ES2356132T3 - Polipéptidos y rutas biosintéticas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de producción de monatina, que comprende convertir el triptófano y/o el ácido indol-3láctico en monatina, en el que el procedimiento comprende: (a) poner en contacto el triptófano o el ácido indol-3-láctico con un primer polipéptido, en el que, cuando el triptófano está en contacto con el primer polipéptido, el primer polipéptido se selecciona de entre triptófano aminotransferasa (CE 2.6.1.27), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), tirosina aminotransferasa (aromática) (CE 2.6.1.5), triptofan-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), triptófano oxidasa, L-aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.2), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1), D-aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.3), D- triptófano aminotransferasa, D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21), glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20), o una combinación de las mismas, en el que, cuando el ácido indol-3-láctico se pone en contacto con el primer polipéptido, el primer polipéptido se selecciona de entre indol-lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.110), R-4 hidroxifenil-lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato reductasa (CE 1.1.1.237), lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.111), y lactato oxidasa (CE 1.1.3.-), o una combinación de las mismas, en el que el primer polipéptido convierte el triptófano o el ácido indol-3láctico en indol-3-piruvato; (b) poner en contacto el indol-3-piruvato con un segundo polipéptido y una fuente de carbono C3, en el que el segundo polipéptido es una enzima CE 4.1.2 o CE 4.1.3., en el que el segundo polipéptido convierte el indol-3-piruvato y la fuente de carbono C3 en 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico; y (c) poner en contacto el 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico con un tercer polipéptido, en el que el tercer polipéptido se selecciona de entre tirosina aminotransferasa (aromática) (CE 2.6.1.5), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), triptófano aminotransferasa (CE 2.6.1.27), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21), D-triptófano aminotransferasa, glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1), una lisina épsilon aminotransferasa, o una combinación de las mismas, en el que el tercer polipéptido convierte el 2-hidroxiácido 2-(indol-3ilmetil)-4-cetoglutárico en monatina.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona polipéptidos y rutas biosintéticas que son útiles en la producción de 5 indol-3-piruvato, 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (PM) y/o monatina.

ANTECEDENTES

Indol piruvato 10

El indol-3-piruvato es un potente antioxidante que se cree que contrarresta el estrés oxidativo en tejidos con altas concentraciones de oxígeno (Politi et al., "Recent advances in Tryptophan Research", editado por G. A. Filippini et al., Plenum Press, Nueva York, 1996, págs. 291-8). El indol piruvato además es un compuesto intermedio en una serie de reacciones para producir ácido indol-acético (IAA), la hormona auxina del crecimiento 15 vegetal primario (factor activador de crecimiento difusible). El IAA es activo en cantidades inferiores al microgramo en una gama de procesos fisiológicos que incluyen la dominancia apical, tropismos, alargamiento del brote, inducción de la división de las células del cambium e iniciación de la raíz. Las auxinas sintéticas se utilizan en horticultura para provocar enraizamiento y para favorecer el cuajado y el desarrollo del fruto. A altas concentraciones las auxinas sintéticas son herbicidas eficaces contra las plantas de hoja ancha. Las auxinas 20 naturales producidas por fermentación pueden considerarse más adecuadas desde un punto de vista ambiental que los herbicidas producidos químicamente. Los reguladores del crecimiento se vendieron en todo el mundo en 1999 por valor de 0,4 miles de millones de libras (1,4 miles de millones de dólares US).

Algunos ejemplos de patentes sobre el ácido indolacético y de derivados del mismo incluyen: la patente US 25 nº 5.843.782 Micropropagation of rose plants, auxina utilizada en el medio de cultivo y la patente US nº 5.952.231 Micropropagation of rose plants.

Además de las utilidades relacionadas con las plantas, el ácido indolacético es útil en aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo, la patente US nº 5.173.497 "Method of preparing alpha-oxopyrrolo[2,3-B]indole acetic 30 acids and derivatives” propone la utilización de estos compuestos en el tratamiento del deterioro de la memoria tal como el asociado a la enfermedad de Alzheimer y a la demencia senil. El mecanismo propuesto en la patente US nº 5.173.497 es que estos compuestos inhiben la polipéptido acetilcolinestarasa y aumentan las concentraciones de acetilcolina en el cerebro.

35

El indol-3-carbinol se produce a partir del indol-3-acético por oxidación catalizada por peroxidasa, y puede convertirse fácilmente en diindolilmetano. Se informa de que ambos compuestos eliminan toxinas y favorecen la producción de hormonas beneficiosas para la salud de las mujeres.

Derivados de triptófano 40

El D-triptófano clorado se ha identificado como un edulcorante no nutritivo, y existe un interés creciente en dedicarse también a otros derivados. La monatina es un edulcorante natural que es similar en composición al aminoácido triptófano. Puede extraerse de la corteza de las raíces del arbusto sudafricano, Sclerochiton ilicifolius, y es prometedor en la industria alimenticia y de bebidas como edulcorante de gran intensidad. Algunos ejemplos de 45 patentes sobre monatina incluyen: la patente US nº 5.994.559 Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener, la patente US nº 5.975.298 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compouds, la patente US nº 5.128.164 Composition for human consumption containing 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compounds; y la patente US nº 5.128.482 Process for the production of 3-1(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl) indole. 50

Algunos de los precursores de monatina descritos en la presente memoria pueden ser también útiles como edulcorantes sintéticos o como productos intermedios en la síntesis de derivados de monatina.

Anteriormente, fueron descritos procedimientos para producir monatina (Nakamura et al., Organic Letters, 55 2, 19: 2967-2970, 2000). Además, una cepa de E. coli que sobreexpresa un gen para aldolasa (Patil et al., J. Bacteriol., 171, 1: 1402-107, 1992), se han descrito células de E. coli que expresan aminoácido deshidrogenasas o aminoácido transferasas heterólogas (Galkin et al., Applied and Environmental Microbiology, 63, 12:4651-4656, 1997) y las células de levadura que expresan glutamato deshidrogenasas (Deluna et al., J. Biol. Chem., 274, 47:43775-43783, 2001). Además, la patente EP 1 445 323 describe la producción biosíntética de monatina a partir 60 de triptófano con indol-3-piruvato y 2-hidroxiácido 2(indol-3-il-metil)-4-cetoglutárico como productos intermedios.

SUMARIO

La presente invención se refiere a las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones. Por lo 65 tanto se refiere a un procedimiento de producción de monatina, que comprende convertir el triptófano y/o el ácido

indol-3-láctico en monatina, en el que el procedimiento comprende:

(a) poner en contacto el triptófano o el ácido indol-3-láctico con un polipéptido, en el que, cuando el triptófano está en contacto con el primer polipéptido, el primer polipéptido se selecciona de entre triptófano aminotransferasa (CE 2.6.1.27), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), tirosina aminotransferasa 5 (aromática)(CE 2.6.1.5), triptofan-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), triptófano oxidasa, L-aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.2), D-amino-ácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1), D-aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.3), D-triptófano aminotransferasa, D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21), glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20), o una combinación de las mismas, en la que, cuando 10 el ácido indol-3-láctico se pone en contacto con el primer polipéptido, el primer polipéptido se selecciona de entre indol-lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.110), R-4 hidroxifenil-lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato reductasa (CE 1.1.1.237), lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3),(3-imidazol-5-il) lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.111), y lactato oxidasa (CE 1.1.3.-), o una combinación de las mismas, en la que el primer polipéptido convierte el triptófano o el ácido indol-3-15 láctico en indol-3-piruvato;

(b) poner en contacto el indol-3-piruvato con un segundo polipéptido y una fuente de carbono C3, en el que el segundo polipéptido es una enzima CE 4.1.2 o CE 4.1.3., en la que el segundo polipéptido convierte el indol-3-piruvato y la fuente de carbono C3 en 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico; y 20

(c) poner en contacto el 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico con un tercer polipéptido, en el que el tercer polipéptido se selecciona de entre tirosina aminotransferasa (aromático) (CE 2.6.1.5), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), triptófano aminotransferasa (CE 2.6.1.27), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), D-alanina aminotransferasa (CE 25 2.6.1.21), D-triptófano aminotransferasa, glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1), una lisina épsilon aminotransferasa, o una combinación de las mismas, en la que el tercer polipéptido convierte el 2-hidroxiácido 2-(indol-3ilmetil)-4-cetoglutárico en monatina.

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La presente invención se refiere además, al procedimiento de producción de monatina, en el que, cuando el primer polipéptido que convierte triptófano en indol-3-piruvato es una aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.-), se utiliza además una catalasa (CE 1.11.1.6).

La presente invención se refiere además, al procedimiento de producción de monatina, en el que, cuando 35 el primer polipéptido que convierte triptófano en indol-3-piruvato es una aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.-), se utiliza además una catalasa (CE 1.11.1.6) en el que la aminoácido oxidasa es una triptófano oxidasa..

La presente invención se refiere además, al procedimiento de producción de monatina, en el que, la enzima CE 4.1.3 es la 4-hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato-liasa (CE 4.1.3.16), la 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato 40 piruvato-liasa (CE 4.1.3.17) o una combinación de las mismas.

La presente invención se refiere además, al procedimiento de producción de monatina, en el que el segundo polipéptido es una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

45

(a) SEC. ID. nº 66, nº de registro en Genbank: CAC46344, nº de registro en Genbank: CAB 14127.1, nº de registro en Genbank: AAC74920.1 o nº de registro en Genbank: CAC47463.1;

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos el 90% de identidad de la secuencia con la SEC. ID. nº 66, nº de registro en Genbank: CAC46344, nº de registro en Genbank: CAB 14127.1, nº de 50 registro en Genbank: AAC74920.1 o nº de registro en Genbank: CAC47463.1; y

(c) secuencias de aminoácidos que se diferencian en la SEC. ID. nº 66, nº de registro en Genbank: CAC46344, nº de registro en Genbank: CAB 14127.1, nº de registro en Genbank: AAC74920.1 o nº de registro en Genbank: CAC47463.1 en menos de 50 sustituciones de aminoácidos conservadoras, en el que 55 la secuencia de aminoácidos convierte el indol-3-piruvato y el piruvato en 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico.

La presente invención se refiere además, al procedimiento de producción de monatina, en el que, cuando el primer polipéptido es una aspartato aminotransferasa, el 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico se pone 60 en contacto con el aspartato para producir oxaloacetato y monatina.

La presente invención se refiere además, al procedimiento de producción de monatina, en el que, cuando el tercer polipéptido es una aspartato aminotransferasa, el 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico se pone en contacto con el aspartato para producir oxaloacetato y monatina y que comprende además la puesta en contacto 65 del oxaloacetato con una descarboxilasa.

La presente invención se refiere además, al procedimiento de producción de monatina, en el que, cuando el tercer polipéptido es una lisina epsilon aminotransferasa el 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-cetoglutárico se pone en contacto además con lisina.

La presente invención se refiere además, a un procedimiento de producción de monatina, en el que, el 5 primer y/o tercer polipéptidos se seleccionan de entre el grupo constituido por:

(a) una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC. ID. nº: 2, 4, 6, 10, 12, 14, 32, nº de registro en Genbank: NP_388848.1, nº de registro en Genbank: ZP00005082.1 o nº de registro en Genbank: ACC74014.1; 10

(b) una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 90% de identidad de secuencias con la secuencia mostrada en las SEC. ID. nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, nº de registro en Genbank: NP_388848.1, nº de registro en Genbank: ZP00005082.1 o nº de registro en Genbank: ACC74014.1; y

15

(c) secuencias de aminoácidos que se diferencian de las SEC. ID. nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, nº de registro en Genbank: NP_388848.1, nº de registro en Genbank: ZP00005082.1 o nº de registro en Genbank: ACC74014.1 en menos de 50 sustituciones conservadoras de aminoácidos, en las que la secuencia de aminoácidos convierte el triptófano en indol-3-piruvato.

20

La presente invención se refiere además, al procedimiento de producción de monatina, en el que, el triptófano se produce a partir del indol utilizando un polipéptido procedente de CE 4.1.99.1.

La presente invención se refiere además, al procedimiento de producción de monatina, en el que, la fuente de carbono C3 se selecciona de entre piruvato, fosfoenolpiruvato, alanina, serina, cisteína o una combinación de los 25 mismos.

La presente invención se refiere al procedimiento de producción de monatina, en el que, la fuente de carbono C3 se selecciona de entre piruvato, fosfoenolpiruvato, alanina, serina, cisteína o una combinación de los mismos, en el que el piruvato es producido por: 30

(a) alanina y un polipéptido que puede realizar la transaminación de alanina;

(b) serina y un polipéptido que puede realizar la beta-eliminación de serina;

35

(c) cisteína y un polipéptido que puede realizar la beta-eliminación de cisteína;

(d) aspartato y un polipéptido que puede realizar las reacciones de beta-liasa con un aminoácido dicarboxílico;

(e) lactato y lactato-oxidasa (CE 1.1.3.-) o una lactato-deshidrogenasa (CE 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3); o 40

(f) una combinación de los mismos.

La presente invención se refiere al procedimiento de producción de monatina, en el que, el procedimiento comprende además reducir una cantidad de peróxido de hidrógeno producido cuando el triptófano se convierte en 45 indol-3-piruvato poniendo en contacto el peróxido de hidrógeno con una catalasa.

La presente invención se refiere al procedimiento de producción de monatina, en el que se producen por lo menos 10 g/l de monatina.

50

La presente invención se refiere además a un procedimiento de producción de monatina, en el que, el procedimiento comprende además la detección del 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico por espectrometría de masas.

La presente invención se refiere además a un procedimiento de producción de monatina, que comprende 55 convertir el indol-3-piruvato en monatina en presencia de piruvato y un primer y un segundo polipéptidos, en el que el primer polipéptido es una aldolasa, y en el que el segundo polipéptido se selecciona de entre tirosina aminotransferasa (aromática) (CE 2.6.1.5), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), triptófano aminotransferasa (CE 2.6.1.27), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21), D-triptófano aminotransferasa, glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2-4), 60 fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1) o una combinación de las mismas.

La invención proporciona varias rutas biosintéticas para la preparación de monatina a partir de glucosa, triptófano, ácido indol-3-láctico y/o mediante precursores de monatina tales como indol-3-piruvato y 2-hidroxiácido 65 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico. Se dan a conocer las secuencias de polipéptidos y de ácidos nucleicos que pueden utilizarse para preparar monatina, indol-3-piruvato y 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico.

La monatina puede producirse mediante indol-3-piruvato, 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (precursor de monatina, PM, la forma alfa-ceto de monatina), ácido indol-3-láctico, triptófano y/o glucosa (figura 1). Se dan a conocer procedimientos de producción o preparación de monatina o sus intermedios mostrados en las figuras 1 a 3 y 11 a 13 que implican convertir un sustrato en un primer producto, y a continuación convertir el primer 5 producto en un segundo producto y así sucesivamente hasta que se crea el producto final deseado.

Las figura 1 a 3 y 11 a 13 presentan productos intermedios potenciales y productos finales en casillas. Por ejemplo, una conversión de un producto en otro, tal como glucosa en triptófano, triptófano en indol-3-piruvato, indol-3-piruvato en PM, PM en monatina, o ácido indol-3-láctico (indol-lactato) en indol-3-piruvato, puede realizarse 10 utilizando estos procedimientos. Estas conversiones pueden facilitarse química o biológicamente. El término "convertir" se refiere a la utilización ya sea de medios químicos o de polipéptidos en una reacción que cambia un primer intermedio en un segundo intermedio. La expresión "conversión química" se refiere a las reacciones que los polipéptidos no facilitan activamente. La expresión "conversión biológica" se refiere a las reacciones que los polipéptidos facilitan activamente. Las conversiones pueden tener lugar in vivo o in vitro. Cuando se utilizan 15 conversiones biológicas los polipéptidos y/o las células pueden inmovilizarse sobre soportes tal como por enlace químico sobre soportes de polímero. La conversión puede realizarse utilizando cualquier reactor conocido por cualquier experto en la materia, por ejemplo en un reactor discontinuo o continuo.

Se proporcionan además procedimientos que incluyen poner en contacto un primer polipéptido con un 20 sustrato y elaborar un primer producto, y a continuación poner en contacto el primer producto creado con un segundo polipéptido y crear un segundo producto, y a continuación poner en contacto el segundo producto creado con un tercer polipéptido y crear un tercer producto, por ejemplo monatina. Los polipéptidos utilizados en los productos producidos se presentan en las figuras 1 a 3 y 11 a 13.

25

Se dan a conocer los polipéptidos, y sus secuencias de codificación, que pueden utilizarse y realizar las conversiones representadas en las figuras 1 a 3 y 11 a 13. En algunos ejemplos, los polipéptidos que tienen una o más mutaciones puntuales que permiten que se modifique la especificidad de sustrato y/o la actividad del polipéptido, se utilizan para preparar monatina.

30

Se dan a conocer células aisladas y recombinantes que producen monatina. Estas células pueden ser cualquier célula, tal como vegetal, animal, bacteriana, de levadura, de alga, de arquea o fúngica.

En un ejemplo específico, las células dadas a conocer incluyen una o más de las actividades siguientes, por ejemplo dos o más o tres o más de las actividades siguientes: triptófano aminotransferasa (CE 2.6.1.27), 35 tirosina aminotransferasa (aromática) (CE 2.6.1.5), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), L-aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.2), triptófano oxidasa (sin número CE, Hadar et al., J. Bacteriol. 125:1096-1104, 1976 y Furuya et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64: 1486-93, 2000), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1), D-aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.3), D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21), 40 sintasa/liasa (4.1.3.-), tal como 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (CE 4.1.3.17) o 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (CE 4.1.3.16), sintasa/liasa (4.1.2.-), D-triptófano aminotransferasa (Kohiba y Mito, Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japón, 1990), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20) y/o glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4).

45

En otro ejemplo, las células incluyen una o más, por ejemplo dos o más, o tres o más, de las actividades siguientes: indol-lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.110), R-4-hidroxifenil-lactato deshidrogenasa (CE1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato reductasa (CE1.1.1.237), lactato deshidrogenasa (CE1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.111), lactato oxidasa (CE 1.1.3.-), sintasa/liasa (CE 4.1.3.-), tal como 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (CE 4.1.3.17) o 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (CE 4.1.3.16), sintasa/liasa 50 (4.1.2.-), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), triptófano amino-transferasa (CE 2.6.1.27), tirosina aminotransferasa (aromática) (CE 2.6.1.5), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20), glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1), D-triptófano aminotransferasa y/o D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21). 55

Además, las células dadas a conocer incluyen una o más de las siguientes actividades, por ejemplo dos o más o tres o más de las siguientes actividades: triptófano aminotransferasa (CE 2.6.1.27), tirosina aminotransferasa (aromática) (CE 2.6.1.5), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), L-aminoácido oxidasa 60 (CE 1.4.3.2), triptófano oxidasa (sin número CE), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1), D-aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.3), D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21), indol-lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.110), R-4-hidroxifenil-lactato deshidrogenasa (CE1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato reductasa (CE1.1.1.237), lactato deshidrogenasa (CE1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.111), lactato oxidasa (CE 1.1.3.-), sintasa/liasa (CE 4.1.3.-), tal como 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (CE 4.1.3.17) o 4-65 hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (CE 4.1.3.16), sintasa/liasa (4.1.2.-), glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20) y/o D-triptófano aminotransferasa.

La monatina puede producirse por un procedimiento que incluye poner en contacto el triptófano y/o el ácido indol-3-láctico, con un primer polipéptido, en el que el primer polipéptido convierte el triptófano y/o el ácido indol-3-láctico en indol-3-piruvato (bien la forma D o la L del triptófano o el ácido indol-3-láctico puede utilizarse como sustrato que se convierte en indol-3-piruvato; un experto en la materia apreciará que los polipéptidos seleccionados 5 para esta etapa presentan teóricamente la especificidad apropiada), poner en contacto el indol-3-piruvato resultante con un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido convierte el indol-3-piruvato en 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (PM) y poner el contacto el PM con un tercer polipéptido, en el que el tercer polipéptido convierte el PM en monatina. Los polipéptidos ejemplificativos que pueden utilizarse para esta conversión se muestran en las figuras 2 y 3. 10

Otro aspecto de la invención proporciona composiciones tales como el PM, células que contienen por lo menos dos polipéptidos, o algunas veces por lo menos tres o por lo menos cuatro polipéptidos, que son codificados en por lo menos una secuencia de ácido nucleico exógeno.

15

Estos y otros aspectos de la invención resultan evidentes a partir de la descripción detallada y de los ejemplos ilustrativos siguientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

20

La figura 1 presenta las rutas biosintéticas utilizadas para producir monatina y/o indol-3-piruvato. Una ruta produce indol-3-piruvato por medio de triptófano, mientras que otra produce indol-3-piruvato por medio de ácido indol-3-láctico. La monatina se produce posteriormente por medio de un 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (PM) intermedio.

25

Los compuestos mostrados en casillas son sustratos y productos producidos en las rutas biosintéticas.

Las composiciones junto a las flechas son cofactores, o reactantes que pueden utilizarse durante la conversión de un sustrato en un producto. El cofactor o reactante utilizado dependerá del polipéptido utilizado para la etapa específica de la ruta biosintética. El cofactor PLP (piridoxal 5’-fosfato) puede catalizar reacciones 30 independientes de un polipéptido, y por consiguiente, proporcionando únicamente PLP puede permitir la evolución del sustrato a producto.

La figura 2 es un diagrama con mayor detalle de la ruta biosintética que utiliza el PM intermedio. Los sustratos de cada etapa en la ruta se muestran en casillas. Los polipéptidos que permiten la conversión entre los 35 sustratos se listan junto a las flechas entre los sustratos. Cada polipéptido está descrito por su denominación corriente y un número de clase enzimática (CE).

La figura 3 presenta un diagrama con mayor detalle de la ruta biosintética de la conversión ddel ácido indol-3-láctico en indol-3-piruvato. Los sustratos se muestran en casillas y los polipéptidos que permiten la 40 conversión entre los sustratos se listan junto a la flecha entre los sustratos. Cada polipéptido está descrito por su denominación corriente y un número de clase enzimática (CE).

La figura 4 presenta una posible reacción para preparar el PM por medios químicos.

45

Las figura 5A y 5B son cromatogramas que presentan la identificación por LC/MS de monatina producida mediante enzimas.

La figura 6 es un espectro de masas con electroatomización de monatina sintetizada mediante enzimas.

50

Las figuras 7A y 7B representan cromatogramas de los análisis LC/MS/MS del ión derivado de monatina producida en una mezcla enzimática.

La figura 8 es un cromatograma que muestra la cuantificación por espectroscopia de masas de alta resolución de monatina producida mediante enzimas. 55

Las figuras 9A a 9C son cromatogramas que presentan la separación quiral del (A) R-triptófano, (B) S-triptófano y (C) monatina producida mediante enzimas.

La figura 10 es un gráfico de barras que muestra la cantidad relativa de monatina producida en células 60 bacterianas después de la inducción con IPTG. El (-) indica una falta de adición del sustrato (no se añadió triptófano ni piruvato).

Las figuras 11 y 12 son diagramas esquemáticos que muestran las rutas utilizadas para aumentar el rendimiento de monatina producida a partir de triptófano o de indol-3-piruvato. 65

La figura 13 es un diagrama esquemático que presenta una ruta que puede utilizarse para aumentar el

rendimiento de monatina producida a partir de triptófano o de indol-3-piruvato.

LISTADO DE SECUENCIAS

Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos en el listado de secuencias adjunto se muestran 5 utilizando abreviaturas en letras normales para las bases nucleotídicas y código de tres letras para los aminoácidos. Solamente se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero la cadena complementaria se sobreentiende que está incluida por cualquier referencia a la cadena presentada.

Las SEC. ID. nº 1 y nº 2 representan las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de una 10 aminotransferasa procedente de Sinorhizobium meliloti, respectivamente (gen tatA, denominado una tirosina aminotransferasa o aromática en la bibliografía).

Las SEC. ID. nº 3 y nº 4 representan las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de una tirosina aminotransferasa procedente de Rhodobacter sphaeroides (2.4.1), respectivamente (por homología con la tatA 15 (SEC. ID. nº 1 y nº 2) se predijo que era una "aspartato aminotransferasa" por programa informático genómico).

Las SEC. ID. nº 5 y nº 6 representan las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de una aminotransferasa de Rhodobacter sphaeroides (35053), respectivamente (nuevas, clonadas basadas en la secuencia de 2.4.1 de las SEC. ID. nº 3 y nº 4). 20

Las SEC. ID. nº 7 y nº 8 representan las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de una sustrato amplio aminotransferasa (bsat) de Leishmania major, respectivamente.

Las SEC. ID. nº 9 y nº 10 representan las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de una 25 aminotransferasa aromática (araT) de Bacillus subtilis, respectivamente.

Las SEC. ID. nº 11 y nº 12 representan nuevas secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de una aminotransferasa aromática (araT) de Lactobacillus amylovorus, respectivamente (identificada por homología como una aminotransferasa aromática). 30

Las SEC. ID. nº 13 y nº 14 representan las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de una sustrato múltiple aminotransferasa (msa) de R. sphaeroides (35053), respectivamente (identificada como una sustrato múltiple aminotransferasa por homología con el nº de registro AAAE01000093.1, 14743 a 16155 pb y nº de registro ZP00005082.1). 35

Las SEC. ID. nº 15 y nº 16 presentan los cebadores utilizados para clonar la secuencia de D-alanina aminotransferasa (dat) de B. subtilis.

Las SEC. ID. nº 17 y nº 18 representan los cebadores utilizados para clonar la secuencia tatA de S. 40 meliloti.

Las SEC. ID. nº 19 y nº 20 representan los cebadores utilizados para clonar la secuencia araT de aminotransferasa de B. subtilis.

45

Las SEC. ID. nº 21 y nº 22 representan los cebadores utilizados para clonar las secuencias de sustrato múltiple aminotransferasa de Rhodobacter sphaeroides (2.4.1 y 35053).

Las SEC. ID. nº 23 y nº 24 representan los cebadores utilizados para clonar la secuencia bsat de Leishmania major. 50

Las SEC. ID. nº 25 y nº 26 representan los cebadores utilizados para clonar la secuencia araT de Lactobacillus amylovorus.

Las SEC. ID. nº 27 y nº 28 representan los cebadores utilizados para clonar las secuencias tatA de R. 55 sphaeroides (tanto la 2.4.1 como la 35053).

Las SEC. ID. nº 29 y nº 30 representan los cebadores utilizados para clonar la secuencia aspC de E. coli (secuencia génica nº de registro en Genbank: AE000195.1, secuencia de proteínas nº de registro en Genbank: AAC74014.1). 60

Las SEC. ID. nº 31 y nº 32 representan las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la aminotransferasa aromática (tyrB) de E. coli, respectivamente.

Las SEC. ID. nº 33 y nº 34 representan los cebadores utilizados para clonar la secuencia tyrB de E. coli. 65

Las SEC. ID. nº 35 a 40 representan los cebadores utilizados para clonar polipéptidos con actividad de 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (KHG) (CE 4.1.3.16).

Las SEC. ID. nº 41 y nº 42 representan las secuencias de ácidos nucleicos de triptofanasa (tna) de E. coli y tirosina fenol-liasa (tpl) de Citrobacter feundii, que codifica las proteínas P00913 (GI: 401195) y P31013 (GI: 5 401201), respectivamente.

Las SEC. ID. nº 43 a 46 representan los cebadores utilizados para clonar polipéptidos de triptofanasa y de polipéptidos de β-tirosinasa (tirosina fenol-liasa).

10

Las SEC. ID. nº 47 a 54 representan los cebadores utilizados para mutar los polipéptidos de triptofanasa y polipéptidos de β-tirosinasa.

Las SEC. ID. nº 55 a 64 representan los cebadores utilizados para clonar los polipéptidos con actividad de 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (CE 4.1.3.17). 15

Las SEC. ID. nº 65 y nº 66 representan las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (proA) de C. testosteroni, respectivamente.

Las SEC. ID. nº 67 a 68 presentan los cebadores utilizados para clonar 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato 20 aldolasa (proA) de C. testosteroni en un operón con aspC de E. coli en el pET30 Xa/LIC.

Las SEC. ID. nº 69 a 72 representan los cebadores utilizados para clonar aspC de E. coli y proA de C. testosteroni en pESC-his.

25

Las SEC. ID. nº 73 y nº 74 representan las secuencias añadidas al extremo 5’ de los cebadores utilizados para clonar los genes dados a conocer en la presente memoria.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE VARIAS FORMAS DE REALIZACIÓN

30

Abreviaturas y términos

Para describir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la materia en la práctica de la presente invención se proporcionan las explicaciones siguientes de los términos y procedimientos. Tal como se utiliza en la presente memoria, "que comprende" significa que incluye y las formas singulares "un", "una" o "el" o "la" 35 incluyen las referencias del plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Por ejemplo, la referencia a "que comprende una proteína" incluye una o varias de dichas proteínas, y la referencia a "que comprende las células" incluye la referencia a una o más células y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia y así sucesivamente.

40

A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado normalmente entendido por cualquier experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque los procedimientos o materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria pueden utilizarse en la práctica o experimentación de la presente invención, los procedimientos y materiales adecuados se describen a continuación. Los materiales, procedimientos y ejemplos se proporcionan 45 únicamente a título de ejemplo limitativo. Otras propiedades y ventajas de la invención resultan evidentes en la siguiente descripción detallada y en las reivindicaciones.

ADNc (ADN complementario): Pieza de ADN que carece de segmentos internos, no codificadores (intrones) y secuencias reguladoras que determinan la transcripción. El ADNc puede sintetizarse en el laboratorio 50 por transcripción inversa a partir del ARN mensajero extraído de las células.

Sustitución conservadora: Una o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo 2, 5 ó 10 restos) para los restos de aminoácidos que tienen similares propiedades bioquímicas. Por lo general, las sustituciones conservadoras tienen poco a ningún impacto sobre la actividad del polipéptido resultante. Por ejemplo, 55 teóricamente, un polipéptido de triptófano aminotransferasa que incluye una o más sustituciones conservadoras conserva actividad de triptófano aminotransferasa. Puede producirse un polipéptido que contenga una o más sustituciones conservadoras manipulando la secuencia nucleotídica que codifica este polipéptido utilizando, por ejemplo, procedimientos convencionales tales como la mutagénesis dirigida o la RCP.

60

Variantes se sustitución son aquellas en las que por lo menos un resto en la secuencia de aminoácidos se ha eliminado y un resto diferente se ha insertado en su lugar. Ejemplos de aminoácidos que pueden ser sustituidos por un aminoácido original en una proteína y que se consideran como sustituciones conservadoras incluyen: Ala sustituido con ser o thr; arg sustituida por gln, his o lys; asn sustituida por glu, gln, lys, his, asp; asp sustituida por asn, glu o gln; cys sustituida por ser o ala; gln sustituida por asn, glu, lys, his, asp o arg; glu sustituido con asn, gln, 65 lys, o asp; gly sustituida por pro; his sustituida por asn, lys, gln, arg, tyr; ile sustituida por leu, met, val, phe; leu

sustituida por ile, met, val, phe; lys sustituida por asn, glu, gln, his, arg; met sustituida por ile, leu, val, phe; fe sustituida por trp, tyr, met, ile o leu; ser sustituida por thr, ala; thr sustituida por ser o ala; trp sustituida por fe, tyr; tyr sustituida por his, fe o trp; y val sustituida por met, ile y leu.

Más información acerca de las sustituciones conservadoras puede encontrarse, entre otros sitios en Ben-5 Bassat et al., (J. Bacteriol., 169:751-7, 1987), O’Reagan et al., (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al., (Protein Sci., 3:240-7, 1994), Hochuli et al., (Bio/Technology, 6:1321-5, 1988), documento WO 00/67796 (Curd et al.) y en los libros de textos normales de genética y de biología molecular.

Exógeno: El término "exógeno" tal como se lo utiliza en la presente memoria haciendo referencia al ácido 10 nucleico y a una célula concreta se refiere a cualquier ácido nucleico que no se origine de esta célula específica como se encuentra en la naturaleza. De esta manera, el ácido nucleico artificial se considera que es exógeno a una célula una vez introducido en la célula. El ácido nucleico que es natural también puede ser exógeno para una célula específica. Por ejemplo, un cromosoma completo aislado de una célula de la persona X es un ácido nucleico exógeno con respecto a una célula de la persona Y una vez que el cromosoma se ha introducido en la célula de Y. 15

Funcionalmente equivalente: Que tiene una función equivalente. En el contexto de una enzima, las moléculas funcionalmente equivalentes incluyen diferentes moléculas que conservan la función de la enzima. Por ejemplo, pueden proporcionarse equivalentes funcionales mediante alteraciones de la secuencia en una secuencia enzimática, en la que el péptido con una o más alteraciones de la secuencia conserva una función del péptido 20 inalterado, de modo que conserva su actividad enzimática. En un ejemplo específico, un equivalente funcional de triptófano aminotransferasa conserva la capacidad para convertir el triptófano en indol-3-piruvato.

Los ejemplos de alteraciones de la secuencia comprenden de manera no limitativa, sustituciones conservadoras, sustracciones, mutaciones, desplazamientos del marco e inserciones. En un ejemplo, un polipéptido 25 dado se une a un anticuerpo, y un equivalente funcional es un polipéptido que se une al mismo anticuerpo. De este modo un equivalente funcional incluye péptidos que tienen la misma especificidad de enlace que un polipéptido, y que puede utilizarse como reactivo en lugar del polipéptido. En un ejemplo un equivalente funcional incluye un polipéptido en el que la secuencia de enlace es discontinua, en el que el anticuerpo se une a un epítopo lineal. Por lo tanto, si la secuencia del péptido es MPELANDLGL (aminoácidos 1 a 10 de la SEC. ID. nº 12) un equivalente 30 funcional incluye epítopos discontinuos, que pueden aparecer de la manera siguiente (** = cualquier número de aminoácidos intervinientes): NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH. En este ejemplo, el polipéptido es funcionalmente equivalente a los aminoácidos 1 a 10 de la SEC. ID. nº 12 si la estructura tridimensional del polipéptido es tal que puede unirse a un anticuerpo monoclonal que se une a aminoácidos 1 a 10 de la SEC. ID. nº 12. 35

Hibridación: El término "hibridación" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un procedimiento de experimentación para complementariedad en la secuencia de nucleótidos de dos moléculas de ácido nucleico, basado en la capacidad del ADN monocatenario complementario y/o del ARN para formar una molécula de doble cadena. Pueden utilizarse técnicas de hibridación del ácido nucleico para obtener un ácido 40 nucleico aislado dentro del alcance de la invención. En resumen, cualquier ácido nucleico que tenga alguna homología con una secuencia indicada en SEC. ID. nº 11 puede utilizarse como sonda para identificar un ácido nucleico similar por hibridación en condiciones de moderada a alta severidad. Una vez identificado, el ácido nucleico luego puede purificarse, secuenciarse y analizarse para determinar si está comprendida dentro del alcance de la presente invención. 45

La hibridación puede realizarse por análisis Southern o Northern para identificar una secuencia de ADN o de ARN, respectivamente, que se hibrida a una sonda. La sonda puede marcarse con biotina, digoxigenina, un polipéptido o un radioisótopo tal como 32P. El ADN o ARN que va a analizarse puede separarse por electroforesis en un gel de agarosa o de poliacrilamida, transferirse a nitrocelulosa, nilón u otra membrana adecuada e hibridarse 50 con la sonda utilizando técnicas convencionales bien conocidas en la materia tales como las descritas en los apartados 7.39 a 7.52 de Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY. Por lo general, una sonda tiene por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Por ejemplo una sonda que corresponde una secuencia de 20 nucleótidos contiguos indicada en SEC. ID. nº 11 puede utilizarse para identificar un ácido nucleico idéntico o similar. Además, pueden utilizarse sondas más largas o más 55 cortas de 20 nucleótidos.

La invención proporciona además secuencias aisladas de ácido nucleico que son por lo menos de 12 bases de longitud (por ejemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 ó 5000 bases de longitud) y se hibridan, en condiciones de hibridación, a la cadena transcrita o 60 complementaria de un ácido nucleico que tiene la secuencia indicada en la SEC. ID. nº 11. Las condiciones de hibridación pueden ser condiciones de hibridación moderadamente o muy severas.

En aras de la presente invención, condiciones de hibridación moderadamente severas significa que la hibridación se realiza a aproximadamente 42ºC en una solución de hibridación que contiene KPO4 25 mM (pH 7,4), 65 5 x SSC, 5 x solución de Denhart, 50 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a ultrasonidos, formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10% y 1 a 15 ng/ml de sonda (aproximadamente 5 x

107 cpm/μg), mientras que los lavados se llevan a cabo aproximadamente a 50ºC con una solución de lavado que contiene 2 x SSC y dodecilsulfato sódico al 0,1%.

Condiciones de hibridación muy severas significa que la hibridación se realiza a aproximadamente 42ºC en una solución de hibridación que contiene KPO4 25 mM (pH 7,4), 5 x SSC, 5 x solución de Denhart, 50 μg/ml de ADN 5 de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a ultrasonidos, formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10% y 1 a 15 ng/ml de sonda (aproximadamente 5 x 107 cpm/μg), mientras que los lavados se llevan a cabo aproximadamente a 65ºC con una solución de lavado que contiene 0,2 x SSC y dodecilsulfato sódico al 0,1%.

Aislado: El término "aislado" tal como se utiliza en la presente memoria, haciendo referencia a un ácido 10 nucleico se refiere a un ácido nucleico natural que no está inmediatamente contiguo a ambas secuencias con las que está inmediatamente contiguo (una en el extremo 5’ y la otra en el extremo 3’) en el genoma natural del organismo del que procede. Por ejemplo, un ácido nucleico puede ser, sin limitación, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, con tal que una de las secuencias de ácido nucleico que se encuentra normalmente flanqueando inmediatamente esta molécula de ADN recombinante en un genoma natural se elimine o 15 falte. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado comprende de manera no limitativa, un ADN recombinante que existe como molécula independiente (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por RCP o un tratamiento de endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias así como un ADN recombinante que esté incorporado en un vector, un plásmido que se replica de forma autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o virus herpético) o en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido 20 nucleico aislado puede incluir una molécula de ADN recombinante que forma parte de un híbrido o de una secuencia de ácido nucleico de fusión.

El término "aislado" tal como se utiliza en la presente memoria con relación al ácido nucleico incluye también cualquier ácido nucleico artificial ya que las secuencias de ácido nucleico artificiales no se encuentran en la 25 naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un genoma natural. Por ejemplo, el ácido nucleico artificial tal como un ácido nucleico modificado genéticamente se considera que es un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico modificado genéticamente puede utilizar técnicas de clonación molecular corriente o de síntesis química de ácido nucleico. El ácido nucleico artificial aislado puede existir independiente de otras secuencias, o incorporado en un vector, un plásmido que se replica de manera autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, 30 adenovirus o virus herpético) o el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, el ácido nucleico artificial puede incluir una molécula de ácido nucleico que forma parte de una secuencia de ácido nucleico híbrido o de fusión.

Para los expertos en la materia resultará evidente que un ácido nucleico que existe entre centenares a 35 millones de otras moléculas de ácido nucleico en, por ejemplo, bancos de ADNc o genómicos, o en rodajas de gel que contienen una enzima de restricción de ADN genómico no se considera un ácido nucleico aislado.

Ácido nucleico: La expresión "ácido nucleico" tal como se utiliza en la presente memoria, comprende tanto el ARN como el ADN comprendiendo de manera no limitativa, ADNc, ADN genómico y ADN sintético (por 40 ejemplo, sintetizado químicamente). El ácido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario. Cuando es monocatenario, el ácido nucleico puede ser la cadena transcrita o la cadena complementaria. Además, el ácido nucleico puede ser circular o lineal.

Operativamente unida: Una primera secuencia de ácido nucleico está "operativamente unida" con una 45 segunda secuencia de ácido nucleico siempre que la primera secuencia de ácido nucleico esté colocada en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un activador está operativamente unido a una secuencia de codificación si el activador afecta la transcripción de la secuencia de codificación. Generalmente, las secuencias de ADN operativamente unidas son contiguas y, cuando es necesario unir dos zonas de codificación del polipéptido, en el mismo marco de lectura. 50

Modificaciones de péptidos: La presente invención incluye enzimas, así como formas de realización sintéticas de las mismas. Además, los análogos (moléculas orgánicas no peptídicas), derivados (moléculas peptídicas químicamente funcionalizadas que comienzan con las secuencias peptídicas dadas a conocer) y las variantes (homólogos) con la actividad enzimática deseada pueden utilizarse en los procedimientos descritos en la 55 presente memoria. Los péptidos dados a conocer en la presente memoria incluyen una secuencia de aminoácidos, que pueden ser L- y/o D- aminoácidos, naturales y distintos.

Los péptidos pueden modificarse mediante varias técnicas químicas para producir derivados que tienen esencialmente la misma actividad que los péptidos inalterados, y opcionalmente tienen otras propiedades 60 deseables, por ejemplo, grupos de ácido carboxílico de la proteína, si el terminal carboxilo o la cadena lateral, pueden suministrarse en forma de sal de un catión farmacéuticamente aceptable o esterificarse para formar un éster C1-C16, o convertirse en una amida de fórmula NR1R2, en la que R1 y R2 son cada una independientemente H o alquiloC1-C16 o combinarse para formar un anillo heterocíclico, tal como un anillo de 5 ó 6 elementos. Los grupos amino del péptido, ya sean de cadena con terminal amino o lateral, pueden estar en forma de una sal de 65 adición de ácido farmacéuticamente aceptable, tal como el HCl, HBr, acético, benzoico, toluensulfónico, maleico,

tartático y otras sales orgánicas, o puede modificarse a alquiloC1-C16 o dialquilamino o transformarse más hasta una amida.

Los grupos hidroxilo de las cadenas peptídicas laterales pueden convertirse en alcohoxi C1-C16 o en éster C1-C16 utilizando técnicas muy reconocidas. Los anillos de fenilo y fenólico de las cadenas laterales del péptido 5 pueden estar sustituidas con uno o más átomos de halógeno, tales como F, Cl, Br o I, o con alquilo C1-C16, alcohoxi C1-C16, ácidos carboxílicos y ésteres de los mismos o amidas de dichos ácidos carboxílicos. Los grupos metileno de las cadenas laterales del péptido pueden prolongarse a alquilenos C2-C4 homólogos. Los tioles pueden protegerse con cualquiera de los numerosos grupos protectores bien reconocidos tales como los grupos acetamida. Los expertos en la materia reconocerán también los métodos para introducir estructuras cíclicas en los péptidos de 10 la presente invención para seleccionar y proporcionar limitaciones de configuración a la estructura que dan como resultado un aumento de estabilidad. Por ejemplo, una cisteína con terminal C o N puede añadirse al péptido, de modo que cuando se oxide el péptido contenga un enlace disulfuro, generando un péptido cíclico. Otros procedimientos de ciclación de péptidos incluyen la formación de tioéteres y de amidas y ésteres con terminal carboxilo y amino. 15

Las formas de realización peptidomiméticas y organomiméticas están asimismo comprendidas dentro del alcance de la presente invención, por lo que la disposición tridimensional de los constituyentes químicos de dicho péptido- y organomiméticos simula la disposición tridimensional del eje central del péptido y de las cadenas laterales del aminoácido componente, dando como resultado dichos péptido- y organomiméticos de las proteínas de 20 la presente invención con actividad enzimática detectable. Para aplicaciones de modelado por ordenador, un farmacóforo es una definición tridimensional idealizada de los requisitos estructurales para la actividad biológica. Pueden diseñarse péptido- y organomiméticos para ajustar cada farmacóforo con el programa informático de modelado por ordenador actual (utilizando el diseño de fármacos asistidos por ordenador o CADD). Véase Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", en Klegerman & Groves (ediciones), Pharmaceutical Biotechnology, 1993, 25 Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, págs. 165-174 y Cap. 102 en Munson (edición), Principles of Pharmacology, 1995, Chapman & Hall, para descripciones y técnicas utilizadas en CADD. Están incluidos también dentro del alcance de la invención los miméticos preparados utilizando dichas técnicas. En un ejemplo, un mimético simula la actividad enzimática generada por una enzima o una variante, fragmento o fusión de la misma.

30

Sondas y cebadores: Las sondas y cebadores de ácido nucleico pueden prepararse fácilmente basándose en las secuencias de aminoácidos y en las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en la presente memoria. Una "sonda" incluye un ácido nucleico aislado que contiene un marcador detectable o una molécula indicadora. Los marcadores ejemplificativos comprenden de manera no limitativa, isótopos radioactivos, ligandos, agentes quimioluminiscentes y polipéptidos. Los procedimientos de marcado y de dirección en la 35 selección de marcadores apropiados para varios propósitos se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1989 y Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York (con actualizaciones periódicas), 1987.

40

Los "cebadores" son por lo general moléculas de ácido nucleico que tienen diez o más nucleótidos (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que tienen entre aproximadamente 10 nucleótidos y aproximadamente 100 nucleótidos). Un cebador puede hibridarse con una cadena de ácido nucleico diana complementario por hibridación del ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ácido nucleico diana, y a continuación prolongarse a lo largo de la cadena de ácido nucleico diana mediante, por ejemplo, un polipéptido de ADN 45 polimerasa. Los pares cebadores pueden utilizarse para la ampliación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) u otros procedimientos de ampliación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica.

Los procedimientos de preparación y utilización de sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en 50 referencias tales como Sambrook et al., (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1989 y Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York (con actualizaciones periódicas), 1987; e Innis et al., (ediciones), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los pares de cebador de RCP pueden proceder de una secuencia conocida, por ejemplo, utilizando programas informáticos 55 pensados con esta finalidad tales como Primer (Versión 0,5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Un experto en la materia valorará que la especificidad de una sonda o cebador concreto aumente con la longitud, pero que una sonda o cebador pueda variar de tamaño desde una secuencia completa a secuencias tan cortas como de cinco nucleótidos consecutivos. Así, por ejemplo, un cebador de 20 nucleótidos consecutivos puede hibridarse a una diana con una especificidad mayor que un cebador correspondiente de sólo 15 60 nucleótidos. Así, con objeto de obtener mayor especificidad, pueden seleccionarse sondas y cebadores que comprenden, por ejemplo, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 2000, 2050, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 65 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 5000, 5050, 5100, 5150, 5200, 5250, 5300, 5350,

5400, 5450, o más nucleótidos consecutivos.

Activador: Matriz de secuencias de control de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Un activador incluye las secuencias necesarias de ácido nucleico próximas al punto de partida de la transcripción, tales como, en el caso de un activador tipo II de polimerasa, un elemento TATA. Un activador puede 5 incluir elementos distales de potenciador o represor que pueden estar situados hasta varios pares de miles de bases desde el punto de partida de la transcripción.

Purificado: El término "purificado" tal como se utiliza en la presente invención, no requiere pureza absoluta; mejor dicho, pretende ser un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación purificada de polipéptido 10 o ácido nucleico puede ser aquella en la que el polipéptido o ácido nucleico en cuestión, respectivamente, está a una concentración mayor que la que estaría en su medio natural el polipéptido o ácido nucleico en un organismo. Por ejemplo, una preparación de polipéptido puede considerarse purificada si el contenido en polipéptido en la preparación representa por lo menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% o 99% del contenido en proteína total de la preparación. 15

Recombinante: Un ácido nucleico "recombinante" es el que tiene (1) una secuencia que no es natural en el organismo en el que se expresa o (2) una secuencia hecha por una combinación artificial de dos secuencias diferentes separadas, más cortas. Esta combinación artificial se realiza con frecuencia por síntesis química o, más frecuentemente, por manipulación artificial de los segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, por 20 técnicas de ingeniería genética. "Recombinante" se utiliza también para describir moléculas de ácidos nucleicos que han sido manipuladas artificialmente, pero contienen las mismas secuencias reguladoras y las zonas de codificación que se encuentran en el organismo en el que se aisló el ácido nucleico.

Identidad de secuencia: La similitud entre las secuencias de aminoácidos se expresa en términos de 25 similitud entre las secuencias, denominada de otra manera identidad de secuencia. La identidad de secuencia se mide frecuentemente en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los homólogos o variantes de un péptido, tales como la SEC. ID. nº 12, posee un grado relativamente alto de identidad de secuencia cuando se alinea utilizando métodos normalizados. 30

Los métodos de alineación de las secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443-53, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:2444-8, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nucleic 35 Acids Research, 16:10881-90; y Altschul et al., Nature Genet., 6:119-29, 1994.

La herramienta básica local de búsqueda de alineación local del NCBI (Basic Local Alignment Search Tool) (BLASTTM) (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-10, 1990) está disponible en varios proveedores, incluyendo el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet para utilización en relación con 40 los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx.

Las variantes de un péptido están caracterizadas por lo general por la posesión de al menos el 50% de identidad de secuencia contada sobre la alineación completa con la secuencia de aminoácidos que utiliza el Blast 2.0 del NCBI, blastp incompleto ajustado para parámetros por defecto. Para las comparaciones de secuencias de 45 aminoácidos mayores de aproximadamente 30 aminoácidos, se emplea la función de secuencias Blast 2 utilizando la matriz BLOSUM62 por defecto ajustada para parámetros por defecto (coste por existencia de hueco de 11 y un coste de 1 por hueco residual). Cuando se alinean péptidos cortos (menores de aproximadamente 30 aminoácidos), la alineación se realiza utilizando la función de las secuencias Blast 2, utilizando la matriz PAM30 ajustada para parámetros por defecto (penalizaciones por hueco abierto 9, por ampliación de hueco 1). Las proteínas con aún 50 mayor similitud a las secuencias de referencia presentarán un aumento del porcentaje de identidades cuando se evalúan por este procedimiento, tal como por lo menos del 80%, por lo menos del 90%, por lo menos del 95%, por lo menos del 98% o incluso por lo menos del 99% de identidad de secuencias. Cuando se está comparando la identidad de secuencias en menos de la secuencia completa, los homólogos y variantes por lo general poseerán por lo menos 80% de identidad de secuencias en intervalos cortos de 10 a 20 aminoácidos, y pueden poseer 55 identidades de secuencias de por lo menos 85%, por lo menos del 90%, por lo menos del 95% o 98% dependiendo de su similitud con la secuencia de referencia. Los métodos para determinar la identidad de secuencias en dichos intervalos cortos se describen en la página web que está mantenida por el National Center for Biotechnology Information in Bethesda, Maryland. Un experto en la materia apreciará que estos intervalos de identidad de secuencias se proporcionan únicamente como orientación; es completamente posible que pudieran obtenerse 60 homólogos muy significativos que no estén comprendidos en los intervalos proporcionados.

Pueden utilizarse procedimientos similares para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de una secuencia de ácido nucleico. En un ejemplo específico, una secuencia homóloga se alinea a una secuencia natural, y el número de emparejamientos se determina haciendo el recuento del número de posiciones en las que un 65 nucleótido idéntico o un resto de aminoácido está presente en ambas secuencias. El porcentaje de identidad de

secuencia se determina dividiendo el número de emparejamientos ya sea por la longitud de la secuencia indicada en la secuencia identificada (por ejemplo, SEC. ID. nº 11) o por una longitud articulada (por ejemplo, 100 nucleótidos consecutivos o restos de aminoácidos procedentes de una secuencia indicada en una secuencia identificada), seguido de multiplicar el valor resultante por 100. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que tiene 1166 emparejamientos cuando se alinea con la secuencia indicada en la SEC. ID. nº 11, es el 75,0 por ciento 5 idéntica a la secuencia indicada en la SEC. ID. nº 11 (es decir, 1166 + 1554 x 100 = 75,0). Se observa que el valor de la identidad de la secuencia por ciento está redondeado a la décima más próxima. Por ejemplo, 75,11, 75,12, 75,13 y 75,14 se redondean a la baja a 75,1 en tanto que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 y 75,19 se redondean a la alta a 75,2. Se indica también que el valor de la longitud será siempre un número entero. En otro ejemplo, una secuencia diana que contiene una zona de 20 nucleótidos que se alinea con 20 nucleótidos consecutivos de una 10 secuencia idéntica como la siguiente contiene una zona que comparte el 75 por ciento de identidad de secuencia con esta secuencia identificada (es decir, 15 ÷ 20 x 100 = 75).

Secuencia diana:

Secuencia identificada:

Agente aglutinante específico: Agente que puede unirse específicamente a alguno de los polipéptidos 15 descritos en la presente memoria. Los ejemplos comprenden de manera no limitativa anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales humanizados) y fragmentos de anticuerpos monoclonales tales como los fragmentos Fab, F(ab’)2 y Fv también como cualquier otro agente capaz de unirse específicamente a un epítopo de dichos polipéptidos.

20

Los anticuerpos contra los polipéptidos suministrados en la presente memoria (o fragmentos, variantes o fusiones de los mismos) pueden utilizarse para purificar o identificar dichos polipéptidos. Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos suministrados en la presente memoria permiten la producción de agentes aglutinantes a base de anticuerpos específicos que reconocen los polipéptidos descritos en la presente memoria.

25

Pueden producirse anticuerpos monoclonales o policlonales contra los polipéptidos, fragmentos de los polipéptidos o variantes de los mismos. De manera óptima, los anticuerpos producidos contra uno o más epítopos en un antígeno de polipéptido detectarán específicamente este polipéptido, es decir, los anticuerpos producidos contra un polipéptido específico reconocerían y se unirían a este polipéptido específico, y no reconocerían sustancialmente ni se unirían a otros polipéptidos. La determinación de que un anticuerpo se une específicamente a 30 un polipéptido específico se hace mediante alguno de los numerosos procedimientos de inmunoanálisis habituales; por ejemplo inmunotransferencia Western (véase, por ejemplo, Sambrook et al., (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1989).

Para determinar que una preparación de anticuerpos dada (tal como una preparación producida en un 35 ratón contra un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC. ID. nº 12) detecta específicamente el polipéptido apropiado (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC. ID. nº 12) por inmunotransferencia Western, puede extraerse de las células toda la proteína celular y separarse por SDS-electroforesis en gel de poliacriamida.

40

Toda la proteína celular separada puede transferirse a continuación a una membrana (por ejemplo, de nitrocelulosa) e incubarse la preparación de anticuerpo con la membrana. Después de lavar la membrana para eliminar los anticuerpos unidos de manera no específica, puede detectarse la presencia de anticuerpos unidos específicamente utilizando un anticuerpo secundario apropiado (por ejemplo, un anticuerpo antirratón) conjugado con un polipéptido tal como fosfatasa alcalina ya que la aplicación de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitroazul de 45 tetrazolio da como resultado la producción de un compuesto coloreado densamente de azul por la fosfatasa alcalina inmunolocalizada.

A partir de células transfectadas, células transformadas o células naturales pueden obtenerse polipéptidos sustancialmente puros, adecuados para su utilización como inmunógenos. Las concentraciones de polipéptidos en 50 la preparación final pueden ajustarse, por ejemplo, por concentración en un dispositivo con filtro Amicon, al nivel de pocos microgramos por mililitro. Además, pueden utilizarse como inmunógenos los polipéptidos de tamaño comprendido entre polipéptidos completos y polipéptidos que presentan solamente nueve restos de aminoácidos. Dichos polipéptidos pueden producirse en cultivo celular, pueden sintetizarse químicamente utilizando procedimientos convencionales o pueden obtenerse cortando grandes polipéptidos en polipéptidos más pequeños 55 que pueden purificarse. Los polipéptidos que presentan solamente nueve restos de aminoácidos de longitud pueden ser inmunógenos cuando se presentan a un sistema inmunitario en el contexto de una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor (CHM) tal como una molécula del CHM de clase I o CHM de clase II. Por consiguiente, los polipéptidos que tienen por lo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 60

1200, 1250, 1300, 1350 o más restos de aminoácidos consecutivos de cualquier secuencia de aminoácido dada a conocer en la presente memoria pueden utilizarse como inmunógenos para producir anticuerpos.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales contra algunos de los polipéptidos dados a conocer en la presente memoria a partir de hibridomas murinos según el procedimiento clásico de Kohler y Milstein (Nature 5 256:495-7, 1975) o un procedimiento modificado del mismo.

El antisuero policlonal que contiene anticuerpos contra los epítopos heterogéneos de cualquier polipéptido dado a conocer en la presente memoria puede prepararse inmunizando animales adecuados con el polipéptido (o un fragmento del mismo), que puede estar inalterado o modificado para aumentar la inmunogenicidad. Un protocolo 10 de inmunización eficaz para conejos puede encontrarse en Vaitukaitis et al. (J. Clin. Endocrinol. Metab., 33:988-91, 1971).

Pueden utilizarse fragmentos de anticuerpo en lugar de anticuerpos completos y pueden expresarse fácilmente en células hospedadoras procarióticas. Los procedimientos para preparar y utilizar fracciones 15 inmunológicamente eficaces de anticuerpos monoclonales, denominados también "fragmentos de anticuerpos", son muy conocidos e incluyen los descritos en Better & Horowitz (Methods Enzymol., 178:476-96, 1989), Glockshuber et al., (Biochemistry, 29:1362-7, 1990), patente US nº 5.648.237 ("Expression of Functional Antibody Fragments"), patente US nº 4.946.778 ("Single Polypeptide Chain Binding Molecules"), patente US nº 5.455.030 ("Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules") y las referencias citadas en éstas. 20

Transformada: Una célula "transformada" es una célula en la que se introducido una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, por técnicas de biología molecular. La transformación comprende todas las técnicas mediante las cuales puede introducirse una molécula de ácido nucleico en dicha célula incluyendo, sin limitación, transfección con un vector vírico, conjugación, transformación con un vector plásmido e introducción del ADN 25 desnudo por electroporación, lipofección y aceleración con cañón de partículas.

Variantes, fragmentos o proteínas de fusión: Las proteínas dadas a conocer, incluyen variantes, fragmentos y fusiones de las mismas. Las secuencias de ADN (por ejemplo la SEC. ID nº 11) que codifica para una proteína (por ejemplo la SEC. ID. nº 12), la proteína de fusión, o un fragmento o variante de una proteína, puede 30 modificarse genéticamente para permitir que la proteína se exprese en células eucarióticas, bacterias, insectos y/o plantas. Para obtener la expresión, la secuencia de ADN puede alterarse y unirse operativamente a otras secuencias reguladoras. El producto final, que contiene las secuencias reguladoras y la proteína, se denomina vector. Este vector puede introducirse en células eucarióticas, bacterias, de insecto y/o vegetales. Una vez dentro de la célula el vector permite producir la proteína. 35

Una proteína de fusión que incluye una proteína, tal como una triptófano aminotransferasa (o variante, poliformismo, mutante o fragmento de la misma), por ejemplo la SEC. ID. nº 12, unida a otras secuencias de aminoácidos que no inhiben la actividad deseada de la proteína, por ejemplo la capacidad para convertir el triptófano en indol-3-piruvato. En un ejemplo, las demás secuencias de aminoácidos no son más de 40 aproximadamente 10, 12, 15, 20, 25, 30 ó 50 aminoácidos de longitud.

El experto en la materia valorará que una secuencia de ADN pueda alterarse de numerosas maneras sin afectar la actividad biológica de la proteína codificada. Por ejemplo, puede utilizarse la RCP para producir variaciones en la secuencia del ADN que codifica una proteína. Dichas variantes pueden ser variantes optimizadas 45 por preferencia de codón en una célula hospedadora utilizada para expresar la proteína, u otros cambios de frecuencia que facilitan la expresión.

Vector: Molécula de ácido nucleico introducida en una célula, que produce de este modo una célula transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en la célula, tal como 50 un origen de replicación. Un vector puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica.

Resumen de las rutas biosintéticas

55

Como se muestra en las figuras 1 a 3 y 11 a 13, pueden utilizarse muchas rutas biosintéticas para producir monatina o sus productos intermedios tales como indol-3-piruvato o PM. Para la conversión de cada sustrato (glucosa, triptófano, ácido indol-3-láctico, indol-3-piruvato y PM) a cada producto (triptófano, indol-3-piruvato, PM y monatina) pueden utilizarse varios polipéptidos diferentes. Además, estas reacciones pueden realizarse in vivo, in vitro o mediante de una combinación de reacciones in vivo y reacciones in vitro tales como las reacciones in vitro 60 que incluyen reacciones químicas no enzimáticas. Por consiguiente, las figuras 1 a 3 y 11 a 13 se proporcinan a título de ejemplo y muestran múltiples rutas diferentes que pueden utilizarse para obtener los productos deseados.

Glucosa en triptófano

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Muchos organismos pueden sintetizar triptófano a partir de glucosa. El(los) montaje(s) que contiene(n)

el(los) gen(es) necesario(s) para producir monatina, PM y/o indol-3-piruvato a partir de glucosa y/o triptófano pueden clonarse en dichos organismos. Se muestra en la presente que el triptófano puede convertirse en monatina.

En otros ejemplos, se modifica genéticamente un organismo utilizando conocidos polipéptidos para producir triptófano o sobreproducir triptófano. Por ejemplo, la patente US nº 4.371.614 describe una cepa de E. coli 5 transformada con un plásmido que contiene un operón de triptófano natural.

Los valores máximos de triptófano dados a conocer en la patente US nº 4.371.614 son de aproximadamente 230 ppm. Asimismo, el documento WO 8701130 describe una cepa de E. coli que ha sido modificada genéticamente para producir triptófano y expone el aumento de producción fermentativa de L-triptófano. 10 Los expertos en la materia reconocerán que los organismos capaces de producir triptófano a partir de glucosa son también capaces de utilizar otras fuentes de carbono y energía que pueden convertirse en glucosa o fructosa-6-fosfato, con similares resultados. Las fuentes de carbono y energía ejemplificativas comprenden de manera no limitativa, sacarosa, fructosa, almidón, celulosa o glicerol.

15

Triptófano en indol-3-piruvato

Pueden utilizarse varios polipéptidos para convertir triptófano en indol-3-piruvato. Los péptidos ejemplificativos incluyen elementos de las clases enzimáticas (CE) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1, y 2.6.1.21. Estas clases incluyen polipéptidos denominados triptófano 20 aminotransferasa (denominados también L-fenilalanina-2-oxoglutarato aminotransferasa, triptófano transaminasa, 5-hidroxitriptófano-cetaglutárico transaminasa, hidroxitriptófano aminotransferasa, L-triptófano aminotransferasa, L-triptófano transaminasa y L-triptófano-2-oxoglutarato aminotransferasa) que convierten el L-triptófano y 2-oxoglutarato en indol-3-piruvato y L-glutamato; D-triptófano aminotransferasa que convierte D-triptófano y un 2-oxoácido en indol-3-piruvato y un aminoácido; triptófano deshidrogenasa (denominado también NAD(P)-L-triptófano 25 deshidrogenasa, L-triptófano deshidrogenasa, L-Trp-deshidrogenasa, TDH y L-triptófano:NAD(P) óxidoreductasa (desaminante)) que convierte L-triptófano y NAD(P) en indol-3-piruvato, NH3 y NAD(P)H; D-aminoácido deshidrogenasa, que convierte D-aminoácidos y FAD en indol-3-piruvato, NH3 y FADH2; triptófano-fenilpiruvato transaminasa (denominada también L-triptófano-α-cetoisocaproato aminotransferasa y L-triptófano:fenilpiruvato aminotransferasa) que convierte L-triptófano y fenilpiruvato en indol-3-piruvato y L-fenilalanina; L-30 aminoácidooxidasa (denominada también ofio-aminoácido oxidasa y L-aminoácido:oxígeno oxidorreductasa (desaminante)) que convierte un L-aminoácido y H2O y O2 en un 2-oxoácido, NH3 y H2O2; D-aminoácido oxidasa (denominada también ofio-aminoácido oxidasa y D-aminoácido:oxígeno oxidorreductasa desaminante)) que convierte una D-aminoácido, H2O y O2 en un 2-oxoácido, NH3 y H2O2; y triptófano oxidasa que convierte L-triptófano y H2O y O2 en indol-3-piruvato y NH3 y H2O2. Estas clases también contienen tirosina (aromática) aminotransferasa, 35 aspartato aminotransferasa, D-aminoácido (o D-alanina) aminotransferasa y aminotransferasa amplia (sustrato múltiple) que tienen múltiples actividades de aminotransferasa, algunas de las cuales pueden convertir el triptófano y un 2-oxoácido en indol-3-piruvato y un aminoácido.

En el Ejemplo 1 se describen a continuación once miembros de la clase aminotransferasa que presentan 40 dicha actividad, incluyendo una nueva aminotransferasa mostrada en las SEC. ID. nº 11 y nº 12. Por consiguiente, la presente invención proporciona secuencias de ácido nucleico y de proteínas aisladas que tienen por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% y por lo menos 98% o incluso por lo menos 99% de identidad de secuencias con las SEC. ID. nº 11 y nº 12. También están comprendidos en la presente invención los fragmentos y las fusiones de las SEC. ID. nº 11 y nº 12 que conservan actividad de aminotransferasa o codifican 45 una proteína que tiene actividad de aminotransferasa. A título de ejemplo los fragmentos comprenden de manera no limitativa por lo menos 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 ó 1000 nucleótidos contiguos de la SEC. ID. nº 11 o por lo menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de la SEC. ID. nº 12. Las secuencias dadas a conocer (y las variantes, fragmentos y fusiones de las mismas) pueden formar parte de un vector. El vector puede utilizarse para transformar células hospedadoras, produciendo de este modo células recombinantes que 50 pueden producir indol-3-piruvato a partir del triptófano, y en algunos ejemplos pueden producir además PM y/o monatina.

Se conocen las L-aminoácido oxidasas (1.4.3.2), y las secuencias pueden aislarse de varias fuentes diferentes, tales como Vipera lebetine (sp P81375), Ophiophagus hannah (sp P81383), Agkistrodon rhodostoma (sp 55 P81382), Crotalus atrox (sp P56742), Burkholderia cepacia, Arabidopsis thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas reinhardtii, Mus musculus, Pseudomona syringae y Rhodococcus str. Además, se describen las triptófano oxidasas en la bibliografía y pueden aislarse, por ejemplo, de Coprinus sp. SF-1, col china con hernia de la col, Arabidopsis thaliana y de hígado de mamífero. En el Ejemplo 3 se expone a continuación un miembro de la clase L-aminoácido de la clase oxidasa que puede convertir el triptófano en indol-3-piruvato, así como fuentes 60 alternativas para la clonación molecular. Muchos genes de D-aminoácido oxidasa están disponibles en las bases de datos para la clonación molecular.

Las triptófano deshidrogenasas son conocidas, y pueden aislarse, por ejemplo, de la espinaca, Pisum sativum, Prosopis juliflora, guisante, mezquite, trigo, maíz, tomate, tabaco, Chromobacterium violaceum y 65 Lactobacilli. Se conocen muchas secuencias génicas de D-aminoácido deshidrogenasa.

Como se muestra en las figuras 11 a 13, si se utiliza una aminoácido oxidasa, tal como triptófano oxidasa, para convertir el triptófano en indol-3-piruvato, puede añadirse catalasa para reducir e incluso eliminar la presencia de peróxido de hidrógeno.

Indol-3-lactato a indol-3-piruvato 5

La reacción para convertir el indol-3-lactato en indol-3-piruvato puede ser catalizada por varios polipéptidos, tales como los miembros de las clases 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.- ó 1.1.1.111 de polipéptidos. La clase 1.1.1.110 de polipéptidos incluye las indol-lactato deshidrogenasas (denominadas también ácido indol-láctico:NAD+ oxidorreductasa). Las clases 1.1.1.27, 1.1.1.28 y 1.1.2.3 incluyen 10 lactato-deshidrogenasas (denominadas también ácido láctico deshidrogenasas, lactato:NAD+ oxidorreductasa). La clase 1.1.1.222 contiene (R)-4-hidroxifenil-lactato deshidrogenasa (denominada también D-lactato aromático deshidrogenasa, R-lactato aromático deshidrogenasa, y R-3-(4-hidroxifenil)lactato:NAD(P)+2-oxidorreductasa) y la clase 1.1.1.237 contiene 3-(4-hidroxifenilpiruvato) reductasa (denominada también hidroxifenilpiruvato reductasa y 4-hidrofenil-lactato:NAD+ oxidorreductasa). La clase 1.1.3.- contiene lactato oxidasas y la clase 1.1.1.111 contiene 15 (3-imidazol-5-il)lactato deshidrogenasas (denominadas también (S)-3-(imidazol-5-il)lactato:NAD(P)+ oxidorreductasa). Es probable que varios de los polipéptidos en estas clases permitan la producción de indol-3-piruvato a partir de ácido indol-3-láctico. Los ejemplos de esta conversión se proporcionan en el Ejemplo 2.

Las reacciones químicas pueden utilizarse también para convertir el ácido indol-3-láctico en indol-3-20 piruvato. Dichas reacciones químicas incluyen una etapa de oxidación que puede realizarse utilizando varios procedimientos, por ejemplo: oxidación con aire utilizando un catalizador B2 (China Chemical Reporter, v 13, n 28, p 18 (1), 2002), permanganato y perclorato diluidos o peróxido de hidrógeno en presencia de catalizadores metálicos.

Indol-3-piruvato en 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (PM) 25

Pueden utilizarse varios polipéptidos conocidos para convertir el indol-3-piruvato en PM. Las clases de polipéptidos ejemplificativas incluyen 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 y 4.1.2.-. Estas clases incluyen las carbono-carbonosintasas/liasas, tales como las aldolasas que catalizan la condensación de dos sustratos de ácido carboxílico. La clase CE 4.1.3.- de péptido son las sintasas/liasas que forman enlaces carbono-carbono utilizando 30 sustratos de oxo-ácido (tal como indol-3-piruvato) como electrófilo, aunque CE 4.1.2.- son sintasas-liasas que forman enlaces carbono-carbono utilizando sustratos de aldehído (tal como benzaldehído) como electrófilo.

Por ejemplo, el polipéptido descrito en la patente EP 1 045 029 (CE 4.1.3.16, 4-hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato-liasa denominada también 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa, 2-oxo-4-hidroxiglutarato aldolasa o KHG 35 aldolasa) convierte el ácido glioxílico y el piruvato en ácido 4-hidroxi-2-cetoglutárico y el polipéptido 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa (CE 4.1.3.17, denominado también 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato-liasa o ProA aldolasa), condensa dos cetoácidos tales como dos piruvatos a 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato. Las reacciones que utilizan estas liasas se describen en la presente memoria.

40

Las figuras 1 a 2 y 11 a 13 representan diagramas esquemáticos de estas reacciones en los que una molécula de 3 carbonos (C3) está combinada con indol-3-piruvato. Muchos miembros de CE 4.1.2.- y 4.1.3.-, particularmente los polipéptidos que utilizan PLP, pueden utilizar moléculas de C3 que son aminoácidos tales como serina, cisteína y alanina o derivados de los mismos. Las condensaciones aldólicas catalizadas por representantes de CE 4.1.2.- y 4.1.3.- requieren que la molécula de tres carbonos de esta ruta sea piruvato o un derivado de 45 piruvato. Sin embargo, otros compuestos pueden actuar como fuente de carbono de C3 y convertirse en piruvato. La alanina puede ser transaminada por muchas transaminasas que utilizan PLP, incluyendo muchas de las mencionadas anteriormente, para dar piruvato. El piruvato y el amoniaco pueden obtenerse por reacciones de beta-eliminación (tal como las catalizadas por triptófano o β-tirosinasa) de L-serina, L-cisteína y derivados de serina y cisteína con suficientes grupos salientes, tales como O-metil-L-serina, O-bencil-L-serina, S-metilcisteína, S-50 bencilcisteína, S-alquil-L-cisteína, O-acil-L-serina y 3-cloro-L-alanina. El aspartato puede servir como fuente de piruvato en las reacciones de beta-liasa mediadas por PLP tales como las catalizadas por triptofanasa (CE 4.1.99.1) y/o β-tirosinasa (CE 4.1.99.2, denominada también tirosina-fenol liasa). La velocidad de las reacciones con beta-liasa puede aumentarse realizando la mutagénesis dirigida en los polipéptidos (4.1.99.1-2) descritos por Mouratou et al. (J. Biol. Chem., 274:1320-5, 1999) y en el Ejemplo 8. Estas modificaciones permiten a los polipéptidos aceptar 55 sustratos de aminoácido dicarboxílico. El lactato puede actura también como fuente de piruvato, y se oxida a piruvato mediante la adición de lactato deshidrogenasa y un cofactor oxidado o lactato oxidado y oxígeno. Los ejemplos de estas reacciones se describen a continuación. Por ejemplo, como se muestra en la figura 2 y en las figuras 11 a 13, las ProA aldolasa puede ponerse en contacto con indol-3-piruvato cuando se utiliza piruvato como molécula de C3. 60

El PM puede generarse también utilizando reacciones químicas, tales como las condensaciones aldólicas proporcionadas en el Ejemplo 5.

PM en monatina 65

La conversión de PM en monatina puede ser catalizada por uno o más de las siguientes: triptófano

aminotransferasa (2.6.1.27), triptófano deshidrogenasas (1.4.1.19), D-aminoácido deshidrogenasas (1.4.99.1), glutamato deshidrogenasas (1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasas (CE 1.4.1.20), triptófano-fenilpiruvato transaminasas (2.6.1.28) o más en general miembros de la familia de la aminotransferasa (2.6.1.-) tal como aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), tirosina aminotransferasa (aromática) (2.6.1.5.), D-triptófano aminotransferasa o D-alanina (2.6.1.21) aminotransferasa (figura 2). Se describen a continuación (Ejemplo 1) once 5 miembros de la clase aminotransferasa, incluyendo un nuevo miembro de la clase mostrada en las SEC. ID. nº 11 y nº 12 y las reacciones que demuestran la actividad de las enzimas aminotransferasa y deshidrogenasa se proporcionan en el Ejemplo 7.

Esta reacción puede realizarse además utilizando reacciones químicas. La aminación del cetoácido (PM) 10 se realiza por aminación reductora utilizando amoniaco y cianoborohidruro sódico.

Las figura 11 a 13 muestran polipéptidos adicionales que pueden utilizarse para convertir PM en monatina, así como para proporcionar rendimientos aumentados de monatina a partir de indol-3-piruvato o triptófano. Por ejemplo, si se utiliza aspartato como donante de amino, puede utilizarse aspartato aminotransferasa para convertir 15 el aspartato en oxaloacetato (figura 11). El oxaloacetato se convierte en piruvato y óxido de carbono mediante una descarboxilasa, tal como oxaloacetato descarboxilasa (figura 11). Además, si se utiliza lisina como donante de amino, puede utilizarse lisina épsilon aminotransferasa para convertir la lisina en alisina (figura 12). La alisina se convierte espontáneamente en 1-piperidina 6-carboxilato (figura 12). Si un polipéptido capaz de catalizar reacciones de aminación reductoras (por ejemplo, como glutamato deshidrogenasa) se utiliza para convertir PM en monatina, 20 un polipéptido que puede reciclar NAD(P)H y/o producir un producto volátil (figura 13) puede utilizarse, tal como formiato deshidrogenasa.

Consideraciones adicionales en el diseño de las rutas biosintéticas

25

Dependiendo de qué polipéptidos se utilicen para generar indol-3-piruvato, PM y/o monatina, cofactores, sustratos y/o polipéptidos adicionales pueden proporcionarse para la producción de células que aumenten la formación del producto.

Eliminación de peróxido de hidrógeno 30

El peróxido de hidrógeno (H2O2) es un producto que, si se genera puede ser tóxico para la producción de células y puede dañar los polipéptidos o compuestos intermedios producidos. La L-aminoácido oxidasa descrita anteriormente genera H2O2 como producto, por consiguiente, si se utiliza la L-aminoácido oxidasa, puede eliminarse el H2O2 resultante o sus niveles disminuidos para disminuir la lesión potencial a la célula o producto. 35

Pueden utilizarse catalasas para reducir la concentración de H2O2 en la célula (figura 11 a 13). La célula de producción puede expresar un gen o una secuencia de ADNc que codifica una catalasa (CE 1.11.1.6), que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y gas oxígeno. Por ejemplo, una catalasa puede expresarse en un vector transfectado en la célula de la producción. Ejemplos de catalasas que pueden utilizarse comprenden 40 de manera no limitativa: trІQ9EV50 (Staphylococcus xylosus), trІQ9KBE8 (Bacillus halodurans), trІQ9URJ7 (Candida albicans), trІP77948 (Streptomyces coelicolor), trІQ9RBJ5 (Xanthomonas campestris) (números de registro en SwwissProt). Los reactores biocatalíticos que utilizan L-aminoácido oxidasa, D-aminoácido oxidasa o triptófano oxidasa pueden contener también un polipéptido de catalasa.

45

Modulación de la disponibilidad de PLP (piridoxal-5’-fosfato)

Como se muestra en la figura 1, el PLP puede utilizarse en una o más de las etapas de biosíntesis descritas en la presente memoria. La concentración de PLP puede complementarse de modo que PLP no llegue a ser una limitación en la eficacia general de la reacción. 50

La ruta biosintética para la vitamina B6 (precursor de PLP) ha sido estudiada a fondo en E. coli y algunas de las proteínas se han cristalizado (Laber et al., FEBS Letters, 449:45-8, 1999). Dos de los genes (epd o gapB y serC) se requieren en otras rutas metabólicas, mientras tres genes (pdxA, pdxB y pdxJ) son únicos para la biosíntesis de piridoxal fosfato. Uno de los materiales de partida en la ruta de E. coli es el 1-desoxi-D-xilulosa-5-55 fosfato (DXP). La síntesis de este precursor de metabolitos centrales de los carbonos 2 y 3 comunes está catalizada por el polipéptido 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DSX). El otro precursor es un derivado de treonina formado a partir del azúcar de 4 carbonos, D-eritrosa 4-fosfato. Los genes requeridos para la conversión en fosfo-4-hidroxil-L-treonina (HTP) son epd, pdxB y serC. La última reacción para la formación de PLP es una condensación intramolecular compleja y la reacción de cierre del anillo entre DXP y HTP, catalizada por los productos génicos de 60 pdxA y pdxJ.

Si el PLP se convierte en un nutriente restringido durante la fermentación para producir monatina, el aumento de expresión de uno más de los genes de la serie de reacciones en una célula hospedadora para producción puede utilizarse para aumentar el rendimiento de monatina. Un organismo hospedador puede contener 65 muchas copias de sus genes de la ruta natural o copias de genes de la ruta artificial pueden incorporarse en el

genoma del organismo. Además, muchas copias de los genes naturales de la serie de reacciones pueden clonarse en el organismo hospedador.

Una serie de reacciones natural que se conserva en todos los organismos recicla varios derivados de la vitamina B6 a la forma activa PLP. Los polipéptidos implicados en esta serie de reacciones son la pdxK cinasa, 5 pdxH oxidasa y pdxY cinasa. La sobreexpresión de uno o más de estos genes puede aumentar la disponibilidad de PLP.

Las concentraciones de vitamina B6 pueden elevarse por eliminación o represión de la regulación metabólica de los genes naturales de la serie de reacciones biosintéticas en el organismo hospedador. El PLP 10 reprime los polipéptidos implicados en la biosíntesis del derivado del precursor treonina en la cepa 238-7 de la bacteria Flavobacterium sp. Esta cepa bacteriana, liberada de control metabólico sobreproduce derivados de piridoxal y puede excretar hasta 20 mg/l de PLP. La manipulación genética del organismo hospedador que produce monatina en un modo similar producirá el aumento de producción de PLP sin sobreexpresión de los genes de las series de reacciones biosintéticas. 15

Utilización de amonio

Las reacciones de triptofanasa pueden ser dirigidas en la dirección de la síntesis (producción de triptófano a partir del indol) haciendo que el amoniaco esté más disponible o por eliminación del agua. Las reacciones 20 reductoras de aminación, tales como las catalizadas por glutamato deshidrogenasa, pueden también ser dirigidas hacia adelante por un exceso de amonio.

El amoniaco puede estar disponible en forma de carbonato amónico o de fosfato amónico en un sistema tamponado de carbonato o fosfato. El amoniaco puede suministrarse también en forma de piruvato amónico o 25 formiato amónico. Alternativamente, el amoniaco puede suministrarse si la reacción está acoplada a una reacción que genere amoniaco, tal como glutamato deshidrogenasa o triptófano deshidrogenasa. Puede generarse amoniaco por adición de los sustratos naturales de CE 4.1.99.-(tirosina o triptófano) que hidrolizará al fenol o indol, piruvato y NH3. Esto permite también un aumento de rendimiento del producto de síntesis sobre la cantidad en equilibrio normal permitiendo a la enzima hidrolizar su sustrato preferido. 30

Eliminación de productos y subproductos

La conversión de triptófano en indol-3-piruvato mediante una triptófano aminotransferasa puede afectar desfavorablemente la velocidad de producción de indol-3-piruvato porque la reacción produce glutamato y requiere 35 el cosustrato 2-oxoglutarato (α-cetoglutarato). El glutamato puede originar inhibición de la aminotransferasa, y la reacción consumirá grandes cantidades de cosustrato. Por otra parte, grandes concentraciones de glutamato son perjudiciales para los procesos de separación corriente abajo.

El polipéptido glutamato deshidrogenasa (GLDH) convierte el glutamato en 2-oxoglutarato, reciclando de 40 este modo el cosustrato en la reacción catalizada por triptófano aminotransferasa. GLDH genera además equivalentes reductores (NADH o NADPH) que pueden utilizarse para generar energía para la célula (ATP) en condiciones aerobias. La utilización de glutamato por GLDH reduce además la formación de subproductos. Además, la reacción genera amoniaco, que puede servir como fuente de nitrógeno para la célula o como un sustrato en una aminación reductora para la etapa final mostrada en la figura 1. Por consiguiente, puede utilizarse 45 una célula de producción que sobreexpresa un polipéptido GLDH para aumentar el rendimiento y reducir el coste del medio y/o de los procesos de separación.

En la ruta de triptófano a monatina, el donante amino de la etapa tres (por ejemplo, glutamato o aspartato), puede volver a convertirse en el receptor amino requerido para la etapa 1 (por ejemplo, 2-oxo-glutarato u 50 oxalacetato), si se utiliza una aminotransferasa de la clases enzimàticas apropiadas. La utilización de dos transaminasas independientes para esta serie de reacciones, en la que el sustrato de una transaminasa no inhibe completamente la actividad de la otra transaminasa, puede aumentar la eficacia de esta serie de reacciones.

Muchas de las reacciones en las series de reacciones descritas son reversibles y, por consiguiente 55 alcanzarán un equilibrio entre sustratos y productos. El rendimiento de la series de reacciones puede aumentarse por eliminación continua de los productos procedentes de los polipéptidos. Por ejemplo, la secreción de monatina en el caldo de fermentación utilizando una permeasa u otra proteína de transporte, o la cristalización selectiva de monatina en una corriente del reactor biocatalítico con reciclo simultáneo de sustratos aumentará el rendimiento de la reacción. 60

La eliminación de subproductos por reacciones enzimáticas adicionales o por sustitución de grupos del donante amino es otro modo de aumentar el rendimiento de la reacción. Varios ejemplos se exponen en el Ejemplo 13 y se muestran en las figuras 11 a 13.

65

Idealmente se produce un subproducto que no está disponible para reaccionar en la dirección inversa, ya sea por cambio de fase (evaporación) o por conversión espontánea en un producto final no reactivo, tal como el

dióxido de carbono.

Modulación de las mezclas de sustratos

La mezcla de indol puede modularse aumentando la producción de precursores de triptófano y/o alterando 5 las rutas catabólicas que implican indol-3-piruvato y/o triptófano. Por ejemplo, la producción de ácido indol-3-acético a partir de indol-3-piruvato puede reducirse o eliminarse, eliminando funcionalmente el gen que codifica CE 4.1.1.74 en la célula hospedadora. La producción de indol a partir de triptófano puede reducirse o eliminarse suprimiendo funcionalmente el gen que codifica CE 4.1.99.1 en la célula hospedadora. Alternativamente, se utilizó un exceso de indol como sustrato en un proceso in vitro o in vivo en combinación con cantidades aumentadas del gen que 10 codifica CE 4.1.99.1 (Kawasaki et al., J. Ferm. and Bioeng., 82:604-6, 1996). Pueden hacerse modificaciones genéticas para aumentar el nivel de productos intermedios tales como D-eritrosa-4-fosfato y corismato.

La producción de triptófano está regulada en la mayoría de los organismos. Un mecanismo es por inhibición por retroalimentación de determinadas enzimas en la serie de reacciones; a medida que aumentan las 15 concentraciones de triptófano, la velocidad de producción del triptófano disminuye. Así, cuando se utiliza una célula hospedadora modificada genéticamente para producir monatina mediante un intermedio de triptófano, puede utilizarse un organismo que no sea sensible a las concentraciones de triptófano. Por ejemplo, una cepa de Catharanthus roseus que es resistente a la inhibición del crecimiento por varios análogos de triptófano se seleccionó por exposición repetida a altas concentraciones de 5-metiltriptófano (Schallenberg y Berlin, Z. 20 Naturforsch, 34:541-5, 1979). La actividad de la cepa resultante de triptófano sintasa se efectuó menos por inhibición de la producción, debido probablemente a mutaciones en el gen. Asimismo, puede optimizarse una célula hospedadora para la producción de monatina.

La producción de triptófano puede optimizarse mediante la utilización de la evolución dirigida para producir 25 polipéptidos que son menos sensibles a la inhibición del producto. Por ejemplo, puede realizarse el cribado en placas que no contienen triptófano en el medio pero con altas concentraciones de análogos de triptófano no metabolizables. Las patentes US nº 5.756.345; nº 4.742.007 y nº 4.371.614 describen procedimientos utilizados para aumentar la producción de triptófano en un organismo de fermentación. La última etapa de la biosíntesis del triptófano es la adición de serina a indol, con lo cual la disponibilidad de la serina podría aumentarse para aumentar 30 la producción de triptófano.

La cantidad de monatina producida por un organismo de fermentación puede aumentarse al aumentar la cantidad de piruvato producido por el organismo hospedador. Determinadas levaduras, tales como Trichosporon cutaneum (Wang et al., Lett. Appl. Microbiol., 35:338-42, 2002) y Torulopsis glabrata (Li et al., Appl. Microbiol. 35 Biotechnol, 57:451-9, 2001) sobreproducen piruvato y pueden utilizarse para practicar los procedimientos dados a conocer en la presente memoria. Además, pueden realizarse modificaciones genéticas en organismos para activar la producción de ácido pirúvico, tal como en la cepa W1485lip2 de E. coli (Kawasaki et al., J. Ferm. and Bioeng., 82:604-6, 1996).

40

Control de quiralidad

Las características de sabor de monatina pueden alterarse controlando la estereoquímica (quiralidad) de la molécula. Por ejemplo, pueden desearse diferentes isómeros de monatina en diferentes mezclas de concentraciones para diferentes sistemas de alimentación. La quiralidad puede controlarse mediante una 45 combinación de pH y polipéptidos.

La racemización de la posición del C-4 de monatina (véase la anterior molécula numerada) puede ocurrir 50 por desprotonación y reprotonación del carbono alfa, lo que puede suceder por un desplazamiento en el pH o por reacción con el cofactor PLP. En un microorganismo, el pH es independiente del desplazamiento lo bastante para producir la racemización, aunque PLP es abundante. Los procedimientos para controlar la quiralidad con los

polipéptidos dependerán de la vía biosintética utilizada para la producción de monatina.

Cuando se forma monatina utilizando la serie de reacciones representada en la figura 2, puede considerarse lo siguiente. En una reacción biocatalítica la quiralidad del carbono 2 es determinada por la enzima que convierte indol-3-piruvato en PM. Muchas enzimas (por ejemplo, desde CE 4.1.2.-, 4.1.3.-) puede convertir el 5 indol-3-piruvato en PM, de este modo, se puede seleccionar la enzima que forma el isómero deseado. Alternativamente, la enantioespecificidad de la enzima que convierte indol-3-piruvato en PM puede modificarse mediante la utilización de la evolución dirigida o de anticuerpos catalíticos que pueden modificarse genéticamente para catalizar la reacción deseada. Una vez se ha producido PM (por condensación enzimática o química) el grupo amino puede añadirse de manera estereoespecífica utilizando una transaminasa, tal como las descritas en la 10 presente memoria.

La configuración R o S del carbono 4 puede generarse dependiendo de si se utiliza una D- o L-aminoácido aromático transferasa. La mayoría de las aminotransferasas son específicas para el isómero L, sin embargo existen D-triptófano aminotransferasas en determinadas plantas (Kohiba y Mito, Proceedings of the 8th International 15 Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japón, 1990). Además, se han identificado las D-alanina aminotransferasas (2.6.1.21), D-metionina-piruvato aminotransferasas (2.6.1.41) y tanto (R)-3-amino-2-metilpropanoato aminotransferasa (2.6.1.61) como (S)-3-amino-2- metilpropanoato aminotransferasa (2.6.1.22). Determinadas aminotransferasas pueden aceptar solamente el sustrato para esta reacción con una configuración específica en el carbono 2. Por consiguiente, incluso si la conversión de PM no es estereoespecífica, la 20 estereoquímica del producto final puede controlarse mediante la selección apropiada de una transaminasa. Como las reacciones son reversibles, el PM sin reaccionar (isómero indeseado) pueden volver a reciclarse en sus constituyentes y una mezcla racémica de PM puede reformarse.

Activación de sustratos 25

En las reacciones dadas a conocer en la presente memoria pueden utilizarse sustratos fosforilados, tales como fosfoenolpiruvato (PEP). Los sustratos fosforilados pueden ser más favorables desde el punto de vista energético y, por consiguiente, pueden utilizarse para aumentar las velocidades y/o los rendimientos de la reacción. En las condensaciones aldólicas, la adición de un grupo fosfato estabiliza el tautómero enólico del sustrato 30 nucleofílico, haciéndole más reactivo. En otras reacciones, un sustrato fosforilado proporciona con frecuencia un grupo saliente mejor. Asimismo, pueden activarse sustratos por conversión a derivados de CoA o derivados de pirofosfato.

EJEMPLO 1 35

Clonación y expresión de triptófano aminotransferasas

Este ejemplo describe procedimientos que se utilizaron para clonar las triptófano aminotransferasas, que pueden utilizarse para convertir el triptófano en indol-3-piruvato. 40

Generalidades experimentales

Se clonaron en E. coli once genes que codifican aminotransferasas. Estos genes eran de D-alanina aminotransferasa de Bacillus subtilis (dat, nº de registro de Genbank Y14082.1 pb 28622-29470 y nº de registro 45 NP_388848.1 en Genbank, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), tirosina aminotransferasa (tatA/SEC. ID. nº 1 y nº 2, secuencia de ácido nucleico y de secuencia de aminoácidos, respectivamente) de Sinorhizobium meliloti (denominado también Rhizobium meliloti), tirosina aminotransferasa (tatA confirmada por homología, SEC. ID. nº 3 y nº 4, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) de la cepa 2.4.1 de Rhodobacter sphaeroides, tirosina aminotransferasa de 35053 de R. 50 sphaeroides (confirmada por homología, SEC. ID. nº 5 y nº 6, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), sustrato amplio aminotransferasa de Leishmania major (bsat, confirmado por homología con los fragmentos peptídicos de L. mexicana, SEC. ID. nº 7 y nº 8, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), aminotransferasa aromática de Bacillus subtilis (araT, confirmado por homología, SEC. ID. nº 9 y nº 10, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), 55 aminotransferasa aromática de Lactobacillus amylovorus (araT, confirmado por homología, SEC. ID. nº 11 y nº 12, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), sustrato múltiple aminotransferasa 35053 de R. sphaeroides (confirmada por homología, SEC. ID. nº 13 y nº 14, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), sustrato múltiple aminotransferasa de la cepa 2.4.1 de Rhodobacter sphaeroides (msa, confirmada por homología, nº de registro AAAE01000093.1, en Genbank de 14743-16155 pb y 60 nº de registro ZP00005082.1 en Genbank, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), aspartato aminotransferasa de Escherichia coli (aspC, nº de registro AE000195.1 en Genbank de 2755-1565 pb y nº de registro AAC74014.1 en Genbank, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) y tirosina aminotransferasa de E. coli (tyrB, SEC. ID. nº 31 y nº 32, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente). 65

Los genes se clonaron, expresaron y se determinó su actividad en la conversión de triptófano a indol-3-piruvato, junto con las enzimas disponibles en el mercado. Los once clones tenían actividad.

Identificación de cepas bacterianas que pueden contener polipéptidos con la actividad deseada

5

Ninguno de los genes en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) se denominaban triptófano aminotransferasas. Sin embargo, se han identificado organismos que tienen esta actividad enzimática. Se ha medido la actividad de L-triptófano aminotransferasa (TAT) en extractos celulares o en proteínas purificadas de las siguientes procedencias: cepa Rhizobacteriana de Festuca octoflora, mitocondrias y citosol de guisante, células cresta de gallo del girasol, biovariedad trifoli de Rhizobium leguminosarum, Erwinia herbicola pv 10 gypsophilae, Pseudomonas syringae pv. savastanoi, Agrobaterium tumefaciens, Azospirillum lipferum y brasilense, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Bradyrhizobium elkanii, Candida maltosa, Azotobacter vinelandii, cerebro de rata, hígado de rata, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas Fluorescens CHA0, Lactococcus lactis, Lactobacullus casei, Lactobacullus helveticus, plantones de trigo, cebada, Phaseolus aureus (fríjol mungo), Saccharomyces uvarum (calsbergensis), Leishmania sp., maíz, tallos de tomate, plantas de guisante, tabaco, cerdo, 15 Clostridium sporogenes y Streptomyces griseus.

Aislamiento del ADN genómico para clonación

Se cultivó S. meliloti (nº 9930 del ATCC) en medio TY a 25ºC, pH 7,2. Se cultivaron las células a una 20 densidad óptica a 600 nm (D.O.600) de 1,85 y se utilizó un inóculo al 2% para las preparaciones del ADN genómico. El kit tip 20/G genómico de Qiagen (Valencia, CA) se utilizó para el aislamiento del ADN genómico.

Se cultivó Bacillus subtilis 6051 (ATCC) a 30ºC en caldo de cultivo Nutrient de Bereto (Difco; Detroit, MI). Se utilizó el protocolo tip 20/G genómico de Qiagen para aislar el ADN genómico con los siguientes cambios: se 25 duplicaron las concentraciones de proteasa K y lisozima y los tiempos de incubación se aumentaron 2 a 3 veces.

El ADN genómico ATCC 50122 de Leishmania major fue suministrado por IDI, Inc. (Quebec, Canadá) en tampón TE, pH 8,0, 17 ng/μl.

30

Se preparó 2.4.1 de Rhodobacter sphaeroides (suministrado por el profesor Sam Kaplan, University of Texas, Houston), R. sphaeroides 35053 (nº de ATCC) y se preparó ADN de L. amylovorus por extracción convencional con fenol. Se recolectaron las células en fase logarítmica tardía, se volvieron a poner en suspensión en tampón TEN (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM) y se lisaron mediante adición de 0,024 ml de laurilsarcosina sódica por ml de suspensión celular. Después de extraer al menos tres veces con un volumen igual 35 de fenol saturado con tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM), la solución de ADN se extrajo una vez con cloroformo:octanol 9:1 y tres veces con cloroformo. Se precipitó el ADN por adición de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 6,8 y 2 volúmenes de etanol. Se recolectó el precipitado por centrifugación y se lavó una vez con etanol al 70%. Por último se disolvió el ADN en 0,10 ml de agua destilada.

40

Se aisló ADN genómico de Escherichia coli de la cepa DH10B (Invitrogen) y se preparó utilizando el kit Genomic-tipTM (500/G) de Qiagen. En 30 ml de este cultivo de la cepa en LB a una D.O.650 de 1,87, se obtuvieron 0,3 mg de ADN purificado. El ADN purificado se disolvió en tampón de elución (EB) de Qiagen a una concentración de 0,37 μg/μl.

45

Protocolo de reacción en cadena de la polimerasa

Se diseñaron cebadores con prominencias compatibles para el vector pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI). El vector pET tiene una prominencia monocatenaria de 12 bases en lado 5’ de la zona Xa/LIC y una prominencia monocatenaria de 15 bases en el lado 3’ de la zona Xa/LIC. Se diseña el plásmido para la clonación 50 independiente de ligadura, con las etiquetas His con terminal N y S y una etiqueta His en terminal C opcional. La secuencia de reconocimiento de la Xa proteasa (IEGR) se fija directamente enfrente del codón de iniciación del gen de interés, de modo que pueden eliminarse las etiquetas de la proteína de fusión.

Se añadieron las siguientes secuencias a los extremos 5’ de las secuencias específicas para el organismo 55 al diseñar los cebadores: cebador directo, 5’ GGTATTGAGGGTCGC (SEC ID nº: 73); cebador inverso: 5’ AGAGGAGAGTTAGAGCC (SEC ID nº: 74).

Bacillus subtilis dat cebadores: terminal N: 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3’ y terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3’ (SEC ID nº: 15 y 16). 60

Sinorhizobium meliloti tatA cebadores: terminal N: 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG y terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC (SEC ID nº: 17 y 18).

65

Bacillus subtilis araT cebadores: terminal N: 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC y

terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG (SEC ID nº: 19 y 20).

Rhodobacter sphaeroides msa (both 2.4.1. y 35053): terminal N: 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT y terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG (SEC ID nº: 21 y 22). 5

Leishmania major bsat: terminal N: 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT y terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCACGATTCACATTGC (SEC ID nº: 23 y 24).

Lactobacillus amylovorus araT: terminal N: 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA y terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTTGTAAAA (SEC ID nº: 25 y 26). 10

Rhodobacter sphaeroides tatA (both 2.4.1 y 35053 strains): terminal N: 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC y terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG (SEC ID nº: 27 y 28).

15

Escherichia coli aspC: terminal N: 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3’ y terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3’ (SEC ID nº: 29 y 30).

Escherichia coli tyrB: terminal N: 5’-GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC y terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG- 3’ (SEC ID nº: 33 y 34). 20

Se amplió el gen procedente de S. meliloti (tatA) utilizando el siguiente protocolo de la RCP. En una reacción con 50 μl se utilizaron 0,1 a 0,5 μg de plantilla, 1,5 μM de cada cebador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Polimerasa High Fidelity Expand (Roche, Indianapolis, IN) y 1 x tampón ExpandTM con Mg. El programa del termociclador utilizado incluía un comienzo en caliente a 96ºC durante 5 minutos, seguido de 29 repeticiones de las 25 etapas siguientes: 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2,5 minutos. Después de 29 repeticiones se mantuvo la muestra a 72ºC durante 10 minutos y a continuación se almacenó a 4ºC. Este protocolo de la RCP produjo un producto de 1199 pb.

Las secuencias de los genes procedentes de R. sphaeroides (msa y tatA), araT de L. amylovorus, y araT 30 de Bacillus, se ampliaron utilizando el siguiente protocolo de RCP. En una reacción con 50 μl se utilizaron 0,1 a 0,5 μg de plantilla, 1,5 μM de cada cebador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Polimerasa High Fidelity ExpandTM y 1 x tampón ExpandTM con Mg. El programa del termociclador utilizado incluía un comienzo en caliente a 96ºC durante 5 minutos, seguido de 29 repeticiones de las etapas siguientes: 94ºC durante 30 segundos, 40-60ºC durante 1 minuto, 45 segundos (gradiente del termociclador) y 72ºC durante 2 minutos 15 segundos. Después de 29 35 repeticiones se mantuvo la muestra a 72ºC durante 10 minutos y a continuación se almacenó a 4ºC.

Para cada gen msa de R. sphaeroides las temperaturas de hibridación de 42ºC y 48ºC produjeron múltiples productos, salvo una banda distinta a aproximadamente 1464 pb. Para araT de L. amylovorus, las temperaturas de hibridación de 42ºC, 48ºC y 56ºC proporcionaron productos individuales con bandas intensas a 1173 pb. Para araT 40 de B. subtilis, las temperaturas de hibridación de 40ºC, 45ºC, 50ºC y 55ºC generaron productos individuales intensos (1173 pb), procedentes tanto de ADN genómico como de colonias. Para bsat de L. major, la temperatura de hibridación de 55ºC dio el producto más limpio (1239 pb). Para los genes tatA de Rhodobacter, las temperaturas de hibridación entre 50 y 55ºC dieron productos limpios en el tamaño correcto (1260 pb). Tanto para los genes de E. coli como para el gen dat de B. subtilis, se utilizó una temperatura de hibridación entre 55 y 60ºC, y el tiempo de 45 hibridación se acortó hasta 45 segundos. Se obtuvieron productos limpios de tamaños correctos (aproximadamente 1,3 kb para los genes de E. coli, 850 pb para el gen dat).

Clonación

50

Los productos de la RCP se purificaron en geles de 0,8 o 1% TAE-agarosa utilizando el kit de extracción en gel de Qiagen (Valencia, CA). Los productos de la RCP se cuantificaron por comparación con patrones en un gel de agarosa, y a continuación se trataron con T4 ADN polimerasa siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante para la Clonación Independiente de la Ligadura (Novagen, Madison, WI).

55

En resumen, se trataron 0,2 pmoles de producto purificado por RCP con 1 U de T4 ADN polimerasa en presencia de dGTP durante 30 minutos a 22ºC. La polimerasa elimina las bases sucesivas de los extremos 3’ del producto de la RCP. Cuando la polimerasa encuentra un resto de guanina, la actividad en 5’ a 3’ de polimerasa de la enzima contrarresta la actividad de exonucleasa para impedir eficazmente más escisiones. Esto crea prominencias monocatenarias que son compatibles con el vector pET30 Xa/LIC. La polimerasa se inactiva por 60 incubación a 75ºC durante 20 minutos.

El vector y la inserción tratada se hibridaron tal como recomienda Novagen. Aproximadamente 0,02 pmoles de la inserción tratada y 0,01 pmoles del vector se incubaron durante 5 minutos a 22ºC, se añadió EDTA 6,25 mM (concentración final) y se repitió la incubación a 22ºC. La reacción de hibridación (1 μl) se añadió a células 65 competentes aisladas NovaBlueTM (Novagen, Madison, WI) y se incubaron en hielo durante 5 minutos. Después del mezclado, las células se transformaron por choque térmico durante 30 segundos a 42ºC. Se colocaron las células

en hielo durante 2 minutos y se dejaron recuperar en 250 μl de SOC a temperatura ambiente durante 30 minutos a 37ºC con agitación a 225 rpm. Se colocaron las células en placas con LB que contenía kanamicina (25-50 μg/ml).

Se purificó el ADN plásmido utilizando el kit spin miniprep de Qiagen y se analizaron las inserciones correctas con las enzimas de restricción XhoI y XbaI. Las secuencias de los plásmidos que parecían tener la 5 inserción correcta se verificaron mediante secuenciado del ADN de terminación de la cadena didesoxi.

Las SEC. ID. nº 1 a nº 14 y nº 31 y nº 32 presentan secuencias nucleótidos y secuencias de aminoácidos correspondientes de las aminotransferasas recombinantes, algunos cambios de las secuencias del Genbank eran sustituciones conservadoras imperceptibles o generadas en la secuencia proteica. Las SEC. ID. nº 11 y nº 12 son 10 nuevas secuencias.

Expresión y análisis génicos

El ADN plásmido, verificado por análisis de secuencias, se subclonó en hospedadores de expresión de E. 15 coli BLR(DE3) o BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI). Los cultivos se desarrollaron y los plásmidos se aislaron utilizando el kit miniprep de Qiagen y se analizó mediante enzimas de restricción para confirmar la identidad.

Inicialmente la inducción se realizó con araT de L. amylovorus, araT de B. subtilis y tatA de S. meliloti tanto en células BLR(DE3) como BL21(DE3). Se realizó un estudio temporal con cultivos desarrollados en kanamicina 20 que contenía LB (30 mg/l) a una D.O.600 entre 0,5 y 0,8 y se indujo con IPTG 1 mM (isopropil tiogalactósido) y se tomaron muestras a las 0, 1, 2 y 4 horas tras la inducción. Las células procedentes de 2,0 ml se volvieron a poner en suspensión en 0,10 ml de Tris-HCl 120 mM, pH 6,8, que contienen dodecilsulfato sódico al 10%, 2-mercaptoetanol al 10% y glicerol al 20%, calentado a 95ºC durante 10 min., se enfriaron y se diluyeron con 0,10 ml de H2O. Se analizaron por SDS-PAGE alícuotas de estas muestras de la proteína celular completa utilizando un gel 25 en gradiente 4 al 15%. No hubo diferencias significativas en la cantidad de proteína expresada entre las 2 y 4 horas de inducción, ni entre las células BLR(DE3) y BL21(DE3).

Se prepararon también extractos celulares procedentes de las muestras de 4 horas poniendo en suspensión los sedimentos celulares procedentes de 2 ml de cultivo en 0,25 ml de reactivo BugBusterTM de 30 Novagen que contenía 0,25 μl de benzonasa nucleasa, incubando a temperatura ambiente durante 20 minutos con agitación suave y centrifugando a 16.000 x g para eliminar el residuo celular. Se cargaron los sobrenadantes (extractos celulares) en geles con gradiente del 4 al 15% para el análisis de las proteínas celulares solubles.

Los tres clones (araT de L. amylovorus (SEC. ID. nº 11 y nº 12), araT de B. subtilis (SEC. ID. nº 9 y nº 10) y 35 tatA de S. meliloti (SEC. ID. nº 1 y nº 2) presentaban la proteína soluble que correspondía al tamaño correcto (aproximadamente 45 kDa). El producto génico araT de B. subtilis se sobreexpresó al nivel más alto y/o fue más soluble que los otros dos productos génicos.

En los procedimientos de expresión posteriores, el ADN plásmido procedente de los clones positivos se 40 subclonó en BL21(DE3) debido a las mejores características de crecimiento de este hospedador. Se repitió la inducción utilizando IPTG 1 mM con los cultivos desarrollados en LB que contienen kanamicina a razón de 50 mg/l que se induce cuando la D.O.600 alcanzó aproximadamente 0,8. Se recolectaron las células después de 4 horas de cultivo a 37ºC, se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos (4ºC), se lavaron con tampón TEGGP (Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), EDTA 0,5 mM, 100 mg/l de glutatión, 5% de glicerol con una mezcla de inhibidor de proteasa 45 completo de Roche) y se congeló instantáneamente en etanol a -80ºC.

Las muestras se volvieron a poner en suspensión en 5 ml/g de peso de células húmedas de reactivo BugBusterTM (Novagen) que contenía 5 μl/ml de el conjunto nº 3 de la mezcla de inhibidor de proteasa (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) y 1 μl/ml de benzonasa nucleasa. Se incubaron las muestras a temperatura 50 ambiente durante 20 minutos en un agitador orbital. Se eliminó el residuo celular insoluble por centrifugación a 16.000 x g durante 20 minutos a 4ºC.

Los extractos celulares se analizaron por SDS-PAGE, y se ensayó la actividad de triptófano aminotransferasa siguiendo la producción del ácido indol-pirúvico que utiliza el siguiente protocolo. Se realizaron 55 reacciones con un ml en tetraborato sódico 50 mM (pH 8,5), EDTA 0,5 mM, arseniato sódico 0,5 mM, piridoxal fosfato 50 μM, α-cetoglutarato 5 mM y L-triptófano 5 mM. Las reacciones se iniciaron con la adición de extractos exentos de células o enzima purificada y se incubaron 30 minutos a 30ºC. Se añadió TCA al 20% (200 μl) para interrumpir la reacción, y la proteína precipitada se separó por centrifugación. Se midió la absorbancia a 327 nm y se comparó con a una curva patrón de indol-3-piruvato recién preparada en el tampón de ensayo. Se realizaron 60 también reacciones de control sin el sustrato triptófano o utilizando extractos exentos de células procedentes de clones transformados con pET30a solo.

Debido al historial de las aminotransferasas de E. coli natural en extractos celulares, se purificaron proteínas recombinantes utilizando cartuchos His-Bind siguiendo los protocolos del fabricante (Novagen, Madison, WI). Las fracciones eluyentes se desalaron en columnas PD-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se 65 eluyeron en Tris 50 mM, pH 7,0. Se analizaron las proteínas purificadas por SDS-PAGE y se determinó su actividad de aminotransferasa.

Los resultados de la inducción a 37ºC con IPTG 1 mM (4 horas) demuestran que bsat de L. major, tatA de S. meliloti, aspC de E. coli y ambos clones tatA de R. sphaeroides tienen niveles significativos de actividad de triptófano aminotransferasa. La proteína araT de B. subtilis se sobreexpresó y era soluble, pero presentó poca actividad enzimática. El producto génico araT de L. amylovorus parecía ser soluble en el extracto celular, pero la 5 purificación que utiliza un cartucho His-Bind produjo solo pequeñas cantidades de proteína con peso molecular correcto. Los productos génicos de msa eran insolubles y además los experimentos de expresión se realizaron a 24ºC para minimizar la formación de inclusión corporal. Varias concentraciones de IPTG entre 10 μM y 1 mM se utilizaron para maximizar la cantidad de proteína soluble.

10

La Tabla 1 lista las actividades específicas medidas en microgramos de indol-3-piruvato (I3P) formado por miligramo de proteína por minuto. En algunos casos, cantidades muy pequeñas de proteína recombinante presentaban grandes concentraciones de actividad por encima del intervalo lineal eficaz del ensayo. En estos casos un signo ">" precede al número de actividad específico.

15

Tabla 1: Actividades específicas de los clones en extractos celulares (EC) y enzimas purificadas (P) y comerciales

Enzima

Actividad específica (μg I3P/mg de proteína/min) Notas

L. major bsatCE

>49,3

L. major bsatP

>4280

S. meliloti tatACE

>28,6

S. meli/oti tatAP

>931

2.4.1 tatACE

>41,2

2.4.1 tatAP

1086

35053 tatACE

>62,3

35053 tatAP

>486

L. amylovorus araTCE

1,26

L. amylovorus araTP

0 proteína pequeña después del cartucho His-Bind

B.subtilis araTCE

0 indetectable

B. subtilis araTP

1,5-4,5

2.4.1 msaCE

2,05 muy poca proteína soluble

2.4.1 msaP

0 nada de proteína después del cartucho His-Bind

35053 msaCE

3,97 Muy poca proteína soluble

35053 msaP

0 Sin proteína después del cartucho His-Bind

E. coli aspC(P)

800

Tabla 1 (Continuación)

Enzima

Actividad específica (μg I3P/mg de proteína/min) Notas

E. coli tyrB(P)

1 no muy soluble

B. subtilisD-aminotransf.(P)

2,7 utilizando D-triptófano como sustrato

Transaminasa de amplio espectro

22 nº T7684 en cat. Sigma

Porcina de tipo II-A

1,5 Sigma G7005

Porcina de tipo I

1 Sigma G2751

Una alineación que compara todas las proteínas recombinantes clonadas ilustra que no existen muchas 20 áreas muy conservadas entre las secuencias araT, tatA, bsat y msa. Una alineación de proteínas recombinantes con máxima actividad: homólogos del producto génico tatA de Rhodobacter, sustrato amplio aminotransferasa de L. major y la tirosina aminotransferasa de Sinorhizobium meliloti presentó varias regiones conservadas, sin embargo son solo aproximadamente 30 a 43% idénticas en concentración de proteína. La disponibilidad de la (D-alanina) aminotransferasa, D-específica (D-alanina) de amplio espectro puede utilizarse en la producción de otros 25 estereoisómeros de monatina.

EJEMPLO 2

Conversión del indol-3-lactato en indol-3-piruvato

Como se muestra en las figuras 1 y 3, el ácido indol-3-láctico puede utilizarse para producir indol-3-5 piruvato. La conversión entre el ácido láctico y el piruvato es una reacción reversible, como es la conversión entre el indol-3-piruvato y el indol-3-lactato. La oxidación del indol-3-lactato fue seguida típicamente debido a la alta cantidad de fondo a 340 nm del indol-3-piruvato.

La mezcla analítica patrón contenía fosfato potásico 100 mM, pH 8,0, NAD+ 0,3 mM, 7 unidades de lactato 10 deshidrogenasa (LDH) (Sigma-L2395, St. Louis, MO) y sustrato 2 mM en 0,1 ml. El ensayo se realizó por duplicado en una placa de microvalorador transparente a UV, utilizando un lector de placas EspectraMax Plus de Molecular Devices. Se mezclaron el polipéptido y el tampón y se pipetearon en los pocillos que contenían el ácido indol-3-láctico y NAD+ y se leyó la absorbancia a 340 nm de cada pocillo a intervalos de 9 segundos después de un breve mezclado. La reacción se mantuvo a 25ºC durante 5 minutos. El aumento de absorbancia a 340 nm siguió a la 15 producción de NADH a partir de NAD+. Se realizaron controles negativos por separado sin NAD+ y sin sustrato. D-LDH procedente de Leuconostoc mesenteroides (nº L2395 en catálogo de Sigma) parecía presentar más actividad con los sustratos derivados de indol que L-LDH de Bacillus stearothermophilus (nº L5275 en catálogo de Sigma).

Se utilizaron procedimientos similares con el ácido D-láctico y NAD+ o NADH y piruvato, sustratos naturales 20 de los polipéptidos D-LDH. La Vmax para la reducción del piruvato fue de 100 a 1.000 veces superior que la Vmax para la oxidación del lactato. La Vmax para la reacción de oxidación del indol-3-láctico con 3-LDH fue de aproximadamente una quinta parte de la del ácido láctico. La presencia de indol-3-piruvato se determinó también siguiendo el cambio de absorbancia a 327 (derivado de enol-borato) utilizando tampón de borato sódico 50 mM que contenía EDTA 0,5 mM y arseniato sódico 0,5 mM. Se observaron pequeños pero repetibles cambios de absorbancia en 25 comparación con las referencias negativas tanto para los polipéptidos L como D-LDH.

Además, las lactato deshidrogenasas de amplia especificidad (enzimas con actividad asociada a las CE 1.1.1.27, CE 1.1.1.28 y/o CE 1.1.2.3) pueden clonarse y utilizarse para preparar indol-3-piruvato a partir de ácido indol-3-láctico. La fuentes de deshidrogenasas de amplia especificidad incluyen E. coli, Neisseria gonorrhoeae y 30 Lactobacillus plantarum.

Alternativamente, puede producirse indol-3-piruvato poniendo en contacto indol-3-lactato con extractos celulares procedentes de Clostridium sporogenes que contienen una indol-lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.110); o extractos celulares de Trypanosoma cruzi epimastigotes que contienen p-hidroxifenil-lactato deshidrogenasa (CE 35 1.1.1.222) conocida por tener actividad sobre indol-3-piruvato; o Pseudomonas acidovorans o extractos celulares de E. coli que contienen una imidazol-5-il lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.111); o Coleus blumei, que contiene una hidroxifenilpiruvato reductasa (CE 1.1.1.237); o Candida maltosa que contiene una D-lactato aromático deshidrogenasa (CE 1.1.1.222). Las referencias que describen dichas actividades incluyen, Nowicki et al. (FEMS Microbiol. Lett., 71:119-24, 1992) Jean y DeMoss (Canadian J. Microbiol. 14, 1968), Coote y Hassall (Biochem. J., 40 111:237-9, 1969), Cortese et al., (C. R. Seances Soc. Biol. Fil., 162 390-5, 1968), Petersen y Alfermann (Z. Naturforsch. C: Biosci., 43 501-4, 1988) y Bhatnagar et al., (J. Gen. Microbiol., 135:353-60, 1989). Además, una lactato oxidasa tal como la procedente de Pseudomonas sp. (Gu et al., J. Mol. Catalysis B: Enzymatic., 18:299-305, 2002), puede utilizarse para la oxidación de indol-3-láctico a indol-3-piruvato.

45

EJEMPLO 3

Conversión de L-triptófano en indol-3-piruvato utilizando L-aminoácido oxidasa

Este ejemplo describe los procedimientos utilizados para convertir el triptófano en indol-3-piruvato 50 mediante una oxidasa (CE 1.4.3.2), como alternativa a la utilización de una triptófano aminotransferasa tal como se describe en el Ejemplo 1. La L-aminoácido oxidasa se purificó a partir de Crotalus durissus (Sigma, St. Louis, MO, nº de catálogo A2805). Los números de registro de las L-aminoácido oxidasas para la clonación molecular incluyen: CAD21325.1, AAL14831, NP_490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, 093364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600, y 55 Z48565.

Se llevaron a cabo reacciones en tubos de microcentrifugadora en un volumen total de 1 ml, se incubaron durante 10 minutos en agitación a 37ºC. La mezcla de reacción contenía L-triptófano 5 mM, tampón fosfato sódico 100 mM, pH 6,6, arseniato sódico 0,5 mM, EDTA 0,5 mM, tetraborato sódico 25 mM, 0,016 mg de catalasa (83 U, 60 Sigma C-3515), 0,008 mg de FAD (Sigma) y 0,005 a 0,125 unidades de L-aminoácido oxidasa. Las referencias negativas contenían todos los componentes excepto triptófano, y los blancos contenían todos los componentes excepto la oxidasa. Se utilizó catalasa para eliminar el peróxido de hidrógeno formado durante la desanimación oxidativa. Se utilizaron tetraborato y arseniato sódico para estabilizar la forma enol-borato del indol-3-piruvato, que presenta una absorbancia máxima a 327 nm. Se prepararon patrones de indol-3-piruvato a concentraciones entre 65 0,1 y 1 mM en la mezcla de reacción.

La L-aminoácido oxidasa adquirida tenía una actividad específica de 540 μg de indol-3-piruvato formado por minuto por mg de proteína. Esta es del mismo orden de magnitud que la actividad específica de las enzimas triptófano aminotransferasa.

EJEMPLO 4 5

Conversión de indol-3-piruvato en 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico con una aldolasa

Este ejemplo describe los procedimientos que pueden utilizarse para convertir el indol-3-piruvato en el precursor de monatina (PM) 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico utilizando una aldolasa (liasa) (figura 2). 10 Las condensaciones aldólicas son reacciones que forman enlaces Carbono-carbono entre el carbono β de un aldehído o cetona y el carbono carbonilo de otro aldehído o cetona. Se forma un carbanión en el carbono adyacente al grupo carbonilo de un sustrato, y sirve como nucleófilo que ataca al carbono carbonilo del segundo sustrato (carbono electrófilo). Más frecuentemente, el sustrato electrófilo es un aldehído, de manera que la mayoría de las aldolasas están comprendidas en la categoría CE 4.1.2. Muy a menudo, el sustrato nucleófilo es el piruvato. Es 15 menos frecuente que las aldolasas catalicen la condensación entre dos cetoácidos o dos aldehídos.

Sin embargo, se han identificado aldolasas que catalizan la condensación de dos ácidos carboxílicos. Por ejemplo, el documento EP 1 045 029 describe la producción del ácido L-4-hidroxi-2-cetoglutárico a partir del ácido glioxílico y piruvato utilizando el cultivo de Pseudomonas (CE 4.1.3.16). Además, la 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato 20 aldolasa (4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liasa, CE 4.1.3.17) puede catalizar la condensación de dos cetoácidos. Por lo tanto, se utilizaron polipéptidos de aldolasa similares para catalizar la condensación de indol-3-piruvato con piruvato.

Clonación 25

Las 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liasas (ProA aldolasa, CE 4.1.3.17) y 4-hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato liasa (KHG aldolasa, CE 4.1.3.16) catalizan reacciones muy similares a la reacción con aldolasa de la figura 2. Se diseñaron cebadores con prominencias compatibles para el vector pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI). El diseño de estos cebadores se describió anteriormente en el Ejemplo 1. 30

Se diseñaron los siguientes cebadores para la clonación con pET30 Xa/LIC:

1. Gen proA para Pseudomonas straminea (nº de registro en GenBank: 12964663 Version: 12964663) y gen proA para Comamonas testosteroni (SEC. ID. nº 65 y nº 66, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de 35 aminoácidos, respectivamente) directo 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3’ e inverso 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3’ (SEC ID nº: 55 y 56).

2. Gen 1021 SMc00502 para Sinorhizobium meliloti (homólogo a proA, nº. de registro en GenBank: 15074579 y nº CAC46344, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos, respectivamente) directo 40 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3’ e inverso 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3’ (SEC ID nº: 61 y 62).

3. Gen LB126 fldZ para Sphingomonas sp. (nº 7573247 de registro en Genbank versión: 7543247, códigos para una supuesta aciltransferasa) directo 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3’ e 45 inverso 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3’ (SEC ID nº: 57 y 58).

4. Gen pcmE para Arthrobacter keyseri (nº AF331043 de registro en Genbank versión: AF331043.1, códigos para una oxalocitramalato aldolasa) directo 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3’ e inverso 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3’ (SEC ID nº: 59 y 60). 50

5. Gen YPO0082 para la cepa CO92 de Yersinia pestis (nº 15978115 de registro en Genbank versión: 15978115, códigos para una posible transferasa) directo 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3’ e inverso 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3’ (SEC ID nº: 63 y 64). 55

6. Gen khg para Bacillus subtilis (nº Z99115.1, nº GI:2634478, nº 126711 a 127301 y nº CAB14127.1 de registro en Genbank, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos, respectivamente) directo 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3’ e inverso 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3’ (SEC ID nº: 35 y 36). 60

7. Gen khg para E. coli (nº AE000279.1 1331-1972 y nº AAC74920.1 de registro en Genbank, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos, respectivamente) directo 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3’ e inverso 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3’ (SEC ID nº: 37 y 38). 65

8. Gen khg para S. meliloti (nº AL591792.1, nº GI:15075850, nº 65353 a nº 64673 y nº CAC47463.1 de registro en Genbank, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos, respectivamente) directo 5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3’ e inverso 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3’ (SEC ID nº: 39 y 40).

5

El ADN genómico procedente de los organismos descritos en los apartados 1 y 2 y 6 a 8, anteriormente, se purificó utilizando el protocolo genomic-tip de Qiagen. Utilizando técnicas similares puede purificarse el ADN genómico procedente de organismos descritos en los apartados 3 a 5.

Se cultivó Pseudomonas straminea (ATCC 33636) a 30ºC en caldo de cultivo nutritivo y medio de 10 hidroxibenzoato. Se cultivó Comamonas testosteroni (ATCC 49249) a 26ºC en caldo de cultivo nutritivo y medio de hidroxibenzoato. Sphingomonas sp. LB126 (Flemish Institute of Tecnological Research, VITO, B-2400 Mol, Belgica) se cultiva según el procedimiento descrito por Wattiau et al., (Research in Microbiol., 152:861-72, 2001). Arthrobacter keyseri (Gulf Ecology Division, National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, Gulf Breeze, FL 32561, US.) se cultiva según el protocolo descrito por Eaton (J. 15 Bacteriol., 183:3869-3703, 2001). Sinorhizobium meliloti 1021 (ATCC 51124) se cultivó a 26ºC en medio ATCC TY y medio de hidroxibenzoato. La cepa CO92 (ATCC) de Yersinia pestis se cultiva a 26ºC en medio 739 de agar-agar con sangre de caballo del ATCC. Bacillus subtilis 6051 (ATCC) se cultivó a 30ºC en caldo de cultivo Nutrient de Bereto (Difco; Detroit, MI). Se aisló ADN genómico de E. coli procedente de la cepa DH10B (Invitrogen) tal como se describe en el Ejemplo 1. 20

Se utilizaron los protocolos de la RCP, de clonación y de identificación descritos en el Ejemplo 1 para clonar las secuencias proA de C. testosteroni y de S. meliloti, así como las secuencias khg de E. coli, B. subtilis y S. meliloti. Pueden utilizarse los mismos procedimientos para clonar las demás secuencias descritas anteriormente.

25

Se secuenciaron clones positivos utilizando el secuenciado de terminación de la cadena didesoxi (Seqwright, Houston, TX) con la etiqueta S y los cebadores del termiandor T7 (Novagen) y cebadores internos de Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA).

Ensayos de expresión y actividad 30

El ADN plásmido (verificado por análisis de secuencias) se subclonó en el hospedador de expresión BL21(DE3) (Novagen). Los cultivos se desarrollaron en medio LB con 50 mg/l de kanamicina, los plásmidos se aislaron utilizando un kit spin plasmid miniprep de Qiagen y se analizaron posteriormente con enzimas de restricción para confirmar la identidad. Se hicieron experimentos de inducción con los montajes BL21(DE3) cultivados en 35 medio LB que contenía 50 mg/l de kanamicina a 37ºC. Se indujo a la expresión de la proteína utilizando IPTG 0,1 mM después que la D.O.600 alcanzó aproximadamente 0,6. Se cultivaron las células durante 4 horas a 30ºC y se recolectaron por centrifugación. Las células se lisaron a continuación utilizando reactivo BugbusterTM (Novagen) y las proteínas recombinantes con etiqueta His se purificaron utilizando los cartuchos His-Bind tal como se describió anteriormente (Ejemplo 1). Las proteínas purificadas se desalaron en columnas PD-10 disponibles y se eluyeron en 40 tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,3 con MgCl2 2 mM.

Se analizaron las proteínas por SDS-PAGE en geles con gradiente 4 al 15% para detectar las concentraciones de proteína soluble al P.M. predicho de la proteína de fusión recombinante.

45

Se analizó la actividad de las proteínas utilizando indol-3-piruvato y piruvato sódico como sustratos. La mezcla analítica contenía Tris-HCl 100 mM (pH 7- pH 8,9), MgCl2 0-8 mM, fosfato potásico 3 mM (pH 8) y 6 mM de cada sustrato en 1 ml. Se comenzó la reacción añadiendo cantidades variables de polipéptido (por ejemplo de 10 a 100 μg) y se incubó entre 25ºC y 37ºC durante 30 minutos, se filtró y se congeló a continuación a -80ºC. 50

Resultados de actividad con los productos del gen proA

Tanto los montajes del gen proA para C. testosteroni como de SMc00502 para S. meliloti presentaban altos niveles de expresión cuando se inducían con IPTG. Las proteínas recombinantes eran muy solubles, determinadas 55 por análisis SDS-PAGE de proteína total y muestras de extracto celular. El producto génico para C. testosteroni se purificó hasta > 95% de pureza. Debido a que el rendimiento del producto génico para S. meliloti fue muy bajo después de la purificación por afinidad utilizando un cartucho His-Bind, se utilizó extracto celular para el análisis enzimático.

60

Ambas aldolasas recombinantes catalizaron la formación de PM a partir de indol-3-piruvato y piruvato. La presencia tanto de fosfato de magnesio bivalente como de potasio se requirieron para la actividad enzimática. Ningún producto se manifestó cuando estaba ausente indol-3-piruvato, piruvato o fosfato potásico. Una pequeña cantidad del producto se formó también en ausencia de enzima (por lo general de un orden de magnitud menos que cuando la enzima estaba presente). 65

El pico del producto eluyó de la columna C18 de fase inversa poco después que el patrón indol-3-piruvato, el espectro de masas de este pico presentaba un ión original ([M+H]+) provocado por colisión de 292,1, el ión original esperado para el producto PM. Los fragmentos derivados mayores presentes en el espectro de masas incluían aquellos con m/z = 158 (ión carbonio de 1H-indol-3-carbaldehído), 168 (ión carbonio de 3-buta-1,3-dienil-1H-indol), 274 (292 - H2O), 256 (292 - 2 H2O), 238 (292 - 3 H2O), 228 (292 - CH4O3) y 204 (pérdida de piruvato). El 5 producto presentaba además un espectro UV característico de otros compuestos que contienen indol, tal como triptófano, con la λmax de 279 a 280 y un pequeño lomo a aproximadamente 290 nm.

La cantidad de PM producida por la aldolasa de C. testosteroni aumentó con un incremento en la temperatura de reacción desde la temperatura ambiente hasta 37ºC, cantidad de sustrato y cantidad de magnesio. 10 La actividad sintética de la enzima disminuyó al aumentar el pH, el producto máximo observado fue a pH 7. Referida a patrones de triptófano, la cantidad de PM producida en un ensayo patrón utilizando 20 μg de proteína purificada fue de aproximadamente 10 a 40 μg por ml de reacción.

Debido al alto grado de homología de las secuencias de codificación de aldolasa de proA de S. meliloti y 15 de C. testosteroni con otros genes descritos anteriormente, cabe esperar que todos los productos génicos recombinantes puedan catalizar esta reacción. Por otra parte, cabe esperar que las aldolasas que tienen treonina (T) en las posiciones 59 y 87, arginina (R) en 119, aspartato (D) en 120 e histidina (H) en 31 y 71 (referidas al sistema de numeración de C. testosteroni) tengan similar actividad.

20

Resultados de actividad con los productos del gen khg

Tanto los montajes génicos khg de B. subtilis como de E. coli tenían altos niveles de expresión de la proteína cuando se inducían con IPTG, mientras que el khg de S. meliloti tenía un nivel de expresión mas bajo. Las proteínas recombinantes eran muy solubles, como se interpreta mediante los análisis SDS-PAGE proteínas totales 25 y de extractos celulares. Los productos génicos khg de B. subtilis y de E. coli se purificaron hasta > 95% de pureza; el rendimiento del producto génico de S. meliloti no fue tan elevado después de la purificación por afinidad utilizando un cartucho His-Bind.

No existen pruebas de que el magnesio y el fosfato se necesiten para la actividad de esta enzima. Sin 30 embargo, la bibliografía da cuenta de la realización de ensayos en tampón de fosfato sódico, y la enzima supuestamente es bifuncional y tiene actividad sobre sustratos fosforilados tales como 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato (KDPG). Se realizaron análisis enzimáticos como se describió anteriormente, y en algunos casos se omitió el fosfato. Los resultados indican que las aldolasas de KHG recombinantes produjeron PM, pero no eran tan activas como las proA aldolasas. En algunos casos el nivel de PM producido por KHG fue casi idéntico a la cantidad 35 producida por magnesio y fosfato solos. El fosfato no parecía aumentar las actividades de KHG. La enzima de Bacillus tenía la mayor actividad, aproximadamente 20 al 25% de actividad mayor que el magnesio y fosfato solos, determinada por RSM (véase el Ejemplo 10). La enzima Sinorhizobium tenía la mínima cantidad de actividad, lo que puede asociarse a problemas de plegamiento y solubilidad indicados en la expresión. Las tres enzimas tienen el glutamato de la zona activa (posición 43 en el sistema de numeración de B. subtilis) así como la lisina requerida 40 para la formación de la base de Shiff con piruvato (posición 130); sin embargo, la enzima de B. subtilis contiene una treonina en la posición 47, un resto de la zona activa, en lugar de arginina. La KHG de B. subtilis es más pequeña y parece estar en un grupo distinto de las enzimas de S. meliloti y de E. coli, con otras enzimas que presentan la treonina de la zona activa. Las diferencias en la zona activa pueden ser la razón para el aumento de actividad de la enzima de B. subtilis. 45

Mejora de la actividad de aldolasa

Los anticuerpos catalíticos pueden ser tan eficaces como las aldolasas naturales, aceptan un amplia gama de sustratos y pueden utilizarse para catalizar la reacción mostrada en la figura 2. 50

Las aldolasas pueden mejorarse también por evolución dirigida, por ejemplo como se describió anteriormente para la aldolasa de KDPG (muy homóloga a KHG descrita anteriormente) producida por reordenación del ADN y RCP propensa a error para eliminar el requisito del fosfato e invertir la enantioselectividad. Los péptidos de KDPG aldolasa son útiles en las reacciones bioquímicas, ya que son muy específicos para el sustrato del 55 donante (en la presente memoria, piruvato) pero son relativamente flexibles con respecto al sustrato del receptor (es decir indol-3-piruvato) (Koeller & Wong, Nature, 409:232-9, 2001). La KHG aldolasa tiene actividad para la condensación del piruvato con numerosos ácidos carboxílicos. Las versiones para mamíferos de la KGH aldolasa se cree que tienen especificidad más amplia que las versiones bacterianas, incluyendo mayor actividad sobre 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato y aceptación de ambos estereoisómeros de 4-hidroxi-2-cetoglutarato. Las fuentes 60 bacterianas parecen tener una preferencia de 10 veces para el isómero R. Existen casi 100 homólogos de KHG disponibles en las bases de datos genómicas y se ha demostrado actividad en Pseudomonas, Paracoccus, Providencia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli y tejidos de mamíferos. Estas enzimas pueden utilizarse como punto de partida para ajustar la enantioespecificidad que se desea para la producción de monatina.

65

Las aldolasas que utilizan piruvato y otro sustrato que es un cetoácido y/o tiene un grupo hidrófobo

voluminoso como indol pueden "producirse" para ajustar la especificidad, velocidad y selectividad del polipéptido. Además de las KHG y proA aldolasas demostradas en la presente memoria, los ejemplos de estas enzimas incluyen, pero no están limitados a: KDPG aldolasa y los polipéptidos afines (KDPH); la transcarboxibenzalpiruvato hidratasa-aldolasa de Nocardioides st., 4-(2-carboxifenil)-2-oxobut-3-enoato aldolasa (2’-carboxibenzalpiruvato aldolasa) que condensa piruvato y 2-carboxibenzaldehído (sustrato que contiene anillo aromático); trans-O-5 hidroxibencilidenpiruvato hidratasa-aldolasa de Pseudomonas putida y Sphingomonas aromatocivorans, que también utiliza piruvato y un aldehído que contiene aromáticos como sustratos; 3-hidroxiaspartato aldolasa (eritro-3-hidroxi-L-aspartato glioxilato liasa), que utiliza 2-oxoácidos como sustratos y se cree que está en el organismo de Micrococcus denitrificans; benzoin aldolasa (benzaldehído liasa) que utiliza sustratos que contienen grupos bencilo; dihidroneopterina aldolasa; L-treo-3-fenilserina benzaldehído-liasa (fenilserina aldolasa) que condensa glicina con 10 benzaldehído; 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa; 1,2-dihidroxibencilpiruvato aldolasa y 2-hidroxibenzalpiruvato aldolasa.

Un polipéptido con la actividad deseada puede seleccionarse cribando clones de interés que utilizan los procedimientos siguientes. Se transforman auxótrofos de triptófano con vectores que llevan los clones de interés en 15 una casete de expresión y se cultivan en un medio que contiene pequeñas cantidades de monatina o PM. Ya que las reacciones de aminotransferasas y aldolasas son reversibles, las células pueden producir triptófano a partir de una mezcla racémica de monatina. Asimismo, los organismos (tanto recombinantes como naturales) pueden cribarse por su capacidad para utilizar PM o monatina como fuente de carbono y energía. Una fuente de aldolasas dianas son los bancos de expresión de varias cepas de Pseudomonas y rhizobacterianas. Las Pseudomonadas 20 tienen muchas rutas catabólicas poco frecuentes para la degradación de moléculas aromáticas y además contienen muchas aldolasas; mientras que las rhizobacterias contienen aldolasas, son conocidas por desarrollarse en la rizosfera vegetal y tienen muchos de los genes descritos para la construcción de una ruta biosintética para la monatina.

25

EJEMPLO 5

Síntesis química del precursor de monatina

El Ejemplo 4 describió un procedimiento de utilización de una aldolasa para convertir el indol-3-piruvato en 30 el 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico, precursor de monatina (PM). Este ejemplo describe un procedimiento alternativo para sintetizar químicamente el PM.

El PM se forma utilizando una condensación aldólica típica (figura 4). En resumen, una reacción aldólica típica conlleva la generación de un carbanión del éster piruvato utilizando una base fuerte, tal como LDA (di-35 isopropilamida de litio), hexametildisilazano de litio o butil-litio. El carbanión que se genera reacciona con el indol-piruvato para formar el producto acoplado.

Los grupos protectores que pueden utilizarse para proteger el nitrógeno del indol comprenden de manera no limitativa: t-butiloxicarbonilo (Boc) y benciloxicarbonilo (Cbz). Los grupos bloqueadores para los ácidos 40 carboxílicos comprenden de manera no limitativa, ésteres de alquilo (por ejemplo ésteres de metilo, etilo o bencilo). Cuando se utilizan dichos grupos protectores, no es posible controlar la estereoquímica del producto que se forma. Sin embargo, si R2 y/o R3 son grupos protectores quirales (figura 4) tal como (S)-2-butanol, mentol o una amina quiral, esto puede favorecer la formación de un enantiómero de PM sobre el otro.

45

EJEMPLO 6

Conversión de triptófano o indol-3.piruvato en monatina

Un procedimiento in vitro que utiliza dos enzimas, una aminotransferasa y una aldolasa, produjeron 50 monatina a partir de triptófano y piruvato. En la primera etapa, el alfa-cetoglutarato fue el receptor del grupo amino del triptófano en una reacción de transaminación que genera indol-3-piruvato y glutamato. Una aldolasa catalizó la segunda reacción en la que el piruvato se hizo reaccionar con indol-3-piruvato, en presencia de Mg2+ y fosfato, generando el derivado alfa-ceto de monatina (PM), 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico. La transferencia del grupo amino desde el glutamato formado en la primera reacción produjo el producto deseado, monatina. La 55 purificación y caracterización del producto demostró que el isómero formado era S,S-monatina. Se describen sustratos, enzimas y condiciones alternativas así como las mejoras que se hicieron en este procedimiento.

Enzimas

60

La aldolasa, 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liasa (ProA aldolasa, gen proA) (CE 4.1.3.17) de Comamonas testosteroni se clonó, expresó y purificó tal como se describe en el Ejemplo 4. Las 4-hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato liasas (KHG aldolasas) (CE 4.1.3.16) de B. subtilis, E. coli y S. meliloti se clonaron, expresaron y purificaron tal como se describe en el Ejemplo 4.

65

Las aminotransferasas utilizadas junto con las aldolasas para producir monatina eran la L-aspartato

aminotransferasa codificada por el gen aspC de E. coli, la tirosina aminotransferasa codificada por el gen tyrB de E. coli, la enzima tatA de S. meliloti, la aminotransferasa de amplio sustrato codificada por el gen bsat de L. major o la glutámico-oxaloacética transaminasa del corazón de cerdo (tipo IIa). La clonación, expresión y purificación de las proteínas que no son de mamífero se describen en el Ejemplo 1. La glutámico-oxaloacética transaminasa del corazón del cerdo(tipo IIa) se adquirió en Sigma (nº G7005). 5

Procedimiento que utiliza ProA aldolasa y L-aspartato aminotransferasa

La mezcla de reacción contenía acetato amónico 50 mM, pH 8,0, MgCl2 4 mM, fosfato potásico 3 mM, piridoxal fosfato 0,05 mM, piruvato amónico 100 mM, triptófano 50 mM, alfa-cetoglutarato 10 mM, 160 mg de ProA 10 aldolasa recombinante de C. testosteroni (extracto celular impurificado, aldolasa al ~30%), 233 mg de L-aspartato aminotransferasa de E. coli recombinante (extracto celular impurificado, ~40% de aminotransferasa) en un litro. Todos los componentes excepto las enzimas se mezclaron y se incubaron a 30ºC hasta que se disolvió el triptófano. Las enzimas se añadieron a continuación y la solución de reacción se incubó a 30ºC con agitación suave (100 rpm) durante 3,5 horas. 0,5 y 1 hora después de la adición de las alícuotas en enzimas de triptófano sólido 15 (50 mmoles cada una) se añadieron a la reacción, Todo el triptófano añadido no se disolvió, pero la concentración se mantuvo en 50 mM o superior. Después de 3,5 horas se filtró el triptófano sólido. El análisis de la mezcla de reacción por LC/MS utilizando una cantidad definida de triptófano como patrón demostró que la concentración de triptófano en la solución era de 60,5 mM y la concentración de monatina era de 5,81 mM (1,05 g).

20

Se utilizaron los procedimientos siguientes para purificar el producto final. El 90% de la solución transparente se aplicó a una columna de resina AG50W-X8 de BioRad (225 ml; capacidad de enlace de 1,7 meq/ml). La columna se lavó con agua, recolectando fracciones de 300 ml hasta que la absorbancia a 280 nm fue < 5% de la primera fracción a través del flujo. La columna se eluyó a continuación con acetato amónico 1 M, pH 8,4, recolectando 4 fracciones de 300 ml. Las 4 fracciones contenían monatina y se evaporaron hasta 105 ml utilizando 25 un roto-evaporador con un baño de agua tibia. Se formó un precipitado a medida que se reducía el volumen y se filtró a lo largo del proceso de evaporación.

Por análisis de las fracciones de la columna por LC/MS se demostró que el 99% del triptófano y de la monatina se unió a la columna. El precipitado que se formó durante el proceso de evaporación contenía > 97% de 30 triptófano y < 2% de monatina. La relación del triptófano a producto en el sobrenadante fue aproximadamente de 2:1.

Se aplicó el sobrenadante (7 ml) a una columna de 100 ml de DEAE Fast Flow Sepharose (Amersham Biosciences) previamente convertida a la forma acetato lavando con 0,5 l de NaOH 1 M, 0,2 l de agua, 1,0 l de 35 acetato amónico 1,0 M, pH 8,4 y 0,5 l de agua. El sobrenadante se cargó a razón de < 2 ml/min y la columna se lavó con agua a razón de 3 a 4 ml/min hasta que la absorbancia a 280 nm fue ~0. Se eluyó la monatina con acetato amónico 100 mM, pH 8,4, recogiendo 4 fracciones de 100 ml.

El análisis de las fracciones demostró que la relación de triptófano a monatina en las fracciones flujo a 40 través era 81:15 y la relación en las fracciones del eluyente era 7:93. Suponiendo que el coeficiente de extinción a 280 nm de monatina es el mismo que el del triptófano, las fracciones eluyentes contenían 0,146 mmoles de producto. La extrapolación a 1 l de reacción total produciría ~2,4 mmoles (~710 mg) de monatina, para una recuperación del 68%.

45

Las fracciones eluyentes de la columna DEAE Sepharose se evaporaron hasta < 20 ml. Una alícuota del producto se purificó más durante la aplicación a una columna C8 de preparación en fase inversa utilizando las mismas condiciones cromatográficas que las descritas en el Ejemplo 10 para la caracterización de la monatina a escala analítica. Se empleó el programa informático FractionlynxTM de Waters para activar la recolección automática de fracciones de monatina basado en la detección de la m/z = 293 ion. Se recolectó la 50 fracción procedente de la columna C8 con el ión molecular correspondiente protonado para monatina, se evaporó a sequedad y a continuación se disolvió en un pequeño volumen de agua. Esta fracción se utilizó para la caracterización del producto.

El producto resultante se caracterizó utilizando los procedimientos siguientes. 55

Espectroscopía UV/visible. Las determinaciones espectroscópicas por UV/visible de monatina producidas mediante enzimas se llevaron a cabo utilizando un espectrofotómetro UV/visible 100 Bio de Cary. El producto purificado, disuelto en agua, presentó un máximo de absorción de 280 nm con un codo a 288 nm, características típicas de los compuestos que contienen indol. 60

Análisis LC/MS. Los análisis de las mezclas para derivados de monatina de las reacciones bioquímicas in vitro se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 10. Un análisis LC/MS típico de monatina en una mezcla sintética enzimática in vitro se ilustra en la figura 5. El panel inferior de figura 5 ilustra un cromatograma iónico seleccionado para el ión molecular protonado de monatina a m/z = 293. Esta identificación de monatina en la 65 mezcla fue corroborada por el espectro de masas ilustrados en la figura 6. El análisis del producto purificado por

LC/MS presentó un solo pico con un ión molecular de 293 y absorbancia a 280 nm. El espectro de masas fue idéntico al mostrado en la figura 6.

Análisis por MS/MS. Los experimentos con ión derivado por LC/MS/MS, tal como se describe en el Ejemplo 10, se realizaron también en monatina. Un espectro de masas de ión derivado de monatina se ilustra en la 5 figura 7. Se hicieron asignaciones estructurales por tanteo de todos los fragmentos de iones marcados en la figura 7. Éstas incluyen los fragmentos de iones de m/z = 275 (293 - H2O), 257 (293 -(2 x H2O)), 230 (275 - COOH), 212 (257 - COOH), 168 (ión carbonio de 3-buta-1,3-dienil-1H-indol), 158 (ión carbonio de 1H-indol-3-carbaldehído), 144 (ión carbonio de 3-etil-1H-indol), 130 (ión carbonio de 3-metileno-1H-indol) y 118 (ión indol carbonio). Muchos de éstos son los mismos que los obtenidos para PM (Ejemplo 4), como era de esperar si procedían de la fracción indol 10 de la molécula. Algunos son 1 unidad de masa mayores que los observados para PM debido a la presencia de un agrupo amino en lugar de una cetona.

Análisis MS de alta resolución. La figura 8 ilustra el espectro de masas obtenido para la monatina purificada empleando un espectrómetro de masas de cuadrupolo híbrido/tiempo de vuelo Q-Star de Applied 15 Biosystems-Perkin Elmer. La masa medida para la monatina protonada utilizando triptófano como patrón de calibración de masa interno fue de 293,1144. La masa calculada de la monatina protonada basada en la composición elemental C14H17N2O5 es de 293,1137. Este es un error de medición de la masa inferior a 2 partes por millón (ppm), que proporciona pruebas concluyentes de la composición elemental de la monatina producida por vía enzimática. 20

Espectroscopía de RMN. Se realizaron experimentos de RMN en un instrumento de 500 MHz Inova de Varian. La muestra de monatina (~3 mg) se disolvió en 0,5 ml de D2O. Inicialmente, el disolvente (D2O) se utilizó como referencia interna a 4,78 ppm. Como el pico para el agua era grande, la 1H-RMN se desarrolló con supresión del pico para el agua. Posteriormente, debido a la amplitud del pico de agua, se utilizó el protón en el C-2 de 25 monatina como pico de referencia, y se fijó en el valor publicado de 7,192 ppm.

Para la 13C-RMN, una serie inicial de varios cientos de exploraciones indicó que la muestra estaba demasiado diluida para obtener un espectro de 13C en el tiempo asignado. Por consiguiente, se realizó un experimento de coherencia cuántica múltiple heteronuclear (HMQC), que permitió la correlación de los hidrógenos y 30 los carbonos a los que estaban unidos, y proporcionando además información de los desplazamientos químicos de los carbonos.

Un resumen de los datos de 1H y de HMQC se muestra en las Tablas 2 y 3. Por comparación con los valores publicados, los datos de la RMN indicaban que la monatina producida por vía enzimática era bien (S,S), 35 (R,R) o una mezcla de ambos.

Análisis quiral por LC/MS. Para demostrar que el producto monatina in vitro era un isómero, y no una mezcla de enantiómeros (R,R) y (S,S) se realizaron análisis quirales LC/MS utilizando los instrumentos descritos en el Ejemplo 10. 40

Se realizaron separaciones quirales por LC utilizando una columna cromatográfica quiral Chirobiotic T (Advances Separations Technology) a temperatura ambiente. La separación y detección, basadas en los protocolos publicados del vendedor, se optimizaron para los isómeros R- (D) y S- (L) de triptófano. La fase LC constaba de A) agua que contenía ácido trifluoroacético al 0,05% (v/v); B) metanol que contenía ácido trifluoroacético al 0,05% 45 (v/v). La elución fue isocrática en 70% de A y 30% de B. El caudal fue de 1,0 ml/min y la absorbancia de PDA se controló desde 200 nm hasta 400 nm. Los parámetros instrumentales utilizados para el análisis LC/MS quiral del triptófano y monatina son idénticos a los descritos en el Ejemplo 10 para el análisis LC/MS. Se utilizó la recolección de los espectros de masas para la zona m/z 150 a 400. Los cromatogramas iónicos seleccionados para los iones moleculares protonados ([M+H]+ = 205 tanto para el R-triptófano como para el S-triptófano y [M+H]+ = 293 para 50 monatina) mostraban identificación directa de estos analitos en las mezclas.

Los cromatogramas de R-triptófano y S-triptófano y monatina, separados por cromatografía quiral y controlados por MS, se muestran en la figura 9. El único pico en el cromatograma de monatina indica que el compuesto es un isómero con un tiempo de retención casi idéntico al de S-triptófano. 55

Tabla 2: Datos de 1H RMN

Cargill Vleggaar et al.1 Takeshi et al.2

Atom

δH J(HH) Hz δH J(HH) Hz δH J(HH) Hz

2

7,192 (1H, s) 7,192 (s) 7,18 (s)

4

7,671 (d) 7,99 7,686 (d) 7,9 7,67 (d) 8,0

5

7,104 (dd) 7,99 7,102 (dd) 8,0,8,0 7,11 (dd) 7,5, 7,5

6

7,178 (dd) * 7,176 (dd) 8,0,8,0 7,17 (dd) 7,5, 7,5

7

7,439 (d) 7,99 7,439 (d) 8,1 7,43 (d) 8,0

10a

3,242(d) 14,5 3,243 (d) 14,3 3,24 (d) 14,5

10b

3,033 (d) 14,5 3,051 (d) 14,3 3,05 (d) 14,5

12

2,626 (dd) 2,015 (dd) 15,5, 1,5 15,0, 12,0 2,651 (dd) 2,006 (dd) 15,3, 1,7 15,3, 11,7 2,62 (dd) 2,01 (dd) 15,5, 1,8 15,5, 12,0

13

3,571 (dd) 10,75*, 1,5 3,168 (dd) 11,6, 1,8 3,57 (dd) 12,0, 1,8

1 Vleggaar et al. (J.C.S. Perkin Trans. 1:3095-8, 1992).

2 Takeshi and Shusuke (JP2002060382, 2002-02-26). 5

Tabla 3: Datos de 13C RMN (procedente del espectro de HMQC)

Cargill Vleggaar et al.1

Atom

δC δC

2

126,1 126,03

3

* 110,31

4

120,4 120,46

5

120,2 120,25

6

122,8 122,74

7

112,8 112,79

8

* 137,06

9

* 129,23

10a

36,4 36,53

12

39,5 39,31

13

54,9 54,89

14

* 175,30

15

* 181,18

1 Vleggaar et al. (J.C S. Perkin Trans. 1:3095-8, 1992). 10

Polarimetría. La rotación óptica se midió en un polarímetro Autopol III de Rudolph. La monatina se preparó como una solución de 14,6 mg/ml en agua. La rotación específica esperada ([α]D20) para S,S-monatina (forma salina) es -49,6 para una solución de 1 g/ml en agua (Vleggaar et al.). La [α]D20 observada fue -28,1 para la monatina purificada, producida por vía enzimática lo que indica que era el isómero S,S. 15

Mejoras

Se optimizaron las condiciones de reacción, incluyendo las concentraciones en reactivo y enzima, y se produjeron rendimientos de 10 mg/ml utilizando la mezcla reactiva siguiente: 20

acetato amónico 50 mM, pH 8,3, MgCl2 2 mM, piruvato (sal de sodio o amonio) 200 mM, alfa-cetoglutarato (sal sódica) 5 mM, piridoxal fosfato 0,05 mM,

agua desaireada hasta conseguir un volumen final de 1 ml después de la adición de las enzimas, 25

fosfato potásico 3 mM, 50 μg/ml de ProA aldolasa recombinante (extracto celular, concentración total de proteínas de 167 μg/ml), 1000 μg/ml de L-aspartato aminotransferasa codificada por el gen aspC de E. coli (extracto celular, concentración total de proteínas de 2500 μg/ml) y triptófano sólido para proporcionar una concentración > 60 mM (saturado; algo sin disolver en toda la reacción). La mezcla se incubó a 30ºC durante 4 horas con agitación o 30 mezclado suave.

Sustituciones

La concentración de alfa-cetoglutarato puede reducirse a 1 mM y enriquecerse con aspartato 9 mM con un rendimiento de monatina equivalente. Pueden utilizarse receptores de aminoácidos alternativos en la primera etapa, tal como oxaloacetato. 5

Cuando se utiliza aminotransferasa de amplio sustrato de L. major recombinante en lugar de la L-aspartato aminotransferasa de E. coli, se consiguieron rendimientos similares de monatina. Sin embargo, se detectó también por análisis LC/MS un segundo producto no identificado (3 al 10% del producto principal) con una masa molecular de 292. Se produjeron concentraciones de monatina entre 0,1 y 0,5 mg/ml cuando se añadía la enzima codificada 10 por tyrB de E. coli, la enzima codificada por tatA de S. meliloti o la glutámico-oxaloacético transaminasa del corazón de cerdo (tipo IIa) como aminotransferasa. Al comenzar la reacción a partir de indol-3-piruvato puede efectuarse una aminación reductora durante la última etapa con glutamato deshidrogenasa y NADH (como en el Ejemplo 7).

Las KHG aldolasas de B. subtilis, E. coli y S. meliloti se utilizaron también con la L-aspartato 15 aminotransferasa de E. coli para producir monatina por vía enzimática. Se utilizaron las siguientes condiciones de reacción: NH4-OAc 50 mM, pH 8,3, MgCl2 2 mM, piruvato 200 mM, glutamato 5 mM, piridoxal fosfato 0,05 mM, agua desaireada hasta conseguir un volumen final de 0,5 ml después de la adición de las enzimas, fosfato potásico 3 mM, 20 μg/ml de KHG aldolasa recombinante de B. subtilis (purificada), aprox. 400 μg/ml de L-aspartato aminotransferasa (AspC) de E. coli sin purificar del extracto celular e indol-3-piruvato 12 mM. Las reacciones se 20 incubaron a 30ºC durante 30 minutos con agitación. La cantidad de monatina producida utilizando la enzima de B. subtilis fue de 80 mg/ml, y aumentó al aumentar las cantidades de aldolasa. Si el indol-3-piruvato y el glutamato se sustituían saturando cantidades de triptófano y alfa-cetoglutarato 5 mM, la producción de monatina aumentaba hasta 360 ng/ml. Se repitieron las reacciones con 30 μg/ml de cada una de las tres enzimas KHG en Tris 50 mM, pH 8,3, saturando cantidades de triptófano, y se dejaron procesar durante una hora para aumentar la detección. La 25 enzima de Bacillus tenía actividad máxima como en el Ejemplo 4, produciendo aproximadamente 4.000 ng/ml de monatina. La KHG de E. coli produjo 3.000 ng/ml de monatina y la enzima de S, meliloti produjo 2.300 ng/ml.

EJEMPLO 7

30

Interconversión entre PM y monatina

La aminación de PM para formar monatina puede ser catalizada por aminotransferasas tales como las identificadas en los Ejemplos 1 y 6, o por deshidrogenasas que requieren un cofactor reductor tal como NADH o NADPH. Estas reacciones son reversibles y pueden medirse en ambas direcciones. La direccionalidad, al utilizar 35 una enzima deshidrogenasa, puede controlarse en gran medida mediante la concentración de sales amónicas.

Actividad de deshidrogenasa. La desaminación oxidativa de la monatina se controló siguiendo el aumento de absorbancia a 340 nm ya que NAD(P)+ se convirtió en más NAD(P)H cromofórico. La monatina se produjo por vía enzimática y se purificó como se describe en el Ejemplo 6. 40

Una mezcla analítica típica contenía Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 a 8,9, NAD+ o NADP+ 0,33 mM, 2 a 22 unidades de glutamato deshidrogenasa (Sigma) y sustrato 10 a 15 mM en 0,2 ml. El análisis se realizó por duplicado en una placa de microvaloración transparente a UV, en un lector de placas SpectraMax Plus de Molecular Devices. Una mezcla de la enzima, tampón y una mezcla de NAD(P)+ se pipetearon en los pocillos que contenían el 45 sustrato y se controló el aumento de absorbancia a 340 nm a intervalos de 10 segundos después de un breve mezclado. Se incubó la reacción a 25ºC durante 10 minutos. Se realizaron controles negativos sin adición de sustrato y se utilizó el glutamato como referencia positiva. La glutamato deshidrogenasa tipo III del hígado bovino (Sigma nº G-7882) catalizó la conversión de la monatina en el precursor de monatina a una velocidad de conversión de aproximadamente una centésima de la velocidad de conversión del glutamato en alfa-cetoglutarato. 50

Actividad de transaminación. Se realizaron ensayos de monatina aminotransferasa con la aspartato aminotransferasa (AspC) de E. coli, la tirosina aminotransferasa (TyrB) de E. coli, la aminotransferasa de amplio sustrato (BSAT) de L. major y las dos glutamato-oxaloacetato aminotransferasas porcinas disponibles en el mercado descritas en el Ejemplo 1. Tanto el oxaloacetato como el alfa-cetoglutarato se probaron como receptores 55 amino. La mezcla de ensayo contenía (en 0,5 ml) Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, PLP 0,05 mM, receptor amino 5 mM, monatina 5 mM y 25 μg de aminotransferasa. Los ensayos se incubaron a 30ºC durante 30 minutos y las reacciones se interrumpieron mediante la adición de 0,5 ml de alcohol isopropílico. La pérdida de monatina fue controlada por LC/MS (Ejemplo 10). La mayor cantidad de actividad se apreció con BSAT de L. major con oxaloacetato como receptor de amino, seguido de la misma enzima con alfa-cetoglutarato como receptor amino. La actividad relativa 60 con oxaloacetato fue: BSAT > AspC > porcino tipo IIa > porcino tipo I = TyrB. La actividad relativa con alfa-cetoglutarato fue: BSAT > AspC > porcino tipo I > porcino tipo IIa > TyrB.

EJEMPLO 8

Producción de monatina a partir de triptófano y otras fuentes de C3 aparte de piruvato

Tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 6, el indol-3-piruvato o el triptófano pueden convertirse en monatina utilizando piruvato como molécula de C3. Sin embargo, en algunas circunstancias el piruvato puede no 5 ser una materia prima deseable. Por ejemplo, el piruvato puede ser más costoso que otras fuentes de carbono de C3 o puede tener efectos perjudiciales en las fermentaciones si se añade al medio. La alanina puede ser transaminada por muchas enzimas con PLP para producir piruvato.

Las enzimas de tipo triptofanasa realizan reacciones de beta-eliminación a velocidades más rápidas que 10 otras enzimas con PLP tales como las aminotransferasas. Las enzimas de esta clase (4.1.99.-) pueden producir amoniaco y piruvato procedente de aminoácidos tales como L-serina, L-cisteína y derivados de serina y cisteína con grupos prominentes adecuados tales como O-metil-L-serina, O-bencil-L-serina, S-metil-cisteína, S-bencil-cisteína, S-alquil-L-cisteína, O-acil-L-serina o 3-cloro-L-alanina.

15

Los procedimientos para producir monatina que utilizan CE 4.1.99.-polipéptidos pueden ser mejorados mutando la β-tirosinasa (TPL) o triptofanasa según el procedimiento de Mouratou et al. (J. Biol. Chem., 274:1320-5, 1999). Mouratou et al. describen la capacidad para convertir la β-tirosinasa en una aminoácido dicarboxílico β-liasa, que no se ha descrito por ser natural. El cambio de especificidad fue acompañado por la conversión de valina (V) 283 en arginina (R) y arginina (R) 100 en treonina (T). Estos cambios de aminoácidos permiten que la liasa acepte 20 un aminoácido dicarboxílico para la reacción de desaminación hidrolítica (tal como aspartato). Por consiguiente, puede utilizarse también aspartato como fuente de piruvato para reacciones de condensación aldólica posteriores.

Además, las células o reactores enzimáticos pueden suministrarse con lactato y una enzima que convierte lactato en piruvato. Los ejemplos de enzimas que pueden catalizar esta reacción incluyen lactato deshidrogenasa y 25 lactato oxidasa.

Aislamiento de ADN genómico

Los polipéptidos de la triptofanasa se han descrito anteriormente, por ejemplo en Mouratou et al. (J.B.C., 30 274:1320-5, 1999). Para aislar los genes que codifican los polipéptidos de la triptofanasa se utilizó como plantilla ADN genómico procedente de DH10B de E. coli para la RCP tal como se describe en el Ejemplo 1.

El gen para la tirosina-fenol liasa se aisló de C. freundii (nº 8090 del catálogo ATCC, denominación ATCC 13316; NCTC 9750) y se cultivó en agar nutritivo (Difco 0001) y caldo de cultivo nutritivo (Difco 0003) a 37ºC hasta 35 una D.O. de 2,0. El ADN genómico se purificó utilizando el kit Genomic-tipTM 100/G de Qiagen.

Amplificación por RCP de secuencias de codificación

Se diseñaron cebadores con prominencias compatibles para el vector pET 30 Xa/LIC (Novagen, Madison, 40 WI) tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 1.

tna de E. coli (SEC. ID. nº 41). Cebador con terminal N para la clonación de pET30 Xa/LIC: 5’-GGT ATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3’ (SEC. ID. nº 43). Cebador con terminal C para la clonación de pET30 Xa/LIC: 5’-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACT TCT TTA AGT TTT G-3’ (SEC. ID. nº 44). 45

tpl de C. freundii (SEC. ID. nº 42). Cebador con terminal N para la clonación de pET30 Xa/LIC: 5’-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3’ (SEC. ID. nº 45). Cebador con terminal C para la clonación de pET 30 Xa/LIC: 5’-AGA GGA GAG TTA GAG CCTTAGATGTAATCAAAGCGTG-3’ (SEC. ID. nº 46).

50

Se utilizó el ciclador térmico Eppendorf MastercyclerTM Gradient 5331 para todas las reacciones RCP. En 50 μl se añadieron 0,5 μg de plantilla (ADN genómico), 1,0 μM de cada cebador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Expand High Fidelity Polymerase (Roche), 1 x tampón Expand con Mg, y DMSO al 5% (concentración final). El programa del termociclador para la RCP utilizado fue el siguiente: inicio en caliente a 96ºC (5 minutos), 94ºC - 30 segundos, 40-60ºC - 1 minuto 45 segundos, 72ºC - 2 minutos 15 segundos; 30 repeticiones. La etapa de 55 polimerización final duró 7 minutos y las muestras se almacenaron entonces a 4ºC.

Clonación

Para identificar los clones apropiados se utilizaron los procedimientos de clonación y de identificación de 60 clones positivos detallados anteriormente en el Ejemplo 1.

Expresión génica y ensayos de actividad

Se subclonó el ADN plásmido (comprobado mediante análisis de las secuencias) en el hospedador de 65

expresión BL21(DE3) (Novagen). Se desarrollaron los cultivos en medio LB con 30 mg/l de kanamicina, se aislaron los plásmidos utilizando el kit miniprep de Qiagen y se analizaron mediante enzimas de restricción para confirmar la identidad.

Se realizaron experimentos de inducción con el hospedador de expresión BL21(DE3), los montajes se 5 desarrollaron en medio LB que contenía 50 mg/l de kanamicina a 37ºC. Se provocó la expresión de la proteína utilizando IPTG 0,1 mM una vez que la D.O.600 del cultivo alcanzó aproximadamente 0,6. Las células se cultivaron durante 4 horas a 30ºC y se recolectaron por centrifugación. Se lisaron a continuación las células en 5 ml/g de reactivo BugBusterTM (Novagen) en peso de células en húmedo que contenía 5 μl/ml de mezcla de inhibidor de proteasa serie III (Calbiochem) y 1 μl/ml de benzonasa nucleasa (Novagen) y las proteínas recombinantes activadas 10 por His se purificaron utilizando los cartuchos His-Bind descritos anteriormente en el Ejemplo 1. Se desalaron las proteínas purificadas en una columna PD-10 (G25 Sephadex, Amersham Biosciences) y se eluyeron en tampón Tris-Cl 100 mM, pH 8,0. Se analizaron las proteínas por SDS-PAGE en geles con gradiente 4 al 15% para comprobar las concentraciones de proteína soluble al P.M. predicho de la proteína de fusión recombinante.

15

Mutagénesis

Algunos miembros del polipéptido clase 4.1.99.- (triptofanasa y β-tirosinasa) llevarán a cabo la reacción de la beta-liasa con aspartato o aminoácidos similares sin ninguna modificación. Sin embargo, puede ser necesario que algunos miembros de la clase experimentes mutagénesis para permitir la utilización de los sustratos y/o la 20 creación del producto. Por otra parte, en algunos casos los polipéptidos que pueden realizar la conversión pueden optimizarse más por mutagénesis.

Se realizó la mutagénesis dirigida basándose en el análisis de estructura 3D de polipéptidos unidos a PLP. Dos ejemplos para cambiar la especificidad del sustrato de los polipéptidos se presentan a continuación. 25

Mutagénesis de la triptofanasa Ejemplo 1

El protocolo de la mutagénesis proporcionado a continuación introdujo dos mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos. La primera mutación puntual cambió la arginina (R) en la posición 103 por treonina (T) y 30 la segunda mutación puntual cambió la valina (V) en la posición 299 por arginina (R) (sistema de numeración para la proteína madura de E. coli). Se realizaron experimentos de mutagénesis por los laboratorios ATG (Eden Prairie, MN). Se introdujeron mutaciones sucesivamente por RCP de fragmentos génicos y el reensamblado de los fragmentos se llevó a cabo por RCP también. Cebadores para convertir arginina (R)103 a treonina (T): 5’-CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3’ (SEC ID nº: 47) y 35 5’-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3’ (SEC ID nº: 48).

Cebadores para convertir valina (V)299 en arginina (R): 5’-TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3’ (SEC ID nº: 49) y 5’-CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3’ (SEC ID nº: 50). 40

Los mutantes se identificaron por análisis con las enzimas de restricción Xba I/HindIII y SphI y se verificaron por secuenciado.

Mutagénesis de tirosina fenol liasa (β-tirosinasa) Ejemplo 2 45

Se realizaron dos mutaciones puntuales a la secuencia de aminoácidos de tirosina fenol liasa. Estas mutaciones convirtieron la arginina (R) en la posición 100 en treonina (T) y valina (V) en la posición 283 en arginina (R) (en la secuencia de la proteína madura de C. freundii).

50

Los cebadores para la conversión de R100T fueron: 5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’ (SEC ID nº: 51) y 5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’ (SEC ID nº: 52). Los cebadores para la conversión de V283R fueron: 5’-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3’ (SEC ID nº: 53) y 5’-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3’ (SEC ID nº: 54).

55

Se utilizaron los procedimientos descritos anteriormente, y los clones se identificaron por digestión con KpnI/SacI y digestión con BstX I. Las secuencias fueron verificadas por secuenciado de la terminación de la cadena didesoxi. La proteína recombinante se produjo tal como se describió anteriormente para las enzimas naturales.

La mezcla de reacción constaba de Tris-Cl 50 mM pH 8,3, MgCl2 2 mM, fuente de carbono de C3 200 mM, 60 sal sódica del alfa-cetoglutarato 5 mM, piridoxal fosfato 0,05 mM, agua desaireada para conseguir un volumen final de 0,5 ml tras la adición de las enzimas, fosfato potásico 3 mM, pH 7,5, 25 μg de ProA aldolasa de C. testosteroni recombinante en bruto preparada como en el Ejemplo 4, 500 μg de L-aspartato aminotransferasa (AspC) en bruto como se preparó en el Ejemplo 1 y triptófano sólido para dar una concentración > 60 mM (saturado; algo no disuelto a lo largo de la reacción). La mezcla de reacción se incubó a 30ºC durante 30 minutos con mezclado. Se 65 suministraron, serina, alanina y aspartato como fuentes 3 carbono C3. Los ensayos se realizaron con y sin enzimas con PLP secundarias (purificadas) capaces de llevar a cabo reacciones de eliminación en beta y de beta-liasa

(triptofanasa (TNA), triptofanasa doble mutante, β-tirosinasa (TPL)). Los resultados se presentan en la Tabla 4:

Tabla 4: Producción de monatina utilizando fuentes de carbono C3 alternativas

Fuente de carbono C3

Enzima con PLP adicional Actividad relativa

ninguna

ninguna

0%

piruvato

ninguna 100%

serina

ninguna 3%

serina

11 μg de TNA natural (1 U) 5,1%

serina

80 μg de TNA doble mutante 4,6%

alanina

ninguna 32%

alanina

11 μg de TNA natural 41,7%

alanina

80 μg de TNA mutante 43,9%

aspartato

110 μg de TNA natural (10 U) 7,7%

aspartato

5 U de TLP natural (en bruto) 5,1%

aspartato

80 μg de TNA mutante 3,3%

5

La monatina producida a partir de alanina y serina como fuentes carbono C3 fue verificada por análisis LC/MS/MS modo daughter scan y fue idéntica a la monatina caracterizada producida en el Ejemplo 6. La alanina fue la mejor alternativa probada y fue transaminada por la enzima AspC. La cantidad de monatina producida aumentó mediante la adición de la triptofanasa, que puede realizar la transaminación como actividad secundaria. La cantidad de monatina producida con la serina como fuente de carbono, se duplicó casi con la adición de las enzimas 10 triptofanasa, aún cuando solamente una quinta parte de la cantidad de triptofanasa en comparación con la aminotransferasa. AspC puede tener alguna cantidad de actividad de beta-eliminación sola. Los resultados con aspartato indican que la actividad de triptofanasa en aspartato no aumenta con las mismas mutaciones dirigidas que se sugirieron anteriormente para la β-tirosinasa. Es de esperar que la β-tirosinasa mutante presenta una mayor actividad para la producción de monatina. 15

EJEMPLO 9

Síntesis química de monatina

20

La adición de alanina al ácido indol-3-pirúvico produce monatina y esta reacción puede llevarse a cabo por síntesis con un reactivo de Grignard u organolitio.

Por ejemplo, a la 3-cloro- o 3-bromo-alanina que se ha bloqueado de manera apropiada en los grupos carboxilo y amino, se añade magnesio en condiciones anhidras. Se añade a continuación indol-3-piruvato 25 (bloqueado de manera apropiada) para formar el producto acoplado seguido de eliminación de los grupos protectores para formar monatina. Los grupos protectores que son particularmente útiles incluyen THP (éter tetrahidropiranílico) que se acopla y se elimina fácilmente.

EJEMPLO 10 30

Detección de monatina y PM

Este ejemplo describe los procedimientos utilizados para detectar la presencia de monatina o de su precursor el 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico. 35

Análisis LC/MS

Los análisis de las mezclas para la forma alfa-cetoácido de monatina (precursor de monatina, PM) y de la monatina procedente de las reacciones bioquímicas in vitro o in vivo se realizaron utilizando un instrumento de 40 espectrometría de masas en tándem con cromatografía liquida (LC/MS/MS) Micromass de Waters que incluye un cromatógrafo para líquidos 2690 de Waters con un monitor de absorbancia 996 Photo-Diode Array (PDA) de Waters colocado en serie entre el cromatógrafo y un espectrómetro de masas triple cuadrupolo Quattro Ultima de Micromass. Se realizaron separaciones por LC utilizando una columna de cromatografía en fase inversa Supelco Discovery C18, 2,1 mm x 150 mm o una columna de cromatografía en fase inversa Xterra MS C8, 2,1 mm x 250 mm, 45 a temperatura ambiente. La fase móvil de la LC constaba de A) agua conteniendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoroacético y B) metanol conteniendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoroacético.

La elución en gradiente fue lineal desde el 5% B hasta el 35% B, 0 a 9 min, lineal desde 35% B hasta el 90% B, 9 a 16 min, isocrática al 90% B, 16 a 20 min, lineal desde el 90% B hasta el 5% B, 20 a 22 min, con un 50 periodo de reequilibrado de 10 min entre las series. El caudal fue de 0,25 ml/min y la absorbancia de PDA se controló desde 200 nm hasta 400 nm. Todos los parámetros de la ESI-MS se optimizaron y seleccionaron basándose en la generación de iones moleculares protonados ([M+H]+) de los analitos de interés, y la producción

de iones de fragmentos característicos.

Se utilizaron los parámetros instrumentales siguientes para el análisis por LC/MS de monatina: capilar: 3,5 kV; cono: 40 V; Hex 1: 20 V; abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; temperatura de la fuente: 100ºC; temperatura de desolvatación: 350ºC; gas de desolvatación: 500 l/h; cono de gas: 50 l/h; resolución baja de masas (Q1): 15,0; 5 resolución alta de masas (Q1): 15,0; energía iónica: 0,2; entrada: 50 V; energía de colisión: 2; salida: 50 V; baja resolución de masas (Q2): 15; alta resolución de masas (Q2): 15; energía iónica (Q2): 3,5; multiplicador: 650. Las incertidumbres para las relaciones de masa/carga indicadas (m/z) y las masas moleculares son ± 0,01%. La detección inicial en las mezclas de la forma alfa-cetoácido de monatina (PM) y de monatina se llevó a cabo por seguimiento por LC/MS con recolección de los espectros de masas para la zona m/z 150-400. Los cromatogramas 10 iónicos seleccionados para los iones moleculares protonados ([M+H]+ = 292 para PM, [M+H]+ = 293 para monatina) permitieron la identificación directa de estos analitos en las mezclas.

Análisis MS/MS

15

Se realizaron experimentos con ión derivado por LC/MS/MS en monatina de la forma siguiente. El análisis del ión derivado implica la transmisión del ión original (por ejemplo, m/z = 293 para monatina) de interés desde el primer analizador de masas (Q1) en la celda de colisión del espectrómetro de masas, donde se introduce el argón y se disocia químicamente el original en fragmentos de iones (derivados). Estos fragmentos de iones se detectan a continuación con el segundo analizador de masas (Q2) y pueden utilizarse para corroborar la asignación estructural 20 del original.

Se utilizaron los siguientes parámetros instrumentales para el análisis LC/MS/MS de monatina: capilar: 3,5 kV; cono: 40 V; Hex 1: 20 V; abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; temperatura de la fuente: 100ºC; temperatura de desolvatación: 350ºC; gas de desolvatación: 500 l/h; cono de gas: 50 l/h; resolución baja de masas (Q1): 13,0; 25 resolución alta de masas (Q1): 13,0; energía iónica: 0,2; entrada: -5 V; energía de colisión: 1,4; salida: 1 V; baja resolución de masas (Q2): 15; alta resolución de masas (Q2): 15; energía iónica (Q2): 3,5; multiplicador: 650.

Determinación por alta resolución de monatina

30

Se realizaron análisis de alta resolución (< 5 min/muestra) de las mezclas para monatina procedente de las reacciones in vitro o in vivo utilizando la instrumentación descrita anteriormente, y los mismos parámetros que los descritos para LC/MS/MS. Se hicieron separaciones por LC utilizando la cromatografía de C8 (2,1 mm x 50 mm) Xterra MS de Waters a temperatura ambiente con elución isocrática en MeOH acuoso al 15%, ácido acético al 0,25% a un caudal de 0,3 ml/min. La detección de monatina en las muestras se realizó utilizando espectrometría de 35 masas en tándem con seguimiento de la reacción seleccionado (SRM). Esto implicaba el seguimiento del ión original provocado por colisiones específicas ([M+H]+ = 293,1) a transiciones del ión derivado (por ejemplo, el fragmento iónico a m/z = 168,1, asignado provisionalmente como ión 3-buta-1,3-dienil-1H-indol carbonio) para maximizar la sensibilidad, selectividad y el rendimiento para la detección de monatina. Los datos de absorbancia del PDA se recogieron en paralelo para la verificación adicional de la identidad de la monatina. 40

EJEMPLO 11

Producción de monatina en bacterias

45

Este ejemplo describe los procedimientos utilizados para producir monatina en células de E. coli. Un experto en la materia apreciará que pueden utilizarse procedimientos similares para producir monatina en otras células bacterianas. Además, los pueden utilizarse vectores que contienen otros genes en la serie de reacciones de la síntesis de monatina (figura 2).

50

El medio con Trp-1+glucosa, medio mínimo que ha sido utilizado para la producción de triptófano en células de E. coli (Zeman et al., Folia Microbiol. 35:200-4, 1990), se preparó de la forma siguiente. A 700 ml de agua nanopura se añadieron los siguientes reactivos: 2 g de (NH4)2SO4, 13,6 g de KH2PO4, 0,2 g de MgSO4·7H2O, 0,01 g de CaCl2·2H2O y 0,5 mg de FeSO4·7H2O. Se ajustó el pH a 7,0, se aumentó el volumen a 850 ml y se esterilizó el medio en autoclave. Se preparó una solución de glucosa al 50% por separado y se filtró estéril. Se agregaron 55 cuarenta ml al medio básico (850 ml) para un volumen final de 1 l.

Se preparó una solución de 10 g/l de L-triptófano en fosfato sódico 0,1 M pH 7 y se filtró estéril. Un décimo del volumen se agregó por lo general a los cultivos como se especifica a continuación. Una solución de piruvato sódico al 10% se preparó también y se filtró estéril. Se utilizó por lo general una alícuota de 10 ml por litro de cultivo. 60 Se prepararon soluciones madre de ampicilina (100 mg/ml), kanamicina (25 mg/ml) e IPTG (840 mM), se filtraron estériles y se almacenaron a -20ºC antes de su uso. Se utilizó Tween 20 (polioxietileno 20-monolaurato de sorbitán) a una concentración final del 0,2% (vol/vol). Se utilizó ampicilina a concentraciones no letales, por lo general 1 a 10 μg/ml de concentración final.

65

Se prepararon placas recientes de E. coli, BL21(DE3)::C. testosteroni proA/pET 30 Xa/LIC (descritas en el

Ejemplo 4) en medio LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina. Los cultivos de toda la noche (5 ml) de una sola colonia se inocularon y se cultivaron a 30ºC en medio LB con kanamicina. Por lo general se utilizaron 1 a 50 inóculos para la inducción en el medio con trp-1+glucosa. Se agregó antibiótico reciente hasta una concentración final de 50 mg/l. En matraces oscilantes se cultivaron a 37ºC antes de la inducción.

5

Se tomaron muestras de las células cada hora hasta que se obtuvo una D.O.600 entre 0,35 y 0,8. Se indujeron a continuación las células con IPTG 0,1 mM, y se redujo la temperatura a 34ºC. Se recolectaron muestras (1 ml) antes de la inducción (punto de tiempo cero) y se centrifugaron a 5000 x g. Se congeló el sobrenadante a -20ºC para el análisis LC/MS. Cuatro horas después de la inducción, se recolectó otra muestra de 1 ml y se centrifugó para separar el caldo del cultivo del sedimento celular. Se añadieron triptófano, piruvato sódico, 10 ampicilina y Tween tal como se describió anteriormente.

Se cultivaron las células durante 48 horas tras la inducción y se tomó otra muestra de 1 ml y se preparó como anteriormente. A las 48 horas, se añadió otra alícuota de triptófano y piruvato. El volumen del cultivo completo se centrifugó después de aproximadamente 70 horas de cultivo (después de la inducción), durante 20 minutos a 15 4ºC y 3500 rpm. Se decantó el sobrenadante y tanto el caldo de cultivo como las células se congelaron a -80ºC. Las fracciones de caldo de cultivo se filtraron y analizaron por LC/MS. Las alturas y las áreas de los picos [M+H]+ = 293 se controlaron como se describe en el Ejemplo 10. Se sustrajo el nivel de fondo del medio. Los datos se normalizaron también para el cultivo celular representando la altura del pico [M+H]+ = 293 dividido por la densidad óptica del cultivo a 600 nm. 20

Se produjeron niveles superiores de monatina cuando el piruvato, la ampicilina y Tween se añadieron 4 horas después de la inducción en lugar de en la inducción. Otros aditivos tales como PLP, fosfato adicional o MgCl2 adicional no aumentaron la producción de monatina. Los títulos mayores de monatina se obtuvieron cuando se utilizaba triptófano en lugar de indol-3-piruvato, y cuando se añadía triptófano después de la inducción en lugar de 25 en la inoculación, o en la inducción. Antes de la inducción y 4 horas después de la inducción (en el momento de la adición del sustrato), no existía por lo general ningún nivel detectable de monatina en el caldo de fermentación o en los extractos celulares. Se realizaron controles negativos utilizando células con vector pET30a solo, así como cultivos donde no se había añadido triptófano ni piruvato. Una ecografía por MS del original demostró que el compuesto con (m+1)/z = 293 no procedía de moléculas mayores, y las ecografías de los derivados realizadas 30 (como en el Ejemplo 10) fueron similares a la monatina preparada in vitro.

Se estudió el efecto de Tween utilizando concentraciones de 0, 0,2% (vol/vol) y 0,6% final de Tween-20. La mayor cantidad de monatina producida por los matraces oscilantes fue en Tween al 0,2%. La concentración de ampicilina varió entre 0 y 10 μg/ml. La cantidad de monatina en el caldo de cultivo celular aumentó rápidamente (2,5 35 veces) entre 0 y 1 μg/ml y aumentó 1,3 veces cuando la concentración de ampicilina aumentaba desde 1 hasta 10 μg/ml.

En la figura 10 se muestra un experimento a lo largo del tiempo que presenta resultados típicos. La cantidad de monatina segregada en el caldo de cultivo celular aumentó, aun cuando los valores están normalizados 40 para el crecimiento celular. Utilizando el coeficiente de extinción molar del triptófano la cantidad de monatina en el caldo de cultivo se estimó que era inferior a 10 μg/ml. El mismo experimento se repitió con las células que contenían el vector sin la inserción proA. Muchas de las cifras eran negativas, lo que se indica por la altura del pico a m/z = 293 que era inferior en estos cultivos que en el medio solo (figura 10). Las cifras eran habitualmente menores cuando faltaban el triptófano y el piruvato, lo que demuestra que la producción de monatina es un 45 resultado de una reacción enzimática catalizada por la enzima aldolasa.

La producción in vivo de monatina en las células bacterianas se repitió en experimentos en matraz oscilante de 800 ml y en fermentadores. Una muestra de 250 ml de monatina (en caldo de cultivo sin células) se purificó por cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía líquida de preparación en fase inversa. Esta 50 muestra se evaporó y se sometió a análisis de espectroscopia de masas de alta resolución (descrito en el Ejemplo 6). La MS de alta resolución indicó que el metabolito que se produce es la monatina.

Los ensayos in vitro indican que la aminotransferasa necesita estar presente a concentraciones más altas que la aldolasa (véase el Ejemplo 6), por consiguiente la aspartato aminotransferasa de E. coli se sobreexpresó en 55 combinación con el gen para aldolasa para aumentar la cantidad de monatina producida. Se diseñaron cebadores para introducir proA de C. testosteroni en un operón con aspC/pET30 Xa/LIC, de la manera siguiente: cebador 5’: ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT (SEC. ID. nº 67) y cebador en 3’: CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC (SEC. ID. nº 68). El cebador en 5’ contiene una secuencia BamHI, el cebador en 3’ contiene una secuencia SaII para clonación. Se realizó la RCP tal como se describe en el 60 Ejemplo 4, y se purificó en gel. El montaje aspC/pET30 Xa/LIC se digirió con BamHI y SaII dado que era el producto de la RCP. Se purificaron las enzimas utilizando una columna de centrifugación de Qiagen. El producto proA de la RCP se ligó al vector utilizando el kit de ligadura rápida de ADN de Roche (Indianapolis, IN) según las instrucciones del fabricante. Se hicieron transformaciones químicas utilizando Novablues Singles (Novagen) tal como se describe en el Ejemplo 1. Se cultivaron las colonias en medio LB que contenía 50 mg/l de kanamicina y se purificó el ADN 65 plásmido utilizando el kit spin mimiprep de Qiagen. Se cribaron los clones por análisis con enzimas de restricción y se confirmó la secuencia mediante Seqwright (Houston, TX). Se subclonaron los montajes en BLR(DE3),

BLR(DE3)pLysS, BL21(DE3) y BL21(DE3)pLysS (Novagen). El montaje proA/pET30 Xa/LIC se transformó también en BL21(DE3)pLysS.

Las comparaciones iniciales de las muestras del matraz oscilante BLR(DE3) en las condiciones normales descritas anteriormente, demostraron que la adición del segundo gen (aspC) mejoró la cantidad de monatina 5 producida en siete veces. Para activar el crecimiento, se utilizaron cepas hospedadoras procedentes de BL21(DE3). Los clones de proA y dos clones del operón del gen se indujeron en medio de Trp-1, los hospedadores pLysS tenían cloranfenicol (34 mg/l) añadido al medio también. Los experimentos en matraz en agitación se realizaron con y sin adición de Tween-20 al 0,2% y 1 mg/l de ampicilina. Se calculó la cantidad de monatina en el caldo de cultivo utilizando monatina in vitro purificada producida como patrón. Se realizaron análisis SRM tal como se describió en 10 el Ejemplo 10. Se tomaron muestras de células a las cero, 4 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas de cultivo.

Los resultados se presentan en la Tabla 5 para las cantidades máximas producidas en los caldos de cultivo. En la mayoría de los casos los dos montajes génicos proporcionaron valores mayores que el montaje de 15 proA solo. Las cepas de pLysS, que deberían tener envolturas celulares más permeables, tenían concentraciones mayores de monatina segregada, aun cuando estas cepas por lo general se desarrollan a velocidad más lenta. Las adiciones de Tween y ampicilina fueron beneficiosas.

Tabla 5: Cantidad de monatina producida por bacterias E. coli 20

Montaje

Hospedador Tween + Amp μg/ml de monatina Tiempo

proA

BL21(DE3) - 0,41 72 h

proA

BL21(DE3) + 1,58 48 h

proA

BL21(DE3)pLysS - 1,04 48 h

proA

BL21(DE3)pLysS + 1,60 48 h

aspC:proA

BL21(DE3) - 0,09 48 h

aspC:proA

BL21(DE3) + 0,58 48 h

aspC:proA

BL21(DE3)pLysS - 1,39 48 h

aspC:proA

BL21(DE3)pLysS + 6,68 48 h

EJEMPLO 12

Producción de monatina en levadura 25

Este ejemplo describe los procedimientos utilizados para producir monatina en células eucarióticas. Un experto en la materia apreciará que pueden utilizarse procedimientos similares para producir monatina en cualquier célula de interés. Además, pueden utilizarse otros genes (por ejemplo, los listados en la figura 2) además de, o alternativamente a los descritos en este ejemplo. 30

El pESC Yeast Epitope Tagging Vector System (Stratagene, La Jolla, CA) se utilizó para clonar y expresar los genes aspC de E. coli y proA de C. testosteroni en Saccharomyces cerevisiae. Los vectores pESC contienen los activadores tanto GAL1 como el GAL10 en cadenas opuestas, con dos secuencias de clonación múltiples distintas, que permiten la expresión de dos genes al mismo tiempo. El vector pESC-His contiene también el gen His3 para la 35 complementación de la auxotrofía de histidina en el hospedador (YPH500). Los activadores GAL1 y GAL10 son reprimidos por la glucosa e inducidos por la galactosa; se utiliza una secuencia Kozak para la expresión óptima en la levadura. Los plásmidos pESC son vectores lanzadera, que permiten que se haga el montaje inicial en E. coli (con el gen bla para selección); sin embargo, ninguna de las secuencias de fijación del ribosoma bacteriano están presentes en las múltiples secuencias de clonación. 40

Se diseñaron los cebadores siguientes para la clonación en pESC-His (las secuencias de restricción están subrayadas, la secuencia Kozak está en negrita): aspC (BamHI/SalI), GAL1: 5’-CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3’ (SEC ID nº: 69) y 5’-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3’ (SEC ID nº: 70). proA (EcoRI/NotI), GAL10: 45 5’-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3’ (SEC ID nº: 71) y 5’-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3’ (SEC ID nº: 72).

El segundo codón para ambas proteínas maduras se cambió desde un aminoácido aromático a la valina debido a la introducción de la secuencia Kozak. Los genes de interés se ampliaron utilizando ADN pET30 Xa/LIC 50 miniprep procedente de los clones descritos en los Ejemplos 1 y el Ejemplo 4 como plantilla. Se llevó a cabo la RCP utilizando el termociclador de gradiente del ciclador Eppendorf Master y el protocolo siguiente para una reacción de 50 μl: 1,0 μl de plantilla, 1,0 μM de cada cebador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Expand High Fidelity Polymerase (Roche, Indianapolis, IN) y 1 x tampón ExpandTM con Mg. El programa del termociclador utilizado consistía en un arranque en caliente a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 29 repeticiones en las etapas siguientes: 94ºC durante 55 30 segundos, 50ºC durante 1 minuto 45 segundos y 72ºC durante 2 minutos 15 segundos. Después de las 29 repeticiones se mantuvo la muestra a 72ºC durante 10 minutos y a continuación sea almacenó a 4ºC. Se purificaron

los productos de la RCP por separación en un gel de TAE-agarosa al 1% seguido de recuperación utilizando un kit de extracción en gel QIA quick (Qiagen, Valencia, CA).

El ADN del vector pESC-His (2,7 μg) se digirió con BamHI/SalI y se purificó en gel como anteriormente. El producto aspC de la RCP se digirió con BamHi/SalI y se purificó con una columna de purificación por RCP de 5 QIAquick. Se realizaron ligaduras con el kit de ligadura rápida de ADN de Roche siguiendo los protocolos del fabricante. Se electroporaron las ligaduras desaladas en 40 μl de células competentes DH10B de Electromax (Invitrogen) en una cubeta disponible BioRad de 0,2 cm utilizando un Gene Pulser II de BioRad con controlador de pulsaciones plus, según las instrucciones del fabricante. Después de 1 hora de recuperación en 1 ml de medio SOC, los transformados se colocaron en placas en medio LB que contenía 100 μg/ml de ampicilina. Las 10 preparaciones del ADN plásmido para los clones se realizaron utilizando los kit Spin Miniprep de QIAprep. El ADN plásmido se identificó mediante enzimas de restricción, y se secuenció (Seqwright) para verificación utilizando los cebadores diseñados para el vector.

El clon aspC/pESC-His se digirió con EcoRI y NotI, ya que era el producto proA de la RCP. El ADN se 15 purificó como anteriormente y se ligó como anteriormente. Los dos montajes génicos se transformaron en células DH10B y se cribaron mediante enzimas de restricción y secuenciado de ADN.

El montaje se transformó en la cepa YPH500 de S. cerevisiae utilizando el kit S.c. EasyCompTM Transformation (Invitrogen). Las reacciones de transformación se colocaron en medio mínimo SC-His (Manual de 20 pYES2 de Invitrogen) que contenía glucosa al 2%. En cada una de las colonias de levadura se identificó la presencia de los genes proA y aspC por RCP de las colonias utilizando los cebadores de RCP anteriores. Las células sedimentadas (2 μl) se pusieron suspensión en 20 μl de tampón Y-Lysis (Zymo Research) que contenía 1 μl de zimolasa y se calentó a 37ºC durante 10 minutos. Se utilizaron a continuación 4 μl de esta suspensión en una reacción RCP de 50 μl utilizando la mezcla de reacción RCP y el programa descrito anteriormente. 25

Se cultivaron durante la noche cultivos de cinco ml en SC-His + glucosa a 30ºC y 225 rpm. Se ajustaron las células gradualmente al cultivo en rafinosa con objeto de minimizar el periodo de inactividad antes de la inducción con galactosa. Después de aproximadamente 12 horas de cultivo, se tomaron mediciones de absorbancia a 600 nm, y se sedimentó un volumen de células apropiado y se volvió a poner en suspensión para dar una D.O. de 30 0,4 en el medio SC-His reciente. Se utilizaron las siguientes fuentes de carbono sucesivamente: rafinosa al 1% + glucosa al 1%, glucosa al 0,5% + rafinosa al 1,5%, rafinosa al 2% y por último rafinosa al 1% + galactosa al 2% para la inducción.

Después de aproximadamente 16 horas de cultivo en el medio de inducción, los cultivos de 50 ml se 35 dividieron en cultivos de 25 ml por duplicado, y se añadió lo siguiente a solamente uno de los duplicados: (concentraciones finales) 1 g/l de L-triptófano, fosfato sódico 5 mM pH 7,1, 1 g/l de piruvato sódico, MgCl2 1 mM. Se conservaron como referencias negativas las muestras de los caldos de cultivo y de los sedimentos celulares procedentes del medio sin inducción, y de los cultivos de 16 horas antes de la adición de sustratos para la serie de reacciones de monatina. Además, los montajes que contienen un gen aspC funcional, (y un gen proA truncado) se 40 utilizaron como otra referencia negativa. Se dejaron cultivar las células durante un total de 69 horas después de la inducción. Ocasionalmente las células de levadura se indujeron a una D.O. inferior, y solamente se cultivaron durante 4 horas antes de la adición de triptófano y piruvato. Sin embargo, los sustratos de monatina parecen inhibir el crecimiento y la adición a D.O. mayor fue más eficaz.

45

Los sedimentos celulares procedentes de los cultivos se lisaron con 5 ml de YeastBusterTM más 50 μl THP(Novagen) por gramo (de peso húmedo) de las células siguiendo los protocolos del fabricante, con adición de inhibidores de plaza y benzonasa nucleasa como se describe en los ejemplos anteriores. El caldo de cultivo y los extractos celulares se filtraron y analizaron por SRM se tal como se describe en el Ejemplo 10. Utilizando este procedimiento, no se detectó monatina en ambas muestras, lo que indica que las células podrían no segregar 50 monatina en estas condiciones. La fuerza protónica del motivo puede ser insuficiente en estas condiciones o los transportadores de aminoácidos generales pueden saturarse con triptófano. La expresión de la proteína no estaba a un nivel que permita la detección de cambios utilizando SDS-PAGE.

La monatina fue detectable (aproximadamente 60 μg/ml) temporalmente en extractos celulares del cultivo 55 con dos genes funcionales, cuando se agregaron triptófano y piruvato al medio. No se detectó monatina en ninguno de los extractos celulares con referencia negativa. Los ensayos in vitro para monatina se realizaron por duplicado con 4,4 mg/ml de proteína completa (aproximadamente el doble de lo que se utiliza por lo general para los extractos celulares de E. coli) utilizando el ensayo optimizado descrito en el Ejemplo 6. Se realizaron otros ensayos con adición de 32 μg/ml de ProA aldolasa de C. testosteroni o 400 μg/ml de AspC aminotransferasa, para determinar 60 qué enzima era limitativa en el extracto celular. Se realizaron controles negativos sin adición de enzima, o con adición de solamente AspC aminotransferasa (la condensación aldólica puede ocurrir en alguna medida sin enzima). Se realizaron controles positivos con enzimas parcialmente puras (30 a 40%), utilizando 16 μg/ml y 400 μg/ml de aminotransferasa.

65

Se analizaron los resultados in vitro por SRM. Los análisis de los extractos celulares demostraron que el triptófano se transportaba eficazmente en las células cuando se añadía al medio después de la inducción, dando

como resultado concentraciones de triptófano de dos órdenes de magnitud mayores que aquellas a las que no se añadió triptófano adicional. Los resultados de los análisis de monatina in vitro se presentan en la Tabla 6 (las cifras están indicadas en ng/ml).

Tabla 6: Producción de monatina con extractos de células de levadura 5

Montaje aspC + aldolasa + AspC Montaje de dos genes + aldolasa + AspC

Reprimido (medio de glucosa)

0 888,3 173,5 0 465,2 829

Inducido (24 h)

0 2832,8 642,4 0 1375,6 9146,6

Inducido (69 h)

0 4937,3 340,3 71,9 1652,8 23693,5

69 h + sus.

0 556,9 659,1 21,9 755,6 16688,2

+ referencia (enzimas purificadas

21853 21853

Control sin enzimas

0 254,3 0 254,3

Se obtuvieron resultados positivos con los extractos celulares de dos genes completos con y sin sustrato añadido de medio de cultivo. Estos resultados, en comparación con las referencias positivas, indican que las enzimas se expresaron a concentraciones próximas al 1% de la proteína total en levadura. La cantidad de monatina 10 producida cuando el extracto celular del montaje aspC (con ProA truncado) se ensayó con aldolasa era significativamente mayor que cuando los extractos se ensayaban solos, e indica que la AspC aminotransferasa recombinante comprende aproximadamente del 1 al 2% de la proteína total de la levadura. Los extractos celulares de cultivos no inducidos tenían una cantidad mayor de actividad cuando se ensayaban con aldolasa debido a la presencia de aminotransferasas naturales en las células. Cuando se ensaya con AspC aminotransferasa, la 15 actividad de los extractos de las células no inducidas aumentó hasta la cantidad de monatina producida por la referencia negativa AspC (aprox. 200 ng/ml). En cambio, la actividad observada cuando se ensaya el extracto celular del montaje de dos genes aumenta más cuando la aminotransferasa está enriquecida que cuando se añade la aldolasa. Ya que ambos genes deberían expresarse al mismo nivel, esto indica que la cantidad de monatina producida se maximiza cuando la concentración de aminotransferasa es mayor que la de aldolasa, de acuerdo con 20 los resultados mostrados en el Ejemplo 6.

La adición de piruvato y triptófano no solamente inhibe el crecimiento celular, sino que aparentemente inhibe la expresión de la proteína también. La adición del plásmido pESC-Trp puede utilizarse para corregir la auxotrofía del triptófano de las células hospedadoras YPH500, para proporcionar un medio de suministrar triptófano 25 con efectos menores sobre el crecimiento, la expresión y la secreción.

EJEMPLO 13

Mejora de los procesos enzimáticos utilizando reacciones acopladas 30

En teoría, si no se producen reacciones secundarias o degradación de sustratos o productos intermedios, la cantidad máxima de producto formada a partir de la reacción enzimática ilustrada en la figura 1 es directamente proporcional a las constantes de equilibrio de cada reacción, y las concentraciones de triptófano y piruvato. El triptófano no es un sustrato muy soluble, y las concentraciones de piruvato mayores de 200 mM parecen tener un 35 efecto negativo en el rendimiento (véase el Ejemplo 6).

Lo ideal es que la concentración de monatina esté maximizada con respecto a los sustratos, con objeto de disminuir el coste de separación. Las separaciones físicas pueden realizarse de modo que la monatina se retire de la mezcla de reacción, evitando que ocurran reacciones inversas. Las materias primas y los catalizadores pueden 40 regenerase a continuación. Debido a la similitud de tamaño, carga e hidrofobia de la monatina para varios de los reactivos y compuestos intermedios, las separaciones físicas serán difíciles a menos que exista una gran cantidad de afinidad por la monatina (tal como una técnica de cromatografía por afinidad). Sin embargo, las reacciones de monatina pueden acoplarse a otras reacciones de modo que el equilibrio del sistema se desplace hacia la producción de monatina. Los siguientes son ejemplos de procedimientos para mejorar el rendimiento de monatina 45 obtenida a partir de triptófano o indol-3-piruvato.

Reacciones acopladas que utilizan oxaloacetato descarboxilasa (CE 4.1.1.3)

La figura 11 es una ilustración de la reacción. La triptófano oxidasa y la catalasa se utilizan para conducir la 50 reacción en la dirección de la producción de indol-3-piruvato. La catalasa se utiliza en exceso de modo que el peróxido de hidrógeno no está disponible para reaccionar en la dirección inversa o para dañar las enzimas o compuestos intermedios. El oxígeno se regenera durante la reacción con catalasa. Alternativamente, puede utilizarse como sustrato indol-3-piruvato.

55

El aspartato se utiliza como donante de amino para la aminación de PM, y se utiliza una aspartato

aminotransferasa. Lo ideal es que se utilice una aminotransferasa que tiene una baja especificidad por la reacción de triptófano/indol-3-piruvato en comparación con la PM para la reacción de monatina de modo que el aspartato no se utiliza para reaminar el indol-3-piruvato. La oxaloacetato descarboxilasa (procedente de Pseudomonas sp.) puede añadirse para convertir el oxaloacetato en piruvato y dióxido de carbono. Ya que el CO2 es volátil, no está disponible para la reacción con las enzimas, disminuyendo o incluso evitando las reacciones inversas. El piruvato 5 producido en esta etapa puede utilizarse también en la reacción de condensación aldólica. Otras enzimas de descarboxilasa pueden utilizarse, y se conocen homólogos que existen en Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Azotobacter vinelandii, Bacteroides fragilis, varias especies de Bordetella, Campylobacter jejuni, Chlorobium tepidum, Chloroflexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Magnetococcus MC-1, Mannheimia haemolytica, 10 Methylobacillus flagellatus KT, Pasteurella multocida Pm70, Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingivalis, varias especies de Pseudomonas, varias especies de Pyrococcus, Rhodococcus, varias especies de Salmonella, varias especies de Streptococcus, Thermochromatium tepidum, Thermotoga maritima, Treponema pallidum y varias especies de Vibrio.

15

Se realizaron ensayos con triptófano aminotransferasa con la aspartato aminotransferasa (AspC) de E. coli, la tirosina aminotransferasa (TyrB) de E. coli, la aminotransferasa de amplio sustrato (BSAT) de L. major, y las dos glutamato-oxaloacetato aminotransferasas porcinas disponibles en el mercado como se describe en el Ejemplo 1. Tanto el oxaloacetato como el alfa-cetoglutarato se probaron como receptor de amino. Se comparó la relación de actividad utilizando monatina (Ejemplo 7) frente a la actividad utilizando triptófano, para determinar que enzima 20 tenía la mayor especificidad para la reacción de monatina aminotransferasa. Estos resultados indican que la enzima con mayor especificidad para la reacción de monatina frente a la reacción de triptófano es la glutamato-oxaloacetato aminotransferasa tipo II-A porcina, GOAT (Sigma G7005). Esta especificidad era independiente de la que se utilizó con el receptor de amino. Por consiguiente, esta enzima se utilizó en las reacciones acopladas con oxaloacetato descarboxilasa. 25

Una reacción típica que parte del indol-3-piruvato incluía (concentraciones finales) Tris-Cl 50 mM pH 7,3, indol-3-piruvato 6 mM, piruvato sódico 6 mM, aspartato 6 mM, PLP 0,05 mM, fosfato potásico 3 mM, MgCl2 3 mM, 25 μg/ml de aminotransferasa, 50 μg/ml de ProA aldolasa de C. testosteroni y 3 Unidades/ml de descarboxilasa (Sigma O4878). Se dejaron proceder las reacciones durante 1 hora a 26ºC. En algunos casos se omitió la 30 descarboxilasa o se sustituyó el aspartato con alfa-cetoglutarato (como referencias negativas). Las enzimas aminotransferasas descritas anteriormente se probaron también en lugar de la GOAT para confirmar los experimentos de especificidad iniciales. Se filtraron las muestras y se analizaron por LC/MS como se describe en el Ejemplo 10. Los resultados demuestran que la enzima GOAT produjo la mayor cantidad de monatina por mg de proteína con la mínima cantidad de triptófano producido como subproducto, además, había un beneficio de 2 a 3 35 veces del que tiene la enzima descarboxilasa añadida. La enzima AspC de E. coli produjo grandes cantidades de monatina en comparación con otras aminotransferasas.

La producción de monatina aumentó por: 1) agregar periódicamente adiciones 2 mM de indol piruvato, piruvato y aspartato (cada media hora a hora), 2) llevar a cabo las reacciones en un medio anaeróbico o con 40 tampones desgasificados, 3) dejar que procedan las reacciones durante la noche y 4) utilizar descarboxilasa recién preparada que no haya sido congelada y descongelada muchas veces. La descarboxilasa fue inhibida por concentraciones de piruvato superiores a 12 mM. A concentraciones de indol-3-piruvato superiores a 4 mM, las reacciones secundarias con indol-3-piruvato se aceleraron. La cantidad de indol-3-piruvato utilizada en la reacción pudo aumentarse si la cantidad de aldolasa aumentaba también. Se encontraron grandes concentraciones de 45 fosfato (50 mM) y aspartato (50 mM) que eran inhibidoras para la enzima descarboxilasa. La cantidad de enzima descarboxilasa añadida pudo reducirse hasta 0,5 U/ml sin disminuir la producción de monatina en una reacción de una hora. La cantidad de monatina producida aumentaba cuando la temperatura aumentaba desde 26ºC hasta 30ºC y desde 30ºC hasta 37ºC; sin embargo, a 37ºC las reacciones secundarias del indol-3-piruvato se aceleraron también. La cantidad de monatina producida aumentó al aumentar el pH desde 7 a 7,3 y era relativamente estable 50 desde pH 7,3 a 8,3.

Una reacción típica que parte de triptófano incluía (concentraciones finales) Tris-Cl 50 mM pH 7,3, triptófano 20 mM, aspartato 6 mM, piruvato sódico 6 mM, PLP 0,05 mM, fosfato potásico 3 mM, MgCl2 3 mM, 25 μg/ml de aminotransferasa, 50 μg/ml de ProA aldolasa de C. testosteroni y 4 unidades/ml de descarboxilasa, 5 a 55 200 mU/ml de L-aminoácido oxidasa (Sigma A-2805), 168 U/ml de catalasa (Sigma C-3515) y 0,008 mg de FAD. Las reacciones se llevaron a cabo durante 30 minutos a 30ºC. Se observó mejoría con la adición de descarboxilasa. La cantidad mayor de monatina se produjo cuando se utilizaron 50 mU/ml de oxidasa. Las mejoras fueron similares a las observadas cuando se utilizó como sustrato indol-3-piruvato. Además, la cantidad de monatina producida aumentó cuando 1) la concentración de triptófano era baja (es decir, inferior a la Km de la enzima aminotransferasa 60 y por consiguiente incapaz de competir con PM en la zona activa) y 2) la relación de oxidasa a aldolasa y aminotransferasa se mantuvo a una concentración tal que el indol-3-piruvato no se pudo acumular.

Ya sea partiendo de indol-3-piruvato o de triptófano, la cantidad de monatina producida en los ensayos con periodos de incubación de 1 a 2 horas aumentó cuando se utilizaban 2 a 4 veces las cantidades de todas las 65 enzimas a la vez que se mantenían la misma relación enzimática. Utilizando uno de los dos sustratos, se consiguieron concentraciones de aproximadamente 1 mg/ml de monatina. La cantidad de triptófano producido si se

parte de indol-piruvato fue por lo general inferior al 20% de la cantidad de producto, lo que demuestra la utilidad de utilizar reacciones acopladas. Con más optimización y control de las concentraciones de los productos intermedios y de las reacciones secundarias, la productividad y el rendimiento pueden mejorarse en gran medida.

Reacciones acopladas que utilizan lisina épsilon aminotransferasa (CE 2.6.1.36) 5

La lisina epsilon aminotransferasa (L-lisina-6-transaminasa) se encuentra en varios organismos, incluyendo Rhodococcus, Mycobacterium, Streptomyces, Nocardia, Flavobacterium, Candida utilis y Streptomyces. Es utilizada por organismos como primera etapa en la producción de algunos antibióticos de beta-lactama (Rius y Demain, J. Microbiol. Biotech., 7:95-100, 1997). Esta enzima convierte la lisina en L-2-aminoadipato 6-semialdehído (alisina) 10 por una transaminación mediada por PLP del C-6 de la lisina, utilizando alfa-cetoglutarato como receptor de amino. La lisina es inestable y espontáneamente experimenta una deshidratación intramolecular para formar 1-piperideína 6-carboxilato, molécula cíclica. Esta inhibe con eficacia cualquier reacción inversa que ocurra. El esquema de reacción se representa en la figura 12. Puede utilizarse también una enzima alternativa, lisina-piruvato 6-transaminasa (CE 2.6.1.71). 15

Una reacción típica contenía en 1 ml: Tris-Cl 50 mM pH 7,3, indol-3-piruvato 20 mM, PLP 0,05 mM, fosfato potásico 6 mM, pH 8, piruvato sódico 2 a 50 mM, MgCl2 1,5 mM, lisina 50 mM, 100 μg de aminotransferasa (lisina épsilon aminotransferasa LAT-101, BioCatalytics Pasadena, CA) y 2000 μg de ProA aldolasa de C. testosteroni. La cantidad de monatina producida aumentó al aumentar las concentraciones de piruvato. La cantidad máxima 20 utilizando estas condiciones de reacción (a piruvato 50 mM) fue 10 veces menos que la que se observó con reacciones acopladas que utilizan oxaloacetato descarboxilasa (aproximadamente 0,1 mg/ml).

Un pico con [M+H]+ = 293 eluyó en el tiempo esperado para monatina y el espectro de masas contenía varios de los mismos fragmentos observados con otros procesos enzimáticos. Un segundo pico con la relación 25 masa a carga (293) correcta eluyó ligeramente antes de que lo que se observa por lo general para la S,S monatina producida en el Ejemplo 6, y puede indicar la presencia de otro isómero de monatina. Esta enzima produjo muy poco triptófano. Sin embargo, existe probablemente alguna actividad sobre el piruvato (que produce alanina como subproducto). Además, se conoce que la enzima es inestable. Pueden introducirse mejoras realizando experimentos de evolución dirigida para aumentar la estabilidad, reducir la actividad con piruvato y aumenta la 30 actividad con PM. Estas reacciones pueden acoplarse también a L-aminoácido oxidasa/catalasa como se describió anteriormente.

Otras reacciones acopladas

35

Otra reacción de acoplamiento que puede mejorar el rendimiento de monatina a partir del triptófano o del indol-piruvato, se muestra en la figura 13. La formiato deshidrogenasa (CE 1.2.1.2 o 1.2.1.43) es una enzima frecuente. Algunas formiato deshidrogenasas requieren NADH mientras que otras pueden utilizar NADPH. La glutamato deshidrogenasa catalizó la interconversión entre el precursor de monatina y monatina en los ejemplos anteriores, utilizando tampones a base de amonio. La presencia del formiato amónico y de la formiato 40 deshidrogenasa es un sistema eficaz para la regeneración de cofactores, y la producción de dióxido de carbono es una manera eficaz de aumentar la velocidad de las reacciones inversas (Bommarius et al., Biocatalysis, 10:37, 1994 y Galkin et al., Appl. Environ. Microbiol., 63:4651-6, 1997). Además, pueden disolverse grandes cantidades de formiato amónico en el tampón de reacción. El rendimiento de monatina producida por las reacciones con glutamato deshidrogenasa (o aminaciones reductoras similares) puede mejorarse por adición de formiato deshidrogenasa y 45 formiato amónico.

Pueden utilizarse otros procedimientos para conducir el equilibrio hacia la producción de monatina. Por ejemplo, si se utiliza aminopropano como donante de aminoácidos en la conversión de PM a monatina con una omega-aminoácido aminotransferasa (CE 2.6.1.18) tal como las descritas por las patentes US nº 5.360.724 y nº 50 5.300.437, uno de los productos resultantes sería acetona, un producto más volátil que el sustrato amino-propano. La temperatura puede elevarse periódicamente durante periodos cortos para emitir la acetona, aliviando de este modo el equilibrio. La acetona tiene un punto de ebullición de 47ºC, una temperatura improbable para degradar los compuestos intermedios si se utiliza durante breves periodos. La mayoría de las aminotransferasas que tiene actividad sobre la alfa-cetoglutarato también tienen actividad sobre el precursor de monatina. Asimismo, si se utiliza 55 un glioxilato/acidoaromatico aminotransferasa (CE 2.6.1.60) con glicina como donante de amino, se produce glioxalato que es relativamente estable y tiene un punto de ebullición muy reducido en comparación con la glicina.

EJEMPLO 14

60

Expresión recombinante

Con secuencias de ADNc enzimático y de aminoácidos disponibles al público, y las enzimas y secuencias dadas a conocer en la presente memoria, tal como las SEC. ID. nº 11 y nº 12, así como las variantes, polimorfismos, mutantes, fragmentos y fusiones de los mismos, se permite la expresión y purificación de cualquier 65 proteína, tal como una enzima, mediante técnicas de laboratorio habituales. Un experto en la materia apreciará que

las enzimas y fragmentos de las mismas pueden producirse de manera recombinante en cualquier célula u organismo de interés, y purificarse antes de su utilización, por ejemplo antes de la producción de la SEC. ID. nº 2 y derivados de las mismas.

Los procedimientos para producir proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica. Por 5 consiguiente, el alcance de la presente invención incluye la expresión recombinante de cualquier proteína o fragmento de la misma, tal como una enzima. Por ejemplo, véase la patente US nº 5.342.764 de Johnson et al., la patente US nº 5.846.819 de Pausch et al., la patente US nº 5.876.969 de Fleer et al. y Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York., 1989, Cap. 17).

10

En resumen, las secuencias de ADNc parcial, completo o variante, que codifican una proteína o péptido, pueden estar ligadas en un vector de expresión, tal como un vector de expresión bacteriano o eucariótico. Pueden producirse proteínas y/o péptidos colocando un activador corriente arriba de la secuencia de ADNc. Los ejemplos de activadores comprenden de manera no limitativa lac, trp, tac, trc, regiones principales del operador y del activador del fago lambda, la región de control de la proteína de la capa fd, los activadores precoz y tardío de SV40, 15 los activadores procedentes de polioma, adenovirus, retrovirus, baculovirus y virus de simio, el activador para la 3-fosfoglicerato cinasa, los activadores de la levadura ácida fosfatasa, el activador de los factores emparejadores de la levadura alfa y combinaciones de los mismos.

Los vectores adecuados para la producción de proteínas naturales intactas incluyen pKC30 (Shimatake y 20 Rosenberg, 1981, Nature 292:128), pKK177-3 (Amann y Brosius, 1985, Gene 40:183) y pET-3 (Studier y Moffatt, 1986, J. Mol. Biol., 189:113). Una secuencia de ADN puede transferirse a otros vehículos de clonación, tales como otros plásmidos, bacteriófagos, cósmidos, virus animales y cromosomas artificiales de levadura (YAC) (Burke et al., 1987, Science, 236:806-12). Estos vectores pueden introducirse en una variedad de hospedadores incluyendo las células somáticas, y organismos sencillos o complejos, tales como bacterias, hongos (Timberlake y Marshall, 1989, 25 Science, 244:1313-7), invertebrados, plantas (Gasser y Fraley, 1989, Science, 244:1293) y mamíferos (Pursel et al., 1989, Science, 244:1281-8), que resultan transgénicos mediante la introducción del ADNc heterólogo.

Para la expresión en células de mamífero, una secuencia de ADNc puede ligarse a activadores heterólogos, tales como el virus SV40 de simio, activador en el vector pSV2 (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. 30 Acad. Sci. USA., 78:2072-6) e introducirse en las células, tal como las células COS-1 (Gluzman, 1981, Cell, 23:175-82), para conseguir la expresión temporal o duradera. La integración estable del montaje génico híbrido puede mantenerse en células de mamífero por selección bioquímica, tal como neomicina (Southern y Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet., 1:327-41) y ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78:2072-6).

35

La transferencia de ADN en células eucarióticas, tales como las del hombre o de otros mamíferos, es una técnica convencional. Los vectores se introducen en las células efectoras como ADN puro (transfección), por ejemplo por precipitación con fosfato cálcico (Graham y Vander Eb., 1973, Virology, 52:466), fosfato de estroncio (Brash et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:2013), electroporación (Neumann et al., 1982, EMBO J., 1:841), lipofección (Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:7413), DEAE dextrano (McCuthan et al., 1968, J. Natl. Cancer 40 Inst., 41:351), microinyección (Mueller et al., 1978, Cell., 15:579), fusión del protoplasto (Schafner, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77:2163-7) o escopetas de perdigones (Klein et al., 1987, Nature 327:70). Alternativamente, el ADNc puede introducirse por infección con vectores víricos, por ejemplo retrovirus (Bernstein et al., 1985, Gen Engrg., 7:235) tales como adenovirus (Ahmad et al., 1986, J. Virol., 57:267) o Herpes (Spaete et al., 1982, Cell., 30:295). 45

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Cargill, Incorporated

50

<120> Polipéptidos y rutas biosintéticas

<130> 6682-64349

<150> 60/374.831 55

<151> 2002-04-23

<160> 74

<170> PatentIn versión 3.1 60

<210> 1

<211> 1170

<212> ADN

<213> Sinorhizobium meliloti 65

<400> 1

5

<210> 2

<211> 389

<212> PRT

<213> Sinorhizobium meliloti 10

<400> 2

<210> 3

<211> 1260

<212> ADN

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 3

<210> 4 5

<211> 419

<212> PRT

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 4 10

<210> 5

<211> 1260

<212> ADN

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 5

<210> 6 5

<211> 419

<212> PRT

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 6 10

<210> 7

<211> 1239

<212> ADN

<213> Leishmania major

<400> 7

<210> 8 5

<211> 412

<212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 8 10

<210> 9

<211> 1182

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 9 5

<210> 10 10

<211> 393

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 10 15

<210> 11 5

<211> 1176

<212> ADN

<213> Lactobacillus amylovorus

<400> 11 10

<210> 12 5

<211> 391

<212> PRT

<213> Lactobacillus amylovorus

<400> 12 10

<210> 13 5

<211> 1413

<212> ADN

<213> R. sphaeroides

<400> 13 10

<210> 14

<211> 470

<212> PRT

<213> R. sphaeroides

<400> 14

<210> 15

<211> 35

<212> ADN 5

<213> Secuencia artificial

<220>

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10

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<211> 37

<212> ADN

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<212> ADN

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10

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<211> 35

<212> ADN

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<212> ADN

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<212> ADN

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

55

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<400> 22

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<212> ADN 65

<213> Secuencia artificial

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<211> 37

<212> ADN 10

<213> Secuencia artificial

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15

<400> 24

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<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25

<223> cebador

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<212> ADN

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<223> cebador

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

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<400> 27

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55

<210> 28

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

60

<220>

<223> cebador

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<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

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<223> cebador

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<211> 37

<212> ADN 15

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

20

<400> 30

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<210> 31 25

<211> 1194

<212> ADN

<213> E. coli

<400> 31 30

imagen1

<210> 32 35

<211> 397

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 32

<210> 33

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 33 35

5

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<210> 34

<211> 37

<212> ADN 10

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

15

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25

<223> cebador

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<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35

<220>

<223> cebador

<400> 36 40

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<210> 37

<211> 35 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 50

<400> 37

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55

<210> 38

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

60

<220>

<223> cebador

<400> 38

65

agaggagagt tagagcctta cagcttagcg ccttcta 37

<210> 39

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> cebador

<400> 39

10

ggtattgagg gtcgcatgcg aggggcatta ttcaa 35

<210> 40

<211> 36

<212> ADN 15

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

20

<400> 40

agaggagagt tagagcctca gcccttgagc gcgaag 36

<210> 41 25

<211> 1416

<212> ADN

<213> E. coli

<400> 41 30

<210> 42

<211> 1371

<212> ADN 5

<213> Citrobacter freundii

<400> 42

<210> 43

<211> 35

<212> ADN 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

10

<400> 43

ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct 35

<210> 44 15

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> cebador

<400> 44

agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg 37 25

<210> 45

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 30

<220>

<223> cebador

<400> 45 35

ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc 35

<210> 46

<211> 37 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 10

<400> 46

agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg 37

15

<210> 47

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> cebador

<400> 47

25

ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t 31

<210> 48

<211> 30

<212> ADN 30

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

35

<400> 48

tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt 30

<210> 49 40

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 45

<223> cebador

<400> 49

tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt 32 50

<210> 50

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 55

<220>

<223> cebador

<400> 50 60

ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca 30

<210> 51

<211> 29 65

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 51 5

aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg 29

<210> 52

<211> 32 10

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 15

<400> 52

tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at 32

20

<210> 53

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25

<220>

<223> cebador

<400> 53

30

gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat 29

<210> 54

<211> 29

<212> ADN 35

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

40

<400> 54

gtagacgcgg actaactctt tggcagaag 29

<210> 55 45

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 50

<223> cebador

<400> 55

ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt 35 55

<210> 56

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 60

<220>

<223> cebador

<400> 56 65

agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc 37

<210> 57

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> cebador

<400> 57 10

ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca 35

<210> 58

<211> 37 15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 20

<400> 58

agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca 37

25

<210> 59

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> cebador

<400> 59

35

ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg 35

<210> 60

<211> 37

<212> ADN 40

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

45

<400> 60

agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca 37

<210> 61 50

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 55

<223> cebador

<400> 61

ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa 35 60

<210> 62

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 65

<220>

<223> cebador

<400> 62

agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc 37 5

<210> 63

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> cebador

<400> 63 15

ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa 35

<210> 64

<211> 37 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 25

<400> 64

agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga 37

30

<210> 65

<211> 684

<212> ADN

<213> C. testosteroni

35

<400> 65

<210> 66 40

<211> 227

<212> PRT

<213> C. testosteroni

<400> 66 45

<210> 67

<211> 42 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 10

<400> 67

actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct 42

15

<210> 68

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> cebador

<400> 68

cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc 33

5

<210> 69

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<223> cebador

<400> 69

15

cgcggatcca taatggttga gaacattacc g 31

<210> 70

<211> 30

<212> ADN 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

25

<400> 70

acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg 30

<210> 71 30

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35

<223> cebador

<400> 71

ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt 32 40

<210> 72

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 45

<220>

<223> cebador

<400> 72 50

gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc 33

<210> 73

<211> 15 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 60

<400> 73

ggtattgagg gtcgc 15

<210> 74 65

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 5

<400> 74

agaggagagt tagagcc 17

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES
2. 1. Procedimiento de producción de monatina, que comprende convertir el triptófano y/o el ácido indol-3-láctico en monatina, en el que el procedimiento comprende:

   (a) poner en contacto el triptófano o el ácido indol-3-láctico con un primer polipéptido, en el que, cuando el 5 triptófano está en contacto con el primer polipéptido, el primer polipéptido se selecciona de entre triptófano aminotransferasa (CE 2.6.1.27), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), tirosina aminotransferasa (aromática) (CE 2.6.1.5), triptofan-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), triptófano oxidasa, L-aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.2), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1), D-aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.3), D-10 triptófano aminotransferasa, D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21), glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20), o una combinación de las mismas, en el que, cuando el ácido indol-3-láctico se pone en contacto con el primer polipéptido, el primer polipéptido se selecciona de entre indol-lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.110), R-4 hidroxifenil-lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato reductasa (CE 1.1.1.237), lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.27, 15 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) lactato deshidrogenasa (CE 1.1.1.111), y lactato oxidasa (CE 1.1.3.-), o una combinación de las mismas, en el que el primer polipéptido convierte el triptófano o el ácido indol-3-láctico en indol-3-piruvato;

   (b) poner en contacto el indol-3-piruvato con un segundo polipéptido y una fuente de carbono C3, en el que el 20 segundo polipéptido es una enzima CE 4.1.2 o CE 4.1.3., en el que el segundo polipéptido convierte el indol-3-piruvato y la fuente de carbono C3 en 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico; y

   (c) poner en contacto el 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico con un tercer polipéptido, en el que el tercer polipéptido se selecciona de entre tirosina aminotransferasa (aromática) (CE 2.6.1.5), triptófano 25 deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), triptófano aminotransferasa (CE 2.6.1.27), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21), D-triptófano aminotransferasa, glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1), una lisina épsilon aminotransferasa, o una combinación de las mismas, en 30 el que el tercer polipéptido convierte el 2-hidroxiácido 2-(indol-3ilmetil)-4-cetoglutárico en monatina.
3. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que, cuando el primer polipéptido que convierte el triptófano en indol-3-piruvato es una aminoácido oxidasa (CE 1.4.3.-), se utiliza además una catalasa (CE 1.11.1.6).

   35
4. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la aminoácido oxidasa es una triptófano oxidasa.
5. 4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la enzima CE 4.1.3 es la 4-hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato-liasa (CE 4.1.3.16), la 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato-liasa (CE 4.1.3.17) o una combinación de las mismas. 40
6. 5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el segundo polipéptido es una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

   (a) SEC. ID. nº 66, nº de registro en Genbank: CAC46344, nº de registro en Genbank: CAB 14127.1, nº de 45 registro en Genbank: AAC74920.1 o nº de registro en Genbank: CAC47463.1;

   (b) una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 90% de identidad de la secuencia con la SEC. ID. nº 66, nº de registro en Genbank: CAC46344, nº de registro en Genbank: CAB14127.1, nº de registro en Genbank: AAC74920.1 o nº de registro en Genbank: CAC47463.1; y 50

   (c) secuencias de aminoácidos que se diferencian de la SEC. ID. nº 66, nº de registro en Genbank: CAC46344, nº de registro en Genbank: CAB 14127.1, nº de registro en Genbank: AAC74920.1 o nº de registro en Genbank: CAC47463.1 en menos de 50 sustituciones de aminoácidos conservadoras, en el que la secuencia de aminoácidos convierte el indol-3-piruvato y el piruvato en 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-55 4-cetoglutárico.
7. 6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que cuando el tercer polipéptido es una aspartato aminotransferasa, el 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico se pone en contacto con el aspartato para producir oxaloacetato y monatina. 60
8. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, que comprende además poner en contacto oxaloacetato con una descarboxilasa.
9. 8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que cuando el tercer polipéptido es una lisina épsilon 65 aminotransferasa, el 2-hidroxiácido 2-(indol-3ilmetil)-cetoglutárico se pone en contacto además con la lisina.
10. 9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primer y/o el tercer polipéptido son seleccionados de entre el grupo constituido por:

    (a) una secuencia de aminoácidos represenada en las SEC. ID. nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, nº de registro en Genbank: NP_388848.1, nº de registro en Genbank: ZP00005082.1 o nº de registro en Genbank: 5 ACC74014.1;

    (b) una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia representada en las SEC. ID. nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, nº de registro en Genbank: NP_388848.1, nº de registro en Genbank: ZP00005082.1 o nº de registro en Genbank: ACC74014.1; y 10

    (c) secuencias de aminoácidos que se diferencian de las SEC. ID. nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, nº de registro en Genbank: NP_388848.1, nº de registro en Genbank: ZP00005082.1 o nº de registro en Genbank: ACC74014.1 en menos de 50 sustituciones de aminoácidos conservadoras, en el que la secuencia de aminoácidos convierte el triptófano en indol-3-piruvato. 15
11. 10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el triptófano es producido a partir de indol utilizando el polipéptido de CE 4.1.99.1.
12. 11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fuente de carbono C3 se selecciona de entre 20 piruvato, fosfoenolpiruvato, alanina, serina, cisteína o una combinación de los mismos.
13. 12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el piruvato es producido por:

    (a) la alanina y un polipéptido que puede realizar la transaminación de la alanina; 25

    (b) la serina y un polipéptido que puede realizar la beta-eliminación de la serina;

    (c) la cisteína y un polipéptido que puede realizar la beta-eliminación de la cisteína;

    30

    (d) el aspartato y un polipéptido que puede realizar las reacciones de beta-liasa con un aminoácido dicarboxílico;

    (e) el lactato y la lactato-oxidasa (CE 1.1.3.-) o una lactato-deshidrogenasa (CE 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.1.2.3); o

    35

    (f) una combinación de los mismos.
14. 13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende además reducir una cantidad de peróxido de hidrógeno producido cuando el triptófano se convierte en indol-3-piruvato poniendo en contacto el peróxido de hidrógeno con una catalasa. 40
15. 14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se produce por lo menos 10 g/l de monatina.
16. 15. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende además la detección del 2-hidroxiácido 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico por espectrometría de masas. 45
17. 16. Procedimiento de producción de monatina, que comprende convertir el indol-3-piruvato en monatina en presencia de piruvato y un primer y un segundo polipéptidos, en el que el primer polipéptido es una aldolasa, y en el que el segundo polipéptido se selecciona de entre tirosina aminotransferasa (aromática) (CE 2.6.1.5), triptófano deshidrogenasa (CE 1.4.1.19), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (CE 2.6.1.28), triptófano amino-50 transferasa (CE 2.6.1.27), aspartato aminotransferasa (CE 2.6.1.1), D-alanina aminotransferasa (CE 2.6.1.21), D-triptófano aminotransferasa, glutamato deshidrogenasa (CE 1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasa (CE 1.4.1.20), sustrato múltiple aminotransferasa (CE 2.6.1.-), D-aminoácido deshidrogenasa (CE 1.4.99.1) o una combinación de las mismas.