CZ2015586A3 - Sekvence nukleotidů kódující hydrolasy esterů α-aminokyselin a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tyto sekvence - Google Patents

Abstract

Sekvence nukleotidů o velikosti 1911 nebo 1917 nt, kde je pořadí nukleotidů identické s pořadím nukleotidové sekvence kódující hydrolasy esterů .alfa.-aminokyselin z Achromobacter sp. CCM 4824 nebo připravených synteticky, případně ve fragmentech těchto sekvencí o délce nejméně 150 nukleotidů, případně v takových nukleotidových sekvencích připravených synteticky a nesoucích záměny nukleotidů vedoucích ke změnám aminokyselinových zbytků. Sekvence mohou být použity pro tvorbu konstrukce DNA, případně konstruktu opatřeného nejméně jednou regulační sekvencí řídící expresi genu a produkci polypeptidu s aktivitou hydrolasy esterů .alfa.-aminokyselin. Sekvence mohou být součástí rekombinantního expresního vektoru, který se skládá z výše uvedeného konstruktu, promotoru, translačního start signálu, translačního a transkripčního stop signálu. Rekombinantní hostitelské buňky obsahující nukleovou kyselinu nesenou na vektoru nebo integrovanou do chromosomu buňky a kmene Escherichia coli BL21(DE3) obsahujícího řečenou sekvenci nukleotidů kódující hydrolasy esterů .alfa.-aminokyselin nesených na plasmidu pJM1, pJM2 nebo pJM5.

Description

Sekvence nukleotidů kódující hydrolasy esterů α-antinokyselin a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tyto sekvence.

Oblast techniky

Vynález se týká sekvencí DNA kódujících polypeptidy hydrolas esterů a-aminokyselin (AEH) a jejich modifikací, konstruktů rekombinantní DNA a rekombinantních mikroorganismů nesoucích tyto sekvence a jejich využití při biotransformacích β-laktamů.

Dosavadní stav techniky

Enzymy esterhydrolasy a -aminokyselin (AEH, β-lactam acylases, EC 3.1.1.43) jsou enzymy patřící do skupiny α/β hydrolas. Tyto enzymy jsou specifické vůči esterům aminokyselin obsahujících aminoskupinu jako substituent na atomu Ca a katalyzují N-acylaci nukleofilů 7-aminocephemů a 6-aminopenamů těmito estery za tvorby amidické vazby. Díky této specifitě mohou AEH syntetizovat klinicky významná polosyntetická β-laktamová antibiotika (SSAB) jako aminopeniciliny (např. ampicilin) a aminocephalosporiny 1. generace (cephalexin, cefadroxil, cefaloglycin, cephradine) a 2. generace (cefroxadine, cefaclor, cefatrizine, cefprozil; Nys et al. 2000). Syntéza antibiotik, zejména kineticky řízená syntéza (Polderman-Tijmes et al. 2002a, Grulich et al., 2013) z aktivovaného acyldonoru (AD; amid nebo ester α-aminokyseliny) s nukleofilem ( β-lactam nebo H20) probíhá dle schématu:

kde jak AD tak i produkt reakce SSBAB mohou být AEH hydrolyzovány.

Jinou, mnohem více prostudovanou skupinou enzymů schopných syntetizovat SSAB jsou penicilin-G-acylasy (Marešová et al., 2014), serinové N-terminální hydrolasy (penicilinamidasa, PGA; EC 3.5.1.11). Tyto enzymy, na rozdíl od AEH, jsou již k syntézám SSAB využívány v průmyslovém měřítku (např. DSM Antilnfectives, Fermenta Biotech Ltd.). V současné době jsou známy dvě základní skupiny hydrolas AEH. První zahrnuje hydrolasy esterů α-aminokyselin mikrobiálního původu, které katalyzují hydrolýzu nebo syntézu β- laktamových antibiotik. Druhá skupina zahrnuje eukaryotní AEHs - valacyklovirasy (VACVasy), které byly izolovány z krys (rVACVasy; Kurochkina et al., 2013) a člověka (hVACVasa; Kurochkina et al., 2013). Enzymy této skupiny aktivují vznik mnoha klinicky zajímavých prekurzorů léků (Kurochkina et al., 2013; Barends et al., 2006). Výhodou AEH, oproti penicilinacylasam (s pH optimem pro aktivitu v alkalické oblasti) je to, že pH optimum se pohybuje v rozmezí 6,0 - 6,5, ve kterém jsou β-laktamy stabilnější. Teplotní optimum aktivity AEH leží v rozmezí 25 - 45°C. Další výhodu je skutečnost, že aktivitu neinhibuje kyselina fenyloctová, běžná příměs nukleofilů v syntetických reakcích. AEH vyžadují ionizované acyldonory (Barends et al, 2003) a jsou stereospecifické: vyžadují enantiomery acyldonorů D-PGME a D-HPGME (Femandez-Lafiiente et al. 2001). Tab. 1 uvádí syntézy SSBA popsané v odborné literatuře.

Tab. 1 Syntézy β-laktamových antibiotik (SSBA) katalyzované AEH

7-ATTC: 7-amino-3-[(lH/l,2,3-triazol-4-ylthio)methyl]-cephalosporanic acid; (dle Marešová et al., 2014)

Kromě cefatrizinu, všechny SSBA byly rovněž připraveny kineticky řízenými syntézami katalyzovanými PGAs. AEHs byly popsány u 10 přírodních mikroorganismů [Kurochkina et al., 2013] stím, že pouze ve čtyřech případech byly strukturní geny klonovány v Escherichia coli (Kurochkina et al., 2013; Blum and Bommarius 2010; Barends et al., 2006; Polderman_Tijmes et al., 2002; Van der Laan et al., 2002; Sklyarenko et al., 2014) zdonorových mikroorganismů Acetobacter turbidans, Xanthomonas citri, Xanthomonas campestris pv. Campestris a Xanthomonas rubrilineans VKPM B-9915. Preferovaným produktem syntéz je β-laktamové antibiotikum cephalexin (Kato et al. 1980b; Nam et al., 2001; Ryu and Ryu, 1988).

Struktury AEH: Xanthomonas citri PDB 1MPX (Barends et al.2003); Acetobacter turbidans 2B9V (Barends et al., 2006) ukazují, že se funkční protein skládá ze čtyř identických subjednotek (dimer dimerů) jejichž vzájemné interakce vykazují rozdílnou afinitu. Každý z monomerů má 614 aminokyselinových zbytků (69 kDa) a je tvořen třemi strukturně odlišnými doménami: každý monomer je vybaven sekreční sekvencí lokalizující AEH do periplasmatického prostoru výše zmíněných mikroorganismů. Aktivní místo vázající a-aminoskupinu acyldonoru je tvořeno triádou Ser205, Asp338 a His370, což řadí AEHs do enzymové rodiny serinových hydroláz (Polderman-Tijmes et al. 2002b; Barends et al. 2003). Reakční mechanismus AEH a PGA je obdobný, v obou případech vzniká přechodný acyl-enzymový intermediát (Blinkovsky a Markaryan 1993).

Za účelem opakovaného, dlouhodobého využívání AEH při biokatalýze může být enzym stabilizován za vzniku enzymového katalyzátoru. V této podobě enzym vykazuje vyšší pH stabilitu, teplotní stabilitu a delší poločas životnosti za reakčních podmínek kineticky řízených biosyntéz.

Podstata vynálezu Předmět vynálezu se týká AEHs náležejících do první skupiny hydrolas bakteriálního původu. Předmětem předloženého vynálezu jsou také optimalizované sekvence nukleotidů, kde je pořadí nukleotidů nejméně z 95% identické s pořadím nukleotidů v sekvencích č. 1,2 nebo 3. Význakem vynálezu jsou dále fragmenty sekvencí nukleotidů podle předloženého vynálezu, kódující AEH, o délce nejméně 150 nukleotidů. Význakem vynálezu je také konstrukt nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů podle předloženého vynálezu, fragment sekvence nukleotidů podle předloženého vynálezu, nebo jejich modifikace podle předloženého vynálezu opatřené nejméně jednou regulační sekvencí řídící expresi genů a produkci polypeptidů s aktivitou AEH. Význakem vynálezu je také chimémí konstrukt nukleové kyseliny obsahující zkrácenou sekvenci AEH o 66 - 78 nukleotidů, nahraženou sekvencí kódující PelB (sekvence č. 4), OmpA či jiným sekrečním signálem. Význakem vynálezu je i rekombinovaný plazmid obsahující sekvenci nukleotidů podle předloženého vynálezu nebo fragment sekvence podle předloženého vynálezu. Význakem vynálezu je dále rekombinantní expresní vektor složený z konstruktu nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, promotoru, translačního start signálu a translačního a transkripčního stop signálu. Význakem vynálezu je také hostitelská buňka obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu. V této hostitelské buňce může být konstrukt nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu nesen na rekombinantním expresním vektoru, být integrován do genomu buňky nebo být přítomen v obou podobách současně. Význakem vynálezu jsou dále rekombinované plazmidy pJM2 a pJM5, charakterizované vloženou sekvencí nukleotidů podle předloženého vynálezu, izolovanou z kmene Achromobacter sp. CCM 4824 a syntetický chimemí gen aehch , s restrikčními mapami dle sekvencí č.l nebo 2. Význakem vynálezu je také bakteriální hostitel, zejména kmen Escherichia coli BL21(DE3) obsahující sekvenci podle předloženého vynálezu, nesenou plazmidy pJM2 nebo pJM5 a jejich modifikace podle předloženého vynálezu. Pomocí vhodného vektoru mohou být uvedené sekvence vneseny do genomu kvasinkového hostitele, kterého lze následně využít pro produkci AEH ze sekvencí podle předloženého vynálezu integrovaných do kvasinkového chromosomu nebo přítomných extrachromosomálně.

Provedení

Jedním z možných provedení je kmen Escherichia coli BL21(DE3)(pJM2) CCM 8612 nebo BL21(DE3)(pJM5) CCM 8613 obsahující rekombinantní plasmid pJM2 nebo pJM5 připravený na bázi sekvence nukleotidů nově izolovaných nebo syntetizovaných strukturních genů s aktivitou hydrolasy esterů α-aminokyselin. Dále také kmeny nesoucí zmíněné rekombinantní plasmidy se sekvencí nukleotidů modifikovanou mutacemi, insercemi nebo delecemi dle přiloženého vynálezu.

Uvedený plazmid pJM5 je charakterizován vložením fragmentu DNA o velikosti 1911 bp do plazmidového vektoru pET26b, a restrikční mapou znázorněnou na obr. 1. Příprava tohoto plasmidu spočívala v izolaci chromosomální DNA z buněk kmene Achromobacter sp. CCM 4824 (původně Comamonas testosteroni CCM 4824; Plháčková et al., 2003), přípravě rekombinantního mikroorganismu E. coli XLlBlue(pKAMP) nesoucí 4,5 kb fragment chromosomální DNA vykazující fenotyp AEH+, získání sekvence strukturního genu aeh a jeho klonování do pET26b expresního plasmidu. Dále byla uvedeným plasmidem provedena transformace kmene E.coli BL21(DE3) za vzniku AEH+ kmene Escherichia coli BL21 (DE3)(pJM5).

Plasmid pJM2 je charakterizován vložením fragmentu DNA o velikosti 1911 bp do plazmidového vektoru pET26b, a restrikční mapou znázorněnou na obr. 1. Příprava tohoto plasmidu spočívala v navržení syntetického chimémího genu, jeho vložení do vektoru pET26b a provedení místně cílené mutagenizace vybraných aminokyselin. Výsledný plasmid nesoucí mutace S345D, K401Q a N159H byl označen jako pJM2 a byla sním provedena transformace kmene E.coli BL21(DE3) za vzniku AEH+ kmene Escherichia coli BL21 (DE3)(pJM2).

Pro cílené modifikace DNA sekvencí byly využity strukturní i genomické bioinformatické analýzy, specifické změny byly vneseny, verifikovány a analyzovány pomocí nástrojů genového inženýrství za účelem získání konstruktů s vylepšenou expresí a produkcí AEH, umožňující zvýšení efektivity biokatalýzy v nižších teplotách a snadnou purifikaci či imobilizaci. Příprava kompetentních buněk a transformace hostitelských kmenů populací rekombinantníeh plazmidů byla provedena dle Nishimura et al., 1990; Hanahan et al., 1991 a Inoue et al., 1990. Výsledné rekombinantní kmeny Escherichia coli nesoucí plazmidy pJMl, pJM2 a pJM5, produkující hydrolasy esterů α-aminokyselin byly kultivovány v míchaném bioreaktoru. Optimálním postupem je kultivace kmenů na obohaceném minerálním médiu MYEGly doplněném glycerolem jako zdrojem uhlíku a energie. Jednorázová přítokovaná kultivace probíhá po dobu 28 až 40 hodin při teplotě 20 až 28 °C za regulace pH v rozmezí 6,9 až 7,5 a koncentrace rozpuštěného kyslíku v mediu 5 až 30 %. Indukce syntézy enzymu je provedena přidáním laktosy. Přehled obrázků

Obr. 1 Restrikční maparekombinantních plazmidů pJMl, pJM2 apJM5.

Obr. 2 Průběh optické density (OD600) a suché hmotnosti buněk (X) během přítokované kultivace kmene E.c. BL21 (DE3)(pJM5)

Obr. 3 Průběh volumetrické aktivity (VAH) a specifické aktivity (SA) během přítokované kultivace kmene E.c. BL21 (DE3)(pJM5)

Obr. 4 Průběh optické density (ODóoo) a suché hmotnosti buněk (X) během přítokované kultivace kmene E.c. BL21 (DE3)(pJM2)

Obr. 5 Průběh volumetrické aktivity (VAH) a specifické aktivity (SA) během přítokované kultivace kmene E.c. BL21 (DE3)(pJM2) Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Kultivace Achromobacter sp. a izolace chromosomální DNA

Kmen mikroorganismu Achromobacter sp. CCM 4824 (Škrob et al., 2003; Plháčková et al., 2003) byl kultivován v 100 ml LB media (v g/1: trypton 10, kvasnicový extrakt 5, NaCl 5; pH 7,2-7,5) při 30 °C na rotační třepačce Gallenkamp (200 otáček/min) po dobu 24 h. Biomasa z 2 ml kultury byla oddělena od media centrifugací (5000 g), promyta fyziologickým roztokem a uschována při -20 °C. Chromozomální DNA byla izolována pomocí DNeasy Blood & Tissue Kit a Genomic-Tip 100/G (Quiagen, Švýcarsko).

Příklad 2 - Použité technologie rekombinantní DNA Všechny potřebné chemikálie byly získány od firmy Sigma Aldrich (USA) s čistotou pro molekulární biologii (For molecular biology, >99) a vyšší. Všechna štěpení DNA prováděná pomocí restrikčních enzymů (New England Biolabs, NEB, USA) a analýzy štěpených fragmentů nebo získaných PCR reakcemi prováděné v 1% agarosovém gelu gelu (při 80 V, cca 30 - 45 minut) v TAE pufru (40 mM Tris-acetát, 2 mM EDTA, pH 8,0) byly prováděny podle standardních protokolů (J. Sambrook, 1989). Jako standard velikostí byl použit Gene Ruler DNA Ladder Mix (Thermo Scientifíc, USA). PCR reakce byly provedeny v přístroji C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, USA). Používány byly dva rozdílné protokoly. PCR protokol využívající Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, USA) je označen P1 a sestával se z následujících kroků: 1) 98°C 30s; 2) 35 cyklů s kroky 98°C lOs, teplota nasednutí primerů po 30s, 72°C polymerace; 3) 72°C 10 minut 4) ochlazení na 4°C do vyjmutí vzorků. Standardní velikost reakce byla 50 μΐ. Kompozice reakce byla dle základního protokolu výrobce. Druhý protokol využívaný k identifikaci plasmidů s vloženým insertem (tzv. PCR colony) byl označován P2. K tomuto protokolu byla využívána PCR polymeráza OneTaq® DNA Polymerase (NEB, USA) a obecně používané univerzální primery Up2: CGTTGTAAAACGACGGCC a T7 terminátor primer: GCTAGTTATTGCTCAGCGG. Standartní velikost reakce byla 10 μΐ. Protokol PCR reakce se sestával se z následujících kroků: 1) 95°C 3 minuty; 2) 35 cyklů s kroky 95°C lOs, 56°C 30s, 72°C 150 s; 3) 72°C 10 minut 4) ochlazení na 4°C do vyjmutí vzorků.

Produkty PCR reakcí či restrikčních štěpení byly vyřezávány zagarosového gelu a purifikovány pomocí NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up kitu (Nacherey-Nagel, Německo). Ligace byla prováděna T4 DNA ligázou (NEB, USA) v reakčním objemu 30 μΐ přes noc při laboratorní teplotě. Transformace ligačních směsí byla vždy prováděna do buněk Escherichia coli XLl-Blue Supercompetent Cells (Agilent, USA) pomocí teplotního šoku, dle protokolu výrobce. Buňky nesoucí ligované plasmidy byly kultivovány po dobu 16 hodin na pevném kultivačním mediu LB doplněném agarem (L2897, Sigma, USA, 15g/L) doplněného o antibiotikum kanamycin (Km, 50pg/ml) při teplotě 37°C. Mini-prep izolace plasmidů byla prováděna pomocí NucleoSpin® Plasmid (Nacherey-Nagel, Německo). Stanovení či verifikace nukleotidové sekvence DNA byla prováděna na Mikrobiologickém ústavu AV ČR, v.v.i. pomocí BigDye Terminátor v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied biosystems, USA) a byla vyhodnocena pomocí ABI PRISM 3130x1. Získané sekvence byly zpracovávány v programu Lasergene (DNASTAR lne., USA). Příklad 3 - Stanovení nukleotidové sekvence AEH genu z Achromobacíer sp. CCM 4824 a optimalizovaný gen aehJMS pro E.coli

Izolovaná chromosomální DNA kmene Achromobacíer sp. CCM 4824 dle příkladu 1. byla fragmentována restrikčním enzymem Sau3Al. Fragmenty byly ligovány s plasmidovou DNA vektoru pK19 (Pridmore, 1987) štěpeného BamHl a vzniklými konstrukty byl transformován hostitel Escherichia coli TOP 10. Plazmid označený jako pKAMP (Bečka et al., 2004) byl funkčním screeningem identifikován jako AEH+. Pomocí degenerovaného páru primerů specifických pro geny AEH (Tab. 1) byla provedena P PCR reakce (annealing při 40°C), a získán fragment o velikosti 301 nukleotidů (nt) s následující sekvencí: TCCGCCAGGTCAACTTCAACTATTTCGCAATGCAGACCGAGAAGCGCGGCAAGG GTACGCCGCTGCCCAGCCTCGGTTACGACGACCACAGCACCTTCCTGCGCATCGG TTCGGCCGGCGACTACGCGCGCTTCACAGGCGTGGACCAGTTGACCTGGTGGAAG AAGCTGGTCGAGCACCCGGCCTATGACGGCTTCTGGCAGGGCCAGGCGCTGGAT GCGGTGATGGCGAAGACCCCGCTGAAGGTGCCGACCATGTGGCTGCAGGGCCTG TGGGACCAGGAGGACATGTGGGGTGCCAA

Bioinformatickou analýzou již známých celogenomových sekvencích mikroorganismů pomocí Standard Nucleotide Blast flhttp.7/b1ast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM~blastn&PAGE TYPE=BlastSearch&LI NK LOC=blasthomeí byl identifikován 301 nt fragment jako součást genu s 96% homologií z celogenomové sekvence Stenotrophomonas maltophilia R551-3 (ID.: gb|CP001111.1|). Tento gen byl v databázi anotován jako X-Pro dipeptidyl-peptidase (GenBank: CP001111.1). Další homology genů byly anotovány jako CocE/NonD hydrolasy a nebo Glutaryl-7-ACA acylasa. Pro tyto nalezené geny byly hledány další homologní sekvence dostupné v GeneBank. Jejich totální přiřazení-alignment v freeware Mega 6 (http://megasoftware.net/) bylo podkladem pro konstrukci sady degenerovaných primerů (Tab. 1) s jejichž pomocí byly metodou PCR získány další fragmenty chromosomální DNA kmene CCM 4824. Po jejich separaci a izolaci z agarosového gelu (1%) byly fragmenty ligovány do vektoru pGEM-T Easy (Promega, USA) a sekvenovány. Tímto způsobem byla získána celá nt sekvence aeh genu z kmene Achromobacíer sp. CCM 4824, kde 5'a 3'nt sekvence odpovídají navrženým primerům (Tab. 2). Získaná sekvence vykazuje 96% homologii s genem z Síenotrophomonas malíophilia R551-3 (GenBank: CP001111.1).

Syntetický gen optimalizovaný pro expresi v E. coli (sekvence č. 1) byl navržen postupem dle Chung a Lee (2012) a následným využitím software gBlocks® Gene Fragments (Integrated DNA Technologies).

Tab. 1. Degenerované primery

Tab. 2. Specifické primery:

Příklad 4 - Screening homologních genů a návrh chimerního genu aehch (aehJM2) exprimovaného kmenem CCM 8612.

Pro screening homologních genů byly využity sekvence proteinových homologů AEH z bakterií Stenotrophomonas a získané sekvence z Achromobacter sp. CCM 4824. Bylo vytvořeno globální přiřazení v softwaru Mega 6 a navrženy degenerované primery na počáteční sekvenci RVR/QAVAVA primer: CGTGTGMRNGCCGTTGCTGTTGCCG a na koncovou sekvenci IE/SLPVY primer: TCAATACACCGGCAGDVNGAT. Rod Stenotrophomonas je typickým půdním mikroorganismem. Z tohoto důvodu byly navržené primery pomocí colony PCR přímo aplikovány na eDNA obohaceného půdního mikrobiomu. Pomocí PCR reakce P1 s teplotou anealingu 35°C a délkou polymerace 2 minuty byly hledány specifické produkty odpovídající svou velikostí genům AEH (cca 1900 nt). Fragment o žádané velikosti byl separován elektroforeticky a purifikován. Pro zvýšení výtěžku a ověření specifického nasedání primerů byl tento produkt využit jako templát pro další PCR P1, tzv. Nested PCR reakci s teplotou anealingu 64°C a délkou polymerace 70 s. Získaný produkt byl analogicky protokolu v příkladu 3 ligován do pGEM-T easy. Vybrané plasmidy pGEM-T easy s insertem byly sekvenovány. Dále byly analogickým postupem aplikovány degenerované primery v Tab. č. 1. a získané fragmenty byly sekvenovány. Tímto postupem byly získány nukleotidové sekvence odpovídající fragmentům či celému genu AEH.

Syntetický chimemí gen optimalizovaný pro expresi v E. coli byl navržen postupem dle Chung a Lee (2012) a následným využitím software gBlocks® Gene Fragments (Integrated DNA Technologies). Pro navržení genu byly využity sekvence č. 1 (aehJM5), a další sekvence získané z GeneBank proteinových homologů s identitou >95% nebo sekvence získané screeningem. Navržený gen v sobě kumuluje mutace vyskytující se ve studovaných sekvencích za účelem pozměnění vlastností enzymu. V přiložené sekvenci (sekvence č. 2) je sekvence nesoucí některé mutace, které se ukázaly jako zásadní pro vysokou aktivitu. Vliv vybraných mutací byl studován i jednotlivě - viz příklad 5. Příklad 5 - Cílené modifikace nt sekvencí aeh genů

Nukleotidová sekvence genu z Achromobacter sp. CCM 4824 začíná sekvencí (20 nt) ATGTCCATGCGTGTGCGTGC, u které není možné s určitostí říci, který z přítomných ATG kodonů je startovní. Varianta obsahující celý počátek byla označena jako WT sekvence a zkrácený konstrukt začínající až třetím kodonem byl označen jako ΗΔ3. Postup klonování a použité primery jsou popsány v příkladu 6. Obě varianty byly klonovány a byla stanovena jejich aktivita. Konstrukt označený jako WT vykazoval 0 - 20% aktivity v porovnání s konstruktem ΗΔ3.

Pomocí freeware dostupných nástrojů jako například PrediSi (http://www.predisi.de) a hmotnostní spektrometrie MALDI (4800 Plus MALDI TOF/TOF analyzer (AB Sciex) bylo nalezeno, že námi izolovaný protein začíná sekvencí PPMTPDI. Tento fakt umožnil vytvoření variant nukleové kyseliny s vyměněnou signální sekvencí za sekvenci z E. coli. Použit byl

PelB leader a klonování do pET26b pomocí Ncol. Výsledný plasmid při expresi za identických podmínek vykazuje 90- 120 % aktivity v porovnání s původní signální sekvencí.

Navržený syntetický chimémí gen aehJM2 (sekvence č. 2) byl dále modifikován tak, aby docházelo k vybraným záměnám aminokyselinových zbytků. Jako zásadní pro vlastnosti enzymu se ukázaly pozice (značení v proteinu): S345D, K401Q a N159H (již v sekvenci č. 2). Mutace K401Q je zásadní pro správné skládání proteinu a vysokou aktivitu AEHJM2. Varianta enzymu např. s dvojicí mutací S345D a N159H vykazuje pouze residuální aktivitu 5 % a vysokou tvorbu inkluzních tělísek (90 %). Dále bylo zjištěno, že mutace L275M, S301T, D321S zvyšují aktivitu enzymu při nižší teplotě (25-28°C). Protein nesoucí tyto mutace byl označen jako JMI a jeho sekvence je označena jako sekvence č. 3. Efekt zvýšení aktivity za nižších teplot lze dále zvyšovat mutacemi: K43R, L536I, K588R. Tyto mutace však současně podstatné redukují stabilitu enzymu. Všechny uvedené mutace byly provedeny pomocí QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent, USA) dle protokolu výrobce. Všechny primery použité v mutagenezi a sekvenaci (Sfl a Sf2) jsou uvedeny v Tab. č. 3.

Za účelem usnadnění izolace a umožnění jednoduché imobilizace, byly vytvářeny konstrukty opatřené purifikační kotvou (His, Střep či Arg tágy) - viz příklad 6. Jak bylo zjištěno, modifikace C nebo N konce studovaných proteinů vede k dramatické redukci aktivity enzymu. Tomuto problému se lze vyvarovat insercí zmíněných sekvencí do námi nalezených peptidových smyček na povrchu proteinu. Sekvence těchto smyček v proteinu AEHJM2 je SCEKACAANS a FQAPAAGEGDF, respektive QGWPRSCEKACAANS a LRAGGKLAFQAPAAGEGD. Do první ze zmíněných smyček byla inzertována sekvence hexahistidinové kotvy SCEHHHPHHHACAANS vedoucí k zachování 73 ± 8 % aktivity. Potřebné primery (QuikChange®) jsou uvedeny v Tab. č. 3.

Tab.č. 3 Specifické primery použité pro přípravu a sekvenaci chimerního genu

Příklad 6 - Konstrukce vysokoprodukčního expresních systémů E. coli CCM 8613 a CCM 8612

Sekvence č. 1 (aehJM5) byla vyštěpena z vektoru pGEM-T easy pomocí restrikčních enzymů EcoRI a Ndel (NEB, USA). Syntetický aehJM2 gen nesoucí restrikční místa pro Ndel a Xhol byl rozpuštěn v 30 μΐ TE pufru. 15 μΐ bylo přímo štěpeno restrikčními enzymy Ndel a Xhol, odpovídající fragmenty DNA byly separovány elektroforeticky, přečištěny a ligo vány do štěpeného vektoru pET26b. Celou ligační směsí (30 μΐ) bylo transformováno 200 μΐ kompetentních buněk XL-lBlue. Po 24h inkubace buněk v 37°C byla ověřena inserce fragmentu odpovídající danému genu do pET26b vektoru pomocí colony PCR. Verifikovaným klonem byla zaočkována kultura pro provedení mini-prep izolace NucleoSpin® Plasmid (Nacherey-Nagel, Německo). Získanou plasmidovou DNA byly transformovány expresní buňky E.coli BL21(DE3).

Pro získání vysokoprodukčního expresního systému byly připraveny také další konstrukty založené na pET plasmidech. Přehled primerů použitých při přípravě těchto konstruktů je ukázán v tabulce č. 4 a jednotlivé konstrukty jsou přehledně ukázány vTab. č. 5.

Tab. č. 4 Primery pro přípravu expresních vektorů

• · ***

Tab. č. 5 - Přehled konstruktů všech získaných genů

Rekombinantní plasmidy pAl, pCl a pS2 jsou v patentu označovány pJM5, pJM2 a pJMl, respektive. Tyto plasmidy zajišťují nejvyšší stabilní specifickou aktivitu v hostiteli E. coli BL21 (DE3). Varianty pA4, pC3, pS3 se záměnou signálního peptidu vykazují 90 - 120 % aktivity a jejich výsledný proteinový produkt vykazuje identickou intaktní hmotnost (MS MALDI). Příklad 7 - Optimalizace kultivační teploty pro syntézu rozpustného proteinu AEHJM1

Buňky E. coli BL21(DE3) s plasmidem pJMl byly kultivovány při různých teplotách za účelem nalezení optimálních expresních podmínek s minimálním vznikem inkluzních tělísek. Buňky byly pěstovány v 37°C do optické density ODóoo = 0,4 a následně byla změněna teplota kultivace na požadovanou hodnotu. Při změněné teplotě a po dosažení ODóoo kultury 0,6 -0,8, byla indukována exprese pomocí lmM IPTG. Buňky byly sklizeny po dosažení maximální hodnoty OD a byla získána cytosolámí a nerospustná frakce rozbitím 10 % (W/W) buněčné suspenze v 50mM fosfátovém pufru (5 ml, pH 7,0) 30 cykly sonikace (Sonicator 3000) za podmínek: lOs pulz s amplitudou 2,5 a průměrným výkonem 14 W následovaný 15s chlazením směsi v ledové lázni (0 °C). Rozbitá směs byla ošetřena přídavkem Ιμΐ Benzonase®Nuclease (250 U/μΙ, Sigma, inkubace 10 minut na ledu) a centrifugována (Beckman Avanti J-30I, 40 000 g, 30 min., 2-8 °C).

Sedimentovaný pelet po centrifugaci byl mechanicky resuspendován v 5 ml roztoku: 50 mM Na2P04, 8M močovina, pH 8,0. Přítomnost rozpustného enzymu a inkluzních tělísek v rozpustné a nerozpustné frakci, respektive, bylo provedeno standadní Tris-glycinovou 10% PAGE v prostředí SDS a redukčního činidla β-mercaptoethanolu. Procentuální zastoupení proteinů obarvených CBB bylo odhadnuto metodou analýzy obrazu. Jako standard molekulových hmotností byl použit Precision Plus Protein™ All Blue Standard (Bio-Rad). Výsledky uvádí Tab. č. 6.

Tab. č. 6 Vliv kultivační teploty na syntézu aktivní AEH JMI kulturou E. coli BL21(DE3) (pJMl)

Příklad 8 - Příbuznost získaných genů s již známými geny pro ΑΈΗ Příbuznost AA sekvencí proteinů AEHJM5 a AEHJM2 a nt sekvencí č. 1 a 2 se sekvencemi AEH a kódujících strukturních genů z mikroorganismů A. turbidans (Uniprot Q8VRK8) a X. citri (Uniprot Q6YBS3) uvádí Tab. 7.

Tab. 7 Srovnání sekvencí aminokyselin v proteinech a nukleotidů v strukturních genech

Wt sekvence: původní úplná sekvence č.l se dvěma ATG kodony Příklad 9 Exprese aehJMS v Escherichia coli BL21 (DE3)(pJM5) Příprava glycerinové konzervy

Narostlá kultura na LBKm mediu byla smíchána s40% TRIS glycerolem v poměru 1:1 a uchovávána v -70 °C. Příprava inokula pro kultivace

Glycerinová konzerva byla vyočkována na Petriho misku s LBKm mediem a kultivována 48h při 28 °C. Narostlá kultura byla použita pro inokulaci 100 mL LBKm media. Po 8h kultivace při 28 °C na orbitálním třepacím stroji při 200 otáěkách/min (Inokulum 1, ODóoo 3,0 - 5,0, pH 6,8 - 7,2) bylo zaočkováno 100 mL MYEGly media (Tab.č. 7). Kultivace byla vedena za stejných podmínek jako Inokulum 1 po dobu 17 - 19h (Inokulum 2, OD6oo 8,0 - 14,0, pH 6,8 -7,2).

Kultivace v bioreaktoru

Kmen E. coli BL21 (DE3)(pJM5) byl kultivován v míchaném bioreaktoru Biostat MD (B. Braun Biotech Intl., Melsungen, Německo). Přítokovaná kultivace probíhala za definovaných podmínek (počáteční pracovní objem 6,0 L, vzdušnění 6 - 8 L vzduchu/min, počáteční frekvence míchání 300 otáček/min při teplotě v rozmezí 20 až 28 °C, počáteční pH 6,9 - 7,5) v mediu MYEGly (Tab. č. 7). pH media bylo udržováno v rozmezí 6,9 až 7,3 a koncentrace rozpuštěného kyslíku (p02) byla automaticky udržována změnou frekvence míchání od 300 do 840 otáček/min v rozmezí 5 až 30 % hodnoty maximálního nasycení media kyslíkem. Přítokování 40 % glycerolem bylo vedeno při konstantním míchání v rozmezí 5 až 30 % hodnoty maximálního nasycení media kyslíkem. Po dosažení ODeoo 50 - 60 byla provedena indukce syntézy enzymu 10 % laktózou. Kultivace probíhala po dobu 28 až 40 hodin. V průběhu kultivace byly sledovány následující parametry: koncentrace biomasy (ODeoo, suchá hmotnost buněk - cdw), volumetrická aktivita (VAH) a specifická aktivita (SAH) AEH (Obr. 2 a 3).

Stanovení aktivity AEH

Pro stanovení aktivity enzymu byly z kultivace po indukci odebírány vzorky kultury o objemu 4 mL. Biomasa byla oddělena centrifiigací, promyta 4 mL 0,1 M fosfátového pufru (pH 7,0), oddělena centrifugací a uchovávána v -20 °C. Rozmražená biomasa byla resuspendována v 0,1 M fosfátovém pufru (pH 7,0) a po rozbití buněk sonikací nebo French pressem byla stanovena hydrolytická aktivita AEH spektrofotometricky při 30 °C sampicilinem jako substrátem. Aktivity enzymu v průběhu kultivace jsou uvedeny po sonikaci buněčné suspenze. Koncentrace biomasy pro určení konečných kultivačních parametrů je použita jako suchá hmotnost v g (cdw).

Stanovené parametry na konci kultivace: • koncentrace biomasy 27 - 29 g cdw/1 kultivačního media • aktivita AEH u buněčné suspenze po sonikaci buněk: volumetrická aktivita (VAH) 110 000 - 165 000 U/l kultivačního média specifická aktivita (SAH) 3 800 - 6 000 U/g cdw • aktivita AEH u buněčné suspenze po použití French pressu : volumetrická aktivita (VAH) 80 000 - 105 000 U/l kultivačního média specifická aktivita (SAH) 2 800 - 3 600 U/g cdw

Tab. 7 Komponenty kultivačního media MYEGly

Příklad 10: Exprese aehJMl v Escherichia coli BL21 (DE3)(pJMl) Příprava glycerinové konzervy, inokula, způsob vedení přítokované kultivace a stanovení aktivity enzymu byly provedeny jako v příkladu 9. Složení kultivačního media viz Tab. 7

Stanovené parametry na konci kultivace: • koncentrace biomasy 25 - 28 g cdw/1 kultivačního media • aktivita AEH u buněčné suspenze po sonikaci buněk: volumetrická aktivita (VAH) 60 000 - 120 000 U/l kultivačního média specifická aktivita (SAH) 2 400- 4 300 U/g cdw • aktivita AEH u buněčné suspenze buněk po French pressu: volumetrická aktivita (VAH) 33 000 - 65 000 U/l kultivačního média specifická aktivita (SAH) 1 300 - 2 300 U/g cdw Příklad 11: Exprese aehJM2 v Escherichia coli BL21 (DE3)(pJM2) Příprava glycerinové konzervy, inokula, způsob vedení přítokované kultivace a stanovení aktivity enzymu byly provedeny jako v příkladu 9. Složení kultivačního media uvádí Tab. 7. Aktivity enzymu v průběhu kultivace jsou uvedeny u buněk po sonikaci buněčné suspenze. V průběhu kultivace byly sledovány následující parametry: koncentrace biomasy (ODeoo, suchá hmotnost buněk - cdw), volumetrická aktivita (VAH) a specifická aktivita (SAH) AEH (Obr. 4 a 5).

Stanovené parametry na konci kultivace: • koncentrace biomasy 26 - 32 g cdw/1 kultivačního media • aktivita AEH u buněčné suspenze po sonikaci buněk: volumetrická aktivita (VAH) 65 000 - 150 000 U/l kultivačního média specifická aktivita (SAH) 2 500 - 4 700 U/g cdw • aktivita AEH u buněčné suspenze buněk po French pressu: volumetrická aktivita (VAH) 36 800 - 84 600 U/l kultivačního média specifická aktivita (SAH) 1 500 - 3 600 U/g cdw

Průmyslová využitelnost

Rekombinované kmeny mikroorganismů obsahující sekvenci nukleotidů podle vynálezu lze využít k produkci AEH pro různé aplikace v chemickém a farmaceutickém průmyslu.

Průmyslová využitelnost

Rekombinantní kmeny mikroorganismů obsahující sekvenci nukleotidů podle vynálezu lze využít k produkci AEH pro různé aplikace v chemickém a farmaceutickém průmyslu.

Literatura

Barends TRM, Polderman-Tijmes JJ, Jekel PA, Hensgens CMH, de Vries EJ, Janssen DB, Dijkstra BW (2003) The sequence and crystal structure of the alpha-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas citri define a new family of beta-lactam antibiotic acylases. J Biol. Chem. 278:23076-23084

Barends TRM, Polderman-Tijmes JJ, Jekel PA, Williams C, Wybenga G, Janssen DB, Dijkstra BW (2006) Acetobacter turbidans α-amino acid ester hydrolase: How a single mutation improves an antibiotic-producing enzyme. J Biol. Chem. 281:5804-5810

Bečka S., Hollerová L. Plháčková K., Štěpánek V. Kyslík P (2004) Ampicillin acylase (a-amino acid ester hydrolase) from Achromobacter sp. CCM 4824. 23. kongres CSSM, Book of abstracts p.130, Brno

Blinkovsky AM, Markaryan AN (1993) Synthesis of β-lactam antibiotics containing a-aminophenylacetyl group in the acyl moiety catalyzed by d(-)-phenylglycyl-p-lactamide amidohydrolase. Enzyme Microbial. Technol. 15:965-73

Blum JK, Bommarius AS (2010) Amino ester hydrolase from Xanthomonas campestris pv. campestris, ATCC 33913 for enzymatic synthesis of ampicillin. J Mol. Catal. B-Enzymatic 67:21-28

Chung BK, Lee D (2012) Computational codon optimization of synthetic gene for protein expression. BMC Syst. Biol. 6:134 DSM internet site: www.dsm.com/en_US/cworld/pub-lic/home/pages/home.jsp

Femandez-Lafuente R, Hemandez-Justiz O, Mateo C, Terrini M, Alonso J, Garcia-Lopez JL, Mořeno MA, Guisán JM (2001) Stabilization of a tetrameric enzyme (α-amino acid ester hydrolase from Acetobacter turbidans) enables a very improved performance of ampicillin synthesis. J Mo.l Catal. B- Enzymatic 11:633-638

Grulich M, Štěpánek V, Kyslík P (2013) Perspectives and industrial potential of PGA selectivity and promiscuity. Biotech. Adv. 31:1458-147

Hanahan D, Jessee J, Bloom FR (1991) Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 204:63—113

Inoue H, Nojima H, Okayama H (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28

Kato K, Kawahara K, Takahashi T, Kakinuma A (1980a) Studies on alpha-amino-acid ester hydrolase of Xanthomonas-citri. 1. Purification of alpha-amino-acid ester hydrolase from Xanthomonas-citri. Agric. Biol. Chem. 44: 1069-1074

Kato K, Kawahara K, Takahash, T, Kakinum, A (1980b) Substráte specificity of alpha-amino acid hydrolase from Xanthomonas citri. Agric. Biol. Chem. 44:1075-1081.

Kurochkina VB, Sklyarenko AV, Berezina OV, Yarotsky SV (2013) Alpha Amino Acid Ester Hydrolases: Properties and Applications. Appl. Biochem. Microbiol. 49: 672-694

Marešová H, Plačková M, Grulich M, Kyslík P (2014) Current statě and perspectives of penicillin G acylase-based biocatalyses. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98:2867-2879

Nam DH, Ryu YW, Ryu DDY (2001) pH controlled synthesis of cephalexin by purified

Acetobactor turbidans ampicillin acylase. J Microbiol. Biotechnol. 11: 329-332

Nishimura A, Morita M, Nishimura Y, Sugino Y (1990) A rapid and highly efficient method for preparation of competent Escherichia coli cells. Nucleic Acids Research 18(20):6169.

Nys PS, Kurochkina VB, Sklyarenko AV, Veinberg GA (2000). Betalactam compounds. Interrlation on structure and biological activity, Anibiotiki i chimioterapiya 45(11):36-42.

Pan J, Wang L, Li D, Ye L (2013) Synthesis of cefatrizine by recombinant α-amino acid ester hydrolase. Chin. J Biotech. 29:501—509

Plháčková K, Bečka S, Škrob F, Kyslík P (2003) Isolation and characterization of a new strain of Achromobacter sp with β-lactam antibiotic acylase activity, Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 507-516

Polderman-Tijmes JJ, Jeckel PA, de Vries EJ, van Merode AE, Floris R, van der Laan JM, Sonke T, Janssen DB (2002a) Cloning, sequence analysis, and expression in Escherichia coli of the gene encoding an α-amino acid ester hydrolase from Acetobacter turbidans. Appl. Eviron. Microbiol. 68:211-8

Polderman-Tijmes JJ, Jeckel PA, Jeronimus-Stratingh CM, Bruins AP, van der Laan JM, Sonke T, Janssen DB (2002b) Identification of the catalytic residues of a-amino acid ester hydrolase from Acetobacter turbidans by labeling and site-directed mutagenesis. J Biol. Chem. 277:29474-82

Pridmore RD (1987) New and versatile cloning vectors with kanamycinresistance markér.

Gene 56:309-312

Ryu YW, Ryu DDY (1988) Semisynthetic β-lactam antibiotic synthesizing enzyme from

Acetobacter turbidans: catalytic properties. Enzyme Microb. Technol. 10(4): 239-245

Sklyarenko AV, Berezina OV, Satarova DE, Fedorchuk VV, Fedorchuk EA, Savin SS, Yarotsky SV, Tishkov VI (2014) Recombinant Alpha-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas rubrilineans VKPM B 9915 is a highly efficient biocatalyst of cephalexin synthesis. Moscow University Chemistry Bulletin, 69: 62-67

Sugihara A, Shimada Y, Sugihara S, Nagao T, Watanabe Y, Tominaga Y (2001) A novel alpha-amino-acid esterase from Bacillus mycoides capable of forming peptides of DD-and DL-configurations. J Biochem. 130:119-126 v w Škrob F, Bečka S, Plháčková K, Fotopulosová V, Kyslík P (2003) Novel penicillin G acylase from Achromobacter sp.CCM 4824. Enzyme Microbiol. Technol. 32:738-744

Takahashi T, Yamazaki Y, Kato K, Isono M (1972) Enzymatic synthesis of cephalosporins. J Amer. Chem. Soc. 94:4035-4037

Takahashi T, Yamazaki Y, Kato K (1974) Substráte specificky of an α-amino acid ester hydrolase produced by Acetobacter turbidans ATCC 9325. Biochem J 137:497-503

Van der Laan J_M, Polderman Tijmes JJ, and Barends TRM (2002) WO Patent 02086111

Wang L, Ye LJ, Pan Y, Cao Y (2012) Two plate-based colorimetric assays for screening a-amino acid ester hydrolase with high synthesis/hydrolysis ratio. Enz. Microb. Technol. 51:107-112

Ye LY, Wang L, Pan Y, Cao Y (2012) Changing the specificky of α-amino acid ester hydrolase toward para-hydroxyl cephalosporins synthesis by side-directed saturation mutagenesis, Biotechnol. Lett. 34:1719-1724 SEZNAM SEKVENCÍ <110> Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i.

<120 Sekvence nukleotidů kódující hydrolasy esterů α-aminokyselin a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tyto sekvence <1604 <210 1 <211> 1917 <212> DNA <213> Achromobacter sp. CCM 4824 <223> Initiation codon highlited <400 1 10 20 30 40 50 60

ATGTCC^ŤGC GTGTGCGTGC CGTTGCTGTT GCCATCGCCC TTTGCCTGTC CAGCACCGTG *70 80 90 100 110 120

CTGGCCGCCG AAACCCCGCC GATGACCCCG GACATCAGCG GCAAGCCCTT CGTTGCCCCC 130 140 150 160 170 180

GATGTCGGTC GTGACTACGA CAAGCGCGTG GTGATGGTTC CGATGCGTGA TGGCACCCGT 190 200 210 220 230 240

CTGTATACCG TTATTGTTGT TCCGAAAGGT GCACGTAATG CACCGATTCT GCTGACCCGT 250 260 270 280 290 300

ACCCCGTATG ATGCAGCAGG TCGTGCAAGC CGTAGCGATA GTCCGCGTAT GCGTGATCTG 310 320 330 340 350 360

CTGCCGCAGG GTGATGAAGT TTTTGTTGAT GGTGGTTATA TTCGCGTGTT TCAGGATATT 370 380 390 400 410 420

CGTGGTAAAT ATGGTAGCGA AGGTGATTAT GTTATGACCC GTCCGCTGCG TGGTCCGCTG 430 440 450 460 470 480

AATAATACCA AAGTTGATCA TAGCACCGAT GCCTGGGATA CCATTGATTG GCTGGTTAAA 490 500 510 520 530 540

AATGTTCCGG AAAGCAATGG TAAAGTTGGT ATGCTGGGTA GCAGCTATGA AGGTTTTACC 550 560 570 580 590 600

GTTGTTATGG CACTGACCGA TCCGCATCCG GCACTGAAAG TTGCAGCACC GCAGAGCCCG 610 620 630 640 650 660

ATGGTTGATG GTTGGATGGG TGATGACTGG CTGAATTATG GTGCATTTCG TCAGGTGAAC 670 680 690 700 710 720

TTTAACTATT TTGCAATGCA GACCGAGAAA CGCGGTAAAG GTACACCGCT GCCGAGCCTG 730 740 750 760 770 780

GGTTATGATG ATTATAGCAC CTTTCTGCGT ATTGGTAGTG CAGGCGATTA TGCACGTTTT 790 800 810 820 830 840

ACCGGTGTGG ATCAGCTGAC CTGGTGGAAA AAACTGGTTG AACATCCTGC CTATGATGGT 850 860 870 880 890 900

TTTTGGCAGG GTCAGGCACT GGATGCAGTT ATGGCAAAAA CACCGCTGAA AGTTCCGACC 910 920 930 940 950 960

CTGTGGCTGC AGGGTCTGTG GGATCAAGAG GATATGTGGG GTGCAAATCA TGCATATCAG 970 980 990 1000 1010 1020

GCAATGGAAG GTCGTGATAG CGGTAATAAT CGTAATTATC TGGTTATGGG TCCGTGGCGT 1030 1040 1050 1060 1070 1080

CATAGCCAGG TGAATTATAG CGGTAGCGAA CTGGGTGCAC TGAAATTTGA TGGTGATACC 1090 1100 1110 1120 1130 1140

GCACTGCAGT TTCGTCGTGA TGTTCTGAAA CCGTTTTTTG ATCAGTATCT GGTGGATGGT 1150 1160 1170 1180 1190 1200

GCACCGAAAG CAGATACCCC TCCGGTTCTG ATTTATAACA CCGGTGAAAA TCATTGGGAT 1210 1220 1230 1240 1250 1260

CGTCTGAAAG GTTGGCCTCG TAGCTGTGAT AAAGGTTGTG CAGCAAGCAG CAAACCGCTG 1270 1280 1290 1300 1310 1320

TATCTGCGTG CCGGTGGTAA ACTGGCATTT CAGGCACCGG CAGCGGGTGA AGGCGATTTT 1330 1340 1350 1360 1370 1380

GAAGAATATG TTAGCGATCC GGCAAAACCG GTTCCGTTTG TTCCGCGTCC GGTTCGTTTT 1390 1400 1410 1420 1430 1440

GGTGATCGTG ATATGTGGAC CACCTGGCTG GTGAAAGATC AGCGTTTTGT GGATGGTCGT 1450 1460 1470 1480 1490 1500

CCGGATGTGC TGACCTTTAT TACCGAACCG CTGACCGCAC CGCTGCGCAT TGGTGGCGCA 1510 1520 1530 1540 1550 1560

CCGGTTGTTC ATCTGCAGGC AAGCACCAGC GGCACCGATA GCGATTGGGT TGTTAAACTG 1570 1580 1590 1600 1610 1620

ATTGATGTGT ATCCGGATCA AGAAGCACTG ACACCGGAAA TGGGTGGTTA TGAACTGCCG 1630 1640 1650 1660 1670 1680

GTTAGCCTGG CAATTTTTCG TGGTCGTTAT CGTGAAAGCT TTAGTGATCC GAAACCGCTG 1690 1700 1710 1720 1730 1740

GCAGCAAATC AGGTTCTGCC GTATCGTTTT GATCTGCCGA ATGCCAATCA TACGTTTCAG 1750 1760 1770 1780 1790 1800

AAAGGTCATC GTGTTATGGT TCAGGTTCAG AGCAGCCTGT TTCCGCTGTA TGATCGTAAT 1810 1820 1830 1840 1850 1860

CCGCAGACCT ATGTTCCGAA CATTTATCTG GCCAAACCGG GTGATTACCA GAAGGCCACG 1870 1880 1890 1900 1910

CAGCGGGTCT GGCACAGCGC GGCGCAGGCC AGTTACATCG ATCTGCCGGT GTATTGA

<210 2 <211> 1911 <212> DNA <213> designed, synthetic gene <223> Initiation codon highlited <400 2 10 20 30 40 50 60

AfGCGTGTGC GTGCCGTTGC TGTTGCCGTA GCCCTGAGCC TGTCCAGCAC CGTGCTGGCG 70 80 90 100 110 120

GCCGAAACGC CGCCGATGAC CCCGGACATC AGCGGAAAAC CCTTCGTCGC TCCCGATGTG 130 140 150 160 170 180

GGCCGCGACT ACGACAAGCG CGTGGTGATG GTGCCGATGC GCGATGGGAC GCGCCTGTAT 190 200 210 220 230 240

ACAGTGATTG TTGTGCCGAA GGGCGCGCAT AATGCGCCTA TCCTTCTGAC ACGCACTCCG 250 260 270 280 290 300

TATGATGCAG CAGGACGCGC CAGTCGCTCG GACTCCCCCC GCATGCGCGA CCTCTTGCCG 310 320 330 340 350 360

CAAGGGGATG AGGTTTTCGT TGACGGCGGC TATATTCGTG TCTTTCAGGA TATCCGCGGC 370 380 390 400 410 420

AAATATGGTT CTGAAGGCGA TTACGTGATG ACTCGTCCGC TTCGTGGGCC GCTCAATGGT 430 440 450 460 470 480

ACGAAAGTCG ATCATTCGAC CGACGCGTGG GATACCATCG ACTGGTTGGT GAAACATGTT 490 500 510 520 530 540

CCTGAAACGA ATGGCAAAGT TGGTATGCTG GGCTCATCCT ACGAAGGTTT CACCGTTGTG 550 560 570 580 590 600

ATGGCACTGA CGGATCCGCA CCCGGCACTG AAAGTTGCGG CACCACAGTC GCCGATGGTC 610 620 630 640 650 660

GACGGCTGGA TGGGTGATGA TTGGTTGAAT TACGGCGCAT TCCGCCAGGT GAATTTTAAC 670 680 690 700 710 720

TATTTTGCCA TGCAAACGGA AAAACGTGGC AAAGGTACCC CACTCCCATC GCTGGGCTAC 730 740 750 760 770 780

GATGATTATT CTACATTCCT GCGTATTGGT TCGGCTGGTG ACTACGCGCG TTTCACAGGG 790 800 810 820 830 840

GTTGATCAGT TAACCTGGTG GAAGAAATTG GTACAGCATC CGGCCTACGA TGCGTTTTGG 850 860 870 880 890 900

CAAGGCCAAG CCCTGGATGC GGTCATGGCA AAGACGCCCT TGAAGGTGCC GACCCTTTGG 910 920 930 940 950 960

TTGCAAGGAC TTTGGGATCA GGAAGACATG TGGGGTGCCA ATCATGCATA CCAGGCCATG 970 980 990 1000 1010 1020

GAAGGCCGTG ACAGTGGCAA CACCCACAAT TACCTGGTCA TGGGCCCATG GCGCCATTCG 1030 1040 1050 1060 1070 1080

CAGGTTAACT ATTCGGGCAG CCAGTTAGGT GCGTTAAAGT TCGATGGGGA TACGGCCCTG 1090 1100 1110 1120 1130 1140

CAGTTCCGCC GCGACGTGTT AAAACCTTTC TTTGATCAGT ACCTCGTAGA CGGCGCGCCG 1150 1160 1170 1180 1190 1200

AAAGCGGACA CTCCGCCCGT CCTGGTATAT AACACCGGCG AGAACCACTG GGACCGTTTG 1210 1220 1230 1240 1250 1260

CAGGGTTGGC CCCGTAGCTG CGAAAAAGCA TGTGCCGCAA ATTCAAAGCC TTTGTATCTG 1270 1280 1290 1300 1310 1320

CGCGCTGGCG GGAAATTAGC GTTCCAGGCT CCAGCCGCCG GTGAGGGGGA CTTTGAAGAG 1330 1340 1350 1360 1370 1380

TACGTCTCTG ATCCTAGCAA ACCGGTGCCG TTCGTACCTC GGCCGGTACG TTTTGGCGAT 1390 1400 1410 1420 1430 1440

CGCGATATGT GGACCACGTG GCTTGTGAAA GACCAACGCT TCGTGGATGG CCGCCCTGAT 1450 1460 1470 1480 1490 1500

GTCCTGACGT TTATTACCGA ACCGTTGACC GCCCCCCTGC GTATCGGTGG TACACCGGTA 1510 1520 1530 1540 1550 1560

GTTAATCTCC AAGCATCCAC GTCAGGAACC GACTCGGATT GGGTAGTGAA ACTTATTGAC 1570 1580 1590 1600 1610 1620

GTCTACCCCG ACCAAGAAGC ATCCACCCCG GAGATGGGGG GGTACGAACT TCCAGTGAGC 1630 1640 1650 1660 1670 1680

TTAGCGATCT TCCGTGGGCG CTATCGCGAG TCATTCTCTG ACCCACGCGC CCTTGCCGCT 1690 1700 1710 1720 1730 1740

AATCAGGTGC TGCCGTATCG TTTTGATTTA CCAAATGCAA ACCATACTTT TCAAAAGGGT 1750 1760 1770 1780 1790 1800

CATCGGGTTA TGGTCCAAGT TCAGAGTAGT CTGTTTCCGC TGTATGATCG GAATCCACAA 1810 1820 1830 1840 1850 1860

ACCTATGTTC CGAACATCTA CCTGGCCAAG CCGGGTGACT ACCAGAAGGC CACGCAGCGG 1870 1880 1890 1900 1910 1920

GTATGGCACA GCGCCGCGCA GGCCAGCTAC ATCGAACTGC CGGTGTACTA A

<210 3 <211> 1917 <212>DNA <213> Achromobacter sp. CCM 4824, mutated sequence <223> Initiation codon highlited <400> 3 10 20 30 40 50 60

ATGTCC£T<SC GTGTGCGTGC CGTTGCTGTT GCCGTAGCCC TGAGCCTGTC CAGCACCGTG 70 80 90 100 110 120

CTGGCGGCCG ACACGCCGCC GATGACCCCG GACATCAGCG GAAAACCCTT CGTCGCTCCC 130 140 150 160 170 180

GATGTGGGCC GCGACTACGA CAAGCGCGTG GTGATGGTTC CGATGCGTGA TGGCACCCGT 190 200 210 220 230 240

CTGTATACCG TTATTGTTGT TCCGAAAGGT GCACATAATG CACCGATTCT GCTGACCCGT 250 260 270 280 290 300

ACCCCGTATG ATGCAGCAGG TCGTGCAAGC CGTAGCGATA GTCCGCGTAT GCGTGATCTG 310 320 330 340 350 360

CTGCCGCAGG GTGATGAAGT TTTTGTTGAT GGTGGTTATA TTCGCGTGTT TCAGGATATT 370 380 390 400 410 420

CGTGGTAAAT ATGGTAGCGA AGGTGATTAT GTTATGACCC GTCCGCTGCG TGGTCCGCTG 430 440 450 460 470 480

AATGGCACCA AAGTTGATCA TAGCACCGAT GCATGGGATA CCATTGATTG GCTGGTTAAA 490 500 510 520 530 540

CATGTTCCGG AAACCAATGG TAAAGTTGGT ATGCTGGGTA GCAGCTATGA AGGTTTTACC 550 560 570 580 590 600

GTTGTTATGG CACTGACCGA TCCGCATCCG GCACTGAAAG TTGCAGCACC GCAGAGCCCG 610 620 630 640 650 660

ATGGTTGATG GTTGGATGGG TGATGACTGG CTGAATTATG GTGCATTTCG TCAGGTGAAC 670 680 690 700 710 720

TTTAACTATT TTGCAATGCA GACCGAGAAA CGCGGTAAAG GTACACCGCT GCCGAGCCTG 730 740 750 760 770 780

GGTTATGATG ATTATAGCAC CTTTCTGCGT ATTGGTAGTG CAGGCGATTA TGCACGTTTT 790 800 810 820 830 840

ACCGGTGTGG ATCAGCTGAC CTGGTGGAAA AAACTGGTTC AGCATCCTGC CTATGATGCA 850 860 870 880 890 900

TTTTGGCAGG GTCAGGCACT GGATGCAGTT ATGGCAAAAA CACCGCTGAA AGTTCCGACC 910 920 930 940 950 960

ATGTGGCTGC AGGGTCTGTG GGATCAAGAG GATATGTGGG GTGCAAATCA TGCATATCAG 970 980 990 1000 1010 1020

GCAATGGAAG GTCGTGATAC CGGTAATACC CATAATTATC TGGTTATGGG TCCGTGGCGT 1030 1040 1050 1060 1070 1080

CATAGCCAGG TTAATTATGA TGGTAGCCAG CTGGGTGCAC TGAAATTTGA TGGTGATACC 1090 1100 1110 1120 1130 1140

GCACTGCAGT TTCGTCGTGA TGTTCTGAAA CCGTTTTTTG ATCAGTATCT GGTGGATGGT 1150 1160 1170 1180 1190 1200

GCACCGAAAG CAGATACCCC TCCGGTTCTG GTGTATAATA CCGGTGAAAA TCATTGGGAT 1210 1220 1230 1240 1250 1260

CGTCTGCAGG GTTGGCCTCG TAGCTGTGAA AAAGCATGTG CAGCAAATAG CAAACCGCTG 1270 1280 1290 1300 1310 1320

TATCTGCGTG CCGGTGGTAA ACTGGCATTT CAGGCACCGG CAGCGGGTGA AGGCGATTTT 1330 1340 1350 1360 1370 1380

GAAGAATATG TTAGCGATCC GAGCAAACCG GTTCCGTTTG TTCCGCGTCC GGTTCGTTTT 1390 1400 1410 1420 1430 1440

GGTGATCGTG ATATGTGGAC CACCTGGCTG GTGAAAGATC AGCGTTTTGT GGATGGTCGT 1450 1460 1470 1480 1490 1500

CCGGATGTGC TGACCTTTAT TACCGAACCG CTGACCGCAC CGCTGCGCAT TGGTGGTACA 1510 1520 1530 1540 1550 1560

CCGGTTGTTA ATCTGCAGGC AAGCACCAGC GGCACCGATA GCGATTGGGT TGTTAAACTG 1570 1580 1590 1600 1610 1620

ATTGATGTGT ATCCGGATCA AGAAGCAAGC ACACCGGAAA TGGGTGGTTA TGAACTGCCG 1630 1640 1650 1660 1670 1680

GTTAGCCTGG CAATTTTTCG TGGTCGTTAT CGTGAAAGCT TTAGTGATCC GCGTGCACTG 1690 1700 1710 1720 1730 1740

GCAGCAAATC AGGTTCTGCC GTATCGTTTT GATCTGCCGA ATGCCAATCA TACCTTTCAG 1750 1760 1770 1780 1790 1800

AAAGGCCATC GTGTTATGGT TCAGGTTCAG AGCAGCCTGT TTCCGCTGTA TGATCGTAAT 1810 1820 1830 1840 1850 1860

CCGCAGACCT ATGTTCCGAA CATTTATCTG GCAAAACCGG GTGATTACCA GAAGGCCACG 1870 1880 1890 1900 1910

CAGCGGGTAT GGCACAGCGC CGCGCAGGCC AGCTACATCG AACTGCCGGT GTACTAA

<210 4 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia coli PelB <400 4

ATGAAAT ACCTGCTGCC GACCGCTGCT GCTGGTCTGC TGCTCCTCGC TGCCCAGCCG GCGATGGCC

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sekvence nukleotidů o velikosti 1917 nukleotidů, kde je pořadí nukleotidů jako u sekvence č.l; sekvence nukleotidů o velikosti 1911 nukleotidů, kde je pořadí nukleotidů jako u sekvence č.2; sekvence nukleotidů o velikosti 1917 nukleotidů, kde je pořadí nukleotidů jako u sekvence č.3.
2. 2. Sekvence nukleotidů vyznačující se záměnou sekvence AA 1-22 podle nároku 1 za sekvenci uvedenou jako sekvence č.4.
3. 3. Fragment sekvence nukleotidů podle nároku 1 nebo 2 o délce nejméně 150 nukleotidů.
4. 4. Modifikovaná nukleová kyselina obsahující sekvenci nukleotidů podle nároku 1,2 nebo fragment sekvence nukleotidů podle nároku 3, vyznačující se záměnou jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, výhodně v pořadí nukleotidů jako u sekvence č.2.
5. 5. Konstrukt nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů podle nároku 1,2 nebo fragment sekvence nukleotidů podle nároku 3 nebo modifikovanou nukleovou kyselinu podle nároku 4, obsahující nejméně jednu regulační sekvenci řídící expresi genu a produkci polypeptidu s aktivitou hydrolasy esterů α-aminokyselin.
6. 6. Konstrukt nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů podle nároku 1,2 nebo fragment sekvence nukleotidů podle nároku 3 nebo modifikovanou nukleovou kyselinu podle nároku 4, obsahující nejméně jednu regulační sekvenci řídící sekreci polypeptidu s aktivitou hydrolasy esterů α-aminokyselin.
7. 7. Rekombinovaný plasmid obsahující sekvenci nukleotidů podle nároku 1,2 nebo fragment sekvence podle nároku 3 nebo modifikovanou nukleovou kyselinu podle nároku 4.
8. 8. Rekombinovaný expresní vektor obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 5 nebo 6, promotor, translační start signál a translační a transkripční stop signál.
9. 9. Rekombinovaný plasmid pJM5 obsahující vloženou sekvenci nukleotidů podle nároku 1, izolovanou z kmene Achromobacter sp., a restrikční mapou dle obr. 1.
10. 10. Rekombinovaný plasmid pJMl obsahující vloženou sekvenci nukleotidů podle nároku 1, a restrikční mapou dle obr. 1.
11. 11. Rekombinovaný plasmid pJM2 obsahující vloženou sekvenci nukleotidů podle nároku 1, syntetického chimemího genu, a restrikční mapou dle obr. 1.
12. 12. Rekombinovaný plasmid, obsahující vloženou sekvenci nukleotidů podle nároku 4, připravený synteticky.
13. 13. Hostitelská buňka obsahující rekombinovaný plasmid podle nároku 7 nebo rekombinovaný expresní vektor podle nároku 8.
14. 14. Hostitelská buňka obsahující rekombinovaný plasmid podle nároku 7 nebo rekombinovaný expresní vektor podle nároku 8 integrovaný do chromosomu buňky.
15. 15. Kmen Escherichia coli BL21(DE3) obsahující sekvenci nukleotidů podle nároku 1 nebo nároku 4 nesenou plasmidy pJM2 nebo pJM5.