
長に対応するｃＤＮＡの塩基配列を順次決定することも
ｏＴ籠である。
このハイブリッドＤＮＡは、それをそのままあるいは適
当な断片として下記に示すような植物細胞形質転換用の
ベクターに組み込んでもよいし、あるいはそれをそのま
まあるいは過当な処理を加えた後新たにハイブリッドＤ
ＮＡを作成して宿主細胞を再度形質転換したり、あるい
はその−イブリッドＤＮＡを保有する形質転換体を増殖
させて増やすこともできる。
例えば、目的とするーイブリツドＤＮＡを大量に調製す
るだのに一工、ハイブリッドＬ）ＮＡケ含有する形質転
換体、−１えは大腸菌Ｊ、イ１０９株を増殖さぜ、さら
には必要に応じてハイブリッドＤＮＡのみを増幅さぜる
ような処理ゲ１え、矢にその菌体を溶菌させ、得らｎた
ハイブリッドＤＮＡ？含有する水溶液から超遠心法、電
気原動法などの手段を施こしてそのハイブリッドＤＮＡ
を分離しうる。
例えば、ハイブリッドＤＮＡが大、ｉ！醜用のプラスミ
ドｐＵＣ１１８とのハイブリッドＤＮＡである場合には
、該ハイブリッドＤ　Ｎ　Ａを含む大腸菌の形質転換体
を公知の方法に従ってハイブリッドＤＮＡ増幅処理した
後公知の方法で溶場し、こうして得られたＤ　７■、４
含有溶液を、セシワムクロライド平衡密度勾配遠心法を
用いてコバレントＩＪ−クローズドサーキュラ−型のハ
イブリッドＤＮＡのみを分離ことにより行なうことがで
きる。
さらにまた、このようにして分ｌＩ！された・・イブリ
ッドυＪＶＡは、クローニングの際に使用したと同じ制
限＃素で処理することにより、オドントグロツサム　リ
ングスポット　ウィルスの遺伝子に対応するＯＮＡ又は
その断片、特に寵ｌＫ示された塩基配列の任意の一部又
は全部を有するＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとに分け
ることができる。
さら（またこうして得られたＤ　ｉＶ　Ａ断片は、アガ
ロースゲルあるいはポリアクリルアミドゲルなどを用い
たゲル電気永動によって互いに分離し１例えば当該ＤＮ
Ａ断片を宮むバンド部分のゲルを切り取り、公知の方法
に従ってゲルよりＤＮＡ断片を抽出するなどして分離し
精製することにより、精製されたものを得ることができ
る。
このようにして得られたＤＮＡは、さらにまた発現用ハ
イブリッドＤ　ＮＡに組み換えて適当な宿主細胞に導入
させて発現させることができる。
本発明においては、オドントグロッサム　リングスポッ
ト　ウィルス粒子を構成する３３にタンパク質＆ひ’／
ｌ；ノパク質を宿主細胞中で発現させて取得することが
できる。
不発明に従えば遺伝子組換えの手法？用いてそれらのタ
ンパク質入）一部のアミノ酸配列Ｄ・らなるペプチドを
取得することも、あるいはその構成アミノ酸の一部を置
換させたり、付加したり、欠失させることも容易に行な
うことができることは当業者であれば容易に理解でさよ
う。
したがって、本発明のオドントグロッサム　リングスポ
ット　ウィルスの３３にタンパク質及び外被タンパク質
。
更ニはそれらの断片ペプチド化合物は、それらすべてを
包含するものである。
なお、上記オドントグロッサム　リングスポット　ウィ
ルスの３３ｆタンパク質ハ、タバコモザイク　ウィルス
（ｒ、ｗ〆）の３０にタンパク質と同様の機能を有する
ものである。
本発明の遺伝子組換えベクターは、前記本発明の丁ドン
トグロッサム　リングスポット　ウィルスの遺伝子（（
対応するＤＮＡ又はその断片あるいは七ｎらの相補Ｓを
、当業者に広（却られたり、当業界において広（使用さ
れてぃた９、市販されており容易に入手することのでき
る植物細胞あるいは植物組織を形質転換し５るベクター
【組み換えて得られるハイブリッドＤＮＡであることか
でさる。
このよ５な種物細胞あるいは櫃物組鐵を形質転換しうる
ベクターとしては１例えばダラム怠性菌のりゾビウム科
ｒｈｉｚｏｇｍｎａｓ） に保持され、植物にクラウンゴール病及び根毛病を引き
起こす原因プラスミドとして見出された１゛ｉ　プラス
ミド又はそｎから誘導３ｎたプラスミド、及びｄ４　７
−ラスミド又はそｒｔ７１１・ら誘導さｌしたフ゛ラス
ミド、カリフラワーモザイクウィルス由来ベタメー、ゾ
エミニウイルス由来ベクター、酵母用ベクターとし℃知
られたンヤトルベクターなどかあげらｎ、植物細胞内で
自律複↓できたつ。
種物細胞の形質転換ができるものなどから選ばれて用い
ることができる。
ここで％疋Ｔｉプラスミド又はそｎから誘導されたプラ
スミドとしてイエ、そのオパインと総称される、−ｊえ
ばオクトビン、ツバリン、アグロピンによって分類さｎ
る各プラスミドがあげられ、またＴ−Ｌ）ＮＡ領領域含
むグラスミド、あるいはその地のオビ７分解、発癌性、
アゲロジン感受性などに関与する遺伝子の他、そのａ衾
などに関与する遺伝子ケ組み合わく″′Ｃ江成さｎたも
のがあげもねる。
このようなプラスミドとしては、ｐ　、Ｗ　（Ｊ　ＩＶ
糸ベクタｐＧＶ　３８５０で代表４１ｂるようなｄＬＳ
ａｒｍ型のＴｉプラスミド、バイナリ−型ベクターなど
があげられる。
このようなプラスミドの代表的なものとしては例えＶま
Ｓ。
Ｇ、Ｒｏｇｍｒｓ　　ａｔ　　ａｈ、Ｋａｃｏｔｎｂｉ
ｎα、Ｉ　　ＤＮＡ　　ｎｓａ　ｔｈａｄｏ−１Ｏｇｙ
　　、Ｒａｙ　　ｉｔｓ　　ａｔ　　ａＬ、ｔＡ、　　
ｐ　　二ｉ８　７−４１７−４１０（１９８９）ＡＣａ
ｔｔ　Ｐｒａ８８　ｉｃ示さｎているｐ　、Ｍ　Ｃｊ　
Ｎ　２００、ｐ、ＬｆＯＮ５　Ｕ５、ｐＭＵＮ２３７な
どをあげることかでさる。
本発明の植物用のハイブリッド１）ｌＶＡは、′Ａえは
、Ｔｉプラスミド又はそれに由来するプラスミドベクタ
ーを使用した場合には、アグロバクテリウム・ツメファ
シェンスに、三親又雑法、二親交雑による自律可動性ベ
クターの直接転移により、あるいは直接的な取り込み法
、七のハイブリッドＤＮＡを含有する他の細胞とのスフ
ェロプラスト融合により、リボゾーム法、あるいはウィ
ルスにバッグージとし℃の感染によるなどにより、導入
し、ついで、このアグロバクテリウム、ツメファシェン
スを植物細胞に感染させることによって植物細胞？形質
転換さゼ５る。
さらにまたＲｓプラスミド又はそれに由来するプラスミ
ドベクターを用いた場合にはアグロバクテリウム・リゾ
ゲネスカ、上記アグロバクテリウムのツメファシェンス
ト同様！こして使用される。
これら、アグロバクテリウム細−を植物細胞に感染させ
るには、当業者に広く用いられている方法が利用できる
。
このような方法とし”（ｆｌ、例えば、培養中の植物細
胞またに植物組織中に七のアグロバクテリウム細菌を加
え℃更に培養を続けるＤ・、栽培中の植物に直接感染さ
せるか、植物プロトプラストにその細菌を直接感染させ
るρ・、植物プロトプラストとその細菌のスフェロプラ
ストとを融合させるなどの方法をとることができる。
また１本発明の−・イブリッドＬ）ＮＡは、直接に［＊
細胞または櫂１Ｉ１１！Ｉ組藏に導入さ６℃、そｎを形
質転換させることかでさる。
このような方法とし′Ｃｈｉ、様々の公知方法Ｄ・便用
でさ、例えば４１１物のプロトプラストをポリエチレン
グリコール等の存在下キャリアーＤＮＡと共に細胞に取
り込ませる方法。
ホスファチジルセリンとコレステロールからなるリボゾ
ームの中にハイブリッドＤＮＡを入れ、そｎでもって植
物プロトプラストをポリエチレングリコール等の存在下
Ｊｐ７／−島力リシウムす液で処理する方法、マイクロ
インジエクシ７法、電気パルス法等があげろしる。
こ５して形質転換さｎた植物細胞又は植物組ｉｌ＆は、
当業者によ（知られた方法で再生さイて他物体とするこ
とかできる。このような他物体は、野外においてもある
いは温室内に′ｊ６いても栽培することができる。
以上！５ｉ、８Ａｔ、たことからも解るように、本発明
はオドントグロツサム　リングスポット　ウィルスの遺
伝子に対応するＬ）ＮＡ又は七の断片、あるいはそれら
の相補鎖を含有する遺伝子組羨えベクターで形質転換さ
れた形質転換体及びその作成法にも関するものであるこ
とは明らかである。
本発明に、さらにオドントグロツサム　リングスポット
ウィルスのＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡ及びその断片
、並びにそれらの相補鎖ＬＩＳＡのいずれかを用いたハ
イブリダイゼーション法にも＠する。本発明を１、また
ｌｆ！ｆに第１図で示される塩基配伺の任意の一部ある
いは全部のＤＮＡ鎖のいずれかを用いたーイブリダイゼ
ー７ヨ７法にも関する。
このハイブリダイゼーションは、種々の公知の手法で行
なうことができるこのハイブリダイゼーションは、ｆ４
えば久のよ５な条件下に行なうことができる。
すなわち、被験ウィルスＤＮＡ￥ニトロセルロースフィ
ルターに１足した麦、１１（１液、例えば、２５惰、イ
ｔｐｏ。
（ｐＨ７，４）５ＸＳさＣ，５ｘυａｓｈαｒａｔｅ液
（このＤａ　５ｈａｒｄ　ｔ　＠ｇｆＸ　Ｏ，２％フィ
コール（か予電４０．０００）、０．２％ポリビニルピ
ロリドン（分子量３０．０００〜４０．０００　）及び
υ２囁ウシ皿渭アルブミン（画分Ｖ）からなる。）、５
０μ、／Ｕサケ精子Ｄ　ＮＡ　、及び５０％ホルムアミ
ド液からなる緩衝液中で、３７°Ｃ〜４２℃にて３時間
から一夜の間プレーイブリタイゼーションを行なう。
次に以上のように処理されたニトロセルロースフィルタ
ーを本発明により得らｎたウィルス遺伝子に対応する１
）ＮＡの一部の配列からなるＬ）ＮＡプローブを含有す
る緩衝液、ｆｌｉ＆！　２５　ｍｕシＩ　　ＫＰＯ，（
ｐｔｌ　　　７．４　　）　、　５ｘＳＳＣ，５ＸＬｌ
ａｓｋ（Ｌｒｄｔ溶液、５Ｑ１１ｙ／１１２サケｓ子Ｄ
ＮＡ、５０％＊ルムアミド液、及び１０％デキストラン
ｆｆ１Ｒ塩液からなる緩衝液中で、３７℃〜４２℃ｅこ
３いて６時（−１ρ）ら−便ハイブリタ゛イゼーンヨン
反応を行ない、矢にノ・イフリタイズしたウィルスＩ）
　Ｎ　Ａ　ｆ（′茗云に便って恢出する。
な、世１本発明において用いられ、そして遺伝子Ｉｔｈ
ｉ１換技術にＰ６Ｖ−）−る一般的な方法及び当業者ん
とって常法であるような１去の詳しい説明（工１例えは
、Ｔ０ＭαルｎｉαｔＬ８　　ａｇαｔ　ｒＭｏＬａｃ
ｓＬａｒ　Ｃｏｎ１ルｇ−Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｒｄａｎｈｂａＬｊＣｏｌｄ　、）ｐｒｉｎｇ　ｔｉａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）　；　Ｒ
ＪＦｕ、　ａｔｉ、　「、イｇｃｈｏｄ　　ｉルＥｎｚ
ｙｍｏＬｏｇｙＪ４６８（１９７９）、１００（１９８
３）、及び１０１（１９８３）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ等・？参照丁Φことｒｚ９容易に理解しつる。
以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、
本発明はこｎら芙遁例シこ限定されるものではない。
液ＫｆｆｌＪで？ｌ１Ｍしたシンビジウムグ〕オドノト
グロツサムリングスポット　ウィルス感染の晒葉乍よく
粉砕し、久にＩＪ、１％ナオグリコールを百〇ｐＨ７，
Ｑのリン酸堪言有峻責液を加えて懸濁し、久にカーゼケ
通して濾過する。久に濾液を四項化炭素で処理した後、
６チのポリエチレングリコ−Ａ／６０００、Ｕ、１　、
ｋｌ　ＮａＣ１，１％ｒｒｉｔｏｎＸ−１００となるよ
うに各試薬を加え、水上にて２時間静置した。
矢にこの溶液を低速遠７１Ｌ？（３０００ｒｐｍ、　１
５Ｗ間、４℃、ＴｕＭＹ−Ｒ５２０ＭＢ）しＣ、ウィル
スＵ子を含む成分を回収する。久にリン咳塩言有緩衝液
を加えて懸濁し、高速遠心処理（３０，ＯＵ　Ｏｒｐｗ
ｈ、　　１時間、４℃、ＢＥＣＩＬＭＡＮ　　　Ｌ８−
７０．ｋｆ　、７０　　、　　ＩＴｉ　　ｒｏｔｏｒ　
　）して、ウィルス粒子を沈殿として回収した。次に得
らｎたウィルス粒子をさらに１０〜４０％のショｌｌ密
度石配遠心（２５，７０Ｏｒｐｍ、２４間、４℃、Ｂ　
Ｅ　ＣＫ　Ｊｆ　、４　Ｎ５ｌＦ’４０Ｔｉ）にかけ、
　遠心チェーブの底部より分−分取する操作？施こしウ
ィルスを細化した。このよ５にし′″ＣＭ化したウィル
ス粒子より常法に従って５１）さ−フェノール法により
ウィルス、’＜　ｌＶ　Ａを抽出した。
実　施　例　２．　　ウィルスＲＪＶ　Ａからのｃｌ）
ＮＡの合成実Ｎ例１のようにして得られたｌｆｌウィル
スＲＮＡの３′禾；４ＶＣ，ＰｏＬｙ（Ａ）ポリメラー
ゼを用いてＰｏ１ｙ（Ａ）％ｌ−付加した。
次にオリゴｄ（Ｔ）をプライマーに用いＡＭＶ逆転写醇
素を用いて通常の方法に従って処理し、ウィルス／？　
ｌＶ　Ａに相補的な第−鎖目のＬ）ＮＡを合成した。
上記オリゴｄ　（Ｔ）ブライマーの代わりに、オドント
グロツサム　リングスポット　ウィルスの塩基配列から
合成プライマー？作成して用いることもできる。
次にこのようにして得られたウィルスＲｌＶ　Ａ　−１
）　＃　Ａからなるーイブリツド核１！ｌ　Ｋ　ＲＩＶ
ａｇａ＆を作用させ、そり）ＲノＶＡ＠にニックを人ｎ
、久にこのＫ　ｒＶ−４をフ゛ライマーとして　Ｌ）　
Ｎ　ＡポリラーゼＩを用い第−嘘のＤｒＶＡに相補的な
第二鎖目のＤＮＡの合成を行なった。仄にクレノウフラ
グメ／ト乞作用さイ℃オーツく一ノヘングを除去し℃、
ｃＬ）ＮＡの画鴻を平滑床端とした。
上記処理を行なうにあたつ℃は、アマジャム−シャツ；
ン。
ファルマシア、コスモ・バイオ、生化学工業、第一化学
薬品、宝酒遺、相九純桑などから市販され℃いる谷櫨千
ット及びそれらの試薬を利用して行なうことができる。
実　施　例　３．　　ウィルスｃＤＮＡのクローニング
実施例２で調製されたＬ）ＮＡ馨常法に促ってＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで処理し℃、その内床端部にＥＣｏＲ（アダ
プターを＊’、１つけた。
このυｔＶＡは常法に従って循々のベクターに組み込ん
でクローニングすることがＣさるか、ここで＆裔大腸＠
　７’ラスミド、、　ｊ７　Ｃ１１８を用いてクローニ
ングする場合ケヅ１にとって説明する。
上記しｆこようにし℃実施例２で調製されたυｌＶ、４
０両末端にＥ（、ｏＲ１アダプター？付加されたＤ　ｉ
Ｖ　Ａは、矢にポリヌクレオチドキナーゼを用いて常法
に従ってそのＰ：ｃｏＲＩアタ′ブタ一部のす／ハ化を
行なった。別に、プラスミドｐＵＣ１１８を制限＃素Ｅ
ｃｏＲ１で３７℃、２時間処理して開裂した。この−抹
化したｐＵｃＬ１８’ｔフェノール処理して、そこに含
１ｒＬる制限酵素？不活性化した後、常法Ｖこ促ってア
ルカリフォスファターゼで処理し℃脱リン酸化した。
上記２櫨類のＤＮＡｖｉエタノール沈ｗｉヲ施して回収
された恢、七ｎ’ｅｎ７　イケーショ７＠衝漱Ｃ−６６
ｓ、Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ　ＣｐＨ７，６）、６．６　
、ｗ　ＭｇＣ２，，１０５Ｍ　ＤＴＴ。
０１朧イフイＴＩ’〕に溶解ぎｎた。仄にこｎらの溶液
を混合し、史７ｆこ七σ）混８溶欣甲にｆ４　　Ｄ　＋
Ｖ　、４　リ、勺−ゼケ塀−ｔて、１６’ｃで２時間反
応ぎへ常法に便ってライＴ−ンヨン反応を行なった。久
ｌここの反応液乞用い、常１去、・ζ便って塩化力ルシ
ウム法によつ１コンピテントな’ｆ、９１ｃさｎでいる
大腸菌ｊｅ１０９の形質転換を行なった。矢に形質転換
さｎた大腸菌Ｊ１％４１０９は、培地中でアノピシリン
耐性で且つＬａｃ−Ｚ遺伝子の発現しないことを指標に
選択されて、最終的にｐＵＣ１１８のＥｃｏＲｌ切断部
位にオドントグロツサム　リングスポット　ウィルスの
遺伝子に対応するＤＮＡまたはその断片の挿入さｎたプ
ラスミドを保持する大腸菌コロニーケ得た。このように
して得らｎた大腸菌コロニーから四つのコロニーを選び
、七ｒＬそれオドントグロツサムリングスポット　ウィ
ルスの遺伝子に対応する１ｉＮＡまたにその断片の挿入
されているプラスミドを得た。こｎらのプラスミドレエ
、それぞれｐＯＲＥ５−２５、ｐＯＲｔ！：６−４５、
ｐＯＲＥ１０３３及びｐ（ＪＲ５２４と苗名された。
谷プラスミドのコード電域は凶２に漢式的に示しである
。
なお上記処理７行なうには、実施例２で記載したように
市販さｎている各撞キット及び試薬？用いて行なうこと
かでさる。
実　施　例　４．　　ウィルス６ＤＮＡの塩基配幻の決
定実施例３で得られたプラスミドを用いて、図２のシー
ケンスストラテジーに示した戦略で、Ｌ）ＮＡｆ）＠基
部列を決定した。
過当な制限＃素で断片化し１次に塩基配列γ決定しよう
とするＬ）　ｔｖＡ　＃ｒ片を、ノＡｅｓｓｉｎｇ　ｓ
　ｔ　　ａＥ　、が開発したＭ１３７アージベクターあ
るいはｐＵＣ１１８／１１９プラスミドベクターでもっ
てクローニングし、久にＦ、Ｓ６１％ｇ−デ５ｔａｔ、
が開発したいわゆるジデオ千シ法（蛋白質核酸酵素Ｖｏ
Ｌ、２９．．Ｉ６４．ｐ２９４〜３０６（１９８４））
を適用してその塩基配列を決定した。
図２に示さｎているよ５にＥ：ｃｏＲｌ、　Ａｃｃ（、
Ｐｓｔｌ、１１ｉｘｄ　Ｉｌｌ、　Ｍ＆ｓ　ｔ、　Ｘｂ
ａ　Ｉ、　Ｍｃｏ　ＲＶ及ヒＡｐαＩノソれぞれの部位
から塩基配列が解析でさるようにｐＵＣ１１８及びｐＬ
Ｉｃ　１１９のそれぞれのクローニング部位に各ＤＮＡ
断片を挿入することがなされるが、過当な大きさに断片
化できない場合にはｔ！、ｚｏｎｓｃＬａａｓａ　匿（
エキンヌクレアーゼ厘）によるプリージョン処理を施こ
し、過当な各種の長さの断片とじ℃から、その塩基配列
を決定した。
上記の１云により決定さｎたオドントグロツサム　リン
グスポット　ウィルス遺伝子に対応するＤ　Ｎ　Ａ　（
１）塩基配列２図１に示す。
図１に示されたＬ）：ＶＡ＠基配列配列ドントグＣ１７
９ムリ／ゲスポット　ウィルス遺伝子の全鎖長に相当す
るものではないが、その５ちに４式つィルス’）　３３
　Ｋ　ｐ　ンパク貰に相当する領域及び外板（コート）
タンパク質に由由する領域が含まれている。
図ＩＫ示さｒた配夕１ｊのうち、上段の配列に該ウィル
スケツムの十ｓｆＲ：ｖＡ疋対応するｃＤ、ＶＡである
。図１に示さｒ、た塩基配列のうち、第５１０７塩目′
７）塩基ρ・ら第５５８３番目までの塩基ツク領域を発
現さくると、ウィルスの外被タンパク質活性を有する発
現物が得られる。なお崗１甲二不鎖の上段は５′−末端
から３′−床端方向への配列で示ざｒて５つ、下段には
上段に対して相補的な配列Ｄ）左側３′−禾瑞より５′
−末端方向疋示さしている。
芙　施　ｆＩＩ５．　　　ウィルスタンパク質の発現以
下の実施例では図１で示さｎる塩基配列より、ウィルス
タンパク質をコードする遺伝子部分を分尊し、矢、てそ
の遺伝子から発現用ベクターを構築し、ついでこうして
得らｎたベクターをもつ℃形質転換した宿主細胞により
産生さｒ５たタンパク質が、ウィルスタンパク質である
ことを確認した。
１１Ｊ　　ウィルス外板タンパク質遺伝子の単離図１７
）塩基配列よりオーブ／リーディングフＶ−ム（転写翻
訳砕：０ＲＦ）の探累な行なった。
次に探索さｎたＯＲＦの内で、タバコモザイクウィルス
（Ｔ、ばＶ）ＣＩ）遺伝子構造と比較検討し℃、ＴＭＶ
Ｏ外被タンパク質遺伝子の装置と同等の位置関係ケ示す
と共にほぼ同等量の分子量？コードすることかでさるＯ
ＲＦ、即ち図１で示ざｎる塩基配列の第５１０７塩基目
から第５５８３塩基目までを、オドントグロツサム　リ
ングスポット　ウィルスの外被タフバク質をコードする
遺伝子部但と推定した。
次に該υ−Ｖ　、４　＃片を制限＃素で切り出した。先
ず外被タフバク質をコードすることが推定される遺伝子
部分を言むＤＮＡ断片１例えはｐ　（Ｊ　ＲＥ　５　２
５　、　ｐ　ＯＲＩ！、１す３３又はｐＯＲＥ６−４５
を制限＃素ｘｂα［（４９５０塩基ｄ）及びＮｓｚ　ｌ
　（３６３９Ｈ番目）を用いて実施例３に記載したよう
な通常の方法ンこ従って処理し一〇、χｂα１−Ｎ５ｉ
１断片を取得した。このｘｂα１−Ｎ５ｉＩ断片？使用
し１図３に示すようにして発現用ベクターを構築した。
このｘｂα■−Ｎ３ｉ（断片を実施例３に記載したよう
な通常の方法に従つ℃、プラスミドベクターｐＵ（−１
１９のＸｂ（１１及びＰｓｔ１部位に結合した。こうし
て得ろｎだハイブリッドＤＮＡを実施例３′／ｃ記載し
たような通常の方法に従つ℃大腸菌］、ｄ１０９に導入
してプブクローニングし℃、そして形質転換８ｎだ大ｍ
ＩＩコロニーを選択した。
こうして得られた形質転換された大腸菌ココニーからサ
ブクローン化した目的ハイブリッドＤ　ＩＶ　Ａプラス
ミドを回収した。次にこのプラスミドを′ｉ！施例３に
記載されているように常法に従って制限酵素Ｋｐｎｌ及
びＳｍαＩで処理して、１状のものとし、次にエキソヌ
クレアーゼＩで通常の方法に従ってプリージョンを行な
った。ウィルス外被タンパク質をコードする遺伝子のＯ
ＲＦの翻訳開始部位ＡＴＧコドンの４塩基手前まで、こ
のプリー７ヨ／を行なう。次てこの５′側平滑末ｙｓ４
に通常の方法を用いてＥｃｏＲＩ　リンカ−を取りつけ
た。次に制限酵素Ｈｉｎｄ　ｆ［でもって通常の方法で
処理して、ウィルス外被タンパク質をコードする遺伝子
のＯＲＦを含有するＥ、ｏＲｌ−ＨｉｎｄＩＩ断片を取
得した。
ｔ２Ｊ　　ウィルス外被タンパク質遺伝子の発現上記工
程ｉｌｌで得らｎたウィルス外被タンパク質遺伝子をコ
ードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、大ＷＩＪ菌用発現
ベクターｐＫＫ２２３−３のｔｔｃ、Ｒ１及びＨｉｎｄ
Ｍ部位に、実施例３に記載されているような通常の方法
に従って結合した。次にこのハイブリッドＤＮＡを用い
、実施例３に記載されているような通常の方法（τ従っ
てコンピテントな大腸菌Ｊ、背１０１−形質転換し、大
ｙＩＪ菌での発現で行なった。
このようにして形質転換さｎた大腸菌は、先ずアンビシ
リ１５０μｙを含む２ＸＴＹＮ地（５紅）で−夜培養を
行ない１次にその培養液から５０μｅを分取し、新鮮培
地［２ＸＴＹ培地（５紅）〕で培養（３７℃、２．５時
間）した。次にその培地シで１００　ｒｎ−’ｙｆ　Ｉ
　／’　ＴＧ　　５μｇ　添加（終濃度０．１ｍＭ）Ｌ
で後、さらに培養を４０℃で１．５時間行なった。
こうして得られた培養液を５分間水冷した後、その２１
Ｌｔの培養液より大腸菌を常法に従って集め、次いでＴ
Ｅ緩衝液で洗浄後、１００μｌのＮｃｄｒＰ　Ｏ，（ｐ
Ｈ７，０）液に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕（１
分間印加、３０秒間停止の処理を６回繰り返す）にかけ
、大ｉ菌よりタンパク質の抽出を行なった。
こうして得られた抽出液を１５４ｓｖｓポリアクリルア
ミド電気泳動にかけた俊、ゲル上のタンパク質をニトロ
セルロースフィルターにエレクトロプロットする。オド
ントグロツサム　リングスポット　ウィルスに対する仇
血清を用いて、公知の方法に従ってイミュンブロットア
ッセイ（ウェスタンプロット法）にカケ、ニトロセルロ
ースフィルター上にそのオドントグロッサム　リングス
ポット　ウィルスに対する仇血清と反応するタンパク質
があるか否かを検ぺた。図３に示すように、上記のよ５
にして形質転換された大腸＠ＪＩｄ１０９（ｐＯＲｃＰ
−Ｄ８３と命名した。）から抽出されたタンパク質は、
オドントグロッサム　リングスポット　ウィルスに対す
る抗皿清と反応した。この抽出されたタンパク質はオド
ントグロッサム　リングスポット　ウィルスの外被タン
パク質であることが確認された。
ここで得られた上記形質転換大＆ｌｉＪ＆ｘｏ９株（ｐ
ｔＪＲｃＰ−Ｄ８３と命名）は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄詫され℃いる（倣工研条寄第１１１３４号
１：ＦＥＢＭ　　Ｐ−１１１３４））。
＋３）　　淋］様な手法を繰り返すことにより、ウィル
スの３３にタンパク質を取得することもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、オドントグロツサム　リングスポット　ウィル
ス遺伝子に対応するＤＮＡの塩基配列？示す。上段の塩
基の配列がウィルスゲノムの中鎖ＲＮＡｖｃ対応するｃ
Ｌ）ＮＡの塩基配列を示すものである。 因２は、図１に示されたＤＮＡの塩基配列を決定するだ
のの戦略と、それに使用さｎた王な制限酵素の切断部位
を示す。各ＤＮＡ断片は矢印の方向にその塩基配列が決
定された。 図３は、オドントグロツサム　リングスポット　ウィル
スの外被タンパク貰遺伝子発現用ベクターの構築法を模
式図４は、遺伝子組換えで得られたオドントグロツサム
リングスポット　ウィルスの外被タン・くり質を同定す
るのに用いらｎたイミュンブロットアツセイ試験の結果
を示すものである。 レーンＡはオドントグロツサム　リングスポット　ウィ
ルス包子、レーンＢは大助ｍＪＩｄ１０９から抽出さｎ
たタンパク質、レーンＣは実施ｆ４５で得られた形質転
換大ｌ１ｌｉ！Ｊ菌ＪＭ１０９ＣｐＯＲＣＰ−Ｄ８３と
命名）から抽出されたタンパク質をそれぞれ示す。 Ｉ＋　　　　−ノ　−！＋−Ｉ′＋　へ　　　し　−ノ
　　　ｒ−〜　　　　しノ　リ　　　　じ　−ノ、←　
←＜　　ＣＪＣ：ｌ　　ｕｏ　　←く　く←　しつ　０
０図３ ９７．４に −６６，２に −４２，７に −３１０に ＝１４４に 区し今

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、オドントグロツサムリングスポットウィルス（Ｏｄ
    ｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ　ｒｉｎｇｓｐｏｔ　ｖｉｒｕ
    ｓ；ＯＲＳＶ）の遺伝子に対応するＤＮＡ及びその断片
    、並びにそれらの相補鎖ＤＮＡ。 ２、次の塩基配列： 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表される二本鎖ＤＮＡのうちの任意の一部あるいは全
    部を含有するものである請求項１に記載のＤＮＡ及びそ
    の断片、並びにそれらの相補鎖ＤＮＡ。 ３、請求項２に記載のＤＮＡ鎖のいずれかとハイブリダ
    イズすることができ、その塩基配列とは部分的に異なる
    塩基配列を有しかつオドントグロッサムリングスポット
    ウィルスの遺伝子としての性質を持つものである請求項
    １に記載のＤＮＡ及びその断片、並びにそれらの相補鎖
    ＤＮＡ。 ４、請求項１に記載の二本鎖ＤＮＡから、制限酵素Ｅ＿
    ｃ＿ｏＲ＿ I 、Ａ＿ｃ＿ｅ＿ I 、Ｐ＿ｓ＿ｔ＿ I 、
    Ｈ＿ｉ＿ｎ＿ｄ＿III、Ｍ＿ｉ＿ｎ＿ I 、Ｘ＿ｂ＿ａ＿
    I 、Ｅ＿ｃ＿ｅＲＶ及びＡ＿ｐ＿ａ＿ I のうちの一種
    あるいは二種以上の制限酵素による開裂により生ずる請
    求項２に記載のＤＮＡ及びその断片、並びにそれらの相
    補鎖ＤＮＡ。 ５、オドントグロッサムリングスポットウィルスのＲＮ
    Ａ遺伝子を単離する工程、その単離されたＲＮＡよりそ
    のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを製造する工程よりなるこ
    とを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ
    及び断片、並びにそれらの相補鎖ＤＮＡを製造する方法
    。 ６、得られたｃＤＮＡをさらにクローニングすることか
    らなる請求項５に記載の方法。 ７、オドントグロッサムリングスポットウィルスの遺伝
    子に対応するＤＮＡ又はその断片、あるいはそれらの相
    補鎖ＤＮＡを組み込んでなる遺伝子組換えベクター。 ８、請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡ又はその断
    片、あるいはそれらの相補鎖ＤＮＡを組み込んでなる請
    求項７に記載の遺伝子組換えベクター。 ９、オドントグロッサムリングスポットウィルスの遺伝
    子に対応するＤＮＡ又はその断片、あるいはそれらの相
    補鎖ＤＮＡを含有する遺伝子組換えベクターで、形質転
    換された形質転換体。 １０、請求項８に記載の遺伝子組換えベクターで、形質
    転換されたものである請求項９に記載の形質転換体。 １１、宿主細胞が大腸菌、枯草菌、酵母アグロバクテリ
    ウム属菌、植物細胞である請求項９または１０に記載の
    形質転換体。 １２、オドントグロツサムリングスポットウィルスの遺
    伝子に対応するＤＮＡ又はその断片、あるいはそれらの
    相補鎖ＤＮＡを組み込んでなる遺伝子組換えベクターで
    もつて宿主細胞を形質転換させることよりなる形質転換
    体の製造法。 １３、請求項８に記載の遺伝子組換えベクターを用いる
    ことからなる請求項１２に記載の方法。 １４、オドントグロツサムリングスポットウィルスのＲ
    ＮＡ遺伝子、あるいはそのＲＮＡ遺伝子を逆転写して得
    られたｃＤＮＡ、あるいはさらにはそのｃＤＮＡをクロ
    ーニングして得られた核酸を、請求項１〜４のいずれか
    に記載のＤＮＡ及びその断片、並びにそれらの相補績か
    ら選ばれたものからなるプローブとのハィブリダイゼー
    シヨンによつて検知することを特徴とするオドントグロ
    ツサムリングスポットウィルス関連遺伝子の分析法。 １５、遺伝子組換え技術により製造されたオドントグロ
    ツサムリングスポットウィルスの３３Ｋタンパク質又は
    その外被タンパク質あるいはそれらのペプチド断片化合
    物。
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