JPH03280895A

JPH03280895A - Ｄ―α―フェニルグリシンの製造法

Info

Publication number: JPH03280895A
Application number: JP8069590A
Authority: JP
Inventors: Ryuichi Endo; 隆一遠藤; Tomohide Yamagami; 山上　知秀
Original assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-03-30
Filing date: 1990-03-30
Publication date: 1991-12-11
Anticipated expiration: 2014-09-20
Also published as: JP2950896B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、ラセミ体のフェニルグリシノニトリルから微
生物の作用によりＤ−α−フェニルグリシンを製造する
方法に関するものである。

Ｄ−α−フェニルグリシンは、ペニシリン系抗生物質、
或はセフェム系抗生物質など、医農薬品原料として重要
なものである。

〔従来の技術と問題点］Ｄ−α−フェニルグリジンの製造方法は、（１）ＤＬ−
５−置換ヒダントインをＤ体特異的ジヒドロビリミジナ
ーゼによりＮ−カルバミル−Ｄアミノ酸とし、次に脱カ
ルバミル化する合成法ＣＳ、　　１’ａｋａｈａｓｈｉ
　　ｅｔ、ａｌ、Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ、丁ｅｃｈｎｏ１
．．　５６４９２　（１９７８）　、特開昭５１−１５
７７１３号公報参照〕、（２）　　Ｄ　Ｌ　−５−置換
ヒダントインをＤ−ヒダントイナーゼとＮ−カルバモイ
ル−〇−アミノ酸ヒドロラーゼを含む微生物により１段
でＤ−アミノ酸に変換する方法〔特開昭５４−８９０８
８号公報参照〕、（３）ＤＬ−アミノ酸アミドをＤ体特
異的アミグーゼにより加水分解しＤ−アミノ酸に変換す
る方法〔特公昭６３−８７９９８号公報参照〕などが公
知である。

しかし、ＤＬアミノ酸アミドの加水分解法では、Ｌ体ア
ミノ酸アミドが未反応分として残り、これを分離、回収
後ラセミ化し再使用する工程がさらに必要となる、また
、ヒダントイン誘導体を原料とする方法では、原料のラ
セミ化を伴う反応となり経済的であるが、脂肪族ヒダン
トインに対しては、−船釣に芳香族ヒ・ダントインと比
べてラセミ化しにくいという欠点があり対象とするヒダ
ントイン化合物が限定される。

一方、アミノニトリルから特異的に、アミノ酸を生産す
る方法としては、（１）　　ブレビバクテリウム属による相当するアミノ
ニトリルからのし一メチオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−フ
ェニルアラニンなどの生産（Ｊ、Ｃ，ＪａＩＩａｇｅ−
ａｓ、　　ｅｔ、ａｌ、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ旧ｏ
ｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　　１４　
１参照〕、（２）　　アシネトバクタ−属によるＤＬ−α−アミノ
プロピオニトリルからのし一アラニンの生産〔＾ｎｎｅ
　Ｍ、、　ｅｔ、ａｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
　Ｌｅｔｔｅｒｓ工８６５（１９８５）参照〕、（３）　　ノカルデイア属、ミコバクテリウム属、コリ
ネバクテリウム属による相当するＤＬアミノニトリルカ
ラのし一バリン、Ｌ−ロイシンの生産方法〔特開平１−
３１７３９３号公報参照〕などがある。

しかし、これらの方法は、すべてアミノニトリルよりＬ
−アミノ酸を製造する方法に関するものでありアミンニ
トリルから直接Ｄ−アミノ酸を生産するものではない、
またＤＬ−α−フェニルグリシノニトリルからＤ−α−
フェニルグリシンを微生物作用により生産したという知
見はない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、Ｄ−α−フェニルグリシンの工業的に有
利な製造方法を開発すべく化学合成で安価に得られるＤ
Ｌ−α−フェニルグリシノニトリルをＤ−α−フェニル
グリシンに特異的に変換する新規な技術について鋭意研
究を行った結果、ＤＬ−α−フェニルグリシノニトリル
に対し光学特異的なニトリル加水分解活性を有する微生
物の作用により、ＤＬ−α−フェニルグリシノニトリル
をＤ−α−フェニルグリシンに特異的に変換し得ること
、さらにこの微生物によるＤ特異的な加水分解反応とア
ンモニアの存在下で中性ないし塩基性の水性媒体中で起
こるフェニルグリシノニトリルのラセミ化反応との共役
的な反応により実質的にＤＬ−α−フェニルグリシノニ
トリルの全てをＤ−α−フェニルグリシンに変換できる
ことを見出した。本発明はこれ′らの知見に基づくもの
である。

すなわち、本発明は、ＤＬ−α−フェニルグリシノニト
リルに対し光学特異的なニトリル加水分解活性を存する
微生物の作用により、水性媒体中で該ニトリルをＤ−α
−フェニルグリシンに変換せしめること、あるいはさら
にこの加水分解反応をアンモニアの存在下、中性ないし
は塩基性条件下で行うことを特徴とするＤ−α−フェニ
ルグリシンの製造法である。

本発明によれば、基質アミノニトリルの化学的なラセミ
化とＤ特異的なニトリル加水分解とにより、ＤＬ−α−
フェニルグリシノニトリルから理論的に１００χの収率
で目的物を得ることができ経済的に有利である。

本発明において、使用される微生物は、アシネトバクタ
−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、カセオバクター
（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物、またはこれらよ
り誘導された変異株であり、具体的には本発明者らが土
壌中より新たに分離したカセオバクターｓｐ、　ＢＣ４
（微工研菌寄第１１２６０号）、カセオバクターｓｐ、
　ＢＣ２３（微工研菌寄第１１２６１号）、シュードモ
ナスｓｐ、　ＢＣｌ３−２（微工研菌寄第１１２６６号
）、シュードモナスｓｐ、　ＢＣｌ３−２（微工研菌寄
第１１２６７号）、アルカリゲネスｓｐ、　ＢＣｌ６−
２（微工研菌寄第１１２７６号）、アシネトバクタ−ｓ
ｐ、　ＢＣ９−２（微工研菌寄第１１２６２号）の菌株
を挙げることができる。これらの微生物は、いずれも工
業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に上記番号に
て寄託されており、それぞれの菌学的性質は以下に示す
とおりである。

ＢＣ４および２３菌株ＮＴ　：試験せず（以下、同し）ＢＣｌ３−２およびＢＣｌ３−２菌株ＢＣ１６−２および９−２菌株以上の菌学的性質をバーシーズ　マニュアルオプ　シス
テマチック　バクテリオロジー（Ｂｅｒ−ｇｅｙ’ｓ　
　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（１９８６）に従って分類
するとＢＣ４およびＢＣ２３株はカセオバクター属、Ｂ
Ｃｌ３−２およびＢＣｌ３−２株はシュードモナス属、
ＢＣｌ６−２株はアルカリ土類金属およびＢＣ９−２株
はアシネトバクタ−属に属する細菌とそれぞれ同定され
た。

次に本発明の実施態様について説明する。

本発明に使用される微生物の培養には、通常資化しうる
炭素源、窒素源および微生物の生育に必要な無機栄養素
を含有する培地が用いられる。

例えば、炭素源としてはグルコース、グリセロール、シ
ュークロース、糖蜜等、窒素源としては酵母エキス、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム等、無機栄養源とし
ては硫酸ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウ
ム、硫酸マンガン、塩化第２鉄、硫酸亜鉛等である。ま
た、培養の初期または中期に生育を大きく阻害しない濃
度のニトリル類（ケイ皮酸ニトリル、ベンジルシアニド
、ベンゾニトリル、２−シアノピリジン、プロピオニト
リル、イソブチロニトリル等）、アミド類（フェニルア
セトアミド、４−ピリジンカルボン酸アミド、イソブチ
ルアミド）、ラクタム類（ε−カプロラクタム、γ−ブ
チロラクタム等）を添加すると、より高い酵素活性が得
られるので好ましい。

培養は、好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜５０
”Ｃ，２４〜９６時間で、それぞれの微生物に適した範
囲に制御しつつ行えばよい。

加水分解反応は、上記により微生物を培養し、その培養
液、培養液から分離した菌体、菌体処理物（菌体破砕物
、抽出酵素）または常法により固定化した菌体あるいは
酵素をＤＬ−α−フェニルグリシノニトリルと混合すれ
ばよい。この際、反部系にアンモニアを共存させ、且つ
咳系を中性ないし塩基性、ｐＨ値で７〜１１に調整する
ことによりＤＬ−α−フェニルグリシノニトリルから理
論的に１０ｏｚの収率で目的物を得ることができる。さ
らにアンモニアに加えてシアンイオンを存在させること
によりより一層の収率向上が期待できる。

アンモニアの添加量は、原料ニトリル１モルに対しアン
モニア１〜５００モル、好ましくは１０〜１００モルで
、アンモニア源としては、通常用いられるアンモニア水
、アンモニウム塩であれば何れでもよく、アンモニア水
−塩化アンモニウムをはじめとするアンモニア系緩衝液
とすれば効果的である。

また、シアンイオン源としてはシアン化カリウム、シア
ン化ナトリウム等のシアン化合物が使用できるが、その
添加量は、原料ニトリル１モルに対し０．１−１００モ
ル、好ましくは１〜５０モルである。

反応液中のＤＬ−α−フェニルグリシノニトリルは、通
常０．０１〜５．０重量％、ＤＬ−α−フェニルグリシ
ノニトリルに対する微生物の使用量は、乾燥菌体量とし
て０．０１〜５．０重蓋％、反応温度は氷点〜６０°Ｃ
１好ましくは、１０〜５０°Ｃで、０．５〜７２時間反
応させればよい。

また、原料のＤＬ−α−フェニルグリシノニトリル、ア
ンモニアおよびシアン化合物は、反応開始時に一括添加
または反応開始後逐次あるいは連続添加する等の何れの
方法を採用してもよい。

Ｄ−α−フェニルグリシンを含む反応液からのＤ−α−
フェニルグリシンの単離は、遠心分離等により菌体を除
去後、濃縮、イオン交換、抽出、晶析なと公知の方法を
利用することにより目的物であるＤ−α−フェニルグリ
シンを取得することができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ＤＬ−α−フェニルグリシノニトリル
をＤ特異的に加水分解することができ、さらにこの微生
物によるＤ特異的な加水分解反応とアンモニアの存在下
で中性付近ないし塩基性の水性媒体中で起こるフェニル
グリシノニトリルのラセミ化反応との共役的な反応によ
り実質的にＤＬ−α−フェニルグリシノニトリルの全て
をＤα−７エニルグリシンに変換できる。

〔実験例〕

以下、実施例により本発明を具体的に説明する力これら
実施例は本発明を限定するものではない。

実施例工（１）培養表１に示す各微生物を下記の培地に接種し培養した。

培地組成グリセロール　　　　　　３０　ｇ／ｉ！。

ベンジルシアニド　　　　　０６２ｇ／ｌ酵母エキス　
　　　　　　　３ｇ／ｊ！ＫＺＩＩＰ０．　　　　　　
　　　　３　　ｇ／ＩＮａｚＳＯａ　　　　　　　　　
　　０．３　ｇ　／　’ＭｇＣ］　Ｚ　　　　　　　　
　　　　Ｏ１２ｇ／ｊＩＣａＣ１ｚ　　　　　　　　　
　　　４０■／２Ｍｎ５Ｏａ・４ｔｌｚＯ４Ｋ／ＩＦｅＣ］ｓ　Ｈ７Ｈ２００，７■／２ＺｎＳＯａ　　　　　　　　　　　　０．１■／１ｐｔ
ｌ　　　　　　　　　　　　　７．２培養上記培地１００−を含む５００−容三角フラスコで３０
°Ｃ１２日間振とう培養を行った。

（３）加水分解反応得られた培養液から菌体を遠心分離にて回収し２０１り
ん酸緩衝液（ａｌｌ　７．５）で洗浄し、沈澱した菌体
を同りん酸緩衝液１０ｄに再懸濁した。終濃度を１０ｒ
ＢＭＤＬ−α−フェニルグリシノニトリルとする５０ｍ
Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，５１に上記菌体懸濁液１　ｍ
ｌを添加して全体で２ｄとし１５°Ｃで９時間反応させ
た。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去した
後、上清液をダイセル化学工業社製ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ
　Ｃ１？　（÷）を充填剤とするカラムを用いて高速液
体クロマトグラフィーで分析し、反応液中のＤα−フェ
ニルグリンン量を測定した。

結果を表１に示した。

実施例２実施例１と同様に各属の微生物を培養後、遠心分離にて
集菌、洗浄し２０ｍＭりん酸緩衝液ムコ懸濁した。次に
、上記菌体Ｉｄｌを含むＤＬ−α−フ二二ルグリシノニ
トリル１０＋ｙＭ、アンモニア水０．４門、シアン化カ
リウム０．２Ｍとする２Ｉｄの反応液を調製した。この
溶液を３５°Ｃで４時間反応させた。反応終了後、反応
液を遠心分離して菌体を除去し、上清液を実施例１と同
様に高速液体クロマトグラフィーにて分析した。

結果を表２に示した。

表

Claims

【特許請求の範囲】１、ＤＬ−α−フェニルグリシノニトリルに対し光学特
異的なニトリル加水分解活性を有する微生物の作用によ
り、水性媒体中で該ニトリルをＤ−α−フェニルグリシ
ンに変換せしめることを特徴とするＤ−α−フェニルグ
リシンの製造法。２、加水分解反応をアンモニアの存在下、中性ないし塩
基性条件下で行うことを特徴とする請求項１記載の製造
法。３、微生物がアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ
）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属ま
たはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属であ
る請求項１記載の製造法。