CN101307354A

CN101307354A - 一种筛选乳酸生产率高的菌株的方法

Info

Publication number: CN101307354A
Application number: CNA2008101162188A
Authority: CN
Inventors: 徐洪涛; 张延平; 李寅
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2008-07-07
Filing date: 2008-07-07
Publication date: 2008-11-19

Abstract

本发明公开了一种辅助筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法。本发明方法包括如下步骤：1)培养待筛选样品，挑取产酸但不产气的菌株，获得产酸不产气菌株；2)培养所述产酸不产气菌株，挑取对数生长期内生长速率高于0.2h^－1的菌株，获得候选乳酸生产率高的乳酸菌。本发明筛选方法实现了乳酸生产率高菌株的快速、高通量筛选，解决了目前工业乳酸菌株筛选过程中费时、费力、筛选效率不高的缺点，为乳酸发酵提供了大量的供选择的菌种资源，为进一步优化改良提高乳酸产量和生产率、降低成本奠定了基础。

Description

一种筛选乳酸生产率高的菌株的方法

技术领域

本发明涉及一种筛选乳酸生产率高的菌株的方法。

背景技术

随着石油资源的不断减少以及不可再生资源价格的节节攀升，开发利用环境友好的生物基产品已成为转变经济增长方式、保障生态链良性循环、实现经济社会可持续发展的战略需求。乳酸是一种重要的、多用途生物基平台化合物，它有两种旋光异构体，其中L-乳酸可用作酸味剂、芳香剂、防腐剂、植物生长调节剂等，在食品、制药、酿造、制革、纺织和农业中具有广泛用途。乳酸的两个功能集团可以进行多种化学反应，包括聚合、酯化、还原和取代反应。利用这些反应，乳酸可被用来生产多种在工业和消费品领域中具有重要用途的产品，包括高聚物(如聚乳酸)、溶剂(如乳酸乙酯、乳酸丙酯、乳酸丁酯等)及含氧化学品(如丙二醇、环氧丙烷、丙烯酸等)，其中最重要、最大宗的工业应用，是用于生产可降解聚合物-聚乳酸，聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性及优良的机械性能和物理性能，因而被产业界认为是新世纪最有发展前途的新型包装材料，将有望逐步替代聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等材料。作为一种能够由可再生碳水化合物转化而来的重要平台化合物，近年来乳酸受到了全世界研究人员和生产企业的极大关注。2005年全球乳酸产量已经达到12万吨，其中20-30％应用在新的工业领域中。随着乳酸新的、大宗的应用不断开发，全球乳酸的市场需求将持续增长。

根据预测，如果10-20年后全球范围内生物基塑料能够替代石油基塑料消费量的10-20％，聚乳酸的年需求量将达到1150-2300万吨。目前全球乳酸产量只有这一预测值的1％，其核心问题是L-乳酸生产成本和市场价格仍然偏高。解决这一问题的关键之一是提高菌株的乳酸生产率，目前已知的大多数菌种的发酵生产率较低，导致发酵周期长，生产成本偏高，从而导致聚乳酸市场开拓受阻。在现有技术基础上对已有菌株进行简单优化或改良对进一步提高乳酸生产率，降低生产成本贡献甚微，因此需要从天然生境中筛选高乳酸生产率的优良菌株，并通过正向、反向和进化代谢工程等技术手段进一步提高并改进菌株的乳酸生产效率、对环境的胁迫能力，从而使菌株能够高效、大量生产L-乳酸，突破聚合级L-乳酸发酵生产的技术瓶颈，为以可再生生物质为原料大规模、低成本地生产高纯度L-乳酸奠定技术基础。

菌种是乳酸发酵的主体和基本要素，能够产生乳酸的微生物有很多，但就工业意义上来说，乳酸杆菌具有最大的工业应用价值。乳酸杆菌包括两种发酵类型，同型发酵和异型发酵。同型发酵菌株在发酵过程中只产生乳酸作为发酵产物，因此是理想的工业乳酸发酵菌株。目前在工业上获得应用的同型发酵菌株主要包括：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)等。自然界中蕴藏着大量有潜力的乳酸产生菌，从环境中筛选天然优良菌株是提高乳酸发酵性能、降低乳酸发酵成本的第一步。美国阿贡国家实验室Tsai等根据选择合适碳源、乳酸发酵类型、对产物耐受能力、产物立体专一性、菌体细胞分离的难易程度、高温耐受等筛选标准，经2轮8套筛选，最终筛选获得耐高温、耐自身发酵产物的优良菌种。Carlson和Peters的专利公开了耐乳酸同型发酵的筛选方案，他们从玉米浸渍浆水中分离了近百株同型乳酸发酵菌种，得到一株在葡萄糖和不同量玉米浆水的培养基中47℃发酵6h产乳酸接近100g/L的耐酸菌种。上述方法虽然能有效筛选到目的菌株，但是其不足是不能高通量筛选，存在极大的局限性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种辅助筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法。

本发明所提供的辅助筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法，包括如下步骤：

1)培养待筛选样品，挑取产酸但不产气的菌株，获得产酸不产气菌株；

2)培养所述产酸不产气菌株，挑取对数生长期内生长速率高于0.2h^-1的菌株，获得候选乳酸生产率高的乳酸菌；

所述对数生长期内生长速率是按照如下公式计算的：V＝(OD₁-OD₀)/Δt；

OD₀为对数生长期内检测起始时间点对应的OD₆₀₀值；

OD₁为对数生长期内检测终止时间点对应的OD₆₀₀值；

Δt为终止时间点至起始时间点之间的时间段。

V为对数生长期内生长速率。

所述挑取对数生长期内生长速率高于0.2h^-1的菌株的方法包括如下步骤：将所述产酸不产气菌株接种于装有培养基的孔板中，再将所述孔板置于酶标仪中进行培养，在培养期的不同时间点直接读取培养液的OD₆₀₀值，按照所述公式计算得到所述菌的对数生长期内生长速率，筛选获得对数生长期内生长速率高于0.2h^-1的菌株。此步骤是利用酶标仪进行培养和读数，方便了生长率的获得，省时省力。

所述培养中所用到的培养基为MRS培养基。

所述乳酸菌为同型发酵乳酸菌。

本发明的另一个目的是提供一种筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法。

本发明所提供的筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法，是用上述任一所述方法获得候选菌后，再对候选菌的乳酸生产率进行鉴定，如果所述候选菌的乳酸生产率大于等于3.9±0.1g/L·h，则所述候选菌为乳酸生产率高的乳酸菌。

同型发酵菌株在发酵过程中只产生乳酸，而且这一途径是唯一的产能途径，因此同型发酵菌株的产乳酸过程与菌株的生长和繁殖是直接相关的，因此通过筛选生长快速的同型发酵菌株可以获得高乳酸生产率的菌株。本发明基于这一原理，建立了通过酶标仪从天然环境中高通量筛选高生产率乳酸菌的方法。

本发明筛选方法将来自自然环境中的发酵样品用生理盐水连续10倍稀释后，涂布在含溴甲酚绿的MRS平板上培养，获得产酸圈较大的产酸菌；通过在96深孔板倒置的杜氏小管中观察是否产气，筛选不产气的细菌即为同型发酵菌株；然后通过酶标仪测定菌株生长曲线，选取生长速率高的菌株即为乳酸生产率高的菌株。在本发明筛选方法的基础上，可以通过生理生化试验鉴定菌株的种类，建立高生产率乳酸菌株库，为乳酸发酵的工业化提供更加充足的菌种资源；可以通过进一步的耐高盐、耐高糖等发酵性能的检测，筛选出满足工业化生产的潜在菌株；还可以对具有乳酸高生产率的菌株做进一步的遗传改造，获得更优良工业菌株。

本发明筛选方法实现了乳酸生产率高菌株的快速、高通量筛选，解决了目前工业乳酸菌株筛选过程中费时、费力、筛选效率不高的缺点，为乳酸发酵提供了大量的供选择的菌种资源，为进一步优化改良提高乳酸产量和生产率、降低成本奠定了基础。

附图说明

图1为乳酸生产率高菌株的筛选流程图。

图2为51株同型发酵乳酸菌菌株的生长速率与乳酸生产率的关系图。

图3为L-乳酸标准品的色谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

下述实施例中所使用的培养基的组成如下：

筛选培养基和种子培养基均为MRS培养基，其组成为：20g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母提取物、2g/L K₂HPO₄、2g/L柠檬酸铵、2g/L醋酸钠、0.58g/L MgSO₄·7H₂O、0.25g/L MnSO₄·4H₂O、1ml/L Tween-80，其余为水，pH为6.2。

发酵培养基组成：150g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母提取物、3g/L K₂HPO₄、3g/L KH₂PO₄、2g/L醋酸钠、0.58g/L MgSO₄·7H₂O、0.25g/L MnSO₄·4H₂O、1ml/L Tween-80。以6mol/L NaOH为中和剂，调节pH为5.5。

实施例1、乳酸菌的生长速率与乳酸生产率的正相关性验证

一、对51株同型发酵乳酸菌株进行检测

1、菌生长速率与乳酸生产率的测定：

将51株保存在-80℃冰箱中的同型发酵乳酸菌菌株接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到发酵培养液；然后将培养液各分成两份：一份用MRS液体培养基稀释到光密度大约为0.05时，取200μL稀释液加到经75％酒精浸泡灭菌的96孔板中，放入酶标仪中37℃培养6h(所有的菌株都完成对数生长期)，期间每隔0.5h检测一次OD₆₀₀值，计算对数生长期内的生长速率；另一份培养液用MRS液体培养基稀释到光密度大约为0.05，然后将稀释液加入到MRS1培养基中，37℃厌氧培养24h，检测24小时内的平均乳酸生产率。

MRS1培养基的组成为：以MRS培养基为基础，其中的葡萄糖浓度变为80g/L，同时含有4％CaCO₃作为中和剂。

定量检测乳酸含量的方法是高效液相色谱法(HPLC)，所用色谱柱为HPX-87H，柱温40℃，检测器为示差检测器，流动相为0.05mmol/L H₂SO₄，流速为0.5ml/L。在此色谱条件下，L-乳酸标准品的色谱图如图3所示，L-乳酸标准品的保留时间为14.974min。

其中，对数生长期内菌的生长速率的计算公式如下：对数生长期内菌生长速率＝(OD₁-OD₀)/Δt；

OD₀为对数生长期内检测起始时间点对应的OD₆₀₀值；

OD₁为对数生长期内检测终止时间点对应的OD₆₀₀值；

Δt为终止时间点至起始时间点之间的时间段。

实验设3次重复，结果取平均数。

结果表明，51株同型发酵乳酸菌菌株的乳酸生产率和生长速率均表现出正相关的关系(图2，横坐标为各菌株的对数生长期内的生长速率，纵坐标为各菌株的乳酸生产率)。因此可以通过检测乳酸菌株的生长速率来筛选高生产率的乳酸菌。

二、检测植物乳杆菌NCIMB 5105、鼠李糖乳杆菌CCUG 36679和植物乳杆菌NCIMB8826

鼠李糖乳杆菌CCUG 36679购买自瑞典大学微生物菌种保藏中心，植物乳杆菌NCIMB 5105购自英国国家工业、食品和海洋细菌菌种保藏中心和植物乳杆菌NCIMB8826购自英国国家工业、食品和海洋细菌菌种保藏中心。

从已知的乳酸菌中选取2株生长速率高的菌株植物乳杆菌NCIMB 5105(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌CCUG 36679(Lactobacillusrhamnosus)，以及1株生长速率较低的植物乳杆菌NCIMB8826，将其分别接种于装有发酵培养基的7L发酵罐中，37℃厌氧培养24h后，得到发酵培养液，然后按照一中所述方法稀释发酵培养液及检测菌的对数生长期内生长速率、24h内的乳酸含量及平均乳酸生产率。

实验设3次重复，结果取平均数。

对数生长期内菌株的生长速率及乳酸的产量和乳酸生产率如表1所示，表明对数生长期内菌株的生长速率和菌株的24小时内平均乳酸生产率具有直接正相关性，进一步验证了图2所示的实验结果。

表1、不同生长速率菌株乳酸发酵结果

同型发酵菌株在发酵过程中只产生乳酸，而且这一途径是唯一的产能途径，因此同型发酵菌株的产乳酸过程与菌株的生长和繁殖是直接相关的，而异型发酵菌株因为在发酵过程中除产生乳酸外，还产生乙醇、乙酸和CO₂等多种产物，因此其乳酸合成与生长是不直接相关的。综上表明，可以通过检测乳酸菌株的对数生长期内生长速率辅助筛选乳酸生产率高的乳酸菌。

实施例2、从环境样品中筛选乳酸高生产率菌株

本实施例是从5种发酵物(泡菜、盐渍大白菜、酸梅汤、酸菜和离体的瘤胃)中筛选出乳酸生产率高的菌株，每种发酵物设2-3次重复实验(表2)。

一、候选菌的筛选方法

1、筛选培养过程中能产酸的菌

用生理盐水分别洗涤(除酸梅汤外的其余四种)或稀释(酸梅汤)5种发酵物，将洗涤液或稀释液再用生理盐水稀释，依次10倍稀释，稀释至满足实验要求；分别取100μL稀释液涂布在以溴甲酚绿为指示剂的MRS平板上，37℃培养24h，挑取菌落周围颜色变黄菌落(图1A)，进行下一步实验，共挑选了约320个菌落。

2、筛选培养过程中不能产气的菌

将步骤1筛选的菌落，分别接种至含有0.6ml MRS液体培养基的96孔深孔板中，向杜氏小管中注满MRS液体培养基，并将其倒置于96孔深孔板中，放入厌氧罐中37℃培养15h，筛选到不产气的菌株，共191株(图1B)；

3、筛选对数生长期内平均生长速率大于0.2h^-1的菌

将步骤2获得的191株菌的菌液分别用MRS液体培养基稀释到其OD₆₀₀值约为0.05，各取200μL加到经75％酒精浸泡灭菌的96孔板中，在酶标仪中37℃培养6h(所有的菌株都完成对数生长期)(因为乳酸菌是兼性厌氧菌，既能在厌氧条件下生长，也能在好氧条件下生长，因此可以在酶标仪中培养，不需要保证厌氧条件)，期间每隔0.5h检测一次OD₆₀₀值，测定生长曲线，计算对数生长期内菌的生长速率，计算方法同实施例1中所述。结果筛选到11株对数生长期内生长速率大于0.2h^-1的菌株(图1C和表2，图1C中，横坐标为发酵时间，纵坐标为发酵液的OD₆₀₀值)，即为候选乳酸生产率高的乳酸菌。

二、证明候选菌的发酵产物为乳酸及乳酸生产率的测定

将步骤一中筛选得到的11株菌株分别接种于装有3L上述发酵培养基的7L发酵罐中，以NaOH为中和剂，37℃厌氧培养24h，发酵结束，检测24小时内平均乳酸生产率。定量检测乳酸含量的方法及乳酸生产率的计算如实施例1中所述。

实验设3次重复，结果取平均值±标准差。

11株菌的乳酸生产率如表2所示。结果表明，经本发明筛选方法筛选出的菌株均为乳酸菌，且乳酸生产率均高于4.0g/L·h。综合以上实验表明，本发明的筛选方法准确、可信度高。

三、菌株的鉴定：

对筛出的11株菌株进行生理生化鉴定，最后鉴定SMB-0788为植物乳杆菌，SMB-0789为干酪乳杆菌、SMB-0790为干酪乳杆菌、SMB-0791为植物乳杆菌、SMB-0792为植物乳杆菌、SMB-0793为鼠李糖乳杆菌、SMB-0794为嗜酸乳杆菌、SMB-0795为类植物乳杆菌、SMB-0796为干酪乳杆菌、SMB-0797为鼠李糖乳杆菌、SMB-0798为唾液乳杆菌(表2)。

表2、高生产率菌株的筛选结果

菌种编号	种名	平均生长速率	菌种来源	乳酸生产率g/L·h
菌种编号	种名	平均生长速率	菌种来源	乳酸生产率g/L·h	SMB-0788	植物乳杆菌	0.22	泡菜	4.2±0.1
SMB-0789	干酪乳杆菌	0.24	泡菜	4.4±0.1	SMB-0788	植物乳杆菌	0.22	泡菜	4.2±0.1
SMB-0789	干酪乳杆菌	0.24	泡菜	4.4±0.1	SMB-0790	干酪乳杆菌	0.25	泡菜	4.5±0.1
SMB-0791	植物乳杆菌	0.21	盐渍大白菜	4.1±0.1	SMB-0790	干酪乳杆菌	0.25	泡菜	4.5±0.1
SMB-0791	植物乳杆菌	0.21	盐渍大白菜	4.1±0.1	SMB-0792	植物乳杆菌	0.20	盐渍大白菜	4.0±0.1
SMB-0793	鼠李糖乳杆菌	0.23	酸菜	4.3±0.1	SMB-0792	植物乳杆菌	0.20	盐渍大白菜	4.0±0.1
SMB-0793	鼠李糖乳杆菌	0.23	酸菜	4.3±0.1	SMB-0794	嗜酸乳杆菌	0.22	酸菜	4.3±0.1
SMB-0795	类植物乳杆菌	0.21	酸梅汤	4.2±0.1	SMB-0794	嗜酸乳杆菌	0.22	酸菜	4.3±0.1
SMB-0795	类植物乳杆菌	0.21	酸梅汤	4.2±0.1	SMB-0796	干酪乳杆菌	0.22	酸梅汤	4.2±0.1
SMB-0797	鼠李糖乳杆菌	0.20	瘤胃	4.0±0.1	SMB-0796	干酪乳杆菌	0.22	酸梅汤	4.2±0.1
SMB-0797	鼠李糖乳杆菌	0.20	瘤胃	4.0±0.1	SMB-0798	唾液乳杆菌	0.20	瘤胃	4.0±0.1

Claims

1、一种辅助筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法，包括如下步骤：

OD₀为对数生长期内检测起始时间点对应的OD₆₀₀值；

OD₁为对数生长期内检测终止时间点对应的OD₆₀₀值；

Δt为终止时间点至起始时间点之间的时间段。

V为对数生长期内生长速率。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述挑取对数生长期内生长速率高于0.2h^-1的菌株的方法包括如下步骤：将所述产酸不产气菌株接种于装有培养基的孔板中，再将所述孔板置于酶标仪中进行培养，在培养期的不同时间点直接读取培养液的OD₆₀₀值，按照所述公式计算得到所述菌的对数生长期内生长速率，筛选获得对数生长期内生长速率高于0.2h^-1的菌株。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述培养中所用到的培养基为MRS培养基。

4、根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述乳酸菌为同型发酵乳酸菌。

5、一种筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法，是用权利要求1-4中任一所述方法获得候选菌后，再对候选菌的乳酸生产率进行鉴定，如果所述候选菌的乳酸生产率大于等于3.9±0.1g/L·h，则所述候选菌为乳酸生产率高的乳酸菌。