JP2000500333A - 高いコハク酸産生を有する突然変異ｅ．コリ菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コハク酸産生バクテリアを単離する方法を提供する。この方法は、ピルベートを異化作用する能力に欠けた、生物のバイオマスを増大させ、次いで嫌気性環境内で、該バイオマスをグルコースに富む培地に接種して、ピルベート−異化作用可能な突然変異体の成長を可能とする工程を含む。本発明は、また大量のコハク酸を生産する突然変異体をも提供し、該突然変異体はピルベートホルメートリアーゼおよびラクテートデヒドロゲナーゼに対する遺伝子を欠く親から誘導され、かつバクテリアのE.コリ群に属する。

Description

【発明の詳細な説明】 高いコハク酸産生を有する突然変異E.コリ菌株 本発明の契約上の起源 米国政府は、U.S.デパートメントオブエネルギー(Department of Energy)と、 アルゴンヌナショナルラボラトリー(Argonne National Laboratory)を代表する シカゴユニバーシティー(Chicago University)との間の、契約書第W-31-109-ENG -38 号に基づき、本件発明に関する権利を有する。 発明の背景 1. 発明の属する分野 本発明はコハク酸、マレイン酸またはフマール酸を製造する方法に関わり、ま たより詳細には、本発明は大量のコハク酸、マレイン酸およびフマール酸を生産 するバクテリアに関するものである。2. 発明の背景技術 カルボン酸は、多数の化学薬品用の潜在的なプリカーサとしての期待を担って いる。例えば、コハク酸は1,4-ブタンジオール(BDO)、テトラヒドロフランおよ びγ−ブチロラクトン等のプラスチックプリカーサ用の、供給原料として機能で きる。コハク酸から誘導される新規な製品は、一定の発展状態にあり、その最も 顕著なものはポリエステルであり、これはコハク酸とBDO との結合により製造さ れる。一般的に、コハク酸のエステルは、より毒性の高い溶媒と置換でき、しか も全市場価値10億ドルの、数百万ポンドに及ぶ化学薬品のプリカーサとして機能 する、新規な「素(green)」溶媒としての可能性を有する。コハク酸と共に、他の4 -炭素ジカルボン酸、例えばリンゴ酸、およびフマール酸も供給原料としての可 能性をもつ。 再生可能な供給原料からのこれらカルボン酸の製造（この場合には、醗酵過程 を通して）は、再生不能な源から、このような酸を誘導する、よりエネルギー集 約的な方法に取って代わる、一つの方法である。サクシネートは、プロピオネー ト−産生バクテリアによる嫌気性醗酵の中間体であるが、これらの過程は低収率 および低濃度をもたらす。 嫌気性ルーメン細菌、例えばバクテロイデスルミニコラ(Bacteroides ruminic ola)およびバクテロイデスアミロフィルス(Bacteroides amylophilus)もサクシ ネートを生産する。しかしながら、ルーメン生物は、特徴的に醗酵過程において 不安定である。 長い間、ストークス(Stokes)，J.L.，1949,「E.コリの懸濁液によるグルコー スの醗酵(Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli)」， J.Bacteriol.，57:147-158に詳述されているように、酸の混合物がE.コリ醗酵に より製造されることが知られていた。しかしながら、醗酵されたグルコース１モ ル当たり、僅かに1.2 モルの蟻酸、0.1-0.2 モルの乳酸および0.3-0.4 モルのコ ハク酸が生成されるに過ぎない。その結果、醗酵によりカルボン酸を生産する努 力は、所定の生成物に変換できない、比較的大量の成長基質、例えばグルコース の生成をもたらした。 グラスナー(Glassner)等に付与された米国特許第5,143,834 号に概説されてい るように、醗酵過程で使用されている幾つかのバクテリア、例えばA.サクシニシ プロデューセンス(succiniciproducens)は、当然中程度の収率でコハク酸を生成 する。しかしながら、この宿主生物は、多くても１モルの炭水化物を、1.33モル のサクシネートと0.67モルのアセテートとに転化するに過ぎない。該アセテート 同時生成物の生産は、高価なグルコースの1/3 がサクシネートに転化されないこ とを意味する。その上、該A.サクシニシプロデューセンス宿主菌株は、これが高 濃度の塩に対して耐性ではなく、かつまた中程度の生成物濃度によって阻害され る点で、高い浸透圧耐性を示すものではなかった。最後に、A.サクシニシプロデ ューセンスは、偏性嫌気性であるので、この生物を利用する手順を酸素の不在下 で実施する必要がある点で、取扱い上の問題を提示する。該接種物用の培地の調 製も、トリプトファンの添加を必要とし、また４種の異なる溶液の混合をも必要 とし、その溶液の一つは腐食性かつ有害なH₂S を含有する。 経済的に多量のカルボン酸、例えばコハク酸、リンゴ酸およびフマール酸を製 造するための醗酵法に対する、当業界における要求がある。この方法では、低コ ストの栄養物を使用すべきであり、また基質も、高い醗酵速度を達成するために 与えられる。このような方法を実施するためには、浸透圧耐性をもつ、十分に特 徴付けされた、通性バクテリア宿主が必要であり、かくして2:1 までの生成物対 成長基質モル比にて、所定の生成物が生成される。 発明の概要 本発明の目的の一つは、公知技術の上記諸欠点の多くを解消する、4-炭素ジカ ルボン酸を製造するための方法を提供することにある。 本発明のもう一つの目的は、リンゴ酸を１ｌ当たり100gの範囲の濃度で生成す る、通性生物の菌株を提供することにある。本発明の一特徴は、ピルベートをリ ンゴ酸に代謝しないバクテリアと、リンゴ酸酵素遺伝子との組み合わせにある。 本発明の利点の一つは、リンゴ酸の排他的な生産、またはリンゴ酸およびコハク 酸の生産である。 更に別の本発明の目的は、約2:1 のコハク酸対炭水化物食物源比にて、コハク 酸を生成する、通性生物の菌株を提供することにある。この発明の一特徴は、選 別培養技術後に、該菌株が出現することである。この発明の一利点は、親菌株の 時間のかかる遺伝子操作の必要なしに、コハク酸−産生変異体を経済的に生産で きることである。 簡単に言えば、コハク酸産生バクテリアの単離法が提供され、該方法は、ピル ベートを異化する能力を欠いた通性生物を単離する工程、好気性過程において該 生物のバイオマスを増大せしめる工程、該バイオマスを、嫌気性環境下でグルコ ースに富む培地に適用して、ピルベート−異化作用する突然変異体を成長させる 工程、および該突然変異体を単離する工程を含む。 本発明は、また醗酵生成物として、コハク酸、酢酸およびエタノールの混合物 を生成し、ピルベートホルメートリアーゼおよびラクテートデヒドロゲナーゼに 対する遺伝子を欠き、かつバクテリアのE.コリ群に属する、ことを特徴とする突 然変異体をも提供する。図面の簡単な説明 上記のおよびその他の目的並びに利点と共に、本発明は、添付図に示された本 発明の態様の以下の詳細な説明から、最も良く理解することができる。ここで、 第１図は、本発明による、高いコハク酸対酢酸の製造比を示すグラフであり、 および 第２図は、本発明に従って、NZN 111 の、リンゴ酸酵素遺伝子による形質転換 後の、高いコハク酸の生産率を示すグラフである。 発明の詳細な説明 一般的に言えば、本発明者等は、醗酵過程にて、経済的に多量のコハク酸、フ マール酸およびリンゴ酸を生産できるバクテリアを確認する方法を見出した。E. コリ突然変異の詳細 一態様においては、E.コリの新規突然変異株を開発したが、これは大量のコハ ク酸を生産するであろう。この菌株がオルターネイティブフィードストックスプ ログラムオブザU.S.デパートメントオブエネルギー(Alternative Feedstocks Pr ogram of the U.S. Department of Energy)の努力により得られたことから、本 発明者等は、この菌株をAFP 111 と呼んでいる。 上で述べたように、通常嫌気性条件下では、野性型のE.コリは醗酵生成物の混 合物を生成し、コハク酸は少量成分である。しかしながら、AFP 111 を嫌気性条 件下で成育した場合には、主な代謝産物はコハク酸である。AFP 111 は固有の自 然な染色体突然変異を含み、該突然変異はコハク酸、酢酸およびエタノールの混 合物を生成し、コハク酸が主生成物である。グルコースの単位重量当たりのコハ ク酸の重量で表した、最大収率99％がAFP 111 により生成される。AFP 111 の使 用によって、醗酵過程によるコハク酸の製造コストを大幅に減ずることが可能と なった。 嫌気性醗酵は、グルコース等の燃料からエネルギーを得るための最も古典的な 経路である。嫌気性細胞において、これが唯一のエネルギー−生産法である。多 くの通性細胞において、これはグルコースの異化作用における必須の第一段階で あり、これはトリカルボン酸サイクルを介する、該醗酵生成物の好気性酸化を伴 う。 最も広範に利用されている型の醗酵は、末端前生成物として生成されるピルベ ートによる解糖である。このピルベートの処理は、どの遺伝子が該生物中に存在 するかに依存する。ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の存在下で、解糖は、ピル ベートがNADH+H⁺を介してラクテートに還元された際に終了する。ピルベートデ ヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの存在下で、エタノールが形 成される。ピルベートホルメートリアーゼの存在下で、醗酵は、アセテート、エ タノール、およびホルメートの生成、または水素＋二酸化炭素の生成により終了 する。 バクテリアゲノム中の突然変異または複数の突然変異が、ピルベートの該異化 作用を司る当該生物における遺伝子を排除すると、ピルベートが蓄積されるであ ろう。E.コリを嫌気性成長させる場合、これらの遺伝子は、ピルベートホルメー トリアーゼ(pfl)およびラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)である。研究者にとっ て、Dr．デービッドクラーク(David Clark),サザンイリノイユニバーシティー(S outhern Illinois University)，IL州カーボンデールから、広範に入手できるE. コリ菌株NZN111は、両遺伝子内に突然変異を含み、そのためpfl およびldh 両者 は、該E.コリの染色体DNA 配列における変更のために不活性化されている。それ 故に、NZN 111 は醗酵を伴う成長を行い得ない。突然変異誘発の詳細 驚いたことにまた予想外のことに、本発明者等は、選別培養中にあるいはプラ スミド形質転換により自然に生じる、NZN 111 に対する付随的な変化が、最終的 に主生成物としてコハク酸を生産する、AFP 111 の出現をもたらすことを見出し た。 AFP 111-型の特徴に導く、NZN 111 に対する自然の染色体突然変異は、選別環 境を連続的培養技術を利用した場合に発生する。第一段階において、NZN 111 バ イオマスは富化(rich)培地、例えばルリアベルタイニ(Luria Bertaini：LB)ブロ ス(0.5％酵母抽出液、1%トリプトンおよび1%NaCl,pH 7.5)上で、嫌気的に増大さ れる。1 ml当たり約10⁹〜10¹⁰細胞の範囲の収率が望ましい。インキュベーショ ン期間は変更できるが、成長期間5-7 時間、37℃および標準的な圧力条件が、上 記の濃度を与える。 第二段階として、かくして蓄積されたバイオマスを、グルコースに富んだ嫌気 性条件に付して、ピルベートを異化作用することのできるこれら細胞（突然変異 体）のみの成長を容易にする。具体的には、細胞を、約1〜30グラムパーリッタ ー(g/l)、好ましくは10 g/lのグルコースおよび30マイクログラム(μg)のカナマ イシンを含有する、1.5%寒天平板培地上で展開させる。カナマイシン耐性遺伝子 を、NZN 111 中のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子に挿入する。培養物を、制 御された嫌気性雰囲気内で、37℃にて24時間成育させる。良好な結果を与える一 つの嫌気性雰囲気は、二酸化炭素と水素との混合物であり、これはガスパック(G ASPAK:商標)として、メリーランド州、コッキースビルのベクトン−ディッキン ソン(Becton-Dickinson)社から市販品として入手できる雰囲気制御装置の使用に より与えられた。 このインキュベーション期間はAFP 111 の多数のコロニー（約2/10⁷細胞）を 生成し、またその約半分が液状培地内で成育して、所定の生成物の混合物を与え た。 プラスミド形質転換の例において、NZN 111 を、突然変異体マレートデヒドロ ゲナーゼ酵素に対する遺伝子mdh を含む、プラスミドpMDH13により形質転換した 場合には、ピルベート異化作用が復活して、ラクテートを生成する。この形質転 換体[NZN 111 (pMDH13)]の連続的培養は、自然の染色体突然変異を含むAFP 111 を与える。AFP 111 は醗酵生成物としてコハク酸、酢酸およびエタノールの混合 物を生成し、該成育培地で使用した該グルコースの重量に比して、99％までのコ ハク酸を生成する。pMDH13の発現および形質転換プロトコールは、ベーンケ(Boe rnke)等(1995年９月10日)，Archives of Biochemistry and Biophysics，322, N o.1，pp.43-52 に記載されているものと同様である。この文献を本発明の参考文 献とする。AFP 111 成長の詳細 AFP 111 の取扱いの容易さおよびその後の成育は、当技術の現状である、A.サ クシニシプロデューセンスを使用した場合よりも、該菌株を使用した研究をより 容易にする。例えば、該生物の通性好気性特性を与えた場合には、本発明の成育 法は厳密な嫌気性培養技術の使用を必要としない。この方法は、大量のバイオマ スを生成するのに、高価な成長培地、例えばグルコースおよびトリプトファンの 使用を必要としない。更に、この生物は、その代謝を全く阻害することなく、醗 酵液１ｌ当たり50ｇを越える濃度の有機酸塩の生成を可能とすることから、浸透 圧耐性である。最後に、AFP 111 バクテリアは、またA.サクシニシプロデューセ ンスが利用不可能な、キシロースおよび他のペントース糖上でも成育する。 本明細書に記載する菌株の実験的評価に関連して、細胞は、0.5 〜10 OD₆₀₀の 範囲の細胞密度が達成されるまで、グルコースを含まない成育培地（ルリアブロ ス）中で嫌気的に培養される。 一旦AFP 111 のこの適当なバイオマスに達したら、次に該細胞を封止した醗酵 反応チャンバーに注入し、あるいはそこに移して、該チャンバー内に含ませる。 該ブロスを、グルコースまたは幾つかのその他の適当な炭水化物、例えばキシロ ース、ガラクトースまたはアラビノースと、約10〜30 g/lの範囲で変動する濃度 にて混合する。かくして該チャンバーに添加された混合物を、雰囲気変化に付し て、嫌気性条件を設定する。この雰囲気変化を達成するための一つの手段は、ガ ス発生ステーション(gassing station)によるものであり、かくして周囲空気は 二酸化炭素で置換される。 該混合物を該醗酵反応チャンバーに導入する前に、該チャンバーに、適当量の 緩衝培地、例えばMgCO₃、CaCO₃またはCaMg(CO₃)₂を供給して、ほぼ中性のpHを維 持する。典型的には、適当な緩衝容量を得るために、約４〜８重量％の緩衝培地 を使用する。特に良好な結果は、該緩衝培地が固体として存在して、該醗酵液に 時限放出型緩衝容量を与えた場合に、得られる。 上記の手順は、高い収率でコハク酸を与える。例えば、コハク酸対酢酸の重量 比6:1 が得られ、この場合収率は99％である。該コハク酸対酢酸の比は、約25％ 〜100%の範囲内のH₂濃度で、水素ガスの存在下で実施した場合には、更に増大す る。これらの結果は、当分野の生物の現状とは異なり、本発明の突然変異体AFP 111 は、還元剤として外因性の水素を使用することを示している。例えば、ルリ アブロス、グルコース、緩衝培地、および水素ガスと二酸化炭素(CO₂は該緩衝培 地から放出される)の混合物が存在する場合、第１図に示したように、９に近い コハク酸対酢酸の比が得られる。この結果は、望ましからぬアセテート−生成副 反応を生じることなく、所定の生成物への、グルコースの異化作用を正確に定め る、本発明の方法のもう一つの利点を反映する。 以下の第１表は、元の親（これもサザンイリノイユニバーシティーから入手で きる）、NZN 111 およびAFP 111 に関する、該ジカルボン酸の生成物分布を示す ものである。 100%二酸化炭素雰囲気を使用した場合には、コハク酸産生が増強され、コハク 酸濃度は約45 g/lに達し、生産速度は約1.6g/l／時に達し、コハク酸のｇ数対グ ルコースのｇ数の％収率は99％に達し、かつコハク酸対酢酸の重量比は約６に達 する。 コハク酸は、また該E.コリNAD-依存性リンゴ酸酵素がNZN 111(該遺伝子maeAの 添加および誘導により)生成される場合にも生成される。本例においては、誘導 可能なプラスミドpMEE2-１を使用して、該形質転換体NZN 111(pMEE2-1)内の該リ ンゴ酸酵素遺伝子の発現を可能とする。 E.コリ MC 1061から単離したゲノムDNA を鋳型として使用して、PCR によるリ ンゴ酸酵素遺伝子をクローニングした。このE.コリ MC 1061は、制限エンドヌク レアーゼHind IIIおよびPstIをもつように設計されており、得られた消化物質は 1%TAE アガロースゲル上でサイズ分画した。このリンゴ酸酵素遺伝子を含有する ゲノムDNA フラグメントのサイズは、上記のように、フォトジーヌ核酸検出装置 (PhotoGene Nucleic Acid Detection System; Cat 8192SA)を使用した、サザン ブロット解析を利用して測定した。ビオチン処理したプローブ 調製法の詳細 プライマーは、以下の遺伝子の公開された、部分DNA 配列に基づくものであっ た： センス：CGAAGAACAAGCGGAACGAGCAT アンチセンス：GGCAGCAGGTTCGGCATCTTGTC これらのプライマー１マイクロモル(μM)を、約20ナノグラム(ng)のゲノムDNA と、100 マイクロリットル(μl)の標準的PCR 反応において結合し、該反応は予 想された0.8 キロベース(kb)の該リンゴ酸酵素遺伝子の内部フラグメントを生成 した。該PCR 生成物を、キアックスゲル抽出キット(Qiaex Gel Extraction Kit) (カリフォルニア州、チャッツワースのキアゲン社(Qiagen Inc.))を使用して精 製し、バイオニックラベリング装置(BioNick Labeling System)(メリーランド州 ガイザースバーグのギブコBLR(GibcoBRL)社)を使用してビオチン処理した。この ビオチン処理したPCR 生成物を、Hind IIIおよび幾つかの他の第二のエンドヌク レアーゼの一つにより開裂されている、ゲノムE.コリDNA のサザンブロット解析 におけるプローブとして使用した。このリンゴ酸酵素遺伝子は、Hind IIIおよび PstI消化DNA の2.0-2.5 kbのフラグメントを含む領域に位置することが確認 された。初期リンゴ酸酵素 遺伝子クローニングの詳細 １μｇのE.コリDNA をHind IIIおよびPstIで消化し、分離用1%TAE アガロース ゲル上でサイズ分画した。該2.0-2.5 kb領域における該E.コリDNA フラグメント を単離し、かつキアックスゲル抽出キットを使用して精製した。この精製したDN A フラグメントを、PstIおよびHind IIIにより開裂し、かつシュリンプアルカリ ンホスファターゼで処理したpUC19 のポリリンカー領域に連結した。次いで、こ の連結した物質をPCR 反応用の鋳型として使用して、該リンゴ酸酵素遺伝子全体 を増幅させた。この連結混合物の１μｌを、該リンゴ酸酵素遺伝子をターゲット とする、センスプライマー：GATGCCCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT 1μM および該 連結されたpUC19 DNA をターゲットとするアンチセンスプライマー：TTTTCCCAGT CACGACGTTG 0.25 μM を含有する鋳型として使用した。この増幅におけるパラメ ータは、94℃での変性、55℃で１分間のハイブリダイゼーションおよび72℃で３ 分間の拡張であり、全体で35サイクル実施した。このPCR 生成物を1%TAE-アガロ ースゲル上で分析し、1.8 kbのフラグメントを単離し、該キアックスゲル抽出キ ットを使用して精製した。該PCR 生成物の一部を、Bcl およびBgl で消化して、 この生成物が実際に該リンゴ酸酵素遺伝子を含有することを明らかにした。該PC R 生成物の残部を、PstIおよびNcoIで消化し、ゲル分離し、再精製し、次いでNc oIおよびPstIで開裂されている発現ベクターpTRC99a(ニュージャージー州、ピス カタウエイのファルマーシア(Pharmacia)社)のポリリンカー領域に連結した。E. コリ菌株NZN 111 を標準的方法で、該連結混合物で形質転換し、得られたコロニ ー（実験から得た４種のコロニーおよびコントロールからの２種のコロニー）を 、Xmn(0.7kb，1.4kbおよび3.9kb のフラグメントが予想される)を使用した制限 フラグメント解析によって、該リンゴ酸酵素遺伝子についてスクリーニングした 。このクローニングしたリンゴ酸酵素遺伝子を含有する該プラスミドを、pMEE3 と命名した。交互N-末端 リンゴ酸酵素に関する詳細 NZN(pMEE3)の培養物100 mlを一夜培養で成長させ、該プラスミドをキアックス ゲル抽出キットを使用して単離した。この単離したプラスミドをPCR 反応用の鋳 型として使用した。交互(alternative)N-末端を与えるように、新たなプライマ ーを設計した。ここで、該末端は該リンゴ酸酵素の該第一のクローニングで使用 したプライマーから81塩基対下流側に位置する。プラスミド20ngを、センスプラ イマー：AGGATCCATGGAACCAAAAACAAAAAAC 1μM およびアンチセンスプライマー： CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACを含有する鋳型として使用した。増幅パラメータは、 上記のものと同様であった。該PCR 生成物の一部を、該生成物が該リンゴ酸酵素 遺伝子を含有することを明らかにする、BclIおよびBgl IIを用いた制限マッピン グによって再度明らかにした。このPCR 物質の残部を、PstIおよびNcoIを用いて 消化し、ゲル分離し、再精製し、次いでNcoIおよびPstIで開裂されている発現ベ クターPTrc99aa（ニュージャージー州、ピスカタウエイのファルマーシア社）の ポリリンカー領域に連結した。E.コリ菌株JM 109を標準的方法で、該連結混合物 で形質転換し、得られたコロニー（実験から得た３種のクローンおよびコントロ ールからの２種のクローン）を、制限フラグメント解析により、該所定の挿入断 片についてスクリーニングした。このリンゴ酸酵素遺伝子のこのバージョンを含 有する該プラスミドをpMEE２と命名した。プロモータの最適化 インデューサ条件の詳細 100 μg/mlのアンピシリンを含有する30mlのLBブロスをpMEE２の一夜培養物1. 5 mlで接種した。成長の２時間後に、該培養物30mlを、3-10mlのアリコートに分 割した。酵素活性を、０、100 μM および10μM のイソプロピルチオガラクトシ ド(IPTG)によって誘発させた。２mlのサンプルを、０、１、２、３および４時間 の各時点で、それぞれの培養物から取り出した。タンパクを、標準的な方法に従 って単離し、その活性を上記のようにして測定した。 各時点における酵素産生を以下の第２表に示す。 pMEE２発現の生理的効果を、第２図に示した。NZN 111(pMEE2)およびコントロ ールとしてのNZN 111(pTRC99a)の二重の培養物を、アンピシリンを含有する２ml のLB培地中で好気条件下で成育した。その各々の一方の培養物を10μM のIPTGに よって誘発させた。３時間後に、OD₆₀₀は0.6から4.8に増加した。該培養物１ml を、10mlのLB培地を含有する封止した58mlのバイアルに注入した。該LB培地はグ ルコース20 g/l、アセテート1g/lおよび固形MgCO₃0.5gを含んでいた。ここで使 用した雰囲気は、周囲圧よりも１atm 高い圧力下の、1:1:2 の割合の空気：水素 ：二酸化炭素からなっていた。この培養物を即座に、および100rpmで攪拌しつつ 37℃にてインキュベートした際に所定の時間間隔でサンプリングした。以下の第 ３表は、NZN 111 を原料ベクター(pTRC99a)およびpMEE２で形質転換した場合の 、生成物収率を比較したものである。 第３表に示した結果は、約19〜42時間の範囲内のインキュベーション期間につ いての結果である。ラクトバチルス突然変異体の詳細 本発明者等は、また醗酵を通して、リンゴ酸を高率で生成する方法をも確認し た。リンゴ酸、即ちコハク酸のプリカーサは、原理的に、その製造が一つのより 非還元的工程を必要とすることから、コハク酸よりも良好な最終生成物である。 リンゴ酸製造の理論的な化学量論によれば、グルコース１モルおよび二酸化炭素 ２モルが、２モルのリンゴ酸に転化される。それ故、リンゴ酸の製造が、グルコ ースの無駄なしに起こる。リンゴ酸の脱水生成物であり、還元経路におけるサク シネートのプリカーサであるフマール酸も、生成することができる。同時生成物 の製造なしに、リンゴ酸およびフマール酸両者を形成することができるが、リン ゴ酸の高い溶解度は、大規模生産工程を好ましいものとする。 リンゴ酸酵素の製造を司る遺伝子（例えばmaeA)をもつ適当なバクテリアの形 質転換は、余分にマレートを生成することを可能とした。一般的に、この理想的 なバクテリアは、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性、およびピルベートを代謝す る他の酵素を欠く可能性があり、従ってピルベートの蓄積をもたらす。このバク テリアは、その代わりに直接マレートを生成するように、maeAで形質転換されて いる。生成マレートの高いレベルを維持するために、このバクテリアは、該マレ ートをラクテートに戻し、あるいはフマレートもしくはサクシネートに転化でき る必要はない。幾つかのラクトバチルス菌株が、このような転化を司る、マロラ クテート酵素、フマラーゼおよびフマレートリダクターゼを欠く限り、これらの 菌株は、醗酵過程でマレートを生産するための特に適した候補である。ラクトバ チルスのこの適応性は、更に増強され、極めて高い浸透圧耐性特性を与える。ラ クトバチルスガセリ(Lactobacillus gasseri)は、このような操作に対する短期( near term)宿主である。というのは、これはグルコースの醗酵中にマレートを 代謝しないことが示されており、かつかなり十分な一般的特徴付けがなされてい るからである。ラクトバチルスカセイ(Lactobacillus casei)も、これがL.ガセ リよりも比較的高い浸透圧耐性を示すことから、十分な能力を維持している。 一般的に、適当なラクトバチルス発現ベクター、例えば機能性のラクテートデ ヒドロゲナーゼ遺伝子を欠いたラクトバチルス宿主中に誘発される、pTRK327 中 のリンゴ酸酵素遺伝子（例えば、maeA）は、リンゴ酸の形成を可能とするはずで ある。これは、該リンゴ酸酵素を、該宿主のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子 内に挿入することによって達成できた。 以上本発明を、図示された態様の詳細を参照して説明してきたが、これらの詳 細は、添付した請求の範囲に規定された本発明の範囲を何等限定するものではな い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ストールス ルーシー アメリカ合衆国 イリノイ州 60517 ウ ッドリッジ ネイプルズ レーン 945

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コハク酸産生バクテリアを単離する方法であって、 a) ピルベートを異化作用する能力に欠けた、通性生物を単離し、 b) 好気的方法で、該生物のバイオマスを増大させ、 c) 嫌気性環境内で、該バイオマスをグルコースに富む培地に接種して、ピル ベート−異化作用可能な突然変異体の成長を可能とし、 d) 該突然変異体を単離する、 諸工程を含む、上記方法。 ２．該通性生物が、ピルベートホルメートリアーゼおよびラクテートデヒドロゲ ナーゼ活性を欠く、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．ピルベートを異化作用する能力に欠けた該通性生物が、NZN 111 である、請 求の範囲第１項に記載の方法。 ４．該生物を、ルリアブロス上で好気的に培養する、請求の範囲第１項に記載の 方法。 ５．該バイオマスを、1ml当たり約10⁹〜10¹⁰細胞の範囲まで増大する、請求の範 囲第１項に記載の方法。 ６．該グルコースに富む培地が、約1g/l〜30 g/lの範囲のグルコースを含む、請 求の範囲第１項に記載の方法。 ７．醗酵生成物としてコハク酸、酢酸およびエタノールの混合物を生成し、ピル ベートホルメートリアーゼおよびラクテートデヒドロゲナーゼに対する遺伝子を 欠く親から誘導され、バクテリアのE.コリ群に属することを特徴とする、突然変 異体。 ８．該親がNZN 111 である、請求の範囲第７項に記載の突然変異体。 ９．請求の範囲第７項に記載のAFP 111 。 10．コハク酸が主な醗酵生成物である、請求の範囲第７項記載の突然変異体。 11．コハク酸を生産する生物の創製方法であって、 a) カルボン酸産生生物を、グルコースを欠く培地中に入れて、そのバイオマ スを増大させる工程と、 b) 該増大させたバイオマスを、嫌気性雰囲気下で、グルコースに富む醗酵培 地に接種する工程と、 c) コハク酸産生生物を該バイオマスから単離する工程と、 を含む上記方法。 12．該生物が浸透圧耐性である、請求の範囲第11項記載の方法。 13．該生物が、ピルベートをジカルボン酸に転化することのできる酵素を発現す るように、遺伝子操作されている、請求の範囲第11項記載の方法。 14．該酵素がリンゴ酸酵素である、請求の範囲第13項記載の方法。 15．該生物がラクトバチルスおよびE.コリバクテリアからなる群から選ばれる、 請求の範囲第14項記載の方法。 16．該生物がE.コリバクテリアであり、該バクテリアが、ピルベートホルメート リアーゼおよびラクテートデヒドロゲナーゼに対する遺伝子を欠く親から誘導さ れ、かつ該生成されるカルボン酸が主としてコハク酸である、請求の範囲第15項 記載の方法。 17．該コハク酸の生成を、水素に富む雰囲気内で増強する、請求の範囲第16項記 載の方法。 18．該生物がラクトバチルスバクテリアであり、かつ該生成されるカルボン酸が リンゴ酸である、請求の範囲第15項記載の方法。 19．該生物が、醗酵生成物としてコハク酸、酢酸およびエタノールの混合物を生 成し、ピルベートホルメートリアーゼおよびラクテートデヒドロゲナーゼに対す る遺伝子を欠く親から誘導され、かつバクテリアのE.コリ群に属する、請求の範 囲第11項記載の方法。 20．該グルコースに富む培地中の、該グルコースの濃度が約10〜30 g/lの範囲に ある、請求の範囲第11項記載の方法。