JP5351230B2 - ポリペプチド及び生合成経路 - Google Patents

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Description

関連出願へのクロスリファレンス
本出願は２００２年４月２３日出願の米国特許出願第６０／３７４，８３１号に基づく優先権を主張する。
分野
この開示はインドール−３−ピルビン酸塩、２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）及び／又はモナチンの生成において有用なポリペプチド及び生合成経路を提供する。
背景
インドールピルビン酸塩
インドール−３−ピルビン酸塩は高酸素濃度の組織において酸化ストレスを打ち消すと考えられる強い抗酸化剤である（Ｐｏｌｉｔｉ ｅｔ ａｌ． “Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇ． Ａ． Ｆｉｌｉｐｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９６， ｐｐ２９１−８）。インドールピルビン酸塩はまた、主要な植物成長ホルモンオーキシン（拡散性の成長促進因子）である、インドール−酢酸（ＩＡＡ）を生成する経路における中間体である。ＩＡＡは頂部優性、屈性、苗条伸長、形成層細胞分裂の誘導、及び根開始を含む生理学的プロセスの範囲においてサブマイクログラムの量で活性である。合成オーキシンは発根を誘導するために及び果実の結実及び発達を促進するために園芸において使用される。高濃度では、上記合成オーキシンは広葉植物に対して有効な除草剤である。発酵により生成された天然オーキシンは化学的に生成された除草剤よりもより環境に調和したものであると考えられうる。成長制御剤は１９９９年において４億ポンド（１４億米ドル）の世界需要を有した。
インドール酢酸及びその誘導体についての特許のいくつかの例は：米国特許第５，８４３，７８２号 Ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｓｅ ｐｌａｎｔｓ， ａｕｘｉｎ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ（バラ植物の微細繁殖、培養媒体において使用されるオーキシン）及び米国特許第５，９５２，２３１号 Ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｓｅ ｐｌａｎｔｓ（バラ植物の微細繁殖）を含む。
植物に関連した利用性に加えて、インドール酢酸は医薬適用において有用である。例えば、米国特許第５，１７３，４９７号“Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｌｐｈａ−ｏｘｏｐｙｒｒｏｌｏ［２，３−Ｂ］ｉｎｄｏｌｅ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（アルファ−オキソピロロ［２，３−Ｂ］インドール酢酸及び誘導体の調製方法）”はアルツハイマー病及び老年性痴呆に関連するものの如き記憶障害の治療におけるこれらの化合物の使用を提案する。米国特許第５，１７３，４９７号において提案される機構は、これらの化合物がポリペプチドアセチルコリンエステラーゼを阻害し、及び脳におけるアセチルコリン値を増大させることである。
インドール−３−カルビノールはペルオキシダーゼ触媒酸化によりインドール−３−酢酸から生成され、及び容易にヂインドリルメタンに変換されうる。両方の化合物は毒素を除去すること及び女性の健康に有益なホルモンの生成を促進することが報告されている。
トリプトファン誘導体
塩素化Ｄ−トリプトファンは非栄養素甘味料として同定されており、及び他の誘導体も追跡することについて増大する関心が存在する。モナチンはアミノ酸トリプトファンと組成において同様の天然甘味料である。それは南アフリカの低木、Ｓｃｌｅｒｏｃｈｉｔｏｎ ｉｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓの根の皮から抽出されることができ、及び高強度甘味料として食物及び飲料産業において見込みを有する。モナチンについての特許のいくつかの例は：米国特許第５９９４５５９号 Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎａｔｉｎ−Ａ ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｎａｔｕｒａｌ ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ（モナチン−高強度天然甘味料の合成）、米国特許第４９７５２９８号 ３−（１−ａｍｉｎｏ−１，３−ｄｉｃａｒｂｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｕｔ−４−ｙｌ）−ｉｎｄｏｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（３−（１−アミノ−１，３−ヂカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブト−４−イル）−インドール化合物）、米国特許第５１２８１６４号 Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３−（１−ａｍｉｎｏ−１，３−ｄｉｃａｒｂｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｕｔ−４−ｙｌ）−ｉｎｄｏｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（３−（１−アミノ−１，３−ヂカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブト−４−イル）−インドール化合物を含むヒト消費用組成物）；及び米国特許第５１２８４８２号 Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ３−１（１−ａｍｉｎｏ−１，３−ｄｉｃａｒｂｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｕｔ−４−ｙｌ）ｉｎｄｏｌｅ（３−１（１−アミノ−１，３−ヂカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブト−４−イル）インドールの生成用プロセス）を含む。
本明細書中で示されるモナチンのいくつかの前駆体はまた合成甘味料として又はモナチン誘導体の合成における中間体として有用でありうる。
要約
本開示はグルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸から及び／又はインドール−３−ピルビン酸塩及び２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の如きモナチン前駆体をとおしてモナチンを生成するいくつかの生合成経路を提供する。モナチン、インドール−３−ピルビン酸塩、及び２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸を生成するために使用されうるポリペプチド及び核酸配列が開示される。
モナチンはインドール−３−ピルビン酸塩、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（モナチン前駆体、ＭＰ、モナチンのアルファ−ケト形）、インドール−３−乳酸、トリプトファン、及び／又はグルコースを経て生成されうる（図１）。基質を第一の生成物に変換すること、及びその後第一の生成物を第二の生成物に変換すること、及び所望の最終生成物が作出されるまで続けることに関する、図１〜３及び１１〜１３中に示されるモナチン又はその中間体を生成する又は作出する方法が開示される。
図１〜３及び１１〜１３は囲み中に可能性のある中間体生成物及び最終生成物を示す。例えば、グルコースからトリプトファン、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸塩、インドール−３−ピルビン酸塩からＭＰ、ＭＰからモナチン又はインドール−３−乳酸（インドール−乳酸塩）からインドール−３−ピルビン酸塩の如き、１の生成物から他のものへの変換はこれらの方法を使用することにより行われうる。これらの変換は化学的に又は生物学的に促進されうる。上記用語「変換する」は第一の中間体を第二の中間体に変化させる反応における化学的方法又はポリペプチドの使用をいう。上記用語「化学変換」はポリペプチドにより活性として促進されない反応をいう。上記用語「生物学的変換」はポリペプチドにより活性として促進される反応をいう。変換はｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで起こりうる。生物学的変換が使用されるとき、上記ポリペプチド及び／又は細胞は重合体支持上の化学結合によるように支持上に固定されうる。上記変換は当業者に知られる反応器を用いて、例えば、バッチ又は連続反応器内で、達成されうる。
第一のポリペプチドを基質と接触させ、及び第一の生成物を作出し、及びその後作出された第一の生成物を第二のポリペプチドと接触させ、及び第二の生成物を作出し、及びその後作出された第二の生成物を第三のポリペプチドと接触させ、及び第三の生成物、例えば、モナチンを作出する方法もまた提供される。使用されるポリペプチド及び作出される生成物は図１〜３及び１１〜１３中に示される。
図１〜３及び１１〜１３中に示される変換を行うために使用されうるポリペプチド、及びそれらのコード配列が開示される。いくつかの例においては、改変されるポリペプチドの基質特異性及び／又は活性を許容する１以上の位置特異的突然変異を有するポリペプチドがモナチンを作出するために使用される。
モナチンを生成する単離された及び組換えられた細胞が開示される。これらの細胞は植物、動物、細菌、酵母、藻類、古細菌又は真菌細胞の如き細胞でありうる。
特定の例においては、開示された細胞は１以上の以下の活性、例えば、２以上の又は３以上の以下の活性：トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．５）、多基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．−）、アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．２８）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．２）、トリプトファンオキシダーゼ（ＥＣ番号なし、Ｈａｄａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １２５：１０９６−１１０４，１９７６及びＦｕｒｕｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６４：１４８６−９３，２０００）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．３）、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２１）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．３．１７）又は４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．３．１６）の如き合成酵素／リアーゼ（ＥＣ ４．１．３．−）、合成酵素／リアーゼ（４．１．２．−）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（Ｋｏｈｉｂａ ａｎｄ Ｍｉｔｏ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ８th Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ6 ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ １９９０）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２０）及び／又はグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２、１．４．１．３、１．４．１．４）を含む。
他の例においては、細胞は１以上の、例えば、２以上の又は３以上の以下の活性：インドール乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１０）、Ｒ−４−ヒドロキシフェニル乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２２２）、３−（４）−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩還元酵素（ＥＣ １．１．１．２３７）、乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３）、（３−イミダゾール−５−イル）乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１１）、乳酸塩オキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．−）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．３．１７）又は４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．３．１６）の如き合成酵素／リアーゼ（４．１．３．−）、合成酵素／リアーゼ（４．１．２．−）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．２８）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．５）、多基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．−）、アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２０）、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２、１．４．１．３、１．４．１．４）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．９９．１）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、及び／又はＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２１）を含む。
さらに、開示された細胞は１以上の以下の活性、例えば、２以上の又は３以上の以下の活性：トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．５）、多基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．−）アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．２８）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．２）、トリプトファンオキシダーゼ（ＥＣ番号なし）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．３）、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２１）、インドール乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１０）、Ｒ−４−ヒドロキシフェニル乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２２２）、３−（４）−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩還元酵素（ＥＣ １．１．１．２３７）、乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３）、（３−イミダゾール−５−イル）乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１１）、乳酸塩オキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．−）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．３．１７）又は４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．３．１６）の如き合成酵素／リアーゼ（４．１．３．−）、合成酵素／リアーゼ（４．１．２．−）、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２、１．４．１．３、１．４．１．４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２０）、及び／又はＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼを含みうる。
モナチン（Ｍｏｎａｔｉｎ）は、トリプトファン及び／又はインドール−３−乳酸を第一のポリペプチドと接触させ、ここで上記第一のポリペプチドがトリプトファン及び／又はインドール−３−乳酸をインドール−３−ピルビン酸塩に変換し（トリプトファン又はインドール−３−乳酸のＤ又はＬ形のいずれかがインドール−３−ピルビン酸塩に変換される基質として使用されうる；当業者はこの段階のために選択されるポリペプチドは理想的には適切な特異性を示すということを理解するであろう）、生ずるインドール−３−ピルビン酸塩を第二のポリペプチドと接触させ、ここで上記第二のポリペプチドがインドール−３−ピルビン酸塩を２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）に変換し、及びＭＰを第三のポリペプチドと接触させ、ここで上記第三のポリペプチドがＭＰをモナチンに変換することを含む方法により生成されうる。これらの変換に使用されうる例示のポリペプチドは図２及び３中に示される。
本発明の他の局面はＭＰの如き組成物、少なくとも１の外因性核酸配列上にコードされる、少なくとも２のポリペプチド又はときどき少なくとも３又は少なくとも４のポリペプチドを含む細胞を提供する。
本開示のこれらの及び他の局面は以下の詳細な説明及び例示的な実施例から明らかである。
図１はモナチン及び／又はインドール−３−ピルビン酸塩を生成するために使用される生合成経路を示す。１の経路はトリプトファンを介してインドール−３−ピルビン酸塩を生成し、一方、他はインドール−３−乳酸を介してインドール−３−ピルビン酸塩を生成する。モナチンは続いて２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）中間体を介して生成される。 囲み内に示される化合物は基質及び生合成経路において生成される生成物である。 矢印の隣の組成物は、基質から生成物への変換の間に使用されうる共因子又は反応体である。使用される共因子又は反応体は上記生合成経路の特定の段階について使用されるポリペプチドに因るであろう。共因子ＰＬＰ（ピリドキサル５’−リン酸塩）はポリペプチドとは独立に反応を触媒しうる、及びそれゆえ、ＰＬＰを提供するだけで基質から生成物への進行を許容しうる。 図２はＭＰ中間体を利用する生合成経路のより詳細な図である。上記経路におけるそれぞれの段階についての基質は囲み内に示される。基質の間の変換を許容するポリペプチドは基質の間の矢印の隣に挙げられる。それぞれのポリペプチドはその通常の名称及び酵素クラス（ＥＣ）番号により示される。 図３はインドール−３−乳酸からインドール−３−ピルビン酸塩への変換の生合成経路のより詳細な図を示す。基質は囲み内に示され、及び基質の間の変換を許容するポリペプチドは基質の間の矢印の隣に挙げられる。それぞれのポリペプチドはその通常の名称及び酵素クラス（ＥＣ）番号により示される。 図４は化学的方法を介してＭＰを作出するための１の可能な反応を示す。 図５Ａ及び５Ｂは酵素的に生成されたモナチンのＬＣ／ＭＳ同定を示すクロマトグラムである。 図６は酵素的に合成されたモナチンのエレクトロスプレイマススペクトルである。 図７Ａ及び７Ｂは酵素混合物中で生成されたモナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン分析のクロマトグラムを示す。 図８は酵素的に生成されたモナチンの高分解マス計測を示すクロマトグラムである。 図９Ａ〜９Ｃは（Ａ）Ｒ−トリプトファン、（Ｂ）Ｓ−トリプトファン、及び（Ｃ）酵素的に生成されたモナチンのキラル分離を示すクロマトグラムである。 図１０はＩＰＴＧ誘導に続いて細菌細胞内で生成されたモナチンの相対量を示す棒グラフである。（−）は基質添加なし（トリプトファン又はピルビン酸塩が添加されなかった）を示す。 トリプトファン又はインドール−３−ピルビン酸塩から生成されるモナチンの収率を増大させるために使用される経路を示す概略図である。 トリプトファン又はインドール−３−ピルビン酸塩から生成されるモナチンの収率を増大させるために使用される経路を示す概略図である。 図１３はトリプトファン又はインドール−３−ピルビン酸塩から生成されるモナチンの収率を増大させるために使用されうる経路を示す概略図である。
配列リスト
付属の配列リスト中に挙げられる核酸及びアミノ酸配列はヌクレオチド塩基についての標準の文字略語、及びアミノ酸についての３文字コードを用いて示される。それぞれの核酸配列の１の鎖のみが示されるが、相補的な鎖は示される鎖を引用して含まれることが理解される。
配列ＩＤ番号：１及び２は、それぞれ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉからのアミノトランスフェラーゼの核酸及びアミノ酸配列を示す（文献中でｔａｔＡ遺伝子、チロシン又は芳香族アミノトランスフェラーゼと呼ばれる）。
配列ＩＤ番号：３及び４は、それぞれ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（２．４．１）からのチロシンアミノトランスフェラーゼの核酸及びアミノ酸配列を示す（ｔａｔＡ（配列ＩＤ番号：１及び２）とのホモロジーによりゲノムソフトウェアにより「アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ」であると予想される）。
配列ＩＤ番号：５及び６は、それぞれ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（３５０５３）からのアミノトランスフェラーゼの核酸及びアミノ酸配列を示す（新規、２．４．１配列 配列ＩＤ番号３及び４に基づいてクローニングされる）。
配列ＩＤ番号：７及び８は、それぞれ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒからの広範囲基質アミノトランスフェラーゼ（ｂｓａｔ）の核酸及びアミノ酸配列を示す。
配列ＩＤ番号：９及び１０は、それぞれ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからの芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ）の核酸及びアミノ酸配列を示す。
配列ＩＤ番号：１１及び１２は、それぞれ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓからの芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ）の新規核酸及びアミノ酸配列を示す（芳香族アミノトランスフェラーゼとして同定されるホモロジーにより）。
配列ＩＤ番号：１３及び１４は、それぞれ、Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（３５０５３）からの多基質アミノトランスフェラーゼ（ｍｓａ）の核酸及びアミノ酸配列を示す（アクセス番号ＡＡＡＥ０１００００９３．１、ｂｐ−１４７４３〜１６１５５及びアクセス番号ＺＰ００００５０８２．１へのホモロジーにより多基質アミノトランスフェラーゼとして同定される）。
配列ＩＤ番号：１５及び１６はＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）配列をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：１７及び１８はＳ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｔａｔＡ配列をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：１９及び２０はＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｒａＴアミノトランスフェラーゼ配列をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：２１及び２２はＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（２．４．１及び３５０５３）多基質アミノトランスフェラーゼ配列をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：２３及び２４はＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ ｂｓａｔ配列をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：２５及び２６はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ａｒａＴ配列をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：２７及び２８はＲ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ｔａｔＡ配列（２．４．１及び３５０５３の両方）をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：２９及び３０はＥ． ｃｏｌｉ ａｓｐＣ配列（遺伝子配列Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＡＥ０００１９５．１、タンパク質配列Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＡＡＣ７４０１４．１）をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：３１及び３２は、それぞれ、Ｅ． ｃｏｌｉからの芳香族アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）の核酸及びアミノ酸配列を示す。
配列ＩＤ番号：３３及び３４はＥ． ｃｏｌｉ ｔｙｒＢ配列をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：３５〜４０は、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ＫＨＧ）（ＥＣ ４．１．３．１６）活性を有するポリペプチドをクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：４１及び４２は、それぞれ、タンパク質Ｐ００９１３（ＧＩ：４０１１９５）及びＰ３１０１３（ＧＩ：４０１２０１）をコードする、Ｅ． ｃｏｌｉからのトリプトファナーゼ（ｔｎａ）及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉからのチロシンフェノール−リアーゼ（ｔｐｌ）の核酸配列を示す。
配列ＩＤ番号：４３〜４６はトリプトファナーゼポリペプチド及びβ−チロシナーゼ（チロシンフェノール−リアーゼ）ポリペプチドをクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：４７〜５４はトリプトファナーゼポリペプチド及びβ−チロシナーゼポリペプチドを突然変異させるために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：５５〜６４は４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．３．１７）活性を有するポリペプチドをクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：６５及び６６は、それぞれ、Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからの４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ｐｒｏＡ）の核酸及びアミノ酸配列を示す。
配列ＩＤ番号：６７〜６８はｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣ内のＥ． ｃｏｌｉ ａｓｐＣを伴うオペロン内のＣ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ｐｒｏＡ）をクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：６９〜７２はｐＥＳＣ−ｈｉｓ内のＥ． ｃｏｌｉ ａｓｐＣ及びＣ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｐｒｏＡをクローニングするために使用されるプライマーを示す。
配列ＩＤ番号：７３〜７４は本明細書中に開示される遺伝子をクローニングするために使用されるプライマーの５’末端に加えられる配列を示す。
いくつかの態様の詳細な説明
略号及び用語
用語及び方法の以下の説明は本開示をよりよく示すために及び本開示の実施において当業者をガイドするために提供される。本明細書中で使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、及び単数形“ａ”若しくは“ａｎ”又は“ｔｈｅ”は文脈が明らかに別段のように規定しない限り、複数の言及を含む。例えば、「タンパク質を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」についての言及は１又は複数の上記タンパク質を含み、及び「細胞を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ）」についての言及は１以上の細胞及び当業者に知られるその相当物についての言及を含む等。
別段のように説明されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は本開示が属する分野における当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に示されるものと同様の又は相当の方法及び材料は本開示の実施又は試験において使用されうるが、好適な方法及び材料は以下に示される。材料、方法及び実施例は例示的なものであるのみで、限定であるとは意図されない。本開示の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明及び請求項から明らかである。
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部の、非コードセグメント（イントロン）及び転写を決定する制御配列を欠く一片のＤＮＡ。ｃＤＮＡは細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡから逆転写により研究室内で合成されうる。
保存的置換：同様の生化学特性を有するアミノ酸残基についての１以上のアミノ酸置換（例えば、２、５又は１０残基）。典型的には、保存的置換は生ずるポリペプチドの活性にほとんど〜全く影響を有しない。例えば、理想的には、１以上の保存的置換を含むトリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチドはトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性を保持する。ポリペプチドは、例えば、位置特異的突然変異又はＰＣＲの如き標準の手順を用いて、そのポリペプチドをコードする核酸を操作することにより１以上の保存的置換を含むよう作出されうる。
置換変形体は、アミノ酸配列中の少なくとも１の残基が除去され、及び異なる残基がその場所に挿入されているものである。タンパク質において元のアミノ酸と置換されうる及び保存的置換とみなされるアミノ酸の例は：ｓｅｒ又はｔｈｒで置換されるａｌａ；ｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓで置換されるａｒｇ；ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐで置換されるａｓｎ；ａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎで置換されるａｓｐ；ｓｅｒ又はａｌａで置換されるｃｙｓ；ａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇで置換されるｇｌｎ；ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐで置換されるｇｌｕ；ｐｒｏで置換されるｇｌｙ；ａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ、ｔｙｒで置換されるｈｉｓ；ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅで置換されるｉｌｅ；ｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅで置換されるｌｅｕ；ａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ａｒｇで置換されるｌｙｓ；ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｐｈｅで置換されるｍｅｔ；ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕで置換されるｐｈｅ；ｔｈｒ、ａｌａで置換されるｓｅｒ；ｓｅｒ又はａｌａで置換されるｔｈｒ；ｐｈｅ、ｔｙｒで置換されるｔｒｐ；ｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐで置換されるｔｙｒ；及びｍｅｔ、ｉｌｅ、ｌｅｕで置換されるｖａｌを含む。
保存的置換についてのさらなる情報は他の位置の中で、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：７５１−７，１９８７）、Ｏ’Ｒｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ７７；２３７−５１，１９８９）、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ３：２４０−７，１９９４）、Ｈｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１３２１−５，１９８８）、ＷＯ ００／６７７９６（Ｃｕｒｄ ｅｔ ａｌ．）中に並びに遺伝学及び分子生物学の標準のテキスト中に見られうる。
外因性の：上記用語「外因性の」は、核酸及び特定の細胞について本明細書中で使用されるとき、天然に見られるその特定の細胞に由来しない核酸をいう。したがって、非天然の核酸は、一旦その細胞に導入されたら、細胞について外因性であると考えられる。天然の核酸もまた特定の細胞について外因性でありうる。例えば、ヒトＸの細胞から単離された染色体全体は、一旦その染色体がＹの細胞に導入されたら、ヒトＹの細胞について外因性の核酸である。
機能的に相当な：相当な機能を有すること。酵素の文脈においては、機能的に相当な分子はその酵素の機能を保持する異なる分子を含む。例えば、機能的相当物は酵素配列における配列変化により提供されることができ、ここで、１以上の配列変化を有するペプチドが、それがその酵素活性を保持するように、変化されていないペプチドの機能を保持する。特定の例においては、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ機能的相当物はトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸塩に変換する能力を保持する。
配列変化の例は、非限定的に、保存的置換、欠失、突然変異、フレームシフト、及び挿入を含む。１の例においては、あるポリペプチドは抗体に結合し、及び機能的相当物は同じ抗体に結合するポリペプチドである。したがって、機能的相当物はポリペプチドと同じ結合特性を有する、及び上記ポリペプチドの代わりに試薬として使用されうるペプチドを含む。１の例においては、機能的相当物は結合配列が不連続であり、上記抗体が線状のエピトープに結合するポリペプチドを含む。したがって、上記ペプチド配列がＭＰＥＬＡＮＤＬＧＬ（配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸１〜１０）である場合、機能的相当物は以下のように現れうる不連続なエピトープを含む（**＝いくつかの介入するアミノ酸）：ＮＨ２−**−Ｍ**Ｐ**Ｅ**Ｌ**Ａ**Ｎ**Ｄ**Ｌ**Ｇ**Ｌ−ＣＯＯＨ。この例において、上記ポリペプチドの三次元構造が、それが配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸１〜１０に結合するモノクローナル抗体に結合しうるようなものである場合、上記ポリペプチドは配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸１〜１０に機能的に相当する。
ハイブリダイゼーション：上記用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書中で使用されるとき、相補的な一重鎖ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの二重鎖分子を形成する能力に基づいた、２の核酸分子のヌクレオチド配列における相補性についての試験方法をいう。核酸ハイブリダイゼーション技術は本開示の範囲内で単離された核酸を得るために使用されうる。簡単に述べると、配列ＩＤ番号：１１中に示される配列といくらかのホモロジーを有する核酸は穏やかな〜高い厳密さの条件下でのハイブリダイゼーションにより同様の核酸を同定するためにプローブとして使用されうる。一旦同定されたら、上記核酸はその後、それが本開示の範囲内であるかどうか決定するために精製され、シークエンスされ、及び分析されうる。
ハイブリダイゼーションは、プローブにハイブリダイズする、それぞれＤＮＡ又はＲＮＡ配列を同定するためのサザン又はノザン分析によりなされうる。上記プローブはビオチン、ヂゴキシゲニン、ポリペプチド又は32Ｐの如き放射性同位体で標識されうる。分析されるべきＤＮＡ又はＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹの節７．３９−７．５２中に示されるものの如き本分野において周知の標準の技術を用いて、アガロース又はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動で分離され、ニトロセルロース、ナイロン又は他の好適な膜に移され、及びプローブとハイブリダイズされうる。典型的には、プローブは少なくとも長さ約２０ヌクレオチドである。例えば、配列ＩＤ番号：１１中に示される連続的な２０ヌクレオチド配列に対応するプローブは同一の又は同様の核酸を同定するために使用されうる。さらに、２０ヌクレオチドよりも長い又は短いプローブが使用されうる。
本開示はまた少なくとも長さ約１２塩基（例えば、少なくとも長さ約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００又は５０００塩基）であり、及びハイブリダイゼーション条件下で配列ＩＤ番号：１１中に示される配列を有する核酸のセンス又はアンチセンス鎖にハイブリダイズする、単離された核酸配列を提供する。上記ハイブリダイゼーション条件は穏やかな又は高くストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でありうる。
本開示の目的のために、穏やかなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが２５ｍＭ ＫＰＯ4（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５０μｇ／ｍＬ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％フォルムアミド、１０％硫酸デキストラン、及び１〜１５ｎｇ／ｍＬプローブ（約５×１０7ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリダイゼーション溶液中で約４２℃で行われ、一方、洗浄は２×ＳＳＣ及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液で約５０℃で行われることを意味する。
高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが２５ｍＭ ＫＰＯ4（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５０μｇ／ｍＬ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％フォルムアミド、１０％硫酸デキストラン、及び１〜１５ｎｇ／ｍＬプローブ（約５×１０7ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリダイゼーション溶液中で約４２℃で行われ、一方、洗浄は０．２×ＳＳＣ及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液で約６５℃で行われることを意味する。
単離された：上記用語「単離された」は、核酸について本明細書中で使用されるとき、それが、それが由来する生物の天然ゲノムにおいて（一方は５’末端で及び一方は３’末端で）直接的に連続している配列の両方と直接的には連続していない天然の核酸をいう。例えば、単離された核酸は、非限定的に、通常天然のゲノムにおいてその組換えＤＮＡ分子のすぐ両側に見られる核酸配列の１が除去される又は欠損することで提供される、いかなる長さの組換えＤＮＡ分子でもありうる。したがって、単離された核酸は、非限定的に、他の配列とは独立に分離した分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処理により作出されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡに加えて、ベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）内に又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に導入された組換えＤＮＡをも含む。さらに、単離された核酸はハイブリッド又は融合核酸配列の一部である組換えＤＮＡ分子を含みうる。
非天然の核酸配列は天然には見られず、及び天然のゲノムにおいて直接的に連続する配列を有しないので、上記用語「単離された」は、核酸について本明細書中で使用されるとき、また非天然の核酸をも含む。例えば、遺伝子工学で作られた核酸の如き非天然の核酸は単離された核酸であると考えられる。遺伝子工学で作られた核酸は通常の分子クローニング又は化学的核酸合成技術を用いて作出されうる。単離された非天然の核酸は他の配列とは独立であり又はベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に導入されうる。さらに、非天然の核酸はハイブリッド又は融合核酸配列の一部である核酸分子を含みうる。
例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリー又はゲノムＤＮＡ制限酵素消化物を含むゲルスライス内の何百〜何百万の他の核酸分子の中に存在する核酸は単離された核酸とは考えられないということは当業者に明らかであろう。
核酸：上記用語「核酸」は、本明細書中で使用されるとき、ＲＮＡ及び、非限定的に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡを含むＤＮＡの両方を含む。核酸は二重鎖又は一重鎖でありうる。一重鎖であるとき、核酸はセンス鎖又はアンチセンス鎖でありうる。さらに、核酸は環状又は直鎖状でありうる。
有効に（作用可能な状態で）結合された：第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係でおかれるときはいつでも、第一の核酸配列は第二の核酸配列に「有効に結合され」る。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響する場合は、プロモーターはコード配列に有効に結合される。一般的に、有効に結合されたＤＮＡ配列は連続しており、及び、２のポリペプチドコード領域をつなげる必要がある場合は同じリーディングフレーム内にある。
ペプチド改変：本開示は酵素及びその合成態様をも含む。さらに、所望の酵素活性を有するアナログ（非ペプチド有機分子）、誘導体（開示されたペプチド配列で出発して得られた化学的に機能的にされたペプチド分子）及び変形（ホモログ）は本明細書中で示される方法中で利用されうる。本明細書中で開示されるペプチドは、天然の及びそうでない、Ｌ−及び／又はＤ−アミノ酸でありうるアミノ酸の配列を含む。
ペプチドは改変されていないペプチドと本質的に同じ活性を有する、及び場合により他の所望の特性を有する誘導体を作出するためにさまざまな化学技術により改変されうる。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシ末端又は側鎖のいずれでも、医薬として許容される陽イオンの塩の形態で提供され又はＣ１−Ｃ１６エステルを形成するようエステル化され又はＲ１及びＲ２はそれぞれ独立にＨ若しくはＣ１−Ｃ１６アルキルである式ＮＲ１Ｒ２のアミドに変換され又は５−若しくは６−員環の如きヘテロ環状環を形成するよう結合されうる。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端又は側鎖のいずれでも、ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸、安息香酸、トルエンスルフォン酸、マレイン酸、酒石酸及び他の有機塩の如き医薬として許容される酸添加塩の形態でありうる又はＣ１−Ｃ１６アルキル若しくはヂアルキルアミノに改変され若しくはさらにアミドに変換されうる。
ペプチド側鎖のヒドロキシル基はよく認識される技術を用いてＣ１−Ｃ１６アルコキシに又はＣ１−Ｃ１６エステルに変換されうる。ペプチド側鎖のフェニル及びフェノール環はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩの如き１以上のハロゲン原子で又はＣ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、カルボン酸及びそのエステル又は上記カルボン酸のアミドで置換されうる。ペプチド側鎖のメチレン基は同族のＣ２−Ｃ４アルキレンに延長されうる。チオールはアセトアミド基の如きいくつかのよく認識される保護基の１で保護されうる。当業者はまた構造に高められた安定性をもたらすコンフォメーションの拘束を選択する及び提供するために本開示のペプチドに環状構造を導入する方法をも認識するであろう。例えば、Ｃ−又はＮ−末端システインがペプチドに加えられることができ、そのため、酸化されたとき、上記ペプチドがヂスルフィド結合を含み、環状ペプチドを作出するであろう。他のペプチド環状化方法はチオエーテル及びカルボキシル−及びアミノ−末端アミド及びエステルの形成を含む。
ペプチドミメティック及び器官ミメティック態様は、上記ペプチド及び器官ミメティックの化学組成の三次元配置がペプチド骨格及び構成成分アミノ酸側鎖の三次元配置を真似、検出可能な酵素活性を有する本開示のタンパク質の上記ペプチド及び器官ミメティックをもたらすことにより、また本開示の範囲内である。コンピュータモデリング適用のために、ファーマコフォアは生物学的活性のための構造的必要性の理想化された三次元定義である。ペプチド及び器官ミメティックは（コンピュータ補助された薬物設計又はＣＡＤＤを用いて）それぞれのファーマコフォアを近年のコンピュータモデリングソフトウェアとフィットさせるよう設計されうる。ＣＡＤＤにおいて使用される技術の記述については、Ｗａｌｔｅｒｓ，“Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ”， ｉｎ Ｋｌｅｇｅｒｍａｎ ＆ Ｇｒｏｖｅｓ（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９３， Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ： Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ， ＩＬ， ｐｐ．１６５−７４及びＣｈ．１０２ ｉｎ Ｍｕｎｓｏｎ（ｅｄ．），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １９９５， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌを参照のこと。上記技術を用いて調製されたミメティックもまた本開示の範囲内に含まれる。１の例においては、ミメティックは酵素又はその変形、断片若しくは融合により作出される酵素活性を真似る。
プローブ及びプライマー：核酸プローブ及びプライマーは本明細書中に提供されるアミノ酸配列及び核酸配列に基づいて容易に調製されうる。「プローブ」は検出可能な標識又はレポーター分子を含む単離された核酸を含む。例示的な標識は、非限定的に、放射活性同位体、リガンド、化学発光剤、及びポリペプチドを含む。標識化方法及びさまざまな目的に適切な標識の選択におけるガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．， ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ），１９８７中で議論される。
「プライマー」は典型的に１０以上のヌクレオチドを有する核酸分子（例えば、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを有する核酸分子）である。プライマーは核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的核酸鎖にアニーリングされ、プライマー及び上記標的核酸鎖の間でハイブリッドを形成し、及びその後、例えば、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドにより上記標的核酸鎖に沿って伸長されうる。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）又は本分野において知られる他の核酸増幅法による、核酸配列の増幅のために使用されうる。
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．，１９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ），１９８７；及びＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０の如き引用文献中に示される。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５，コピーライト１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．）の如きその目的のために意図されるコンピュータプログラムを用いることにより、既知の配列に由来しうる。当業者は、特定のプローブ又はプライマーの特異性は長さと共に増大するが、プローブ又はプライマーはサイズが全長配列〜短くても５の連続したヌクレオチドの配列に及びうるということを理解するであろう。したがって、例えば、２０の連続したヌクレオチドのプライマーは１５ヌクレオチドのみの対応するプライマーよりも高い特異性で標的にアニーリングしうる。したがって、より大きな特異性を得るために、例えば、１０、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０、３４００、３４５０、３５００、３５５０、３６００、３６５０、３７００、３７５０、３８００、３８５０、３９００、４０００、４０５０、４１００、４１５０、４２００、４２５０、４３００、４３５０、４４００、４４５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０、４７００、４７５０、４８００、４８５０、４９００、５０００、５０５０、５１００、５１５０、５２００、５２５０、５３００、５３５０、５４００、５４５０又はより多い連続したヌクレオチドを含む、プローブ及びプライマーが選択されうる。
プロモーター：核酸の転写を方向付ける核酸制御配列の並び。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントの如き、転写開始部位の近辺の必須の核酸配列を含む。プロモーターは転写開始部位から何千塩基対もの位置にありうる遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含みうる。
精製された：上記用語「精製された」は、本明細書中で使用されるとき、絶対的な精製度を必要としない；むしろ、それは比較の用語として意図される。したがって、例えば、精製されたポリペプチド又は核酸の調製物は、問題のポリペプチド又は核酸、それぞれが、上記ポリペプチド又は核酸が生物内でその天然環境において存在するであろうよりは高濃度で存在するものでありうる。例えば、ポリペプチド調製物は、調製物中の上記ポリペプチド内容量が上記調製物中の総タンパク質内容量の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％又は９９％を示す場合、精製されたと考えられうる。
組換え：「組換え」核酸は（１）それが発現される生物内で天然には起こらない配列又は（２）２の、そうでなければ別々の、より短い配列の人工的な組み合わせにより作出される配列を有するものである。この人工的な組み合わせはしばしば化学合成により又はより通常には、核酸の単離されたセグメントの人工的な操作により、例えば、遺伝子工学技術により達成される。「組換え」はまた人工的に操作されているが、上記核酸が単離された生物中に見られる同じ制御配列及びコード領域を含む核酸分子を示すためにも使用される。
配列同一性：アミノ酸配列間の類似性は、そうでなければ配列同一性といわれる、配列間の類似性の用語で表現される。配列同一性はしばしばパーセント同一性（又は類似性又はホモロジー）の用語で計測される；パーセントが高くなればなるほど、２の配列はより類似する。配列ＩＤ番号：１２の如きペプチドのホモログ又は変形は標準の方法を用いて並べられたとき比較的高い程度の配列同一性を有する。
比較のための配列の整合方法は本分野において周知である。さまざまなプログラム及び整合アルゴリズムが：Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２，１９８１； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−５３， １９７０； Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４−８，１９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ ７３：２３７−４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−３， １９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１−９０，１９８８；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ６：１９９−２９， １９９４中に示される。
Ｔｈｅ ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標））（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０，１９９０）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連した使用のために、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）を含むいくつかの源から及びインターネット上で入手可能である。
ペプチドの変形は典型的に、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ２．０を用いて、ギャップｂｌａｓｔｐをデフォルトパラメーターに設定して、アミノ酸配列との全長整合にわたりカウントされる少なくとも５０％の配列同一性の所有により特徴付けられる。約３０アミノ酸よりも大きなアミノ酸配列の比較のために、Ｂｌａｓｔ２配列機能がデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスをデフォルトパラメーターに設定して用いて使用される（ギャップの存在はコスト１１、及び残基ギャップ当たりはコスト１）。（約３０アミノ酸よりも少ない）短いペプチドを整合するとき、整合はＢｌａｓｔ２配列機能を用いて、ＰＡＭ３０マトリックスをデフォルトパラメーターに設定して使用して行われる（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１ペナルティー）。引用配列にさらにより大きな類似性を有するタンパク質はこの方法により評価されたとき、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性の如き、増大するパーセント同一性を示すであろう。全体より少ない配列が配列同一性について比較されるとき、ホモログ及び変形は典型的に１０〜２０アミノ酸の短いウィンドウにわたり少なくとも８０％配列同一性を有するであろう、及び引用配列に対するそれらの類似性に因り少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９８％の配列同一性を有しうる。上記短いウィンドウにわたる配列同一性の決定方法はｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄにより維持されるウェブサイトで示される。当業者は、これらの配列同一性の範囲はガイダンスのためにのみ提供されるということを理解するであろう；提供される範囲外にある非常に顕著なホモログが得られうることは全く可能である。
同様の方法は核酸配列のパーセント配列同一性を決定するために使用されうる。特定の例においては、同族の配列はネイティブ配列に並べられ、及び適合の数は同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が両方の配列に示される位置の数をカウントすることにより決定される。パーセント配列同一性は適合の数を同定された配列（例えば、配列ＩＤ番号：１１）中に示される配列の長さで又は節に区切られた長さ（例えば、同定された配列において示される配列からの１００の連続したヌクレオチド又はアミノ酸残基）で割り、続いて生ずる値に１００を掛けることにより決定される。例えば、配列ＩＤ番号：１１中に示される配列と並べられたとき１１６６の適合を有する核酸配列は配列ＩＤ番号：１１中に示される配列に対して７５．０パーセント同一である（すなわち、１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。パーセント配列同一性値は小数第一位辺りまで概数にされるということに注意せよ。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、及び７５．１４は７５．１に切り捨てられ、一方、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、及び７５．１９は７５．２に繰り上げられる。また、長さの値は常に整数であろうということにも注意せよ。他の例において、以下の同定された配列からの２０の連続したヌクレオチドと並ぶ２０ヌクレオチド領域を含む標的配列はその同定された配列と７５パーセント配列同一性を共有する領域を含む（すなわち、１５÷２０＊１００＝７５）。
Figure 0005351230
特異的結合剤：本明細書中に示されるポリペプチドのいずれかに特異的に結合することができる剤。例は、非限定的に、ポリクローナル抗体、（ヒト化モノクローナル抗体を含む）モノクローナル抗体、及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｖ断片の如きモノクローナル抗体の断片及び上記ポリペプチドのエピトープに特異的に結合することができる他の剤を含む。
本明細書中に提供されるポリペプチドに対する抗体（又はその断片、変形又は融合）は上記ポリペプチドを精製する又は同定するために使用されうる。本明細書中に提供されるアミノ酸及び核酸配列は、本明細書中に示されるポリペプチドを認識する特定の抗体に基づいた結合剤の作出を許容する。
モノクローナル又はポリクローナル抗体はポリペプチド、ポリペプチドの一部又はその変形に作出されうる。場合により、ポリペプチド抗原上の１以上のエピトープに対して作出された抗体はそのポリペプチドを特異的に検出するであろう。すなわち、１の特定のポリペプチドに対して作出された抗体はその特定のポリペプチドを認識し及び結合しうる、及び他のポリペプチドを実質的に認識しない及び結合しないであろう。抗体が特定のポリペプチドに特異的に結合するという決定はいくつかの標準の免疫分析法のいずれか１によりなされる；例えば、ウェスタンブロッティング（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９を参照のこと）。
（配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対してマウスにおいて作出される調製物の如き）ある抗体調製物はウェスタンブロッティングにより適切なポリペプチド（例えば、配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）を特異的に検出するということを決定するために、全細胞タンパク質が細胞から抽出され、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されうる。
分離された全細胞タンパク質はその後膜（例えば、ニトロセルロース）に移され、及び上記抗体調製物は上記膜とインキュベートされうる。上記膜を洗浄し、非特異的に結合した抗体を除去した後、特異的に結合した抗体の存在は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムの適用が免疫局在化したアルカリフォスファターゼにより濃い青色の化合物の生成をもたらすので、アルカリフォスファターゼの如きポリペプチドに結合された適切な二次抗体（例えば、抗マウス抗体）を用いて検出されうる。
免疫原としての使用のために好適な実質的に純粋なポリペプチドはトランスフェクトされた細胞、形質転換された細胞又は野生型細胞から得られうる。最終調製物中のポリペプチド濃度はミリリットル当たり数マイクログラムの値に、例えば、Ａｍｉｃｏｎ ｆｉｌｔｅｒ装置上の濃度により調節されうる。さらに、大きさが全長ポリペプチド〜９程度のアミノ酸残基を有するポリペプチドに及ぶポリペプチドは免疫原として利用されうる。上記ポリペプチドは細胞培養物中に作出されうる、標準の方法を用いて化学的に合成されうる又は大きなポリペプチドを精製されうるより小さいポリペプチドに切断することにより得られうる。長さが９程度のアミノ酸残基を有するポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子の如き主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に関連して免疫系に提示されたとき免疫原性でありうる。したがって、本明細書中に開示されるアミノ酸配列の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０又はより多い連続したアミノ酸残基を有するポリペプチドが抗体を作出するための免疫原として使用されうる。
本明細書中に開示されるポリペプチドのいずれかに対するモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−７，１９７５）の古典的方法又はその誘導された方法にしたがってマウスハイブリドーマから調製されうる。
本明細書中に開示されるいずれかのポリペプチドの不均一なエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、改変されない又は免疫原性を高めるために改変されうる上記ポリペプチド（又はその断片）で好適な動物を免疫化することにより調製されうる。ウサギについての有効な免疫化プロトコルはＶａｉｔｕｋａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ３３：９８８−９１，１９７１）中に見られうる。
抗体断片は抗体全体の代わりに使用されうる及び原核生物宿主細胞内で容易に発現されうる。「抗体断片」ともいわれる、モノクローナル抗体の免疫学的に有効な部分を作出する及び使用する方法は周知であり、及びＢｅｔｔｅｒ ＆ Ｈｏｒｏｗｉｔｚ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １７８：４７６−９６，１９８９）、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１３６２−７，１９９０）、米国特許第５，６４８，２３７号（“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”）、米国特許第４，９４６，７７８号（“Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈａｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”）、米国特許第５，４５５，０３０号（“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”）、及び本明細書中に引用される引用文献中に示されるものを含む。
形質転換された：「形質転換された」細胞は、核酸分子が、例えば、分子生物学的技術により導入されている細胞である。形質転換は、非限定的に、ウイルスベクターでのトランスフェクション、接合、プラスミドベクターでの形質転換、及びエレクトロポーレーション、リポフェクション、及びパーティクルガン促進による裸ＤＮＡの導入を含む、核酸分子が上記細胞に導入されうる全ての技術を含む。
変形、断片又は融合タンパク質：開示されたタンパク質はその変形、断片及び融合を含む。タンパク質（例えば、配列ＩＤ番号：１２）、融合タンパク質又はタンパク質の断片若しくは変形をコードするＤＮＡ配列（例えば、配列ＩＤ番号：１１）は上記タンパク質が真核細胞、細菌、昆虫、及び／又は植物中で発現されるよう遺伝子工学で作り変えられうる。発現を得るために、上記ＤＮＡ配列は変化され及び他の制御配列に有効に結合されうる。上記制御配列及び上記タンパク質を含む最終生成物はベクターといわれる。このベクターは真核生物、細菌、昆虫、及び／又は植物細胞に導入されうる。一旦細胞内に入ったら、上記ベクターは上記タンパク質を生成させる。
融合タンパク質は、そのタンパク質の所望の活性、例えば、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸塩に変換する能力を阻害しない他のアミノ酸配列につなげられた、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（又はその変形、多形、突然変異体若しくは断片）、例えば、配列ＩＤ番号：１２の如きタンパク質を含む。１の例において、上記他のアミノ酸配列は長さが多くて約１０、１２、１５、２０、２５、３０又は５０アミノ酸である。
当業者は、ＤＮＡ配列がコードされたタンパク質の生物学的活性に影響することなく、多くの方法で変化されうることを理解するであろう。例えば、ＰＣＲはタンパク質をコードするＤＮＡ配列中に変形を作出するために使用されうる。上記変形体は上記タンパク質を発現するために使用される宿主細胞におけるコドン優先又は発現を促進する他の配列変化のために最適化された変形体でありうる。
ベクター：細胞内に導入され、それにより形質転換された細胞を作出する核酸分子。ベクターは、複製起点の如き、それが細胞内で複製することを許容する核酸配列を含みうる。ベクターはまた１以上の選択可能なマーカー遺伝子及び本分野において知られる他の遺伝的エレメントをも含みうる。
生合成経路の概略
図１〜３及び１１〜１３中に示されるように、多くの生合成経路はモナチン又はインドール−３−ピルビン酸塩若しくはＭＰの如きその中間体を生成するために使用されうる。それぞれの基質（グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸、インドール−３−ピルビン酸塩、及びＭＰ）のそれぞれの生成物（トリプトファン、インドール−３−ピルビン酸塩、ＭＰ及びモナチン）への変換のために、いくつかの異なるポリペプチドが使用されうる。さらに、これらの反応はｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで又は非酵素的化学反応を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ反応の如き、ｉｎ ｖｉｖｏ反応及びｉｎ ｖｉｔｒｏ反応の組み合わせをとおして行われうる。それゆえ、図１〜３及び１１〜１３は例示であり、及び所望の生成物を得るために使用されうる複数の異なる経路を示す。
グルコース〜トリプトファン
多くの生物はグルコースからトリプトファンを合成しうる。グルコース及び／又はトリプトファンからモナチン、ＭＰ、及び／又はインドール−３−ピルビン酸塩を生成するために必要な遺伝子（単数又は複数）を含む構築物（単数又は複数）は上記生物内にクローニングされうる。トリプトファンはモナチンに変換されうることが本明細書中で示される。
他の例において、生物はトリプトファンを生成する又はトリプトファンを過剰生成するよう既知のポリペプチドを用いて遺伝子工学的に作り変えられる。例えば、米国特許第４，３７１，６１４号（本明細書中に援用する）は野生型トリプトファンオペロンを含むプラスミドで形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ株を示す。
米国特許第４，３７１，６１４号中に開示されるトリプトファンの最大タイターは約２３０ｐｐｍである。同様に、ＷＯ ８７０１１３０（本明細書中に援用する）はトリプトファンを生成するよう遺伝子工学で作り変えられたＥ． ｃｏｌｉ株を示し、及びＬ−トリプトファンの増大する発酵生成を議論する。当業者は、グルコースからトリプトファンを生成することができる生物はまた、同様の結果で、グルコース又はフルクトース−６−リン酸塩に変換されうる他の炭素及びエネルギー源を利用することができることを認識するであろう。例示的な炭素及びエネルギー源は、非限定的に、スクロース、フルクトース、デンプン、セルロース又はグリセロールを含む。
トリプトファン〜インドール−３−ピルビン酸塩
いくつかのポリペプチドはトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸塩に変換するために使用されうる。例示的なポリペプチドは酵素クラス（ＥＣ）２．６．１．２７、１．４．１．１９、１．４．９９．１、２．６．１．２８、１．４．３．２、１．４．３．３、２．６．１．５、２．６．１．−、２．６．１．１、及び２．６．１．２１のメンバーを含む。これらのクラスはＬ−トリプトファン及び２−オキソグルタル酸塩をインドール−３−ピルビン酸塩及びＬ−グルタミン酸塩に変換するトリプトファンアミノトランスフェラーゼ（Ｌ−フェニルアラニン−２−オキソグルタル酸塩アミノトランスフェラーゼ、トリプトファントランスアミナーゼ、５−ヒドロキシトリプトファン−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、ヒドロキシトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファントランスアミナーゼ、及びＬ−トリプトファン：２−オキソグルタル酸塩アミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）；Ｄ−トリプトファン及び２−オキソ酸をインドール−３−ピルビン酸塩及びアミノ酸に変換するＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ；Ｌ−トリプトファン及びＮＡＤ（Ｐ）をインドール−３−ピルビン酸塩及びＮＨ3及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換するトリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ（Ｐ）−Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−Ｔｒｐ−デヒドロゲナーゼ、ＴＤＨ及びＬ−トリプトファン：ＮＡＤ（Ｐ）酸化還元酵素（脱アミノ化）とも呼ばれる）；Ｄ−アミノ酸及びＦＡＤをインドール−３−ピルビン酸塩及びＮＨ3及びＦＡＤＨ2に変換するＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ；Ｌ−トリプトファン及びフェニルピルビン酸塩をインドール−３−ピルビン酸塩及びＬ−フェニルアラニンに変換するトリプトファン−フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼ（Ｌ−トリプトファン−α−ケトイソカプロン酸塩アミノトランスフェラーゼ及びＬ−トリプトファン：フェニルピルビン酸塩アミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）；Ｌ−アミノ酸及びＨ2Ｏ及びＯ2を２−オキソ酸及びＮＨ3及びＨ2Ｏ2に変換するＬ−アミノ酸オキシダーゼ（オフィオ−アミノ−酸オキシダーゼ及びＬ−アミノ−酸：酸素酸化還元酵素（脱アミノ化）とも呼ばれる）；Ｄ−アミノ酸及びＨ2Ｏ及びＯ2を２−オキソ酸及びＮＨ3及びＨ2Ｏ2に変換するＤ−アミノ酸オキシダーゼ（オフィオ−アミノ−酸オキシダーゼ及びＤ−アミノ−酸：酸素酸化還元酵素（脱アミノ化）とも呼ばれる）；及びＬ−トリプトファン及びＨ2Ｏ及びＯ2をインドール−３−ピルビン酸塩及びＮＨ3及びＨ2Ｏ2に変換するトリプトファンオキシダーゼと呼ばれるペプチドを含む。これらのクラスはまたチロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ、アルパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸（又はＤ−アラニン）アミノトランスフェラーゼ、及び複数のアミノトランスフェラーゼ活性を有し、それらのいくつかはトリプトファン及び２−オキソ酸をインドール−３−ピルビン酸塩及びアミノ酸に変換しうる広範囲（多基質）アミノトランスフェラーゼをも含む。
配列ＩＤ番号：１１及び１２中に示される新規アミノトランスフェラーゼを含む、上記活性を有するアミノトランスフェラーゼクラスの１１のメンバーは以下の実施例１中に示される。それゆえ、この開示は配列ＩＤ番号：１１及び１２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する単離された核酸及びタンパク質配列を提供する。アミノトランスフェラーゼ活性を保持する又はアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列ＩＤ番号：１１及び１２の断片及び融合もまた本開示に含まれる。例示的な断片は、非限定的に、配列ＩＤ番号１１の少なくとも１０、１２、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００又は１０００の連続したヌクレオチド又は配列ＩＤ番号：１２の少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００又は３５０の連続したアミノ酸を含む。開示された配列（及びその変形、断片、及び融合）はベクターの一部でありうる。上記ベクターは宿主細胞を形質転換するために使用されることができ、それにより、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸塩を生成しうる、及びいくつかの例においてはさらにＭＰ及び／又はモナチンを生成しうる組換え細胞を作出する。
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（１．４．３．２）は既知であり、及び配列はＶｉｐｅｒａ ｌｅｂｅｔｉｎｅ（ｓｐ Ｐ８１３７５）、Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ ｈａｎｎａｈ（ｓｐ Ｐ８１３８３）、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ（ｓｐ Ｐ８１３８２）、Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘ（ｓｐ Ｐ５６７４２）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｅｎｔｕｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｌｔａｒｄｔｉｉ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔｒ．の如きいくつかの異なる源から単離されうる。さらに、トリプトファンオキシダーゼは文献中に示され、及び、例えば、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐ． ＳＦ−１、根こぶ病を有する体菜（白菜）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、及び哺乳類の肝臓から単離されうる。トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸塩に変換しうるＬ−アミノ酸オキシダーゼクラスの１のメンバーは以下の実施例３、及び分子クローニングについての代替の源中で議論される。多くのＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子は分子クローニングについてのデータベースにおいて入手可能である。
トリプトファンデヒドロゲナーゼは既知であり、及び、例えば、ホウレンソウ、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｊｕｌｉｆｌｏｒａ、マメ、メスキート、小麦、トウモロコシ、トマト、タバコ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉから単離されうる。多くのＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列は既知である。
図１１〜１３中に示されるように、トリプトファンオキシダーゼの如きアミノ酸オキシダーゼがトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸塩に変換するために使用される場合、カタラーゼが過酸化水素の存在を減少させる又は打ち消すために添加されうる。
インドール−３−乳酸塩〜インドール−３−ピルビン酸塩
インドール−３−乳酸塩をインドール−３−ピルビン酸塩に変換する反応はポリペプチドの１．１．１．１１０、１．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３、１．１．１．２２２、１．１．１．２３７、１．１．３．−又は１．１．１．１１１クラスのメンバーの如き、さまざまなポリペプチドにより触媒されうる。上記１．１．１．１１０クラスのポリペプチドはインドール乳酸塩デヒドロゲナーゼ（インドール乳酸：ＮＡＤ+酸化還元酵素とも呼ばれる）を含む。上記１．１．１．２７、１．１．１．２８、及び１．１．２．３クラスは乳酸塩デヒドロゲナーゼ（乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸塩：ＮＡＤ+酸化還元酵素とも呼ばれる）を含む。上記１．１．１．２２２クラスは（Ｒ）−４−ヒドロキシフェニル乳酸塩デヒドロゲナーゼ（Ｄ−芳香族乳酸塩デヒドロゲナーゼ、Ｒ−芳香族乳酸塩デヒドロゲナーゼ、及びＲ−３−（４−ヒドロキシフェニル）乳酸塩：ＮＡＤ（Ｐ）+２−酸化還元酵素とも呼ばれる）を含み、及び上記１．１．１．２３７クラスは３−（４−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩）還元酵素（ヒドロキシフェニルピルビン酸塩還元酵素及び４−ヒドロキシフェニル乳酸塩：ＮＡＤ+酸化還元酵素とも呼ばれる）を含む。上記１．１．３．−クラスは乳酸塩オキシダーゼを含み、及び上記１．１．１．１１１クラスは（３−イミダゾール−５−イル）乳酸塩デヒドロゲナーゼ（（Ｓ）−３−（イミダゾール−５−イル）乳酸塩：ＮＡＤ（Ｐ）+酸化還元酵素とも呼ばれる）を含む。これらのクラス内のポリペプチドのいくつかはインドール−３−乳酸からのインドール−３−ピルビン酸塩の生成を許容するようである。この変換の例は実施例２中に提供される。
化学反応はまたインドール−３−乳酸をインドール−３−ピルビン酸塩に変換するために使用されうる。上記化学反応はいくつかの方法、例えば：Ｂ２触媒を用いた空気酸化（Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ， ｖ １３， ｎ ２８， ｐ １８（１），２００２）、希釈過マンガン酸塩及び過塩素酸塩又は金属触媒の存在下での過酸化水素を用いて達成されうる酸化段階を含む。
インドール−３−ピルビン酸塩〜２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）
いくつかの既知のポリペプチドはインドール−３−ピルビン酸塩をＭＰに変換するために使用されうる。例示的なポリペプチドクラスは４．１．３．−、４．１．３．１６、４．１．３．１７、及び４．１．２．−を含む。これらのクラスは２のカルボン酸基質の縮合を触媒するアルドラーゼの如き炭素−炭素合成酵素／リアーゼを含む。ペプチドクラスＥＣ４．１．３．−は（インドール−３−ピルビン酸塩の如き）オキソ酸基質を求電子剤として利用して炭素−炭素結合を形成する合成酵素／リアーゼであり、一方、ＥＣ４．１．２．−は（ベンズアルデヒドの如き）アルデヒド基質を求電子剤として利用して炭素−炭素結合を形成する合成酵素／リアーゼである。
例えば、ＥＰ １０４５−０２９中に示されるポリペプチド（ＥＣ４．１．３．１６、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ、２−オキソ−４−ヒドロキシグルタル酸塩アルドラーゼ又はＫＨＧアルドラーゼとも呼ばれる４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸塩グリオキシル酸塩−リアーゼ）はグリオキシル酸及びピルビン酸塩を４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸に変換する、及びポリペプチド４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩−リアーゼ又はＰｒｏＡアルドラーゼとも呼ばれる）は２のピルビン酸塩の如き２のケト酸を縮合して４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩にする。これらのリアーゼを利用する反応は本明細書中に示される。
図１〜２及び１１〜１３は３−炭素（Ｃ３）分子がインドール−３−ピルビン酸塩と結合されるこれらの反応の概略図を示す。ＥＣ４．１．２．−及び４．１．３．−の多くのメンバー、特にＰＬＰを利用するポリペプチドはセリン、システイン、及びアラニンの如きアミノ酸又はその誘導体であるＣ３分子を利用しうる。ＥＣ４．１．２．−及び４．１．３．−の代表者により触媒されるアルドール縮合はピルビン酸塩又はピルビン酸塩の誘導体になるこの経路の３の炭素分子を必要とする。しかしながら、他の化合物はＣ３炭素源としてはたらき及びピルビン酸塩に変換されうる。アラニンは、上記に挙げられるものの多くを含む多くのＰＬＰを利用するトランスアミナーゼによりアミノ基転移され、ピルビン酸塩を産出しうる。ピルビン酸塩及びアンモニアはＯ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｓ−アルキル−Ｌ−システイン、Ｏ−アシル−Ｌ−セリン、及び３−クロロ−Ｌ−アラニンの如き十分な脱離基を伴うＬ−セリン、Ｌ−システイン、及びセリン及びシステインの誘導体の（トリプトファナーゼ又はβ−チロシナーゼにより触媒されるものの如き）ベータ−消去反応により得られうる。アスパラギン酸塩はトリプトファナーゼ（ＥＣ４．１．９９．１）及び／又はβ−チロシナーゼ（ＥＣ４．１．９９．２、チロシン−フェノールリアーゼとも呼ばれる）により触媒されるものの如きＰＬＰ仲介ベータ−リアーゼ反応におけるピルビン酸塩の源としてはたらきうる。ベータ−リアーゼ反応の速度はＭｏｕｒａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１３２０−５，１９９９）により及び実施例８中に示されるように（４．１．９９．１−２）ポリペプチド上で位置特異的突然変異を行うことにより増大されうる。これらの改変は上記ポリペプチドがヂカルボキシルアミノ酸基質を受けることを許容する。乳酸塩はまたピルビン酸塩の源としてはたらきうる、及び乳酸塩デヒドロゲナーゼ及び酸化共因子又は乳酸塩オキシダーゼ及び酸素の添加によりピルビン酸塩に酸化される。これらの反応の例は以下に示される。例えば、図２及び図１１〜１３中に示されるように、ピルビン酸塩がＣ３分子として使用されるとき、ＰｒｏＡアルドラーゼはインドール−３−ピルビン酸塩と接触されうる。
ＭＰはまた実施例５中に提供されるアルドール縮合の如き化学反応を用いて作出されうる。
ＭＰ〜モナチン
ＭＰのモナチンへの変換は１以上の：トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２７）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（１．４．１．１９）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（１．４．９９．１）、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ（１．４．１．２−４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２０）、トリプトファン−フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼ（２．６．１．２８）又はより一般的にはアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（２．６．１．５）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ又はＤ−アラニン（２．６．１．２１）アミノトランスフェラーゼの如きアミノトランスフェラーゼファミリー（２．６．１．−）のメンバーにより触媒されうる（図２）。配列ＩＤ番号：１１及び１２中に示される上記クラスの新規メンバーを含む、アミノトランスフェラーゼクラスの１１のメンバーは以下（実施例１）に示され、及びアミノトランスフェラーゼ及びデヒドロゲナーゼ酵素の活性を示す反応は実施例７中に提供される。
この反応はまた化学反応を用いても行われうる。ケト酸（ＭＰ）のアミン化はアンモニア及びシアノボロヒドリドナトリウムを用いる還元的アミン化により行われる。
図１１〜１３はＭＰをモナチンに変換し、及びインドール−３−ピルビン酸塩又はトリプトファンからのモナチンの増大した収率を提供するために使用されうる追加のペプチドを示す。例えば、アスパラギン酸塩がアミノ供与体として使用される場合、アルパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼはアスパラギン酸塩をオキサロ酢酸に変換するために使用されうる（図１１）。オキサロ酢酸塩はオキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼの如きデカルボキシラーゼによりピルビン酸塩及び二酸化炭素に変換される（図１１）。さらに、リジンがアミノ供与体として使用される場合、リジンイプシロンアミノトランスフェラーゼはリジンをアルリジンに変換するために使用されうる（図１２）。アルリジンは自発的に１−ピペリデイン６−カルボキシレートに変換される（図１２）。還元的アミン化反応を触媒することができるポリペプチド（例えば、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ）がＭＰをモナチンに変換するために使用される場合、蟻酸塩デヒドロゲナーゼの如き、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生し及び／又は揮発性生成物を生成し（図１３）うるポリペプチドが使用されうる。
生合成経路の設計における追加の考慮
どのポリペプチドがインドール−３−ピルビン酸塩、ＭＰ及び／又はモナチンを作出するために使用されるかに因り、共因子、基質、及び／又は追加のポリペプチドが生成物形成を高めるために生成細胞に提供されうる。
過酸化水素の除去
過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）は、生成された場合、生成細胞に対して毒性でありうる及びポリペプチド又は生成された中間体を損傷しうる生成物である。上記に示されるＬ−アミノ酸オキシダーゼはＨ2Ｏ2を生成物として作出する。それゆえ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼが使用される場合、細胞又は生成物への可能性のある損害を減少させるために生ずるＨ2Ｏ2は除去され又はその値は減少されうる。
カタラーゼは細胞においてＨ2Ｏ2の値を減少させるために使用されうる（図１１〜１３）。生成細胞は、過酸化水素の水及び酸素ガスへの分解を触媒するカタラーゼ（ＥＣ １．１１．１．６）をコードする遺伝子又はｃＤＮＡ配列を発現しうる。例えば、カタラーゼは生成細胞にトランスフェクトされたベクターから発現されうる。使用されうるカタラーゼの例は、非限定的に：ｔｒ｜Ｑ９ＥＶ５０（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ）、ｔｒ｜Ｑ９ＫＢＥ８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、ｔｒ｜Ｑ９ＵＲＪ７（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ｔｒ｜Ｐ７７９４８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ｔｒ｜Ｑ９ＲＢＪ５（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．）を含む。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ又はトリプトファンオキシダーゼを利用する生物触媒反応はまたカタラーゼポリペプチドをも含みうる。
ＰＬＰ（ピリドキサル−５’−フォスフェート）アベイラビリティの調節
図１中に示されるように、ＰＬＰは本明細書中に示される１以上の生合成段階において利用されうる。ＰＬＰの濃度は、ＰＬＰが反応の全体の効率に対する限界にならないように補充されうる。
ビタミンＢ6（ＰＬＰの前駆体）の生合成経路はＥ． ｃｏｌｉにおいて徹底的に研究されており、及びいくつかのタンパク質は結晶化されている（Ｌａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４４９：４５−８， １９９９）。２の遺伝子（ｅｐｄ又はｇａｐＢ及びｓｅｒＣ）は他の代謝経路において必要とされ、一方、３の遺伝子（ｐｄｘＡ、ｐｄｘＢ、及びｐｄｘＪ）はピリドキサルフォスフェート生合成に独特である。Ｅ． ｃｏｌｉ経路における出発物質の１は１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−フォスフェート（ＤＸＰ）である。通常の２及び３の炭素中心代謝物からのこの前駆体の合成はポリペプチド１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−フォスフェート合成酵素（ＤＳＸ）により触媒される。他の前駆体は４−炭素糖、Ｄ−エリスロース４−フォスフェートから形成されるスレオニン誘導体である。フォスフォ−４−ヒドロキシル−Ｌ−スレオニン（ＨＴＰ）への変換に必要とされる遺伝子はｅｐｄ、ｐｄｘＢ、及びｓｅｒＣである。ＰＬＰの形成のための最後の反応はｐｄｘＡ及びｐｄｘＪの遺伝子産物により触媒される、ＤＸＰ及びＨＴＰの間の複合体分子内縮合及び環閉鎖反応である。
ＰＬＰがモナチンを生成するための発酵の間の制限的栄養物質になる場合、生成宿主細胞における１以上の経路遺伝子の増大した発現はモナチンの収率を増大させるために使用されうる。宿主生物はそのネイティブ経路遺伝子の複数のコピーを含みうる又は非ネイティブ経路遺伝子のコピーが生物ゲノム内に導入されうる。さらに、救助経路遺伝子の複数のコピーは宿主生物内にクローニングされうる。
全ての生物において保存される１の救助経路はビタミンＢ6のさまざまな誘導体を活性ＰＬＰ形に再生する。この経路に関連するポリペプチドはｐｄｘＫキナーゼ、ｐｄｘＨオキシダーゼ、及びｐｄｘＹキナーゼである。１以上のこれらの遺伝子の過剰発現はＰＬＰアベイラビリティを増大しうる。
ビタミンＢ6値は宿主生物におけるネイティブ生合成経路遺伝子の代謝制御の消去又は抑制により上昇されうる。ＰＬＰは細菌Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株２３８−７において前駆体スレオニン誘導体の生合成に関連するポリペプチドを抑制する。代謝制御から解放されたこの菌株はピリドキサル誘導体を過剰生成し、及び２０ｍｇ／ＬまでのＰＬＰを放出しうる。同様の様式でのモナチンを生成する宿主生物の遺伝子操作は生合成経路遺伝子の過剰発現を伴わずに、増大されたＰＬＰ生成を許容するであろう。
アンモニウム利用
トリプトファナーゼ反応はアンモニアをより入手可能にすることにより又は水の除去により合成方向（インドールからのトリプトファンの生成）に駆動されうる。グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼにより触媒されるものの如き、還元的アミン化反応はまた過剰のアンモニウムにより駆動されうる。
アンモニアは炭酸塩又はリン酸塩緩衝系において炭酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム塩として入手可能にされうる。アンモニアはまたピルビン酸アンモニア又は蟻酸アンモニアとしても提供されうる。あるいは、上記反応が、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ又はトリプトファンデヒドロゲナーゼの如き、アンモニアを作出する反応とカップリングされる場合、アンモニアが補充されうる。アンモニアはフェノール又はインドール、ピルビン酸塩及びＮＨ3に加水分解されるであろう、ＥＣ ４．１．９９．−の天然基質（チロシン又はトリプトファン）の添加により作出されうる。これはまた上記酵素にその好ましい基質を加水分解させることにより正常平衡量を超える合成生成物の増大した収率を許容する。
生成物及び副生成物の除去
反応がグルタミン酸塩を生成し、及び共基質２−オキソグルタル酸塩（α−ケトグルタル酸塩）を必要とするので、トリプトファンアミノトランスフェラーゼを介したトリプトファンのインドール−３−ピルビン酸塩への変換はインドール−３−ピルビン酸塩の生成速度に悪い影響を及ぼしうる。グルタミン酸塩はアミノトランスフェラーゼの阻害を引き起こしうる、及び上記反応は大量の共基質を消費するであろう。さらに、高いグルタミン酸塩濃度は下流の分離プロセスに有害である。
ポリペプチドグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）はグルタミン酸塩を２−オキソグルタル酸塩に変換し、それによりトリプトファンアミノトランスフェラーゼにより触媒される反応における共基質を再生する。ＧＬＤＨはまた好気性条件下で細胞のためのエネルギー（ＡＴＰ）を作出するために使用されうる還元当量（ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）をも作出する。ＧＬＤＨによるグルタミン酸塩の利用はまた副生成物形成を減少させる。さらに、上記反応は、細胞のための窒素源として又は図１中に示される最終段階のための還元的アミン化における基質としてはたらきうるアンモニアを生成する。それゆえ、ＧＬＤＨポリペプチドを過剰発現する生成細胞は収率を増大させ及び媒体及び／又は分離プロセスのコストを減少させるために使用されうる。
トリプトファンからモナチンへの経路において、適切な酵素クラスからのアミノトランスフェラーゼが使用される場合、段階３のアミノ供与体（例えば、グルタミン酸塩又はアスパラギン酸塩）は段階１に必要とされるアミノ受容体（例えば、２−オキソ−グルタル酸塩又はオキサロ酢酸塩）に戻されうる。１のトランスアミナーゼの基質が他のトランスアミナーゼの活性を競合的に阻害しない、この経路のための２の別々のトランスアミナーゼの利用はこの経路の効率を増大しうる。
示される経路における多くの反応は可逆であり、及び、それゆえ、基質及び生成物の間の平衡に達するであろう。上記経路の収率はポリペプチドからの生成物の連続的な除去により増大されうる。例えば、透過酵素又は他の輸送タンパク質を用いたモナチンの発酵液への分泌又は基質の付随する再生を伴う生触媒反応器ストリームからのモナチンの選択的結晶化は反応収率を増大させるであろう。
追加の酵素反応による又はアミノ供与基の置換による副生成物の除去は反応収率を増大させる他の方法である。いくつかの例は実施例１３中に議論され、及び図１１〜１３中に示される。理想的には、逆方向に反応するために使えない副生成物は、相変化（蒸発）により又は二酸化炭素の如き不反応性最終生成物への自発的変換により作出される。
基質プールの調節
インドールプールはトリプトファン前駆体の生成を増大させること及び／又はインドール−３−ピルビン酸塩及び又はトリプトファンに関する異化経路を変化させることにより調節されうる。例えば、インドール−３−ピルビン酸塩からのインドール−３−酢酸の生成は宿主細胞においてＥＣ ４．１．１．７４をコードする遺伝子を機能的に欠失させることにより減少され又は消去されうる。トリプトファンからのインドールの生成は宿主細胞においてＥＣ ４．１．９９．１をコードする遺伝子を機能的に欠失させることにより減少され又は消去されうる。あるいは、過剰のインドールは増大された量のＥＣ ４．１．９９．１をコードする遺伝子と共にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏプロセスにおいて基質として利用されうる（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｆｅｒｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．， ８２：６０４−６，１９９６）。遺伝子改変はＤ−エリスロース−４−フォスフェート及びコリスメートの如き中間体の値を増大させるためになされうる。
トリプトファン生成はほとんどの生物において制御される。１の機構は経路におけるある酵素のフィードバック阻害を介する；トリプトファン値が増大すると、トリプトファン生成速度は減少する。したがって、トリプトファン中間体を介してモナチンを生成するよう遺伝子工学的に作り変えられた宿主細胞を用いるとき、トリプトファン濃度に感受性でない生物が使用されうる。例えば、さまざまなトリプトファンアナログによる成長阻害に耐性であるＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓの株は高濃度の５−メチルトリプトファンへの繰り返される暴露により選択された（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂｅｒｌｉｎ， Ｚ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ３４：５４１−５，１９７９）。上記株の生ずるトリプトファン合成酵素活性は、おそらく遺伝子内の突然変異のために、生成物阻害によりあまり影響されなかった。同様に、モナチン生成に使用される宿主細胞は最適化されうる。
トリプトファン生成は生成物阻害にあまり感受性でないポリペプチドを進化させるための方向付けられた進化の使用をとおして最適化されうる。例えば、スクリーニングは媒体中にトリプトファンを含まないが、高い値の代謝不可能なトリプトファンアナログを有するプレート上で行われうる。米国特許第５，７５６，３４５号；第４，７４２，００７号；及び第４，３７１，６１４号は発酵生物においてトリプトファン生産性を増大させるために使用される方法を示す。トリプトファン生合成の最終段階はインドールへのセリンの添加である；それゆえ、セリンのアベイラビリティはトリプトファン生成を増大させるために増大されうる。
発酵生物により生成されるモナチンの量は宿主生物により生成されるピルビン酸塩の量を増大させることにより増大されうる。Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｔｔ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５：３３８−４２）及びＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５７：４５１−９，２００１）の如きある酵母はピルビン酸塩を過剰生成し、及び本明細書中に開示される方法を実施するために使用されうる。さらに、Ｅ． ｃｏｌｉ株Ｗ１４８５ｌｉｐ２におけるものの如き、遺伝子改変はピルビン酸生成を促進するために生物になされうる（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｆｅｒｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ． ８２：６０４−６，１９９６）。
キラリティの制御
モナチンの味感プロファイルは分子の立体化学（キラリティ）を制御することにより変化されうる。例えば、異なるモナチン異性体は異なる食物系のための濃度の異なる配合において所望されうる。キラリティはｐＨ及びポリペプチドの組み合わせを介して制御されうる。
Figure 0005351230
モナチンのＣ−４位でのラセミ化（上記の番号を付けられた分子を参照のこと）は、ｐＨにおけるシフトにより又は共因子ＰＬＰとの反応により起こりうる、アルファ炭素の脱プロトン化及び再プロトン化により起こりうる。微生物においては、ｐＨはラセミ化を引き起こすのに十分なほどシフトしないが、ＰＬＰは豊富である。ポリペプチドでキラリティを制御する方法はモナチン生成に利用される生合成経路に因る。
モナチンが図２中に示される経路を用いて形成されるとき、以下のものが考えられうる。生触媒反応においては、炭素−２のキラリティはインドール−３−ピルビン酸塩をＭＰに変換する酵素により決定される。（例えば、ＥＣ ４．１．２．−、４．１．３．−からの）複数の酵素はインドール−３−ピルビン酸塩をＭＰに変換しうる、したがって、所望の異性体を形成する酵素を選択することが可能である。あるいは、インドール−３−ピルビン酸塩をＭＰに変換する酵素のエナンチオ特異性は方向付けられた進化の使用をとおして改変されうる又は触媒抗体は所望の反応を触媒するよう遺伝子工学的に作り変えられうる。一旦ＭＰが生成されたら（酵素的に又は化学縮合により）、アミノ基は本明細書中に示されるものの如きトランスアミナーゼを用いて立体特異的に添加されうる。炭素−４のＲ又はＳ配置はＤ−あるいはＬ−芳香酸アミノトランスフェラーゼが使用されるかどうかに因り生成されうる。ほとんどのアミノトランスフェラーゼはＬ−異性体に特異的である、しかしながら、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼはいくつかの植物において存在する（Ｋｏｈｉｂａ ａｎｄ Ｍｉｔｏ， Ｐｒｅｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ6 ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ １９９０）。さらに、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２１）、Ｄ−メチオニン−ピルビン酸塩アミノトランスフェラーゼ（２．６．１．４１）並びに（Ｒ）−３−アミノ−２−メチルプロパノエートアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．６１）及び（Ｓ）−３−アミノ−２−メチルプロパノエートアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２２）の両方が同定されている。いくつかのアミノトランスフェラーゼはＣ２炭素での特定の配置でのみこの反応のための基質を受けうる。それゆえ、ＭＰへの変換が立体特異的でない場合でさえも、最終生成物の立体化学はトランスアミナーゼの適切な選択をとおして制御されうる。上記反応は可逆であるので、反応しないＭＰ（所望されない異性体）はその構成成分に再生されうる、及びＭＰのラセミ混合物が再形成されうる。
基質の活性化
フォスフォエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）の如きリン酸化された基質は本明細書中に開示される反応において使用されうる。リン酸化された基質はよりエネルギー的に好まれうる、及びそれゆえ、反応速度及び／又は収率を増大させるために使用されうる。アルドール縮合において、リン酸基の添加は求核基質のエノール互変異性体を安定化させ、それをより反応性にさせる。他の反応においては、リン酸化された基質はしばしばよりよい脱離基を提供する。同様に、基質はＣｏＡ誘導体又はピロフォスフェート誘導体への変換により活性化されうる。
実施例１
トリプトファンアミノトランスフェラーゼのクローニング及び発現
この実施例は、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸塩に変換するために使用されうるトリプトファンアミノトランスフェラーゼをクローニングするために使用された方法を示す。
実験の概略
アミノトランスフェラーゼをコードする１１の遺伝子をＥ． ｃｏｌｉ内にクローニングした。これらの遺伝子はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｙ１４０８２．１ ｂｐ ２８６２２−２９４７０及びＧｅｎｂａｎｋアクセス番号ＮＰ＿３８８８４８．１、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉとも呼ばれる）チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔａｔＡ、配列ＩＤ番号：１及び２、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ株２．４．１チロシンアミノトランスフェラーゼ（ホモロジーにより断定されるｔａｔＡ、配列ＩＤ番号：３及び４、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ３５０５３チロシンアミノトランスフェラーゼ（ホモロジーにより断定される、配列ＩＤ番号：５及び６、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ広範囲基質アミノトランスフェラーゼ（ｂｓａｔ、Ｌ． ｍｅｘｉｃａｎａからのペプチド断片へのホモロジーにより断定される、配列ＩＤ番号：７及び８、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ、ホモロジーにより断定される、配列ＩＤ番号：９及び１０、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ芳香族アミノトランスフェラーゼ（ホモロジーにより断定されるａｒａＴ、配列ＩＤ番号：１１及び１２、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ３５０５３多基質アミノトランスフェラーゼ（ホモロジーにより断定される、配列ＩＤ番号：１３及び１４、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ株２．４．１多基質アミノトランスフェラーゼ（ホモロジーにより断定されるｍｓａ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＡＡＢ０１００００９３．１、ｂｐ１４７４３−１６１５５及びＧｅｎｂａｎｋアクセス番号ＺＰ００００５０８２．１、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＥ０００１９５．１ ｂｐ ２７５５−１５６５及びＧｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＡＣ７４０１４．１、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）、及びＥ． ｃｏｌｉチロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ、配列ＩＤ番号：３１及び３２、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）であった。
上記遺伝子をクローニングし、発現し、及び商業的に入手可能な酵素と共に、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸塩への変換における活性について試験した。全ての１１のクローンは活性を有した。
所望の活性を有するポリペプチドを含みうる菌株の同定
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースにおけるどの遺伝子もトリプトファンアミノトランスフェラーゼとして指定されなかった。しかしながら、この酵素活性を有する生物は同定されている。Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）活性は細胞抽出物において又は以下の源からの精製タンパク質から計測されている：Ｆｅｓｔｕｃａ ｏｃｔｏｆｌｏｒａからのリゾバクテリア単離物、マメミトコンドリア及び細胞質、ヒマワリクラウンゴール細胞、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ 生物型ｔｒｉｆｏｌｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ ｐｖカスミソウ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｓａｖａｓｔａｎｏｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｆｅｒｕｍ ＆ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｌｋａｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、ラット脳、ラット肝臓、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＣＨＡ０、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｌ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、小麦種苗、大麦、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｕｒｅｕｓ（緑豆）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐ．、トウモロコシ、トマトの苗条、マメ植物、タバコ、ブタ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ。
クローニングのためのゲノムＤＮＡの単離
Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ（ＡＴＣＣ番号９９３０）を２５℃、ｐＨ７．２でＴＹ培地中で生育させた。細胞を６００ｎｍ（ＯＤ600）で１．８５の光学濃度まで生育させ、及び２％接種をゲノムＤＮＡ調製物に使用した。Ｑｉａｇｅｎゲノムチップ２０／Ｇキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）をゲノムＤＮＡ単離に使用した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ６０５１（ＡＴＣＣ）をＢｅｒｅｔｏ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＴ）中で３０℃で生育させた。Ｑｉａｇｅｎゲノムチップ２０／Ｇプロトコルを以下の変化を伴ってゲノムＤＮＡを単離するために使用した：プロテイナーゼＫ及びリゾチームの濃度は二倍であり、及びインキュベーション時間は２〜３倍に増大した。
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ ＡＴＣＣ ５０１２２ゲノムＤＮＡはＴＥ緩衝液ｐＨ８．０、１７ｎｇ／μＬ中にＩＤＩ，Ｉｎｃ．（Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）により補充された。
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ２．４．１（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｓａｍ Ｋａｐｌａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ， Ｈｏｕｓｔｏｎにより提供された）、Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ３５０５３（ＡＴＣＣ番号）、及びＬ． ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓゲノムＤＮＡを標準のフェノール抽出により調製した。細胞を遅いログフェーズで回収し、ＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、及びｍＬ細胞懸濁物当たり０．０２４ｍＬラウリルサルコジンナトリウムの添加により溶解した。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で飽和した等量のフェノールで少なくとも３回抽出した後、上記ＤＮＡ溶液を９：１ クロロフォルム：オクタノールで１回及びクロロフォルムで３回抽出した。上記ＤＮＡを０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８及び２容量のエタノールの添加により沈殿させた。上記沈殿物を遠心分離により回収し、及び７０％エタノールで一回洗浄した。最後に、上記ＤＮＡを０．１０ｍＬ蒸留水中に溶解した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを株ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から単離し、及びＱｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（商標）（５００／Ｇ）キットを用いて調製した。１．８７のＯＤ650までＬＢ中で生育した３０ｍＬのこの株から、０．３ｍｇの精製ＤＮＡが得られた。精製ＤＮＡを０．３７μｇ／μＬの濃度でＱｉａｇｅｎ溶離緩衝液（ＥＢ）中に溶解した。
ポリメラーゼ鎖反応プロトコル
プライマーをｐＥＴ ３０Ｘａ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）についての融和性のオーバーハングと共に設計した。上記ｐＥＴベクターはＸａ／ＬＩＣサイトの５’側に１２塩基の一重鎖オーバーハング及びＸａ／ＬＩＣサイトの３’側に１５塩基の一重鎖オーバーハングを有する。上記プラスミドはＮ−末端Ｈｉｓ及びＳ−タグ並びに場合によるＣ−末端Ｈｉｓ−タグを伴って、ライゲーション独立クローニングのために設計される。上記Ｘａプロテアーゼ認識部位（ＩＥＧＲ）は問題の遺伝子の開始コドンのすぐ前に位置するので、融合タンパク質のタグは除去されうる。
プライマーを設計するとき、以下の配列を生物特異的配列の５’末端に加えた：前向きプライマー：５’ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣ（配列ＩＤ番号：７３）；逆向きプライマー：５’ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣ（配列ＩＤ番号：７４）。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｄａｔ プライマー：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＴＧＧ−３’及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：１５及び１６）。
Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｔａｔＡ プライマー：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＣＧ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ（配列ＩＤ番号：１７及び１８）。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｒａＴ プライマー：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＴＣＣ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＡＡＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧ（配列ＩＤ番号：１９及び２０）。
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ｍｓａ（２．４．１．及び３５０５３の両方）：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＴ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２１及び２２）。
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ ｂｓａｔ：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＡＴ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＣＴＣＡＣＧＡＴＴＣＡＣＡＴＴＧＣ（配列ＩＤ番号：２３及び２４）。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ａｒａＴ：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＴＴＡＧＣＴＡＡＴＧＡ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＴＣＧＴＣＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＡ（配列ＩＤ番号：２５及び２６）。
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ｔａｔＡ（２．４．１及び３５０５３株両方）：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＣＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＧ（配列ＩＤ番号：２７及び２８）。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓｐＣ：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧＣ−３’及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧ−３’（配列ＩＤ番号：２９及び３０）。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｙｒＢ：Ｎ末端：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＣ及びＣ末端：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧ−３’（配列ＩＤ番号：３３及び３４）。
Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ（ｔａｔＡ）由来の遺伝子を以下のＰＣＲプロトコルを用いて増幅した。５０μＬの反応中に、０．１〜０．５μｇ鋳型、１．５μＭのそれぞれのプライマー、０．４ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、３．５ＵのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）、及びＭｇを伴う１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液を使用した。使用されたサーモサイクラープログラムは９６℃での高温開始５分間、続いて以下の段階：９４℃で３０秒間、５５℃で２分間、及び７２℃で２．５分間の２９の繰返しを含んだ。２９の繰返しの後、上記サンプルを７２℃で１０分間維持し、及びその後４℃で保存した。このＰＣＲプロトコルは１１９９ｂｐの生成物を生成した。
Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ｍｓａ及びｔａｔＡ）、Ｌ． ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ａｒａＴ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ ａｒａＴ由来の遺伝子配列を以下のＰＣＲプロトコルを用いて増幅した。５０μＬ反応中に、０．１〜０．５μｇの鋳型、１．５μＭのそれぞれのプライマー、０．４ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、３．５Ｕ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及びＭｇを伴う１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液を添加した。使用されたサーモサイクラープログラムは９６℃での高温開始５分間、続いて以下の段階：９４℃で３０秒間、４０〜６０℃で１分４５秒間（勾配サーモサイクラー）及び７２℃で２分１５秒間の２９の繰返しを含んだ。２９の繰返し後、上記サンプルを７２℃で１０分間維持し、及びその後４℃で保存した。
それぞれのＲ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ｍｓａ遺伝子について、４２℃及び４８℃のアニーリング温度は複数の生成物を生成したが、明らかなバンドは約１４６４ｂｐであった。Ｌ． ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ａｒａＴについて、４２℃、４８℃、及び５６℃のアニーリング温度は１１７３ｂｐの強いバンドで単一の生成物を産出した。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｒａＴについて、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃のアニーリング温度はゲノムＤＮＡ及びコロニーの両方から単一の強い生成物（１１７３ｂｐ）を生成した。Ｌ． ｍａｊｏｒ ｂｓａｔについて、５５℃のアニーリング温度は最もきれいな生成物（１２３９ｂｐ）を与えた。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｔａｔＡ遺伝子について、５０〜５５℃のアニーリング温度は正しい大きさ（１２６０ｂｐ）のきれいな生成物を与えた。Ｅ． ｃｏｌｉ遺伝子及びＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｄａｔ遺伝子の両方について、５５〜６０℃のアニーリング温度を使用し、及び上記アニーリング時間を４５秒間に短縮した。正しい大きさのきれいな生成物が得られた（Ｅ． ｃｏｌｉ遺伝子について約１．３ｋｂ、ｄａｔ遺伝子について８５０ｂｐ）。
クローニング
上記ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて０．８又は１％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。上記ＰＣＲ産物をアガロースゲル上の標準に比較して定量し、及びその後Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）についての製造業者の推奨するプロトコルにしたがってＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した。
簡単に述べると、約０．２ｐｍｏｌの精製ＰＣＲ産物をｄＧＴＰの存在下で１Ｕ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで２２℃で３０分間処理した。上記ポリメラーゼは上記ＰＣＲ産物の３’末端から連続した塩基を除去する。ポリメラーゼがグアニン残基に出会うとき、上記酵素の５’〜３’ポリメラーゼ活性はエキソヌクレアーゼ活性を妨げ、さらなる切除を効果的に妨げる。これはｐＥＴ Ｘａ／ＬＩＣベクターと融和性である一重鎖オーバーハングを作出する。上記ポリメラーゼは７５℃で２０分間インキュベートすることにより不活性化される。
上記ベクター及び処理された挿入物をＮｏｖａｇｅｎにより推奨されるようにアニーリングした。約０．０２ｐｍｏｌの処理された挿入物及び０．０１ｐｍｏｌのベクターを２２℃で５分間インキュベートし、６．２５ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加し、及び２２℃でのインキュベーションを繰り返した。上記アニーリング反応（１μＬ）をＮｏｖａＢｌｕｅ（商標）ｓｉｎｇｌｅｓコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）に添加し、及び氷上で５分間インキュベートした。混合後、上記細胞を４２℃で３０秒間の熱ショックにより形質転換した。上記細胞を氷上に２分間置き、及び２５０μＬの室温のＳＯＣ中で３７℃で３０分間２２５ｒｐｍで振騰しながら回復させた。細胞をカナマイシン（２５〜５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上にまいた。
プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを用いて精製し、及びＸｈｏＩ及びＸｂａＩでの制限酵素消化により正しい挿入物についてスクリーニングした。正しい挿入物を有することがわかったプラスミドの配列をヂデオキシ鎖停止ＤＮＡシークエンシングにより実証した。
配列ＩＤ番号：１〜１４及び３１〜３２は組換えアミノトランスフェラーゼのヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列を示し、Ｇｅｎｂａｎｋ配列からのどの変化も上記タンパク質配列においてサイレント又は作出された保存的置換であった。配列ＩＤ番号：１１及び１２は新規配列である。
遺伝子発現及び分析
配列分析により実証されたプラスミドＤＮＡをＥ． ｃｏｌｉ発現宿主ＢＬＲ（ＤＥ３）又はＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）内にサブクローニングした。培養物を生育させ、及び上記プラスミドをＱｉａｇｅｎミニプレップキットを用いて単離し、及び同一性を確認するために制限酵素消化により分析した。
誘導はＢＬＲ（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内でＬ． ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ａｒａＴ、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｒａＴ、及びＳ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｔａｔＡではじめに行った。タイムコース研究をカナマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ中で０．５〜０．８のＯＤ600まで生育させた培養物で行い、及び１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）で誘導し、及び誘導後０、１、２、及び４時間でサンプリングした。２．０ｍＬからの細胞を１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％ ２−メルカプトエタノール、及び２０％グリセロールを含む０．１０ｍＬ １２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８中に再懸濁し、及び９５℃で１０分間熱し、及び冷却し、及び０．１０ｍＬのＨ2Ｏで希釈した。これらの全細胞タンパク質サンプルの等分を４〜５％勾配ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。２時間及び４時間誘導の間でも、ＢＬＲ（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の間でも、発現されたタンパク質の量において顕著な差はなかった。
細胞抽出物をまた０．２５μＬベンゾナーゼヌクレアーゼを含む０．２５ｍＬ Ｎｏｖａｇｅｎ ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬中に２ｍＬの培養物からの細胞ペレットを懸濁し、室温で２０分間穏やかに振騰しながらインキュベートし、及び細胞くずを除去するために１６，０００×ｇで遠心分離することにより、４時間サンプルから調製した。上記上清（細胞抽出物）を細胞可溶性タンパク質の分析のために４〜１５％勾配ゲル上にロードした。
３のクローン、（Ｌ． ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ａｒａＴ（配列ＩＤ番号：１１及び１２）、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｒａＴ（配列ＩＤ番号：９及び１０）、及びＳ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｔａｔＡ（配列ＩＤ番号：１及び２））は正しい大きさ（約４５ｋＤａ）に対応する可溶性タンパク質を示した。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｒａＴ遺伝子産物は最も高い値で過剰発現され、及び／又は他の２の遺伝子産物よりも可溶性であった。
続く発現方法において、陽性クローンからのプラスミドＤＮＡを、この宿主のよりよい成長特性のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）内にサブクローニングした。誘導は５０ｍｇ／Ｌでカナマイシンを含むＬＢ中で生育させた培養物で１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて繰り返し、ＯＤ600が約０．８に達したとき誘導した。細胞を３７℃での生育の４時間後に回収し、３０００ｒｐｍで１０分間（４℃）遠心分離し、ＴＥＧＧＰ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍｇ／Ｌグルタチオン、５％グリセロール）で洗浄し、及び−８０℃エタノール中でフラッシュ凍結乾燥させた。
サンプルを５μＬ／ｍＬのｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｅｔ ＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）及び１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼを含む５ｍＬ／ｇ細胞湿重量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）試薬中に再懸濁した。サンプルを軌道シェーカー上で室温で２０分間インキュベートした。不溶性細胞くずは１６，０００×ｇで２０分間４℃の遠心分離により除去した。
細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、及び以下のプロトコルを用いてインドール−ピルビン酸の生成を追うことによりトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性について分析した。１ｍＬ反応を５０ｍＭテトラホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ砒酸ナトリウム、５０μＭピリドキサルフォスフェート、５ｍＭ α−ケトグルタル酸塩、及び５ｍＭ Ｌ−トリプトファン中で行った。上記反応を細胞除去抽出物又は精製酵素の添加により開始し、及び３０℃で３０分間インキュベートした。２０％ ＴＣＡ（２００μＬ）を上記反応を停止させるために添加し、及び沈殿したタンパク質を遠心分離により除去した。３２７ｎｍでの吸収を計測し、及び分析緩衝液中に新しく調製したインドール−３−ピルビン酸塩の標準曲線と比較した。基質トリプトファンなしの又はｐＥＴ３０ａのみで形質転換したクローンからの細胞除去抽出物を用いたコントロール反応もまた行った。
細胞抽出物中のネイティブＥ．ｃｏｌｉアミノトランスフェラーゼからのバックグラウンドのために、組換えタンパク質を製造業者のプロトコル（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）にしたがってＨｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッヂを用いて精製した。溶離画分をＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）カラム上で脱塩し、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０中に溶離した。精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、及びアミノトランスフェラーゼ活性について分析した。
１ｍＭ ＩＰＴＧでの３７℃誘導（４時間）からの結果は、Ｌ． ｍａｊｏｒ ｂｓａｔ、Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｔａｔＡ、Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓｐＣ、及びＲ． ｓｈａｅｒｏｉｄｅｓ ｔａｔＡクローンの両方は顕著な値のトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性を有することを示した。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓからのａｒａＴタンパク質は過剰発現され、及び可溶性であったが、ほとんど酵素活性を示さなかった。Ｌ． ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ａｒａＴ遺伝子産物は細胞抽出物中では可溶性に見えたが、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッヂを用いた精製は正しい分子量を有する少量のみのタンパク質をもたらした。ｍｓａ遺伝子産物は不溶性であり、及びインクルージョンボディ形成を最小限にするためにさらなる発現実験が２４℃で行われた。１０μＭ〜１ｍＭの間のＩＰＴＧのいくつかの濃度を可溶性タンパク質の量を最大限にするために使用した。
表１は１分間当たり１ミリグラムタンパク質当たり形成されたインドール−３−ピルビン酸塩（Ｉ３Ｐ）のマイクログラムで計測された特異的活性を列挙する。いくつかの場合、非常に少量の組換えタンパク質は上記分析の有効直線範囲を超える高い値の活性を示した。これらの場合には、＞が特異的活性数の前についている。
Figure 0005351230
クローニングされた全ての組換えタンパク質を比較する並びは、ａｒａＴ、ｔａｔＡ、ｂｓａｔ、及びｍｓａ配列の間に多くの高く保存された領域はないことを示す。最も高い活性の組換えタンパク質：Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｔａｔＡ遺伝子産物ホモログ、Ｌ． ｍａｊｏｒ広範囲基質アミノトランスフェラーゼ、及びＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉチロシンアミノトランスフェラーゼの並びはいくつかの保存された領域を示した、しかしながら、それらはタンパク質値で約３０〜４３％のみ同一である。広範囲、Ｄ−特異的（Ｄ−アラニン）アミノトランスフェラーゼのアベイラビリティはモナチンの他の立体異性体の生成において有用でありうる。
実施例２
インドール−３−乳酸塩のインドール−３−ピルビン酸塩への変換
図１及び３中に見られるように、インドール−３−乳酸はインドール−３−ピルビン酸塩を生成するために使用されうる。乳酸及びピルビン酸塩の間の変換は可逆反応であり、インドール−３−ピルビン酸塩及びインドール−３−乳酸塩の間の変換も同じである。インドール−乳酸塩の酸化は典型的に、インドール−３−ピルビン酸塩からの３４０ｎｍでの高い量のバックグラウンドのために、続けられた。
標準の分析混合物は０．１ｍＬ中に１００ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ８．０、０．３ｍＭ ＮＡＤ+、７ユニットの乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（Ｓｉｇｍａ−Ｌ２３９５，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及び２ｍＭ 基質を含んだ。上記分析をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダーを用いてＵＶ−透明マイクロタイタープレート中で二重で行った。ポリペプチド及び緩衝液を混合し、及びインドール−３−乳酸及びＮＡＤ+を含むウェル中に移し、及びそれぞれのウェルの３４０ｎｍでの吸収を短い混合後９秒間隔で読んだ。反応を２５℃で５分間維持した。３４０ｎｍでの吸収における増大はＮＡＤ+からのＮＡＤＨの生成にしたがう。別々のネガティブコントロールをＮＡＤ+なしで及び基質なしで行った。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ２３９５）からのＤ−ＬＤＨはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ５２７５）からのＬ−ＬＤＨが示すよりもインドール−誘導基質でより活性を示すことがわかった。
同様の方法をＤ−ＬＤＨポリペプチドの天然基質である、Ｄ−乳酸及びＮＡＤ+又はＮＡＤＨ及びピルビン酸塩で利用した。ピルビン酸塩の還元についてのＶmaxは乳酸塩の酸化についてのＶmaxより１００〜１０００倍高かった。Ｄ−ＬＤＨでのインドール−３−乳酸の酸化反応についてのＶmaxは乳酸のそれの約５分の１であった。インドール−３−ピルビン酸塩の存在はまた０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５ｍＭ砒酸ナトリウムを含む５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて３２７（エノール−ホウ酸塩誘導体）での吸収における変化を追うことにより計測された。Ｌ及びＤ−ＬＤＨポリペプチドについてのネガティブコントロールと比較して、小さな、しかし繰り返されうる、吸収変化が観察された。
さらに、広範囲特異性乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２７、ＥＣ １．１．１．２８、及び／又はＥＣ １．１．２．３に関連する活性を有する酵素）はクローニングされ、及びインドール−３−乳酸からインドール−３−ピルビン酸塩を作出するために使用されうる。広範囲特異性デヒドロゲナーゼの源はＥ． ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍを含む。
あるいは、インドール−３−ピルビン酸塩はインドール−３−乳酸塩を、インドール乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１０）を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓからの細胞抽出物；又はインドール−３−ピルビン酸塩について活性を有することが知られるｐ−ヒドロキシフェニル乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２２２）を含むＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｅｐｉｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ細胞抽出物；又はイミダゾール−５−イル乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１１）を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ若しくはＥ． ｃｏｌｉ細胞抽出物；又はヒドロキシフェニルピルビン酸塩還元酵素（ＥＣ １．１．１．２３７）を含むＣｏｌｅｕｓ ｂｌｕｍｅｉ；又はＤ−芳香族乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２２２）を含むＣａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａと接触させることにより生成されうる。上記活性を示す引用文献は、Ｎｏｗｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ７１：１１９−２４，１９９２）、Ｊｅａｎ ａｎｄ ＤｅＭｏｓｓ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １４ １９６８）， Ｃｏｏｔｅ ａｎｄ Ｈａｓｓａｌｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １１１：２３７−９，１９６９）、Ｃｏｒｔｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃ． Ｒ． Ｓｅａｎｃｅｓ Ｓｏｃ． Ｂｉｏｌ． Ｆｉｌ． １６２ ３９０−５， １９６８）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ａｌｆｅｒｍａｎｎ（Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ． Ｃ： Ｂｉｏｓｃｉ． ４３ ５０１−４， １９８８）、及びＢｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３５：３５３−６０， １９８９）を含む。さらに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．からのものの如き乳酸塩オキシダーゼ（Ｇｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ：１８：２９９−３０５，２００２）はインドール−３−乳酸のインドール−３−ピルビン酸塩への酸化のために利用されうる。
実施例３
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを利用したＬ−トリプトファンのインドール−３−ピルビン酸塩への変換
この実施例は、実施例１中に示されるようにトリプトファンアミノトランスフェラーゼを用いることの代わりに、オキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．２）を介してトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸塩に変換するために使用される方法を示す。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼはＣｒｏｔａｌｕｓ ｄｕｒｉｓｓｕｓ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， カタログ番号Ａ−２８０５）から精製された。分子クローニングのためのＬ−アミノ酸オキシダーゼのアクセス番号は：ＣＡＤ２１３２５．１、ＡＡＬ１４８３１、ＮＰ＿４９０２７５、ＢＡＢ７８２５３、Ａ３８３１４、ＣＡＢ７１１３６、ＪＢ０２６６、Ｔ０８２０２、Ｓ４８６４４、ＣＡＣ００４９９、Ｐ５６７４２、Ｐ８１３８３、Ｏ９３３６４、Ｐ８１３８２、Ｐ８１３７５、Ｓ６２６９２、Ｐ２３６２３、ＡＡＤ４５２００、ＡＡＣ３２２６７、ＣＡＡ８８４５２、ＡＰ００３６００、及びＺ４８５６５を含む。
反応を総容積１ｍＬ中のマイクロ遠心分離管中で、３７℃で振騰しながら１０分間インキュベートして行った。上記反応混合物は５ｍＭ Ｌ−トリプトファン、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．６、０．５ｍＭ砒酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ テトラホウ酸ナトリウム、０．０１６ｍｇカタラーゼ（８３Ｕ、Ｓｉｇｍａ Ｃ−３３１５）、０．００８ｍｇ ＦＡＤ（Ｓｉｇｍａ）、及び０．００５〜０．１２５ユニットのＬ−アミノ酸オキシダーゼを含んだ。ネガティブコントロールはトリプトファン以外の全ての成分を含み、及びブランクはオキシダーゼ以外の全ての成分を含んだ。カタラーゼを酸化的脱アミノ化の間に形成される過酸化水素を除去するために使用した。テトラホウ酸ナトリウム及び砒酸ナトリウムを３２７ｎｍで最大吸収を示すインドール−３−ピルビン酸塩のエノールホウ酸塩形を安定化するために使用した。インドール−３−ピルビン酸塩標準を反応混合物中に０．１〜１ｍＭの濃度で調製した。
購入したＬ−アミノ酸オキシダーゼはｍｇタンパク質当たり１分間当たりに形成された５４０μｇインドール−３−ピルビン酸塩の特異的活性を有した。これはトリプトファンアミノトランスフェラーゼ酵素の特異的活性と同じ次数の等級である。
実施例４
アルドラーゼでインドール−３−ピルビン酸塩を２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸に変換すること
この例はアルドラーゼ（リアーゼ）を用いてインドール−３−ピルビン酸塩を２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸モナチン前駆体（ＭＰ）に変換するために使用されうる方法を示す（図２）。アルドール縮合はアルデヒド又はケトンのβ−炭素及び他のアルデヒド又はケトンのカルボニル炭素の間の炭素−炭素結合を形成する反応である。カルボアニオンは１の基質のカルボニル基の近隣の炭素上に形成され、及び第二の基質のカルボニル炭素（求電子炭素）を攻撃する求核剤としてはたらく。最も通常には、上記求電子基質はアルデヒドであり、そのためほとんどのアルドラーゼはＥＣ ４．１．２．−カテゴリーに入る。かなりしばしば、上記求核基質はピルビン酸塩である。アルドラーゼが２のケト−酸又は２のアルデヒドの間の縮合を触媒することは珍しい。
しかしながら、２のカルボン酸の縮合を触媒するアルドラーゼは同定されている。例えば、ＥＰ １０４５−０２９はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ培養物（ＥＣ ４．１．３．１６）を用いたグリオキシル酸及びピルビン酸塩からのＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成を示す。さらに、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩アルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩リアーゼ、ＥＣ ４．１．３．１７）は２のケト酸の縮合を触媒しうる。それゆえ、同様のアルドラーゼポリペプチドがインドール−３−ピルビン酸塩とピルビン酸塩の縮合を触媒するために使用された。
クローニング
４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩リアーゼ（ＰｒｏＡ アルドラーゼ、ＥＣ ４．１．３．１７）及び４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸塩グルオキシル酸塩−リアーゼ（ＫＨＧアルドラーゼ、ＥＣ ４．１．３．１６）は図２のアルドラーゼ反応に非常によく似た反応を触媒する。プライマーはｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）についての融和性のオーバーハングと共に設計された。これらのプライマーの設計は上記実施例１中に示される。
以下のプライマーはｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣクローニングのために設計された：
１．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ ｐｒｏＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：１２９６４６６３バージョン：１２９６４６６３）及びＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｐｒｏＡ遺伝子（配列ＩＤ番号：６５−６６、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）前向き５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＡＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＴＧＴ−３’及び逆向き５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＧＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：５５及び５６）。
２．Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ １０２１ ＳＭｃ００５０２遺伝子（ｐｒｏＡと同族、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：１５０７４５７９及びＣＡＣ４６３４４、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）前向き５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡ−３’及び逆向き５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＴＣＧＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：６１及び６２）。
３．Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＬＢ１２６ ｆｌｄＺ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：７５７３２４７バージョン：７５７３２４７、推定されているアシルトランスフェラーゼをコードする）前向き５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＴＣＣＡ−３’及び逆向き５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣＡ−３’（配列ＩＤ番号：５７及び５８）。
４．Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｅｙｓｅｒｉ ｐｃｍＥ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＡＦ３３１０４３バージョン：ＡＦ３３１０４３．１、オキサロシトラリンゴ酸塩アルドラーゼをコードする）前向き５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＣＧＧ−３’及び逆向き５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＡＴＴＣＣＡ−３’（配列ＩＤ番号：５９及び６０）。
５．Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＣＯ９２ ＹＰＯ００８２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：１５９７８１１５バージョン：１５９７８１１５、可能性のあるトランスフェラーゼをコードする）前向き５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＧＡＡ−３’及び逆向き５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＧＡ−３’（配列ＩＤ番号：６３及び６４）。
６．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｋｈｇ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｚ９９１１５．１ ＧＩ：２６３４４７８、１２６７１１−１２７３０１及びＣＡＢ１４１２７．１それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列）前向き５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＧＴＣＧＴＴＧＡ−３’及び逆向き５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：３５及び３６）。
７．Ｅ． ｃｏｌｉ ｋｈｇ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＥ０００２７９．１ １３３１−１９７２及びＡＡＣ７４９２０．１、それぞれ核酸及びアミノ酸配列）前向き５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧ−３’及び逆向き５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡ−３’（配列ＩＤ番号：３７及び３８）。
８．Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｋｈｇ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＬ５９１７９２．１ ＧＩ：１５０７５８５０、６５３５３−６４６７３及びＣＡＣ４７４６３．１、それぞれ核酸及びアミノ酸配列）前向き５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＧＡＧＧＧＧＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡ−３’及び逆向き５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＧＣＧＡＡＧ−３’（配列ＩＤ番号：３９及び４０）。
上記１〜２及び６〜８中に示される生物からのゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐプロトコルを用いて精製した。同様の技術を用いて、３〜５中に示される生物からのゲノムＤＮＡが精製されうる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ（ＡＴＣＣ ３３６３６）をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ及びヒドロキシ安息香酸培地中で３０℃で生育させた。Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（ＡＴＣＣ ４９２４９）をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ及びヒドロキシ安息香酸培地中で２６℃で生育させた。Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＬＢ１２６（Ｆｌｅｍｉｓｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＶＩＴＯ、Ｂ−２４００ Ｍｏｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）をＷａｔｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５２：８６１−７２，２００１）により示される方法にしたがって生育させた。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｅｙｓｅｒｉ（Ｇｕｌｆ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｕ．Ｓ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ， Ｇｕｌｆ Ｂｒｅｅｚｅ， ＦＬ ３２５６１，ＵＳＡ）をＥａｔｏｎ（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８３：３６８９−３７０３，２００１）により示されるプロトコルにしたがって生育させた。Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（ＡＴＣＣ ５１１２４）をＡＴＣＣ ＴＹ培地及びヒドロキシ安息香酸培地中で２６℃で生育させた。Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ株ＣＯ９２（ＡＴＣＣ）をＡＴＣＣ培地７３９ウマ血液アガー中で２６℃で生育させた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ６０５１（ＡＴＣＣ）をＢｃｒｅｔｏ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中で３０℃で生育させた。Ｅ． ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを実施例１中に示されるように株ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から単離した。
実施例１中に示されるＰＣＲ、クローニング及びスクリーニングプロトコルをＣ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ及びＳ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｐｒｏＡ配列、及びＥ． ｃｏｌｉ、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、及びＳ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｋｈｇ配列をクローニングするために使用した。同じ方法は上記に示される他の配列をクローニングするために使用されうる。
陽性クローンをＳ−タグ及びＴ７ターミネータープライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ）、及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）からの内部プライマーでヂデオキシ鎖停止シークエンシング（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）を用いてシークエンシングした。
発現及び活性分析
プラスミドＤＮＡ（配列分析により実証された）を発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にサブクローニングした。上記培養物を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを有するＬＢ培地中で生育させ、プラスミドをＱｉａｇｅｎスピンプラスミドミニプレップキットを用いて単離し、及び続いて同一性を確認するために制限酵素消化により分析した。誘導実験を３７℃で５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で生育させたＢＬ２１（ＤＥ３）構築物で行った。タンパク質発現を、ＯＤ600が約０．６に達した後、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。上記細胞を３０℃で４時間生育させ、及び遠心分離により回収した。上記細胞をその後Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解し、及びＨｉｓ−タグ組換えタンパク質を上記（実施例１）に示されるようにＨｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッヂを用いて精製した。精製タンパク質をＰＤ−１０ディスポーザブルカラム上で脱塩し、及び２ｍＭ ＭｇＣｌ2を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．３中で溶離した。
上記タンパク質を組換え融合タンパク質の予想されるＭＷで可溶性タンパク質の値を検出するために４〜１５％勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
上記タンパク質をインドール−３−ピルビン酸塩及びピルビン酸ナトリウムを基質として用いて活性について分析した。上記分析混合物は１ｍＬ中に１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７−ｐＨ８．９）、０−８ｍＭ ＭｇＣｌ2、３ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８）、及び６ｍＭのそれぞれの基質を含んだ。上記反応をさまざまな量のポリペプチド（例えば、１０〜１００μｇ）を添加することにより開始し、及び２５℃〜３７℃で３０分間インキュベートし、ろ過し、及びその後−８０℃で凍結した。
ｐｒｏＡ遺伝子産物での活性結果
Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｐｒｏＡ及びＳ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＳＭｃ００５０２遺伝子構築物の両方はＩＰＴＧで誘導されたとき高い値の発現を有した。上記組換えタンパク質は総タンパク質及び細胞抽出サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定されるように、高く可溶性であった。Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ遺伝子産物を＞９５％精製度まで精製した。Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ遺伝子産物の収率はＨｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッヂを用いたアフィニティ精製後非常に低かったので、細胞抽出物を酵素分析に使用した。
両方の組換えアルドラーゼはインドール−３−ピルビン酸塩及びピルビン酸塩からのＭＰの形成を触媒した。二価マグネシウム及びリン酸カリウムの両方の存在は酵素活性に必要とされた。インドール−３−ピルビン酸塩、ピルビン酸塩又はリン酸カリウムが存在しないとき、生成物は明らかでなかった。また少量の生成物が酵素の不在下で形成された（典型的に酵素が存在するときより１次数等級少ない）。
生成物ピークはインドール−３−ピルビン酸塩標準よりもわずかに遅く、逆相Ｃ１８カラムから溶離し、このピークのマススペクトルは２９２．１の衝突誘導親イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）を示し、上記親イオンは生成物ＭＰであると予測された。マススペクトル中に存在する主な娘断片はｍ／ｚ＝１５８（１Ｈ−インドール−３−カルボアルデヒドカルボニウムイオン）、１６８（３−ブタ−１，３−ヂエニル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、２７４（２９２−Ｈ2Ｏ）、２５６（２９２−２Ｈ2Ｏ）、２３８（２９２−３Ｈ2Ｏ）、２２８（２９２−ＣＨ４Ｏ３）、及び２０４（ピルビン酸塩の損失）でのものを含んだ。生成物はまた、２７９〜２８０のλmax及び約２９０ｎｍの小さなショルダーを有し、トリプトファンの如き他のインドール含有化合物のＵＶスペクトル特性を示した。
Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉアルドラーゼにより生成されるＭＰの量は室温〜３７℃の反応温度、基質の量、及びマグネシウムの量における増大と共に増大した。酵素の合成活性は増大するｐＨと共に減少し、観察される最高量生成物はｐＨ７であった。トリプトファン標準に基づいて、２０μｇの精製タンパク質を用いた標準分析の下に生成されるＭＰの量は１ｍＬ反応当たり約１０〜４０μｇであった。
Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ及びＣ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＰｒｏＡアルドラーゼコード配列の上記に示される他の遺伝子との高い程度のホモロジーのために、全ての上記組換え遺伝子産物はこの反応を触媒しうることが期待される。さらに、（Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉの番号システムに基づいて）５９及び８７位にスレオニン（Ｔ）、１１９にアルギニン（Ｒ）、１２０にアスパラギン酸（Ｄ）、及び３１及び７１にヒスチヂン（Ｈ）を有するアルドラーゼは同様の活性を有するであろうことが期待される。
ｋｈｇ遺伝子産物の活性結果
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＥ． ｃｏｌｉ ｋｈｇ遺伝子構築物の両方はＩＰＴＧで誘導されたとき高い値のタンパク質発現を有し、一方、Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｋｈｇはより低い値の発現を有した。上記組換えタンパク質は、総タンパク質及び細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により判断されるように、高く可溶性であった。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＥ． ｃｏｌｉ ｋｈｇ遺伝子産物を＞９５％精製度まで精製した；Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ遺伝子産物の収率はＨｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッヂを用いたアフィニティ精製後それほど高くなかった。
マグネシウム及びリン酸がこの酵素の活性に必要とされるという証拠はなかった。しかしながら、文献はリン酸ナトリウム緩衝液中で分析を行うことを報告し、及び酵素は伝えるところによれば二機能性であり、及び２−ケト−３−デオキシ−６−フォスフォグルコネート（ＫＤＰＧ）の如きリン酸化基質について活性を有する。上記酵素分析は上記に示されるように行われ、及びいくつかの場合、リン酸塩が省かれた。上記結果は、上記組換えＫＨＧアルドラーゼはＭＰを生成したが、ＰｒｏＡアルドラーゼほど活性ではなかったことを示す。いくつかの場合、ＫＨＧにより生成されるＭＰの値はマグネシウム及びリン酸塩のみにより生成される量とほとんど同一であった。リン酸塩はＫＨＧ活性を増大するようには見えなかった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ酵素はＳＲＭ（実施例１０を参照のこと）により決定されるように、最も高い活性、マグネシウム及びリン酸塩のみより約２０〜２５％高い活性を有した。Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ酵素は最も少ない量の活性を有し、それは発現において注目される折りたたみ及び可溶性の問題に関連しうる。全ての３の酵素は活性部位グルタミン酸（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ番号システム中の４３位）、及びピルビン酸塩とのＳｈｉｆｆ塩基形成に必要とされるリジン（１３０位）を有する；しかしながら、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素は４７位にアルギニンではなく、活性部位残基、スレオニンを含む。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＨＧはより小さく、及び活性部位スレオニンを有する他の酵素と共に、Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ及びＥ． ｃｏｌｉ酵素とは区別されるクラスター中にあるように見える。活性部位における相違はＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素の増大された活性の理由でありうる。
アルドラーゼ活性の改善
触媒抗体は天然アルドラーゼと同じくらい有効であり、広い範囲の基質を受けうる、及び図２中に示される反応を触媒するために使用されうる。
アルドラーゼはまた、例えば、リン酸塩必要性を除去するために及びエナンチオ選択性を逆にするためにＤＮＡシャッフリング及びエラーしやすいＰＣＲにより進化されるＫＤＰＧアルドラーゼ（上記に示されるＫＨＧと高く同族の）について以前に示されるように、方向付けられた進化により改善されうる。ＫＤＰＧアルドラーゼポリペプチドは、供与基質（ここでは、ピルビン酸塩）について高く特異的であるが、受容基質（すなわち、インドール−３−ピルビン酸塩）については比較的柔軟であるので、生化学反応において有用である（Ｋｏｅｌｌｅｒ ＆ Ｗｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ ４０９：２３９−９，２００１）。ＫＨＧアルドラーゼはピルビン酸塩のいくつかのカルボン酸との縮合について活性を有する。ＫＨＧアルドラーゼの哺乳類バージョンは、４−ヒドロキシ４−メチル２−オキソグルタル酸塩についてのより高い活性及び４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸塩の両方の立体異性体の受容を含んで、細菌バージョンより広い特異性を有すると考えられる。細菌の源はＲ異性体について１０倍優先性を有するように見える。ゲノムデータベース中で入手可能な１００近くのＫＨＧホモログがあり、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｅ． ｃｏｌｉ、及び哺乳類組織において活性が示されている。これらの酵素はモナチン生成のために所望されるエナンチオ特異性を調整するための出発点として使用されうる。
ピルビン酸塩及びケト酸である及び／又はインドールの如き嵩張る疎水性基を有する他の基質を利用するアルドラーゼはポリペプチドの特異性、速さ、及び選択性を調整するために「進化され」うる。本明細書中で示されるＫＨＧ及びＰｒｏＡアルドラーゼに加えて、これらの酵素の例は、非限定的に：ＫＤＰＧアルドラーゼ及び関連するポリペプチド（ＫＤＰＨ）；Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｔからのトランスカルボキシベンザルピルビン酸塩ヒドラターゼ−アルドラーゼ；ピルビン酸塩及び２−カルボキシベンズアルデヒド（芳香族環を含む基質）を縮合する４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブト−３−エノエートアルドラーゼ（２’−カルボキシベンザルピルビン酸塩アルドラーゼ）；またピルビン酸塩及び芳香族含有アルデヒドを基質として利用する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ及びＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓからのトランス−Ｏ−ヒドロキシベンジリデンピルビン酸塩ヒドラターゼ−アルドラーゼ；２−オキソ酸を基質として使用する及び生物Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおいて存在すると考えられる、３−ヒドロキシアスパラギン酸塩アルドラーゼ（エリスロ−３−ヒドロキシ−Ｌ−アスパラギン酸塩グリオキシレートリアーゼ）；ベンジル基を含む基質を利用する、ベンゾインアルドラーゼ（ベンズアルデヒドリアーゼ）；ヂヒドロネオプテリンアルドラーゼ；グリシンとベンズアルデヒドを縮合する、Ｌ−スレオ−３−フェニルセリンベンズアルデヒド−リアーゼ（フェニルセリンアルドラーゼ）；４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸塩アルドラーゼ；１，２−ヂヒドロキシベンジルピルビン酸塩アルドラーゼ；及び２−ヒドロキシベンザルピルビン酸塩アルドラーゼを含む。
所望の活性を有するポリペプチドは以下の方法を用いて問題のクローンをスクリーニングすることにより選択されうる。トリプトファン栄養要求体を、発現カセット上に問題のクローンを有するベクターで形質転換し、及び少量のモナチン又はＭＰを含む培地上で生育させる。アミノトランスフェラーゼ及びアルドラーゼ反応は可逆であるので、上記細胞はモナチンのラセミ混合物からトリプトファンを生成することができる。同様に、生物（組換え及び野生型の両方）はＭＰ又はモナチンを炭素及びエネルギー源として利用する能力によりスクリーニングされうる。標的アルドラーゼの１の源はさまざまなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ及びリゾ細菌株の発現ライブラリーである。シュードモナスは芳香族分子の分解のための多くの普通でない異化経路を有し、及びそれらはまた多くのアルドラーゼを含む；一方、リゾ細菌はアルドラーゼを含み、植物の根圏中で生育することが知られ、及びモナチンの生合成経路の構築について示される多くの遺伝子を有する。
実施例５
モナチン前駆体の化学合成
実施例４はインドール−３−ピルビン酸塩を２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸モナチン前駆体（ＭＰ）に変換するためにアルドラーゼを使用する方法を示した。この例はＭＰを化学的に合成する代替の方法を示す。
ＭＰは典型的なアルドール型縮合を用いることにより形成される（図４）。簡単に述べると、典型的なアルドール−型反応はＬＤＡ（リチウムヂイソプロピルアミド）、リチウムヘキサメチルヂシラザン又はブチルリチウムの如き強い塩基を用いたピルビン酸塩エステルのカルボアニオンの生成に関する。生成されたカルボアニオンはインドール−ピルビン酸塩と反応し、連結された生成物を形成する。
インドール窒素を保護するために使用されうる保護基は、非限定的に：ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、及びベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）を含む。カルボン酸についてのブロッキング基は、非限定的に、アルキルエステル（例えば、メチル、エチル、ベンジルエステル）を含む。上記保護基が使用されるとき、形成される生成物の立体化学を制御することは可能ではない。しかしながら、Ｒ２及び／又はＲ３が（Ｓ）−２−ブタノール、メタノール又はキラルアミンの如きキラル保護基である場合（図４）、これは他にまさり１のＭＰエナンチオマーの形成を好みうる。
実施例６
トリプトファン又はインドール−３−ピルビン酸塩のモナチンへの変換
２の酵素、アミノトランスフェラーゼ及びアルドラーゼを利用するｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスはトリプトファン及びピルビン酸塩からモナチンを生成した。第一の段階において、アルファ−ケトグルタル酸塩はインドール−３−ピルビン酸塩及びグルタミン酸塩を生成するアミン転移反応においてトリプトファンからのアミノ基の受容体であった。アルドラーゼは、Ｍｇ2+及びリン酸塩の存在下で、ピルビン酸塩がインドール−３−ピルビン酸塩と反応される第二の反応を触媒し、モナチンのアルファ−ケト誘導体（ＭＰ）、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸を生成した。第一の反応において形成されたグルタミン酸塩からのアミノ基の転移は所望の生成物、モナチンを生成した。上記生成物の精製及び特徴付けは、形成された異性体はＳ，Ｓ−モナチンであることを確立した。代替の基質、酵素、及び条件並びにこのプロセスになされた改善も示される。
酵素
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからのアルドラーゼ、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩リアーゼ（ＰｒｏＡ アルドラーゼ、ｐｒｏＡ遺伝子）（ＥＣ ４．１．３．１７）は実施例４中に示されるようにクローニングされ、発現され、及び精製された。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ． ｃｏｌｉ、及びＳ． ｍｅｌｉｌｏｔｉからの４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸塩グリオキシル酸塩リアーゼ（ＫＨＧアルドラーゼ）（ＥＣ ４．１．３．１６）は実施例４中に示されるようにクローニングされ、発現され、及び精製された。
モナチンを生成するためにアルドラーゼに関連して使用されるアミノトランスフェラーゼはＥ． ｃｏｌｉ ａｓｐＣ遺伝子によりコードされるＬ−アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｙｒＢ遺伝子によりコードされるチロシンアミノトランスフェラーゼ、Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＴａｔＡ酵素、Ｌ． ｍａｊｏｒ ｂｓａｔ遺伝子によりコードされる広範囲基質アミノトランスフェラーゼ又はブタ心臓からのグルタミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＩＩａ型）であった。非哺乳類タンパク質のクローニング、発現及び精製は実施例１中に示される。ブタ心臓からのグルタミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＩＩａ型）はＳｉｇｍａ（＃Ｇ７００５）から得られた。
ＰｒｏＡアルドラーゼ及びＬ−アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼを用いる方法
反応混合物は１リットル中に５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ８．０、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、３ｍＭリン酸カリウム、０．０５ｍＭリン酸ピリドキサル、１００ｍＭピルビン酸塩アンモニウム、５０ｍＭトリプトファン、１０ｍＭアルファ−ケトグルタル酸塩、１６０ｍｇの組換えＣ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＰｒｏＡアルドラーゼ（精製されていない細胞抽出物、〜３０％アルドラーゼ）、２３３ｍｇの組換えＥ． ｃｏｌｉ Ｌ−アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（精製されていない細胞抽出物、〜４０％アミノトランスフェラーゼ）を含んだ。酵素を除く全ての成分を共に混合し、及びトリプトファンが溶解されるまで３０℃でインキュベートした。上記酵素をその後添加し、及び上記反応溶液を３０℃でおだやかに振騰しながら（１００ｒｐｍ）３．５時間インキュベートした。酵素添加後０．５及び１時間に、固体トリプトファンの等分（それぞれ５０ｍｍｏｌｅｓ）を上記反応に添加した。添加されたトリプトファンの全ては溶解しなかったが、濃度は５０ｍＭ以上に維持された。３．５時間後、上記固体トリプトファンをろ過した。定義された量のトリプトファンを標準として用いたＬＣ／ＭＳによる上記反応混合物の分析は、上記溶液中のトリプトファン濃度は６０．５ｍＭであり、及びモナチン濃度は５．８１ｍＭ（１．０５ｇ）であることを示した。
以下の方法は最終生成物を精製するために使用された。透明な溶液の９０パーセントをＢｉｏＲａｄ ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂（２２５ｍＬ；１．７ｍｅｑ／ｍＬの結合キャパシティ）のカラムにのせた。上記カラムを、２８０ｎｍの吸収が画分をとおしてはじめの流分の＜５％になるまで水で洗浄し、３００ｍＬ画分を集めた。上記カラムをその後１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８．４で溶離し、４の３００ｍＬ画分を集めた。全ての４の画分はモナチンを含み、及び微温水浴を伴うロト−エヴァポレーターを用いて１０５ｍＬまで蒸発させた。容積が減少されるにつれて沈殿物が形成され、及び蒸発プロセスの過程にわたりろ過された。
ＬＣ／ＭＳによるカラム画分の分析は、トリプトファン及びモナチンの９９％がカラムに結合したことを示した。蒸発プロセスの間に形成された沈殿物は＞９７％トリプトファン及び＜２％モナチンを含んだ。上清中のトリプトファン：生成物の割合は約２：１であった。
上記上清（７ｍｌ）を、事前に０．５Ｌ １Ｍ ＮａＯＨ、０．２Ｌ水、１．０Ｌの１．０Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８．０、及び０．５Ｌ水で洗浄することにより酢酸形に変換された１００ｍＬ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムにのせた。上記上清を＜２ｍＬ／分でロードし、及び上記カラムを２８０ｎｍの吸収が〜０になるまで３〜４ｍＬ／分で水で洗浄した。モナチンは１００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ８．０で溶離し、４の１００ｍＬ画分を集めた。
上記画分の分析は、画分をとおした流分中のトリプトファン：モナチンの割合は８５：１５であり、及び溶離画分中の割合は７：９３であることを示した。モナチンの２８０ｎｍでの吸光係数がトリプトファンと同じであると仮定すると、溶離画分は０．１４６ｍｍｏｌｅの生成物を含んだ。１Ｌ反応全体についての推定は、６８％の回復について、〜２．４ｍｍｏｌｅｓ（〜７１０ｍｇ）のモナチンを生成するであろう。
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶離画分を＜２０ｍＬまで蒸発させた。上記生成物の等分をさらに分析−スケールモナチン特徴付けについて実施例１０中に示されるものと同じクロマトグラフィー条件を用いてＣ8調製済み逆相カラムへの適用により精製した。Ｗａｔｅｒｓ Ｆｒａｃｔｉｏｎｌｙｎｘ（商標）ソフトウェアをｍ／ｚ＝２９３イオンの検出に基づいてモナチンの自動化された画分回収を引き起こすために使用した。モナチンに対応するプロトン化分子イオンを有するＣ8カラムからの画分を集め、乾燥するまで蒸発させ、及びその後少量の水中に溶解した。この画分を生成物の特徴付けのために使用した。
生ずる生成物を以下の方法を用いて特徴付けた。
ＵＶ／可視スペクトロスコピー 酵素的に生成されたモナチンのＵＶ／可視スペクトロスコピーの計測はＣａｒｙ １００ Ｂｉｏ ＵＶ／可視スペクトロフォトメーターを用いて行われた。水中に溶解された精製生成物は、インドール含有化合物に典型的な特徴である、２８８ｎｍのショルダーを伴う２８０ｎｍの吸収最大値を示した。
ＬＣ／ＭＳ分析 ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学反応に由来するモナチンについての混合物の分析を実施例１０中に示されるように行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素的合成的混合物におけるモナチンの典型的なＬＣ／ＭＳ分析は図５中に例示される。図５の下のパネルはｍ／ｚ＝２９３のモナチンのプロトン化分子イオンについての選択されたイオンクロマトグラムを例示する。混合物中におけるモナチンのこの同定は図６中に例示されるマススペクトルにより確証された。ＬＣ／ＭＳによる精製生成物の分析は２９３の分子イオン及び２８０ｎｍの吸収を有する単一のピークを示した。上記マススペクトルは図６中に示されるものと同一であった。
ＭＳ／ＭＳ分析 実施例１０中に示されるように、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン実験をまたモナチンについて行った。モナチンの娘イオンマススペクトルは図７中に例示される。図７中に標識化される全ての断片イオンの仮の構造割当てがなされた。これらはｍ／ｚ＝２７５（２９３−Ｈ2Ｏ）、２５７（２９３−（２×Ｈ2Ｏ））、２３０（２７５−ＣＯＯＨ）、２１２（２５７−ＣＯＯＨ）、１６８（３−ブタ−１，３−ヂエニル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、１５８（１Ｈ−インドール−３−カルボアルデヒドカルボニウムイオン）、１４４（３−エチル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、１３０（３−メチレン−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、及び１１８（インドールカルボニウムイオン）の断片イオンを含む。上記分子のインドール部分に由来する場合に予想されるように、これらの多くはＭＰについて得られるものと同じである（実施例４）。いくつかは、ケトンの代わりのアミノ基の存在のために、ＭＰについて見られるものより１マス単位高い。
高分解ＭＳ分析 図８はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｑ−Ｓｔａｒ ｈｙｂｒｉｄ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ／ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔマススペクトロメーターを使用して精製モナチンについて得られたマススペクトルを例示する。トリプトファンを内部マス較正標準として用いたプロトン化モナチンについての計測されたマスは２９３．１１４４であった。本質的な組成であるＣ14Ｈ17Ｎ2Ｏ5に基づいた、プロトン化モナチンの計算されたマスは２９３．１１３７である。これは１００万（ｐｐｍ）当たり２部分未満のマス計測誤差であり、酵素的に生成されたモナチンの本質的な組成の確証を提供する。
ＮＭＲスペクトロスコピー ＮＭＲ実験をＶａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ５００ＭＨｚ器械上で行った。モナチンのサンプル（〜３ｍｇ）を０．５ｍｌのＤ2Ｏ中に溶解した。はじめに、溶媒（Ｄ2Ｏ）を４．７８ｐｐｍで内部リファレンスとして使用した。水についてのピークが大きかったので、1Ｈ−ＮＭＲを水についてのピークの抑制で行った。続いて、水のピークの広さのために、モナチンのＣ−２プロトンをリファレンスピークとして使用し、及び７．１９２ｐｐｍの公表された値で設定した。
13Ｃ−ＮＭＲについて、数百スキャンのはじめのランは、上記サンプルが分配された時間内に十分な13Ｃスペクトルを得るには薄すぎることを示した。それゆえ、ヘテロ核多量子結合（ＨＭＱＣ）実験を行い、それは水素及びそれらが結合する炭素の相互関係を可能にし、及びまた上記炭素の化学シフトについての情報を提供した。
1Ｈ及びＨＭＱＣデータの要約は表２及び３中に見られる。公表された値との比較により、上記ＮＭＲデータは、酵素的に生成されたモナチンは（Ｓ，Ｓ）、（Ｒ，Ｒ）又は両方の混合物のいずれかであることを示した。
キラルＬＣ／ＭＳ分析 ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されたモナチンが１の異性体であり、及び（Ｒ，Ｒ）及び（Ｓ，Ｓ）エナンチオマーの混合物でないことを確立するために、キラルＬＣ／ＭＳ分析を実施例１０中に示される器械を用いて行った。
キラルＬＣ分離を室温でＣｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）キラルクロマトグラフィーカラムを用いて行った。業者からの公開されたプロトコルに基づいた、分離及び検出をトリプトファンのＲ−（Ｄ）及びＳ−（Ｌ）異性体について最適化した。上記ＬＣ移動相はＡ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む水；Ｂ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むメタノールから成った。溶離は７０％Ａ及び３０％Ｂでイソクラティックであった。流速は１．０ｍＬ／分であり、及びＰＤＡ吸収を２００ｎｍ〜４００ｎｍまでモニターした。トリプトファン及びモナチンのキラルＬＣ／ＭＳ分析について使用される器械パラメーターはＬＣ／ＭＳ分析について実施例１０中に示されるものと同一である。領域ｍ／ｚ １５０〜４００についてのマススペクトルの収集を利用した。プロトン化分子イオンについての選択されたイオンクロマトグラム（Ｒ−及びＳ−トリプトファンの両方について［Ｍ＋Ｈ］+＝２０５及びモナチンについて［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３）は混合物中でのこれらの分析物の直接的な同定を許容した。
キラルクロマトグラフィーにより分離される及びＭＳによりモニターされる、Ｒ−及びＳ−トリプトファン及びモナチンのクロマトグラムは図９中に示される。モナチンのクロマトグラムにおける単一のピークは、上記化合物が、Ｓ−トリプトファンとほとんど同一のリテンション時間を有する、１の異性体であることを示す。
Figure 0005351230
Figure 0005351230
偏光分析 光回旋をＲｕｄｏｌｐｈ Ａｕｔｏｐｏｌ ＩＩＩ偏光計測器上で計測した。モナチンを水中の１４．６ｍｇ／ｍＬ溶液として調製した。Ｓ，Ｓモナチン（塩形）についての予想された特異的回旋（［α］D 20）は水中の１ｇ／ｍＬ溶液について−４９．６である（Ｖｌｅｇｇａａｒ ｅｔ ａｌ）。観察された［α］D 20は精製された、酵素的に生成されたモナチンについて−２８．１であり、そのことはそれがＳ，Ｓ異性体であることを示した。
改善
試薬及び酵素濃度を含む反応条件を最適化し、及び１０ｍｇ／ｍＬの収率が以下の試薬混合物を用いて作出された：
５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ８．３、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００ｍＭピルビン酸塩（ナトリウム又はアンモニウム塩）、５ｍＭアルファ−ケトグルタル酸塩（ナトリウム塩）、０．０５ｍＭリン酸ピリドキサル、酵素の添加後１ｍＬの最終容積を達成するための脱気水、３ｍＭリン酸カリウム、５０μｇ／ｍＬの組換えＰｒｏＡアルドラーゼ（細胞抽出物；１６７μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度）、Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓｐＣ遺伝子によりコードされる１０００μｇ／ｍＬのＬ−アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（細胞抽出物；２５００μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度）、及び＞６０ｍＭの濃度を得るための固体トリプトファン（飽和；いくらかは反応をとおして溶解されないままである）。上記混合物を穏やかに攪拌しながら又は混合しながら３０℃で４時間インキュベートした。
置換
アルファ−ケトグルタル酸塩の濃度は１ｍＭまで減少され、及び９ｍＭアスパラギン酸塩で補充され、モナチンの相当収率を与える。オキサロ酢酸塩の如き、代替のアミノ酸受容体は第一段階において利用されうる。
組換えＬ． ｍａｊｏｒ広範囲基質アミノトランスフェラーゼがＥ． ｃｏｌｉＬ−アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼの代わりに使用されたとき、同様のモナチン収率が達成された。しかしながら、２９２の分子量を有する第二の同定されていない生成物（主要生成物の３〜１０％）もまたＬＣ−ＭＳ分析により検出された。Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｙｒＢをコードする酵素、Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ ｔａｔＡをコードする酵素又はブタ心臓からのグルタミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＩＩａ型）がアミノトランスフェラーゼとして添加されたとき、０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬのモナチン濃度が生成された。インドール−３−ピルビン酸塩から反応を出発するとき、還元的アミン化がグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＨで最終段階のためになされうる（実施例７中のように）。
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ． ｃｏｌｉ、及びＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉからのＫＨＧアルドラーゼはまた酵素的にモナチンを生成するためにＥ． ｃｏｌｉ Ｌ−アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼと共に使用された。以下の反応条件が使用された：５０ｍＭ ＮＨ4−ＯＡｃ ｐＨ８．３、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００ｍＭピルビン酸塩、５ｍＭグルタミン酸塩、０．０５ｍＭリン酸ピリドキサル、酵素添加後に０．５ｍＬの最終容積を達成するための脱気水、３ｍＭリン酸カリウム、２０μｇ／ｍＬの組換えＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＫＨＧアルドラーゼ（精製済み）、細胞抽出物から精製されていないｃａ．４００μｇ／ｍＬのＥ． ｃｏｌｉ Ｌ−アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、及び１２ｍＭインドール−３−ピルビン酸塩。上記反応を振騰しながら３０℃で３０分間インキュベートした。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素を用いて生成されたモナチンの量は８０ｎｇ／ｍＬであり、及びアルドラーゼの増量と共に増大された。インドール−３−ピルビン酸塩及びグルタミン酸塩が飽和量のトリプトファン及び５ｍＭアルファ−ケトグルタル酸塩により置換された場合、モナチンの生成は３６０ｎｇ／ｍＬまで増大された。反応を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３中で、飽和量のトリプトファンを伴って、３０μｇ／ｍＬの３のＫＨＧ酵素のそれぞれで繰り返し、及び検出を増大させるために１時間進行させた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ酵素は実施例４中のように最も高い活性を有し、約４０００ｎｇ／ｍＬのモナチンを生成した。Ｅ． ｃｏｌｉ ＫＨＧは３０００ｎｇ／ｍＬのモナチンを生成し、及びＳ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ酵素は２３００ｎｇ／ｍＬを生成した。
実施例７
ＭＰ及びモナチンの間の内部変換
モナチンを形成するためのＭＰのアミン化は実施例１及び６中に同定されるものの如きアミノトランスフェラーゼにより又はＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨの如き還元共因子を必要とするデヒドロゲナーゼにより触媒されうる。これらの反応は可逆であり、及びいずれかの方向で計測されうる。デヒドロゲナーゼ酵素を用いるとき、方向性はアンモニウム塩の濃度により主に制御されうる。
デヒドロゲナーゼ活性 モナチンの酸化的脱アミン化を、ＮＡＤ（Ｐ）+がより発色性のＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換されるときの３４０ｎｍの吸収における増大を追うことによりモニターした。モナチンは実施例６中に示されるように酵素的に生成され、及び精製された。
典型的な分析混合物は０．２ｍＬ中に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〜８．９、０．３３ｍＭ ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+、２〜２２ユニットのグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、及び１０〜１５ｍＭ基質を含んだ。分析をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダー上で、ＵＶ−透明マイクロタイタープレート中で二重で行った。酵素、緩衝液、及びＮＡＤ（Ｐ）+の混合物を基質を含むウェル中に移し、及び３４０ｎｍの吸収における増大を短い混合後１０秒間隔でモニターした。上記反応を２５℃で１０分間インキュベートした。ネガティブコントロールを基質の添加なしで行い、及びグルタミン酸塩をポジティブコントロールとして利用した。ウシ肝臓からのＩＩＩ型グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ−７８８２）はグルタミン酸塩のアルファ−ケトグルタル酸塩への変換速度の約１００分の１の変換速度でモナチンのモナチン前駆体への変換を触媒した。
アミン転移活性 モナチンアミノトランスフェラーゼ分析をＥ． ｃｏｌｉからのアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、Ｅ． ｃｏｌｉからのチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴｙｒＢ）、Ｌ． ｍａｊｏｒからの広範囲基質アミノトランスフェラーゼ（ＢＳＡＴ）、及び実施例１中に示される２の商業的に入手可能なブタグルタミン酸塩−オキサロ酢酸塩アミノトランスフェラーゼで行った。オキサロ酢酸塩及びアルファ−ケトグルタル酸塩の両方はアミノ受容体として試験された。分析混合物は（０．５ｍＬ中に）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０５ｍＭ ＰＬＰ、５ｍＭアミノ受容体、５ｍＭモナチン、及び２５μｇのアミノトランスフェラーゼを含んだ。上記分析を３０℃で３０分間インキュベートし、及び上記反応を０．５ｍＬイソプロピルアルコールの添加により停止させた。モナチンの損失をＬＣ／ＭＳによりモニターした（実施例１０）。最も高い量の活性はＬ． ｍａｊｏｒ ＢＳＡＴでオキサロ酢酸塩をアミノ受容体とした場合、続いて同じ酵素でアルファ−ケトグルタル酸塩をアミノ受容体とした場合で見られた。オキサロ酢酸塩での比較活性は：ＢＳＡＴ＞ＡｓｐＣ＞ブタＩＩａ型＞ブタＩ型＝ＴｙｒＢであった。アルファ−ケトグルタル酸塩での比較活性は：ＢＳＡＴ＞ＡｓｐＣ＞ブタＩ型＞ブタＩＩａ型＞ＴｙｒＢであった。
実施例８
トリプトファン及びピルビン酸塩以外のＣ３源からのモナチン生成
上記実施例６中に示されるように、インドール−３−ピルビン酸塩又はトリプトファンはピルビン酸塩をＣ３分子として用いてモナチンに変換されうる。しかしながら、いくつかの場合、ピルビン酸塩は好ましい生の材料ではない場合もある。例えば、ピルビン酸塩は他のＣ３炭素源よりもより高価でありうる又は培地に添加される場合、発酵に悪い影響を及ぼしうる。アラニンは多くのＰＬＰ−酵素によりアミン転移され、ピルビン酸塩を生成しうる。
トリプトファナーゼのような酵素はアミノトランスフェラーゼの如き他のＰＬＰ酵素よりも速い速度でベータ−消去反応を行う。このクラスからの酵素（４．１．９９．−）は、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｓ−アルキル−Ｌ−システイン、Ｏ−アシル−Ｌ−セリン、３−クロロ−Ｌ−アラニンの如き、よい脱離基を有するＬ−セリン、Ｌ−システイン、及びセリン及びシステインの誘導体の如きアミノ酸からアンモニア及びピルビン酸塩を生成しうる。
ＥＣ ４．１．９９．−ポリペプチドを用いてモナチンを生成するプロセスはＭｏｕｒａｔｏｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１３２０−５，１９９９）の方法にしたがって、β−チロシナーゼ（ＴＰＬ）又はトリプトファナーゼを突然変異させることにより改善されうる。Ｍｏｕｒａｔｏｕ ｅｔ ａｌ．は、天然には起こると報告されていない、β−チロシナーゼをヂカルボキシルアミノ酸β−リアーゼに変換する能力を示す。特異性における変化はバリン（Ｖ）２８３をアルギニン（Ｒ）に及びアルギニン（Ｒ）１００をスレオニン（Ｔ）に変換することにより達成された。これらのアミノ酸変化は、リアーゼが（アスパラギン酸塩の如き）加水分解脱アミン化反応のためのヂカルボキシルアミノ酸を受けることを可能にする。それゆえ、アスパラギン酸塩はまた、続くアルドール縮合反応のためのピルビン酸塩源として使用されうる。
さらに、細胞又は酵素反応は乳酸塩及び乳酸塩をピルビン酸塩に変換する酵素で補充されうる。この反応を触媒することができる酵素の例は乳酸塩デヒドロゲナーゼ及び乳酸塩オキシダーゼを含む。
ゲノムＤＮＡの単離
トリプトファナーゼポリペプチドは、例えば、Ｍｏｕｒａｔｏｕ ｅｔ ａｌ．（ＪＢＣ ２７４：１３２０−５，１９９９）中で以前に報告されている。トリプトファナーゼポリペプチドをコードする遺伝子を単離するために、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ１０ＢからのゲノムＤＮＡを実施例１中に示されるようにＰＣＲのための鋳型として使用した。
チロシン−フェノールリアーゼについての遺伝子をＣ． ｆｒｅｕｎｄｉｉ（ＡＴＣＣ カタログ番号８０９０、Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＡＴＣＣ １３３１６；ＮＣＴＣ９７５０）から単離し、及びＮｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ ０００１）及びｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ ０００３）上で３７℃で２．０のＯＤになるまで生育させた。ゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（商標）１００／Ｇキットを用いて精製した。
コード配列のＰＣＲ増幅
プライマーを上記実施例１中に示されるように、ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）についての融和性のオーバーハングと共に設計した。
Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｎａ（配列ＩＤ番号：４１）。ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣクローニングのためのＮ−末端プライマー：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：４３）。ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣクローニングのためのＣ−末端プライマー：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：４４）。
Ｃ． ｆｒｅｕｎｄｉｉ ｔｐｌ（配列ＩＤ番号：４２）。ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣクローニングのためのＮ−末端プライマー：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＡＡＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：４５）。ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣクローニングのためのＣ−末端プライマー：５’−ＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＡＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：４６）。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔ ５３３１ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを全てのＰＣＲ反応のために使用した。５０μＬ中に０．５μｇ鋳型（ゲノムＤＮＡ）、１．０μＭのそれぞれのプライマー、０．４ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、３．５Ｕ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｍｇを伴う１×Ｅｘｐａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ、及び５％ＤＭＳＯ（最終濃度）を添加した。使用されるサーモサイクラーＰＣＲプログラムは以下のとおりである：９６℃高温開始（５分間）、９４℃−３０秒間、４０〜６０℃−１分４５秒間、７２℃−２分１５秒間；３０回繰返し。最終ポリメライゼーション段階は７分間であり、及び上記サンプルをその後４℃で貯蔵した。
クローニング
上記実施例１中に詳述されるクローニング及びポジティブクローン同定手順を適切なクローンを同定するために使用した。
遺伝子発現及び活性分析
（配列分析により実証された）プラスミドＤＮＡを発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にサブクローニングした。培養物を３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地中で生育させ、プラスミドをＱｉａｇｅｎミニプレップキットを用いて単離し、及び同一性を確認するために制限酵素消化により分析した。
誘導実験をＢＬ２１（ＤＥ３）発現宿主で行い、上記構築物を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で３７℃で生育させた。タンパク質発現を、上記培養物のＯＤ600が約０．６に達した後、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。上記細胞を３０℃で４時間生育させ、及び遠心分離により回収した。上記細胞をその後５μＬ／ｍＬのプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃ＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及び１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含む５ｍＬ／ｇ細胞湿重量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）試薬中に溶解し、及びＨｉｓ−タグを付けた組換えタンパク質を上記実施例１中に示されるようにＨｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッヂを用いて精製した。精製タンパク質をＰＤ−１０（Ｇ２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラム上で脱塩し、及び１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．０中に溶離した。上記タンパク質を組換え融合タンパク質の予想されるＭＷでの可溶性タンパク質の値についてチェックするために４〜１５％勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
突然変異
ポリペプチドクラス４．１．９９．−（トリプトファナーゼ及びβ−チロシナーゼ）のいくつかのメンバーは改変なしにアスパラギン酸塩又は同様のアミノ酸でベータ−リアーゼ反応を行うであろう。しかしながら、上記クラスのいくつかのメンバーは上記基質の使用及び／又は生成物の作出を許容するために変異される必要がありうる。さらに、いくつかの場合、変換を行いうるポリペプチドは突然変異によりさらに最適化されうる。
位置特異的突然変異をＰＬＰ−結合ポリペプチドの３Ｄ構造分析に基づいて行った。ポリペプチドの基質特異性を変化させる２の例は以下に示される。
トリプトファナーゼの突然変異実施例１
以下に提供される突然変異プロトコルはアミノ酸配列中に２のポイント突然変異を導入した。第一のポイント突然変異は１０３位のアルギニン（Ｒ）をスレオニン（Ｔ）に変え、及び第二のポイント突然変異は２９９位のバリン（Ｖ）をアルギニン（Ｒ）に変えた（Ｅ． ｃｏｌｉ成熟タンパク質についての番号システム）。突然変異実験をＡＴＧ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ， ＭＮ）により行った。突然変異を遺伝子断片のＰＣＲにより連続して導入し、及び断片の再配列もＰＣＲにより達成された。アルギニン（Ｒ）１０３をスレオニン（Ｔ）に変換するためのプライマー：５’−ＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴＴ−３’（配列ＩＤ番号：４７）及び５’−ＴＧＣＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＣＧＧＡＡＴＧＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：４８）。
バリン（Ｖ）２９９をアルギニン（Ｒ）に変換するためのプライマー：５’−ＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＡＡＡＧＧＧＴＴＣＴＧＣＡＣＴＣＧＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：４９）及び５’−ＣＴＴＴＧＣＣＧＣＧＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＣＧＡＣＡ−３’（配列ＩＤ番号：５０）。
突然変異をＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩでの制限酵素消化によりスクリーニングし、及びシークエンシングにより実証した。
チロシンフェノールリアーゼ（β−チロシナーゼ）の突然変異実施例２
２のポイント突然変異をチロシンフェノールリアーゼアミノ酸配列に行った。これらの突然変異は１００位のアルギニン（Ｒ）をスレオニン（Ｔ）に及び２８３位のバリン（Ｖ）をアルギニン（Ｒ）に変換した（Ｃ． ｆｒｅｕｎｄｉｉ成熟タンパク質配列において）。
Ｒ１００Ｔ変換のためのプライマーは：５’−ＡＧＧＧＧＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＡＴＣＧ−３’（配列ＩＤ番号：５１）及び５’−ＡＧＧＧＧＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＡＴＣＧ−３’（配列ＩＤ番号：５２）であった。Ｖ２８３Ｒ変換のためのプライマーは：５’−ＧＴＴＡＧＴＣＣＧＣＧＴＣＴＡＣＧＡＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡＴ−３’（配列ＩＤ番号：５３）及び５’−ＧＴＡＧＡＣＧＣＧＧＡＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列ＩＤ番号：５４）であった。
上記に示される方法を使用し、及び上記クローンをＫｐｎＩ／ＳａｃＩ消化、及びＢｓｔＸ Ｉ消化によりスクリーニングした。上記配列をヂデオキシ鎖停止シークエンシングにより実証した。組換えタンパク質を野生型酵素について上記に示されるように作出した。
上記反応混合物は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．３、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００ｍＭ Ｃ３炭素源、５ｍＭ アルファ−ケトグルタル酸ナトリウム塩、０．０５ｍＭリン酸ピリドキサル、酵素添加後に０．５ｍＬの最終容積を達成するための脱気水、３ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、実施例４中のように調製される２５μｇの粗い組換えＣ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＰｒｏＡアルドラーゼ、実施例１中で調製される５００μｇの粗いＬ−アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、及び＞６０ｍＭの濃度を得るための固体トリプトファン（飽和；いくらかは反応をとおして溶解されないままであった）から成った。上記反応混合物を混合しながら３０℃で３０分間インキュベートした。セリン、アラニン、及びアスパラギン酸塩は３−炭素源として補充された。分析をベータ−消去及びベータ−リアーゼ反応を行うことができる（精製された）第二のＰＬＰ酵素（トリプトファナーゼ（ＴＮＡ）、二重突然変異トリプトファナーゼ、β−チロシナーゼ（ＴＰＬ））あり及びなしで行った。結果は表４中に示される：
Figure 0005351230
３−炭素源としてアラニン及びセリンから生成されるモナチンはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘スキャン分析により実証され、及び実施例６中で生成される特徴付けられたモナチンと同一であった。アラニンは試験された最もよい代替物であり、及びＡｓｐＣ酵素によりアミノ転移された。生成されたモナチンの量は、第二の活性としてアミノ転移をすることができる、トリプトファナーゼの添加により増大された。炭素源としてセリンで生成されたモナチンの量は、アミノトランスフェラーゼに比較して５分の１量のトリプトファナーゼが添加されただけであるが、トリプトファナーゼ酵素の添加により２倍近くになった。ＡｓｐＣはある量のベータ−消去活性のみをすることができる。アスパラギン酸塩での結果は、アスパラギン酸塩に対するトリプトファナーゼ活性はβ−チロシナーゼについて以前に示唆されたのと同じ位置特異的突然変異で増大しないことを示す。突然変異体β−チロシナーゼはモナチンの生成についてより高い活性を有するであろうことが期待される。
実施例９
モナチンの化学合成
インドール−３−ピルビン酸へのアラニンの添加はモナチンを生成し、及びこの反応はＧｒｉｇｎａｒｄ又は有機リチウム試薬で合成的に行われうる。
例えば、カルボキシル及びアミノ基で適切にブロックされた３−クロロ−又は３−ブロモ−アラニンに無水条件下でマグネシウムを添加する。（適切にブロックされた）インドール−３−ピルビン酸塩がその後添加され、連結した生成物を形成し、続いて保護基が除去され、モナチンを形成する。特に有用な保護基は、容易に結合され及び除去されるＴＨＰ（テトラヒドロピラニルエーテル）を含む。
実施例１０
モナチン及びＭＰの検出
この実施例はモナチン又はその前駆体２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の存在を検出するために使用される方法を示す。
ＬＣ／ＭＳ分析
ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ生化学反応に由来するモナチンのアルファ−ケト酸形（モナチン前駆体、ＭＰ）及びモナチンについての混合物の分析をクロマトグラフ及びＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅマススペクトロメーターの間に直列に置かれたＷａｔｅｒｓ ９９６ Ｐｈｏｔｏ−Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ（ＰＤＡ）吸収モニターを有するＷａｔｅｒｓ ２６９０液体クトマトグラフを含む、Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）器械を用いて行った。ＬＣ分離をＳｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ18逆相クロマトグラフィーカラム、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ又はＸｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ8逆相クロマトグラフィーカラム、２．１ｍｍ×２５０ｍｍを用いて室温で行った。ＬＣ移動相はＡ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む水及びＢ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むメタノールから成った。
勾配溶離は５％Ｂ〜３５％Ｂ直線で０〜９分、３５％Ｂ〜９０％Ｂ直線で９〜１６分、９０％Ｂイソクラティックで１６〜２０分、９０％Ｂ〜５％Ｂ直線で２０〜２２分であり、ランの間に１０分間の再平衡化時間を有した。上記流速は０．２５ｍＬ／分であり、及びＰＤＡ吸収を２００ｎｍ〜４００ｎｍでモニターした。ＥＳＩ−ＭＳの全てのパラメーターは問題の分析物のプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］+）の生成、及び特徴的な断片イオンの生成に基づいて最適化され及び選択された。
以下の器械パラメーターをモナチンのＬＣ／ＭＳ分析に使用した：Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：３．５ｋＶ；Ｃｏｎｅ：４０Ｖ；Ｈｅｘ １：２０Ｖ；Ａｐｅｒｔｕｒｅ：０Ｖ；Ｈｅｘ ２：０Ｖ；Ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：１００℃；Ｄｅｓｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：３５０℃；Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｇａｓ：５００Ｌ／ｈ；Ｃｏｎｅ ｇａｓ：５０Ｌ／ｈ；Ｌｏｗ ｍａｓｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑ１）：１５．０；Ｈｉｇｈ ｍａｓｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑ１）：１５．０；Ｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ：０．２；Ｅｎｔｒａｎｃｅ：５０Ｖ；Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ：２；Ｅｘｉｔ：５０Ｖ；Ｌｏｗ ｍａｓｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑ２）：１５；Ｈｉｇｈ ｍａｓｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑ２）：１５；Ｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ（Ｑ２）：３．５；Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ：６５０。報告されたマス／チャージ率（ｍ／ｚ）及び分子マスについての不確定性は±０．０１％である。混合物中におけるモナチンのアルファ−ケト酸形（ＭＰ）及びモナチンのはじめの検出は領域ｍ／ｚ １５０〜４００についてのマススペクトルの収集を伴うＬＣ／ＭＳモニタリングにより達成された。プロトン化分子イオン（ＭＰについて［Ｍ＋Ｈ］+＝２９２、モナチンについて［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３）についての選択されたイオンクロマトグラムは混合物中におけるこれらの分析物の直接の同定を許容した。
ＭＳ／ＭＳ分析
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン実験を以下のようにモナチンについて行った。娘イオン分析は問題の親イオン（例えば、モナチンについてｍ／ｚ＝２９３）の第一のマスアナライザー（Ｑ１）からマススペクトロメーターの衝突セルへの伝達に関し、衝突セルではアルゴンが導入され、及び上記親を断片（娘）イオンに化学的に分離する。これらの断片イオンはその後第二のマスアナライザー（Ｑ２）で検出され、及び上記親の構造割当てを確証するために使用されうる。
以下の器械パラメーターをモナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に使用した：Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：３．５ｋＶ；Ｃｏｎｅ：４０Ｖ；Ｈｅｘ １：２０Ｖ；Ａｐｅｒｔｕｒｅ：０Ｖ；Ｈｅｘ ２：０Ｖ；Ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：１００℃；Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：３５０℃；Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｇａｓ：５００Ｌ／ｈ；Ｃｏｎｅ ｇａｓ：５０Ｌ／ｈ；Ｌｏｗ ｍａｓｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑ１）：１３．０；Ｈｉｇｈ ｍａｓｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑ１）：１３．０；Ｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ：０．２；Ｅｎｔｒａｎｃｅ：−５Ｖ；Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ：１４；Ｅｘｉｔ：１Ｖ；Ｌｏｗ ｍａｓｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑ２）：１５；Ｈｉｇｈ ｍａｓｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑ２）：１５；Ｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ（Ｑ２）：３．５；Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ：６５０。
モナチンのハイスループット決定
ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ反応に由来するモナチンについての混合物のハイスループット分析（＜５分／サンプル）を上記に示される器械、及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳについて示される同じパラメーターを用いて行った。ＬＣ分離を０．３ｍＬ／分の流速で１５％水性ＭｅＯＨ、０．２５％酢酸中でイソクラティック溶離で室温でＷａｔｅｒｓ Ｘｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ8（２．１ｍｍ×５０ｍｍ）クロマトグラフィーを用いて行った。混合物中のモナチンの検出は選択反応モニタリング（ＳＲＭ）−タンデムマススペクトロメトリーを用いて達成された。これはモナチンの検出のための感受性、選択性、及びスループットを最大限にするために、特定の衝突で誘導された親イオン（［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３．１）の娘イオン（例えば、ｍ／ｚ＝１６８．１の断片イオン、３−ブタ−１，３−ヂエニル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオンとして試しに割当てられた）移行をモニタリングすることに関する。ＰＤＡ吸収データをモナチン同一性のさらなる実証のために並行して集めた。
実施例１１
細菌におけるモナチンの生成
この実施例はＥ． ｃｏｌｉ細胞においてモナチンを生成するために使用される方法を示す。当業者は、同様の方法が他の細菌細胞においてモナチンを生成するために使用されうることを理解するであろう。さらに、モナチン合成経路（図２）における他の遺伝子を含むベクターが使用されうる。
Ｅ． ｃｏｌｉ細胞における増大したトリプトファン生成のために使用されている最小限培地である、Ｔｒｐ−１＋グルコース培地（Ｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５：２００−４，１９９０）を以下のように調製した。７００ｍＬのナノ単位で純粋な水に、以下の試薬を添加した：２ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4、１３．６ｇ ＫＨ2ＰＯ4、０．２ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、及び０．５ｍｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ。上記ｐＨを７．０に調節し、容積を８５０ｍＬに増大させ、及び培地をオートクレーブした。５０％グルコース溶液を別々に調製し、及びろ過滅菌した。４０ｍＬを基礎培地（８５０ｍＬ）に添加し、１Ｌ最終容積にした。
１０ｇ／ＬのＬ−トリプトファン溶液を０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７中に調製し、及びろ過滅菌した。１０分の１の容積を以下に特定されるように典型的に培養物に添加した。１０％ピルビン酸ナトリウム溶液をまた調製し、及びろ過滅菌した。培養物リットル当たり１０ｍＬ等分を典型的に使用した。アンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）、カナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）及びＩＰＴＧ（８４０ｍＭ）のストックを調製し、ろ過滅菌し、及び使用するまで−２０℃で保存した。Ｔｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチレン ２０−ソルビタン一ラウリン酸塩）を０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）最終濃度で利用した。アンピシリンを非致死濃度、典型的に１〜１０μｇ／ｍＬ最終濃度で使用した。
（実施例４中に示される）Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）：：Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣの新しいプレートを５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地上に調製した。一晩の培養物（５ｍＬ）を単一のコロニーから接種し、及びカナマイシンを含むＬＢ培地中で３０℃で生育させた。典型的に、１〜５０の接種をｔｒｐ−１＋グルコース培地における誘導に使用した。新鮮な抗生物質を５０ｍｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。振騰フラスコを誘導前に３７℃で生育させた。
細胞を、０．３５〜０．８のＯＤ600が得られるまで１時間毎にサンプリングした。細胞をその後０．１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、及び上記温度を３４℃まで減少させた。サンプル（１ｍｌ）を誘導前に回収し（０時点）、及び５０００×ｇで遠心分離した。上清をＬＣ／ＭＳ分析のために−２０℃で凍結した。誘導４時間後、他の１ｍｌサンプルを回収し、及び遠心分離して細胞ペレットから培養液を分離した。トリプトファン、ピルビン酸ナトリウム、アンピシリン、及びＴｗｅｅｎを上記に示されるように添加した。
上記細胞を誘導後４８時間生育させ、及び他の１ｍｌサンプルを取り、及び上記のように調製した。４８時間目に、トリプトファン及びピルビン酸塩の他の等分を添加した。培養容積全体を約７０時間の生育（誘導後）の後、４℃及び３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を注ぎ、及び培養液及び細胞の両方を−８０℃で凍結した。培養液画分をろ過し、及びＬＣ／ＭＳにより分析した。［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３ピークの高さ及び領域を実施例１０に示されるようにモニターした。培地のバックグラウンド値を差し引いた。またデータを６００ｎｍでの培養物の光学濃度で割った［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３ピークの高さをプロットすることにより細胞の成長について正規化した。
ピルビン酸塩、アンピシリン、及びＴｗｅｅｎが誘導時ではなく、誘導４時間後に添加されたとき、より高い値のモナチンが生成された。ＰＬＰ、追加のリン酸又は追加のＭｇＣｌ2の如き他の添加物はモナチンの生成を増大させなかった。トリプトファンがインドール−３−ピルビン酸塩の代わりに利用されたとき、及びトリプトファンが接種時又は誘導時ではなく誘導後に添加されたとき、より高いタイターのモナチンが得られた。誘導前、及び誘導４時間後（基質添加時）、典型的に発酵培養液又は細胞抽出物中に検出可能な値のモナチンはなかった。ネガティブコントロールをｐＥＴ３０ａベクターのみを有する細胞、並びにトリプトファン及びピルビン酸塩を添加されない培養物を利用して行った。親ＭＳスキャンは、（ｍ＋１）／ｚ＝２９３を有する化合物はより大きな分子に由来しないことを示し、及び娘スキャン（実施例１０中のように行われた）はｉｎ ｖｉｔｒｏで作出されたモナチンと同様であった。
Ｔｗｅｅｎ（商標）の効果を０、０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、及び０．６％最終濃度のＴｗｅｅｎ−２０を利用することにより研究した。振騰フラスコにより生成された最も高い量のモナチンは０．２％Ｔｗｅｅｎでのものであった。アンピシリン濃度を０〜１０μｇ／ｍＬの間で変化させた。細胞培養液中のモナチンの量は０〜１μｇ／ｍＬの間で急激に（２．５×）増大し、及びアンピシリン濃度が１〜１０μｇ／ｍＬに増大されたとき１．３×に増大した。
典型的な結果を示すタイムコース実験は図１０中に示される。値を細胞成長について正規化したときでさえ、細胞培養液中に分泌されたモナチンの量は増大した。トリプトファンのモル吸光係数を用いることにより、培養液中のモナチンの量は１０μｇ／ｍＬ未満であると見積もられた。同じ実験をｐｒｏＡ挿入物を有しないベクターを含む細胞で繰り返した。多くがネガティブであり、ｍ／ｚ＝２９３のピーク高さは培地のみにおけるよりもこれらの培養物において少ないことを示した（図１０）。数は、トリプトファン及びピルビン酸塩がないとき一貫して低く、モナチン生成はアルドラーゼ酵素により触媒される酵素反応の結果であることを示した。
細菌細胞におけるモナチンのｉｎ ｖｉｖｏ生成を８００ｍＬ振騰フラスコ実験中で及び発酵器内で繰り返した。モナチンの２５０ｍＬサンプル（細胞なし培養液中）を陰イオン交換クロマトグラフィー及び調製済み逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。このサンプルを蒸発させ、及び高分解マス分析にかけた（実施例６中に示される）。高分解ＭＳは、生成された代謝物はモナチンであることを示した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析は、アミノトランスフェラーゼはアルドラーゼよりも高い値で存在することが必要であることを示し（実施例６を参照のこと）、それゆえ、Ｅ． ｃｏｌｉからのアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼは生成されるモナチンの量を増大させるためにアルドラーゼ遺伝子と共に過剰発現された。プライマーは以下のように、ａｓｐ Ｃ／ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣを有するオペロン内にＣ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｐｒｏＡを導入するよう設計された：５’プライマー：ＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＴ（配列ＩＤ番号：６７）及び３’プライマー：ＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＡＧＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧＣ（配列ＩＤ番号：６８）。クローニングのために、上記５’プライマーはＢａｍＨＩサイトを含み、上記３’プライマーはＳａｌＩサイトを含む。ＰＣＲを実施例４中に示されるように行い、及びゲルを精製した。ａｓｐ Ｃ／ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣ構築物をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、ＰＣＲ産物も同様にした。消化物をＱｉａｇｅｎスピンカラムを用いて精製した。ｐｒｏＡ ＰＣＲ産物を製造業者の教示にしたがってＲｏｃｈｅ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてベクターにつなげた。化学形質転換を実施例１中に示されるようにＮｏｖａｂｌｕｅｓ Ｓｉｎｇｌｅｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて行った。コロニーを５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で生育させ、及びプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを用いて精製した。クローンを制限酵素消化分析によりスクリーニングし、及び配列をＳｅｑｗｒｉｇｈｔ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）により確認した。構築物をＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にサブクローニングした。上記ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣ構築物をまたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内に導入した。
上記に示される標準条件下のＢＬＲ（ＤＥ３）振騰フラスコサンプルの初期の比較は、第二の遺伝子（ａｓｐＣ）の添加は生成されるモナチンの量を７倍改善することを示した。生育を促進するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）由来宿主株を使用した。ｐｒｏＡクローン及び２の遺伝子オペロンクローンを上記のようにＴｒｐ−１培地中で誘導し、ｐＬｙｓＳ宿主は培地に添加されたクロラムフェニコール（３４ｍｇ／Ｌ）をも有した。振騰フラスコ実験を０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０及び１ｍｇ／Ｌアンピシリンの添加あり及びなしで行った。培養液中のモナチンの量をｉｎ ｖｉｔｒｏ生成された精製モナチンを標準として用いて計算した。ＳＲＭ分析を実施例１０中に示されるように行った。細胞を０、生育の４時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び９６時間にサンプリングした。
結果は培養液中に生成された最大量について表５中に示される。ほとんどの場合、２の遺伝子構築物はｐｒｏＡ構築物のみよりも高い値を与えた。漏りやすい細胞エンベロープを有するはずであるｐＬｙｓＳ株は、これらの株は典型的により遅い速度で生育したが、より高い値の分泌モナチンを有した。Ｔｗｅｅｎ及びアンピシリンの添加は有益であった。
Figure 0005351230
実施例１２
酵母におけるモナチン生成
この実施例は真核細胞においてモナチンを生成するために使用される方法を示す。当業者は、同様の方法が問題のどんな細胞においてもモナチンを生成するために使用されうることを理解するであろう。さらに、他の遺伝子が、この例において示されるものに加えて又はその代わりに使用されうる（例えば、図２中に挙げられるもの）。
ｐＥＳＣ Ｙｅａｓｔ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内にＥ． ｃｏｌｉ ａｓｐＣ及びＣ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｐｒｏＡ遺伝子をクローニングする及び発現するために使用した。ｐＥＳＣベクターは、２の区別できる多様クローニング部位を伴って、反対の鎖上にＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターの両方を含み、２の遺伝子の同時発現を許容する。ｐＥＳＣ−Ｈｉｓベクターはまた宿主（ＹＰＨ５００）におけるヒスチヂン栄養要求性の相補のためにＨｉｓ３遺伝子を含む。ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターはグルコースにより抑制され、及びガラクトースにより誘導される；Ｋｏｚａｋ配列は酵母における最適発現のために利用される。上記ｐＥＳＣプラスミドはシャトルベクターであり、はじめの構築物が（選択のためにｂｌａ遺伝子を有する）Ｅ． ｃｏｌｉ内で作出されることを許容する；しかしながら、菌のリボソーム結合部位は多様クローニング部位に存在しない。
以下のプライマーをｐＥＳＣ−Ｈｉｓ内へのクローニングのために設計した（制限部位は下線を引かれ、Ｋｏｚａｋ配列は太字である）：ａｓｐＣ（ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ），ＧＡＬ１：５’−
Figure 0005351230
両方の成熟タンパク質についての第二のコドンをＫｏｚａｋ配列の導入のために芳香族アミノ酸からバリンに変化した。問題の遺伝子を、鋳型として実施例１及び実施例４中に示されるクローンからのｐＥＴ３０ Ｘａ／ＬＩＣミニプレップＤＮＡを用いて増幅した。ＰＣＲをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒサイクラー勾配サーモサイクラー及び５０μＬ反応についての以下のプロトコルを用いて行った：１．０μＬ鋳型、１．０μＭのそれぞれのプライマー、０．４ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、３．５Ｕ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、及びＭｇを含む１× Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液。使用されたサーモサイクラープログラムは９４℃で５分間の高温開始、続いて以下の段階：９４℃で３０秒間、５０℃で１分４５秒間、及び７２℃で２分１５秒間の２９の繰返しから成った。２９の繰返しの後、上記サンプルを７２℃で１０分間維持し、及びその後４℃で保存した。上記ＰＣＲ産物を１％ ＴＡＥ−アガロースゲル上での分離により精製し、続いてＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて回復させた。
ｐＥＳＣ−ＨｉｓベクターＤＮＡ（２．７μｇ）をＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、及び上記のようにゲル精製した。ａｓｐＣ ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、及びＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎで精製した。ライゲーションを製造業者のプロトコルにしたがってＲｏｃｈｅ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔで行った。脱塩されたライゲーションを製造業者の教示にしたがって、パルスコントローラープラスを有するＢｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩを用いて０．２ｃｍ Ｂｉｏｒａｄ ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅキュベット中の４０μｌのＥｌｅｃｔｒｏｍａｘ ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にエレクトロポーレーションした。１ｍＬのＳＯＣ培地中での１時間の回復後、形質転換体を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地上にまいた。クローンについてのプラスミドＤＮＡ調製をＱＩＡ ｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて行った。プラスミドＤＮＡを制限酵素消化によりスクリーニングし、及び上記ベクターについて設計されたプライマーを用いて実証のためにシークエンスした（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ）。
ａｓｐＣ／ｐＥＳＣ−ＨｉｓクローンをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐｒｏＡ ＰＣＲ産物も同様にした。ＤＮＡを上記のように精製し、及び上記のようにライゲーションした。上記２の遺伝子構築物をＤＨ１０Ｂ細胞内へ導入し、及び制限酵素消化及びＤＮＡシークエンシングによりスクリーニングした。
上記構築物をＳ． ｃ． ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＹＰＨ５００内に導入した。形質転換反応を２％グルコースを含むＳＣ−Ｈｉｓ最小限培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＹＥＳ２マニュアル）上にまいた。個々の酵母コロニーを上記のＰＣＲプライマーを用いてコロニーＰＣＲによりｐｒｏＡ及びａｓｐＣ遺伝子の存在についてスクリーニングした。ペレット化した細胞（２μｌ）を１μｌのチモラーゼを含む２０μＬのＹ−Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中に懸濁し、及び３７℃で１０分間熱した。４μＬのこの懸濁物をその後上記に示されるＰＣＲ反応混合物及びプログラムを用いて５０μＬ ＰＣＲ反応中に使用した。
５ｍＬ培養物をＳＣ−Ｈｉｓ＋グルコース上で３０℃及び２２５ｒｐｍで一晩生育させた。上記細胞をガラクトースでの誘導前に遅延時間を最小限にするためにラフィノース上での生育に徐々に順応させた。約１２時間の生育後、６００ｎｍでの吸収計測を取り、及び適切な容量の細胞をスピンダウンし、及び新しいＳＣ−Ｈｉｓ培地中に０．４のＯＤを与えるよう再懸濁した。以下の炭素源を連続して使用した：１％ラフィノース＋１％グルコース、０．５％グルコース＋１．５％ラフィノース、２％ラフィノース、及び最後に誘導のために１％ラフィノース＋２％ガラクトース。
誘導培地中での約１６時間の生育後、５０ｍＬ培養物を２の２５ｍＬ培養物に分け、及び以下のものを２のうちの１にのみ添加した：（最終濃度）１ｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン、５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．１、１ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ ＭｇＣｌ2。非誘導培地からの、及びモナチン経路のための基質の添加前１６時間培養物からの培養液及び細胞ペレットのサンプルをネガティブコントロールとして保存した。さらに、機能的なａｓｐＣ遺伝子（及び切りつめられたｐｒｏＡ遺伝子）のみを含む構築物を他のネガティブコントロールとして利用した。上記細胞を全部で誘導後６９時間生育させた。臨時に、上記酵母細胞をより低いＯＤで誘導し、及びトリプトファン及びピルビン酸塩の添加前に４時間のみ生育させた。しかしながら、これらのモナチン基質は生育を阻害するように見え、及びより高いＯＤでの添加がより効果的であった。
培養物からの細胞ペレットを、以前の実施例中に示されるようにプロテアーゼ阻害剤及びベンゾナーゼヌクレアーゼの添加を伴って、製造業者のプロトコルにしたがって細胞のグラム（湿重量）当たり５ｍＬのＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ（商標）＋５０μｌ ＴＨＰ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解した。上記培養液及び細胞抽出物をろ過し、及び実施例１０中に示されるようにＳＲＭにより分析した。この方法を用いて、モナチンは培養液サンプル中に検出されず、このことは、上記細胞はこれらの条件下でモナチンを分泌することができないことを示した。プロトン動力がこれらの条件下で不十分でありうる又は一般的なアミノ酸輸送体がトリプトファンで飽和されうる。タンパク質発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて変化の検出ができる値ではなかった。
トリプトファン及びピルビン酸塩が培地に添加されたとき、モナチンは２の機能的な遺伝子を有する培養物の細胞抽出物において一過的に検出可能であった（約６０μｇ／ｍＬ）。モナチンはネガティブコントロール細胞抽出物のいずれにおいても検出されなかった。モナチンについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を実施例６中に示される最適化された分析を用いて４．４ｍｇ／ｍＬの総タンパク質（典型的にＥ． ｃｏｌｉ細胞抽出物について使用されるものの約２倍）で二重で行った。他の分析を、いずれの酵素が細胞抽出物中で制限されているかを決定するために、３２μｇ／ｍＬ Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＰｒｏＡアルドラーゼ又は４００μｇ／ｍＬ ＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼのいずれかの添加を伴って行った。ネガティブコントロールを酵素の添加なし又はＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼのみの添加で行った（アルドール縮合が酵素なしである程度まで起こりうる）。ポジティブコントロールを１６μｇ／ｍＬアルドラーゼ及び４００μｇ／ｍＬアミノトランスフェラーゼを用いて、部分的に純粋な酵素（３０〜４０％）で行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果をＳＲＭにより分析した。細胞抽出物の分析は、トリプトファンが、それが誘導後に培地へ添加されたとき、細胞内へ効果的に輸送され、追加のトリプトファンが添加されなかったものより２次数高い大きさのトリプトファン値をもたらしたことを示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏモナチン分析についての結果は表６中に示される（数字はｎｇ／ｍＬを示す）。
Figure 0005351230
生育培地に添加された基質あり及びなしの全長２遺伝子構築物細胞抽出物で陽性結果が得られた。これらの結果は、ポジティブコントロールに比較して、上記酵素は酵母中の総タンパク質の１％に近い値で発現されたことを示す。（切つめられたｐｒｏＡを有する）ａｓｐＣ構築物の細胞抽出物がアルドラーゼと共に分析されたとき、生成されたモナチンの量は、細胞抽出物が単独で分析されたときより顕著に高く、及び組換えＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼは酵母総タンパク質の約１〜２％を含むことを示す。誘導されていない培養物の細胞抽出物は、細胞内の天然アミノトランスフェラーゼの存在のために、アルドラーゼと共に分析されたとき少量の活性を有した。ＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼと共に分析されたとき、誘導されていない細胞からの抽出物の活性はＡｓｐＣを有するネガティブコントロールにより生成されたモナチンの量まで増大した（ｃａ．２００ｎｇ／ｍｌ）。対照的に、２遺伝子構築物細胞抽出物を分析したとき観察された活性は、アルドラーゼが添加されたときよりアミノトランスフェラーゼが補充されたとき増大した。両方の遺伝子が同じ値で発現されるべきであるので、このことは、実施例６中に示される結果と一致して、生成されたモナチンの量はアミノトランスフェラーゼの値がアルドラーゼのそれよりも高いとき最高に達することを示す。
ピルビン酸塩及びトリプトファンの添加は細胞の成長を阻害するのみでなく、明らかにタンパク質発現をも阻害する。ｐＥＳＣ−Ｔｒｐプラスミドの添加はＹＰＨ５００宿主細胞のトリプトファン栄養要求性について補正するために使用されることができ、成長、発現、及び分泌へのより少ない影響でトリプトファンを補充する方法を提供する。
実施例１３
カップリングした反応を用いた酵素プロセスの改善
理論的には、副反応又は基質若しくは中間体の分解が起こらない場合、図１中に例示される酵素反応から形成される生成物の最大量はそれぞれの反応の平衡定数、及びトリプトファン及びピルビン酸塩の濃度に直接的に比例する。トリプトファンは高く可溶性の基質ではなく、２００ｍＭ超のピルビン酸塩の濃度は収率に悪い影響を及ぼすように見える（実施例６を参照のこと）。
理想的には、モナチンの濃度は分離のコストを下げるために、基質について最大化される。逆反応が起こることを避けて、物理的な分離が、モナチンが反応混合物から除去されるように行われうる。生の材料及び触媒はその後再生されうる。いくつかの試薬及び中間体に対する大きさ、チャージ、及び疎水性におけるモナチンの類似性のために、物理的分離は、（アフィニティクロマトグラフィー技術の如き）モナチンについての高い量のアフィニティがない限り、困難であろう。しかしながら、モナチン反応は、系の平衡がモナチン生成に向かうようシフトするように他の反応にカップリングされうる。以下のものはトリプトファン又はインドール−３−ピルビン酸塩から得られるモナチンの収率を改善するためのプロセスの例である。
オキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３）を用いたカップリング反応
図１１は反応の例示である。トリプトファンオキシダーゼ及びカタラーゼはインドール−３−ピルビン酸塩生成の方向に反応を駆動するために利用される。カタラーゼは、過酸化水素が逆方向に反応するために又は酵素若しくは中間体を損傷するために利用できないように過剰に使用される。酸素はカタラーゼ反応の間に再生される。あるいは、インドール−３−ピルビン酸塩は基質として使用されうる。
アスパラギン酸塩はＭＰのアミノ化のためのアミノ供与体として使用され、及びアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼが利用される。理想的には、アスパラギン酸塩がインドール−３−ピルビン酸塩を再アミノ化するために利用されないように、ＭＰ〜モナチン反応に比較してトリプトファン／インドール−３−ピルビン酸塩反応について低い特異性を有するアミノトランスフェラーゼが使用される。（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．からの）オキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼはオキサロ酢酸塩をピルビン酸塩及び二酸化炭素に変換するために添加されうる。ＣＯ2は揮発性であるので、それは酵素での反応のために利用可能ではなく、逆反応を減少させ又は妨げさえもする。この段階において生成されるピルビン酸塩はまたアルドール縮合反応において利用されうる。他のデカルボキシラーゼ酵素が使用されることができ、及びホモログがＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、いくつかのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ＭＣ−１、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ ＫＴ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ Ｐｍ７０、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｉｏｔｈｅｒｍａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、いくつかのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、いくつかのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、いくつかのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種、いくつかのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｔｈｅｒｍｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、及びいくつかのＶｉｂｒｉｏ種において存在することが知られる。
トリプトファンアミノトランスフェラーゼ分析をＥ． ｃｏｌｉからのアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、Ｅ． ｃｏｌｉからのチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴｙｒＢ）、Ｌ． ｍａｊｏｒからの広範囲基質アミノトランスフェラーゼ（ＢＳＡＴ）、及び実施例１中に示される２の商業的に入手可能なブタグルタミン酸塩オキサロ酢酸塩アミノトランスフェラーゼで行った。オキサロ酢酸塩及びアルファ−ケトグルタル酸塩の両方をアミノ受容体として試験した。モナチンを用いた活性（実施例７）対トリプトファンを用いた活性の比率を、いずれの酵素がモナチンアミノトランスフェラーゼ反応について最も高い特異性を有するかを決定するために比較した。これらの結果は、モナチン反応対トリプトファン反応についての最も高い特異性を有する酵素はブタＩＩ−Ａ型グルタミン酸塩−オキサロ酢酸塩アミノトランスフェラーゼ、ＧＯＡＴ（Ｓｉｇｍａ Ｇ７００５）であることを示した。この特異性は、いずれのアミノ受容体が利用されるかとは独立であった。それゆえ、この酵素はオキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼとのカップリング反応において使用された。
インドール−３−ピルビン酸塩から出発する典型的な反応は（最終濃度）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．３、６ｍＭインドール−３−ピルビン酸塩、６ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭアスパラギン酸塩、０．０５ｍＭ ＰＬＰ、３ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５μｇ／ｍＬアミノトランスフェラーゼ、５０μｇ／ｍＬ Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＰｒｏＡアルドラーゼ、及び３Ｕｎｉｔｓ／ｍＬのデカルボキシラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｏ４８７８）を含んだ。上記反応を２６℃で１時間進めた。いくつかの場合、デカルボキシラーゼは除かれ又はアスパラギン酸塩はアルファ−ケトグルタル酸塩で置換された（ネガティブコントロールとして）。上記に示されるアミノトランスフェラーゼ酵素をまた初期の特異性実験を確認するためにＧＯＡＴの代わりに試験した。サンプルをろ過し及び実施例１０中に示されるようにＬＣ／ＭＳにより分析した。上記結果は、ＧＯＡＴ酵素はタンパク質ｍｇ当たり最も高い量のモナチンを生成し、副生成物として最も少ない量のトリプトファンを生成したことを示す。さらに、デカルボキシラーゼ酵素を添加したことから２〜３倍の利点があった。Ｅ． ｃｏｌｉ ＡｓｐＣ酵素はまた他のアミノトランスフェラーゼに比較して大量のモナチンを生成した。
モナチン生成は：１）インドール−ピルビン酸塩、ピルビン酸塩、及びアルパラギン酸塩の２ｍＭ添加（３０分毎〜１時間毎）を定期的に添加すること、２）無気環境で又は脱気緩衝液で反応を行うこと、３）反応を一晩進めること、及び４）複数回凍結融解をされていない新たに調製したデカルボキシラーゼを用いることにより増大された。デカルボキシラーゼは１２ｍＭ超のピルビン酸塩濃度により阻害された。４ｍＭ超のインドール−３−ピルビン酸塩濃度で、インドール−３−ピルビン酸塩での副反応が促進された。上記反応において使用されるインドール−３−ピルビン酸塩の量は、アルドラーゼの量がまた増大された場合、増大されうる。高い値のリン酸塩（５０ｍＭ）及びアルパラギン酸塩（５０ｍＭ）はデカルボキシラーゼ酵素に対して阻害的であることがわかった。添加されるデカルボキシラーゼ酵素の量は１時間反応におけるモナチン生成において減少なしに、０．５Ｕ／ｍＬまで減少されうる。生成されるモナチンの量は、温度が２６℃から３０℃に及び３０℃から３７℃に増大されたとき、増大した；しかしながら、３７℃では、インドール−３−ピルビン酸塩の副反応もまた促進された。生成されるモナチンの量はｐＨを７から７．３に増大することで増大し、及びｐＨ７．３〜８．３で比較的安定であった。
トリプトファンで出発する典型的な反応は（最終濃度）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ ７．３、２０ｍＭトリプトファン、６ｍＭアスパラギン酸塩、６ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ ＰＬＰ、３ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５μｇ／ｍＬアミノトランスフェラーゼ、５０μｇ／ｍＬ Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＰｒｏＡアルドラーゼ、４Ｕｎｉｔｓ／ｍＬのデカルボキシラーゼ、５〜２００ｍＵ／ｍＬ Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａ−２８０５）、１６８Ｕ／ｍＬカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃ−３５１５）、及び０．００８ｍｇ ＦＡＤを含んだ。反応を３０℃で３０分間行った。デカルボキシラーゼの添加で改善が観察された。５０ｍＵ／ｍＬのオキシダーゼが使用されたとき、最大量のモナチンが生成された。改善は、インドール−３−ピルビン酸塩が基質として使用されたときに見られたものと同様であった。さらに、生成されたモナチンの量は１）トリプトファン値が低かった（すなわち、アミノトランスフェラーゼ酵素のＫm未満、及びそれゆえ、活性部位においてＭＰと競合することができない）、及び２）オキシダーゼ対アルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼの比率が、インドール−３−ピルビン酸塩が蓄積できないような値に維持されたとき、増大した。
インドール−３−ピルビン酸塩又はトリプトファンのいずれで出発しようと、１〜２時間のインキュベーション時間での分析において生成されるモナチンの量は、同じ酵素比率を維持しながら２〜４倍量の全ての酵素が使用されたとき、増大した。いずれかの基質を用いて、約１ｍｇ／ｍＬのモナチンの濃度が達成された。インドール−ピルビン酸塩から出発した場合、生成されたトリプトファンの量は、典型的に生成物量の２０％未満であり、それはカップリング反応を利用することの利点を示す。中間体濃度及び副反応のさらなる最適化及び制御で、生産性及び収率は大いに改善されうる。
リジンイプシロンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．３６）を用いたカップリング反応
リジンイプシロンアミノトランスフェラーゼ（Ｌ−リジン６−トランスアミナーゼ）は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含むいくつかの生物において見られる。それはいくつかのベータ−ラクタム抗生物質の生成において第一段階として生物により利用される（Ｒｉｕｓ ａｎｄ Ｄｅｍａｉｎ， Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ７：９５−１００，１９９７）。この酵素は、アルファ−ケトグルタル酸塩をアミノ受容体として利用して、リジンのＣ−６のＰＬＰ仲介アミノ転移により、リジンをＬ−２−アミノアヂピン酸塩６−セミアルデヒド（アルリジン）に変換する。アルリジンは不安定であり、及び自発的に分子内脱水を経験し、１−ピペリデイン６−カルボキシレート、環状分子を形成する。これは逆反応が起こることを効果的に阻害する。反応スキームは図１２中に示される。代替の酵素、リジン−ピルビン酸塩６−トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．７１）もまた使用されうる。
典型的な反応は１ｍＬ中に：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．３、２０ｍＭ インドール−３−ピルビン酸塩、０．０５ｍＭ ＰＬＰ、６ｍＭリン酸カリウム ｐＨ８、２〜５０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭリジン、１００μｇアミノトランスフェラーゼ（リジンイプシロンアミノトランスフェラーゼＬＡＴ−１０１、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、及び２００μｇ Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＰｒｏＡアルドラーゼを含んだ。生成されたモナチンの量はピルビン酸塩濃度を増大することで増大した。これらの反応条件（５０ｍＭピルビン酸塩で）を用いた最大量は、オキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼを用いたカップリング反応で観察されたものより１０倍少なかった（約０．１ｍｇ／ｍＬ）。
［Ｍ＋Ｈ］+＝２９３でのピークはモナチンについての予想された時間で溶離し、及びマススペクトルは他の酵素プロセスで観察されたものと同じいくつかの画分を含んだ。チャージ率（２９３）についての正しいマスでの第二のピークは実施例６中で生成されたＳ，Ｓモナチンについて典型的に観察されたものよりわずかに早く溶離し、及びモナチンの他の異性体の存在を示しうる。この酵素によりトリプトファンはほとんど生成されなかった。しかしながら、ピルビン酸塩についていくらかの活性が存在するようである（アラニンを副生成物として生成する）。また、上記酵素は不安定であることが知られる。安定性を増大させる、ピルビン酸塩での活性を減少させる、及びＭＰでの活性を増大させるために、方向付けられた進化実験を行うことにより改善がなされうる。これらの反応はまた上記に示されるようにＬ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼにカップリングされうる。
他のカップリング反応
トリプトファン又はインドール−ピルビン酸塩からのモナチン収率を改善しうる他のカップリング反応は図１３中に示される。蟻酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．２又は１．２．１．４３）は広く知られた酵素である。いくつかの蟻酸塩デヒドロゲナーゼはＮＡＤＨを必要とし、一方、その他はＮＡＤＰＨを利用しうる。グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼは以前の例において、アンモニウムを基礎とした緩衝液を用いて、モナチン前駆体及びモナチンの間の内部変換を触媒した。蟻酸アンモニウム及び蟻酸塩デヒドロゲナーゼの存在は共因子の再生のための効率のよい系であり、及び二酸化炭素の生成は逆反応の速度を減少させるための有効な方法である（Ｂｏｍｍａｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ １０：３７，１９９４及びＧａｌｋｉｎ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３；４６５１−６，１９９７）。さらに、大量の蟻酸アンモニウムが反応緩衝液中に溶解されうる。グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ反応（又は同様の還元的アミノ化）により生成されるモナチンの収率は蟻酸塩デヒドロゲナーゼ及び蟻酸アンモニウムの添加により改善されうる。
他のプロセスはモナチン生成の方向に平衡を駆動するために使用されうる。例えば、アミノプロパンが米国特許第５，３６０，７２４号及び第５，３００，４３７号により示されるものの如き、オメガ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１８）でのＭＰからモナチンへの変換においてアミノ酸供与体として利用される場合、生ずる生成物の１は基質であるアミノプロパンよりも揮発性生成物である、アセトンでありうる。温度を、アセトンをすばやく消すために定期的に短時間上げ、それにより、平衡を緩和しうる。アセトンは４７℃の沸点を有し、その温度は短時間で使用される場合中間体を分解することはあまりない。アルファ−ケトグルタル酸塩について活性を有するほとんどのアミノトランスフェラーゼはまたモナチン前駆体について活性を有する。同様に、グリオキシル酸塩／芳香族酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．６０）がアミノ供与体としてグリシンを伴って使用される場合、比較的不安定であり、及びグリシンに比較して非常に低い沸点を有するグリオキシル酸塩が生成される。
実施例１４
組換え発現
公に入手可能な酵素ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号：１１及び１２の如き、本明細書中に開示される酵素及び配列、並びにそれらの変形、多形、突然変異体、断片及び融合で、標準の研究室技術による、酵素の如きタンパク質の発現及び精製が可能である。当業者は、酵素及びその断片は問題のいかなる細胞又は生物においても組換えとして作出され、及び使用前に、例えば、配列ＩＤ番号：１２及びその誘導体の生成前に精製されうることを理解するであろう。
組換えタンパク質の生成方法は本分野で周知である。それゆえ、本開示の範囲は、酵素の如き、いかなるタンパク質又はその断片の組換え発現をも含む。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，３４２，７６４号；Ｐａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８４６，８１９号；Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８７６，９６９号及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９，Ｃｈ．１７）を参照のこと。
簡単にいうと、タンパク質又はペプチドをコードする、部分的な、全長の又は変形ｃＤＮＡ配列は細菌又は真核生物発現ベクターの如き、発現ベクターにつなげられうる。タンパク質及び／又はペプチドはプロモーターを上記ｃＤＮＡ配列の上流に置くことにより生成されうる。プロモーターの例は、非限定的に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ファージラムダの主要なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス及び類人猿のウイルス由来のプロモーター、３−フォスフォグリセレートキナーゼのプロモーター、酵母酸フォスファターゼのプロモーター、酵母アルファ−交配因子のプロモーター及びそれらの組み合わせを含む。
無傷のネイティブタンパク質の生成に好適なベクターはｐＫＣ３０（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）、ｐＫＫ１７７−３（Ａｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｏｓｉｕｓ，１９８５，Ｇｅｎｅ ４０：１８３）及びｐＥＴ−３（Ｓｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔｔ，１９８６，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３）を含む。ＤＮＡ配列は他のプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、動物ウイルス及び酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）の如き、他のクローニング媒体に移されうる（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８０６−１２）。これらのベクターは、異種のｃＤＮＡの導入によりトランスジェニックにされる、体細胞及び、細菌、真菌（Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３１３−７）、無脊椎動物、植物（Ｇａｓｓｅｒ ａｎｄ Ｆｒａｌｅｙ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３）、及び哺乳類（Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８１−８）の如き単純な又は複雑な生物を含む、さまざまな宿主内へ導入されうる。
哺乳類細胞における発現のために、ｃＤＮＡ配列はｐＳＶ２ベクター内プロモーターである、類人猿のウイルスＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２−６）の如き、異種のプロモーターにつなげられ、及びサルＣＯＳ−１細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ， １９８１， Ｃｅｌｌ ２３：１７５−８２）の如き、細胞内へ導入され、一過性の又は長期の発現を達成しうる。キメラ遺伝子構築物の安定な統合はネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，１９８２，Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １：３２７−４１）及びマイコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２−６）の如き生化学選択により哺乳類細胞において維持されうる。
ＤＮＡのヒト又は他の哺乳類細胞の如き、真核生物内への移行は慣用の技術である。ベクターは、例えば、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎｄｅｒ Ｅｂ， １９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４６６）、リン酸ストロンチウム（Ｂｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７：２０１３）での沈殿、エレクトロポーレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１）、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３）、ＤＥＡＥデキストラン（ＭｃＣｕｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９６８， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ４１：３５１）、マイクロインジェクション（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｅｌｌ １５：５７９）、プロトプラスト融合（Ｓｃｈａｆｎｅｒ， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：２１６３−７）又はペレットガン（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０）により、純粋なＤＮＡとして受容細胞内に導入される（トランスフェクション）。あるいは、上記ｃＤＮＡは例えば、レトロウイルス（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｇｅｎ． Ｅｎｇｒｇ． ７：２３５）、アデノウイルス（Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７）又はヘルペス（Ｓｐａｅｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｃｅｌｌ ３０：２９５）の如きウイルスベクターでの感染により導入されうる。
我々の開示の原理が適用されうる多くの可能な態様の観点において、例示された態様は本開示の単なる特定の例であり、及び本開示の範囲についての限定として取られるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本開示の範囲は以下の請求項に一致する。我々はそれゆえ、我々の発明としてこれらの請求項の範囲及び本質の範囲内に入るもの全てを請求する。

Claims (7)

  1. トリプトファン及び／又はインドール−３−乳酸をモナチンに変換することを含むモナチン製造方法であって、以下のステップ：
    トリプトファン又はインドール−３−乳酸を第一のポリペプチドと接触させ、上記第一のポリペプチドがトリプトファン又はインドール−３−乳酸をインドール−３−ピルビン酸塩に変換する、ここで、該第一のポリペプチドは、トリプトファンが上記第一のポリペプチドと接触するとき、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．５）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１９）、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２、ＥＣ １．４．１．３、ＥＣ １．４．１．４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２０）、トリプトファン−フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．２８）、アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．２）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．３）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アラニン）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２１）、又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれ、かつ、前記第一のポリペプチドは、インドール−３−乳酸が、上記第一のポリペプチドと接触するとき、インドール乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１０）、Ｒ−４−ヒドロキシフェニル乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２２２）、３−（４）−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩還元酵素（ＥＣ １．１．１．２３７）、乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２７、ＥＣ １．１．１．２８、ＥＣ １．１．２．３）、（３−イミダゾール−５−イル）乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１１）、及び乳酸塩オキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．−）又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれる；
    インドール−３−ピルビン酸塩を第二のポリペプチド及びＣ３炭素源と接触させ、上記第二のポリペプチドがインドール−３−ピルビン酸塩及びＣ３炭素源を２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸に変換する、ここで、該第二のポリペプチドは、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸塩グリオキシル酸塩−リアーゼ（ＥＣ ４．１．３．１６）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩−リアーゼ（ＥＣ ４．１．３．１７）又はそれらの組み合わせから選ばれる；及び
    ２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸を第三のポリペプチドと接触させ、上記第三のポリペプチドが２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸をモナチンに変換する、ここで、該第三のポリペプチドは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．５）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１９）、トリプトファン−フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．２８）、アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１）、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２−４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２０）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アラニン）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２１）、Ｄ−メチオニン−ピルベートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．４１）、又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれる；
    を含み、それよりモナチン又はその塩を製造する、前記方法。
  2. 前記第一のポリペプチドはアミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．３）を含み、かつ、前記第一のポリペプチドはトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸塩に変換する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アミノ酸オキシダーゼはトリプトファンオキシダーゼを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記Ｃ３炭素源はピルビン酸塩、フォスフォエノールピルビン酸塩、アラニン、セリン、システイン又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記第三のポリペプチドは還元的アミノ化活性を有する酵素及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生することができるポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記還元的アミノ化活性を有する前記酵素はグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、トリプトファンデヒドロゲナーゼ又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれる、請求項５に記載の方法。
  7. 前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドの内の少なくとも１つは、精製されたポリペプチド、異種の組換え又は単離された核酸から発現されたポリペプチド、化学合成されたポリペプチド、及び組換え細胞又は組換え細胞抽出物中のポリペプチド、及びそれらの組み合わせから選ばれる、請求項１に記載の方法。
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