JP2001211892A - グリシンの微生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物を用いグリシノニトリルからグリシン
を生産するに当たり、菌体当たり、かつ単位時間当たり
の活性が高く、培地や菌体を多量に廃棄せず、反応液の
ｐＨを調整するために緩衝液を用いず、グリシンとアン
モニアを定量的に、かつ容易に回収できる方法を提供す
る。 【解決手段】 ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、
グリシノニトリルを微生物の作用による加水分解反応に
付し、生成するグリシンとアンモニアの水溶液からグリ
シンとアンモニアを回収することを含むグリシンの微生
物学的製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グリシンの微生物
学的製造方法に関する。さらに詳しくは、ｐＨを調整し
ない閉鎖的反応条件下で、ホルムアルデヒド、青酸およ
びアンモニアの反応で得られるグリシノニトリルを微生
物の作用による加水分解反応に付し、生成するグリシン
とアンモニアを水溶液から回収することを含むグリシン
の微生物学的製造方法に関する。得られるグリシンは、
食品添加物、洗浄剤、医農薬合成原料として有用であ
る。本発明の製造法は、有用なグリシンを効率よく工業
的に製造するため利用することができる。

【０００２】

【従来の技術】グリシンは、従来、ホルムアルデヒド、
青酸およびアンモニアからシュトレッカー法にて一旦グ
リシノニトリルを合成し、これを苛性ソーダ等のアルカ
リで加水分解し、グリシンソーダとアンモニアに変換し
た後、硫酸等の酸で中和して製造されている。この時、
アンモニアはアルカリで加水分解される際、蒸発して回
収され、グリシンは酸で中和後、晶析法で回収される
（特開昭４３−２９９２９号、特開昭５１−１９７１９
号、特開昭４９−１４４２０号、特開昭４９−３５３２
９号）。このように従来法は、アルカリや酸を多量に用
いる欠点に加え、中和工程で塩類が多量に副成されるた
め、廃棄物が多く環境負荷が大きい欠点があった。さら
に、中和副成する塩類はグリシンに溶解度が酷似してい
るため、グリシンを精製回収するためには、晶析操作を
複数回繰り返したり、母液を循環する等の煩雑な操作が
必要であった（特開昭５１−３４１１３号）。

【０００３】一方、グリシノニトリルを酵素的に加水分
解してグリシンを得る方法も知られている。特公昭５８
−１５１２０号においては、ブレビバクテリウムＲ３１
２株を苛性カリ等でｐＨ８に調整した反応液に懸濁し加
水分解反応に用いる方法が、また、特開平３−６２３９
１号においては、コリネバクテリウムＮ−７７４株をリ
ン酸緩衝液でｐＨ７．７に調整した反応液に懸濁し反応
に用いる方法が開示されている。しかし、これらの方法
は、実施例によると、グリシンを得るためには、グリシ
ン重量の１倍から１０倍に相当する多量の菌体を用いる
必要があり、さらに、反応液のｐＨを調整するため、緩
衝液が用いられる点に問題があった。すなわち、多量の
菌体を用いるため、培地や菌体を多量に浪費する欠点が
あり、また、ｐＨ調整剤として緩衝液を用いるため、緩
衝液の廃棄が避けられない欠点があった。さらに、緩衝
液はアンモニア塩となり、アンモニアの回収を妨げる問
題もある。ロドコッカス属、アルスロバクター属、カセ
オバクター属、シュードモナス属、エンテロバクター
属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、コリネバ
クテイリア属またはストレプトマイセス属の微生物を用
いる特開平３−２８０８８９号においては、菌体使用量
は生成グリシン重量の約２０分の１に改良されている
が、反応時間が約４０時間と長い欠点がある、さらに、
緩衝液を反応に用いる問題は解決されていない。

【０００４】このように、従来の微生物を用いたグリシ
ノニトリルからグリシンを生産する方法は、菌体当た
り、かつ単位時間当たりの活性が低く、培地や菌体を多
量に浪費する欠点に加え、反応液のｐＨを調整するため
に用いた緩衝液の廃棄が避けられない欠点、さらに、緩
衝液がアンモニアの回収を妨げる問題があり、工業的に
実施できるものではなかった。また、従来の微生物を用
いた方法では、アンモニアを回収する工夫は開示されて
いなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、微生物を用
いグリシノニトリルからグリシンを生産するに当たり、
菌体当たり、かつ単位時間当たりの活性が高く、培地や
菌体を多量には廃棄せず、反応液のｐＨを調整するため
に緩衝液を用いず、グリシンとアンモニアを定量的に、
かつ容易に回収できる方法を提供することを目的とす
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決するため、菌体当たり、かつ単位時間当たり高い
活性を持ち、反応系で生成したグリシンやアンモニアを
分解または消費せず、グリシンとアンモニアを定量的
に、かつ容易に回収できる反応系を構築すべく、適した
微生物を探索した。その結果、ｐＨを調整しない閉鎖的
反応条件下でグリシンとアンモニウムが生成し、反応液
のｐＨが１０を越えても反応が進行する微生物を見い出
すことができ、本微生物の培養条件、反応条件と反応方
法等の研究を鋭意行った結果、本発明を完成するに至っ
た。

【０００７】すなわち、本発明は、ｐＨを調整しない閉
鎖的反応条件下で、グリシノニトリルの水溶液に微生物
を作用させることを特徴とするグリシンの製造法であ
り、また、本発明は、ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件
下で、グリシノニトリルの水溶液に微生物を作用させ、
酵素反応により生成するグリシンおよびアンモニアを回
収することを特徴とするグリシンの製造法である。本発
明に使用する微生物としては、例えば、ロドコッカス
（Rhodococcus ）属に属する微生物が適していることが
新たに発見されたが、これに限定されるものではない。

【０００８】本発明に適した微生物として選択されたロ
ドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９株は、１９９３年
１１月２日に工業技術院微生物工業技術研究所に原寄託
され、１９９５年９月１日に国際寄託に移管されＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５２１９の受託番号を付与されており、微生
物学的性質は以下に示すとおりである。 （ａ）形状、成育状況 １．細胞の形 桿状 ２．細胞の多形性の有無 有 ３．運動性の有無 無 ４．胞子の有無 無 ５．グラム染色性 陽性 ６．肉汁寒天平板培養における 生育良好・オフホワイト・不明・ コロニーの状態 滑らか・凸状・光沢有

【０００９】 （ｂ）生理学的性質 １．カタラーゼ ＋ ２．オキシダーゼ − ３．ＯＦテスト 実施せず ４．細胞壁ジアミノ酸 meso−ジアミノミメリン酸

【００１０】 （ｃ）その他生理学的性質 １．硝酸塩の還元 ＋ ２．ピラジンアミダーゼ ＋ ３．システインアリルアミダーゼ − ４．バリンアリルアミダーゼ ＋ ５．ピロリドニルアリルアミダーゼ − ６．アルカリフォスフォダーゼ ＋ ７．β−グルクロニダーゼ − ８．β−ガラクトシダーゼ − ９．α−グルコシダーゼ ＋ １０．ウレアーゼ − １１．ゼラチン分解 − １２．溶血性 − １３．アデニン分解 ＋ １４．チロシン分解 − １５．５％ＮａＣｌ存在下での生育 生育する １６．リボースからの酸生成 ＋

【００１１】 （ｄ）各単一炭素源での生育 １．イノシトール − ２．マルトース − ３．マンニトール − ４．ラムノース − ５．ソルビトール − ６．ｍ−ヒドロキシ安息香酸 ＋ ７．アジピン酸ナトリウム − ８．クエン酸ナトリウム − ９．グルタル酸ナトリウム ＋ １０．Ｌ−チロシン − １１．グリセロール − １２．トレハロース − １３．アセトアミド − １４．Ｄ−ガラクトース − 菌株の同定に際しては、バージェイズ・マニュアル・オ
ブ・システマティク・バイオテリオロジー（Bergy's Ma
nual of Determinative Bacteriolog ）第２巻（１９８
６）およびザ・プロカリオート（The Prokaryotes ）第
２版（１９９２）に従って分類した。

【００１２】次に、本発明の一般的実施態様について説
明する。本発明に使用される微生物の培養には、通常用
いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリン、有
機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、窒素源
としては、アンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩および
有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペプト
ン、肉エキス等が用いられる。また、培地にはリン酸
塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバル
ト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加される。
培養はｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０〜
３７℃、好ましくは２７〜３２℃で好気的に行われる。
本発明の微生物の培養において、上記の培地に酵素誘導
剤を加えてもよい。例えば、ラクタム化合物（γ−ラク
タム、δ−ラクタム、ε−カプロラクタム等）、ニトリ
ル化合物、アミド化合物等を用いてもよい。

【００１３】本発明の微生物は、そのまま工業使用でき
るが、適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしくは
遺伝子工学的手法により改良された変異株、例えば、酵
素を構成的に生産する変異株を育成し用いることもでき
る。本発明の菌体とは、培養液から採取した菌体または
菌体処理物（菌体の破砕物、菌体破砕物より分離した酵
素、および菌体または菌体から分離抽出された酵素を固
定化した処理物）である。培養液からの菌体の採取は、
公知の方法で行うことができる。

【００１４】本発明において用いるグリシノニトリル
は、公知の方法で合成することができる。例えば、ホル
ムアルデヒドと青酸およびアンモニアから得る方法、あ
るいはホルムアルデヒドと青酸を反応させ一旦グリコロ
ニトリルを合成し、継いでアンモニアを作用させて得る
方法で合成される。どちらも、シュトレッカー法として
総称されている。

【００１５】本発明においては、上述の方法で分離した
菌体および菌体処理物は、ｐＨを調整しない密閉反応条
件下でグリシノニトリル水溶液に懸濁することで、速や
かに加水分解反応が進行し、グリシンとアンモニアに転
換することができる。すなわち、通常、前記微生物菌体
または菌体処理物を例えば０．０１〜５重量％、および
グリシノニトリルを１〜３０重量％含むｐＨを調整しな
い水性懸濁液を、生成するアンモニアが放散しないよう
に密閉容器に仕込み、温度として例えば０〜５０℃の条
件を用いて、反応時間を例えば１〜２４時間反応させれ
ばよい。この場合、グリシノニトリルを薄い濃度で仕込
み経時的に追加添加したり、反応温度を経時的に変化さ
せてもよい。

【００１６】かくして、グリシンは、ほぼ１００％のモ
ル収率でグリシンとアンモニアに転換し、グリシンアン
モニウム塩の高濃度水溶液として生成蓄積させることが
できる。もし、グリシンアミドが残存する場合は、グリ
シンアミドの加水分解活性を持つ菌体もしくは酵素を追
添加することにより、完全にグリシンおよびアンモニア
に転換することも可能である。グリシンアンモニウム塩
の高濃度反応液からのグリシンの回収は、例えば、反応
液から菌体を遠心濾過、膜分離等によって除いた後、グ
リシンは晶析法、イオン交換法または貧性溶媒による分
別沈澱法にて回収できる、また、アンモニアは一部の水
と一緒に蒸発後、蒸留や抽出によって回収することがで
きる。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により説明
するが、本発明は、この実施例により限定されるもので
はない。

【実施例１】（１）グリシノニトリルの合成 ホルマリンに等量の青酸をを作用させて、一旦生成した
グリコロニトリル水溶液に、過剰量のアンモニア水溶液
を添加し、３０重量％グリシノニトリル水溶液を得た。

【００１８】（２）菌体の培養 ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９を、下記の条件
で培養した。 (1) 培地 グリセリン １．０重量％ 肉エキス １．０ ペプトン １．０ 食塩 ０．１ ε−カプロラクタム ０．３ リン酸第一カリウム ０．２ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ 塩化アンモニウム ０．１ 硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３ 塩化マンガン・４水塩 ０．００２ 塩化コバルト・６水塩 ０．００２ ｐＨ ７．５

【００１９】(2) 培養条件 ３０℃／１日 (3) グリシノニトリルの加水分解 菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸
留水等で洗浄したものを反応に用いた。密閉した１００
ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として６２ｍ
ｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを
１７ｍｌの蒸留水に調合し、２０℃にて反応を開始し
た。反応開始２時間後、ｐＨは１０になっていた。この
反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノ
ニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成してい
た。そこで、２時間毎に反応温度を５℃昇温し、基質の
３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを追加添加
し、反応液を液体クロマトグラフィー法で分析した。こ
の操作を４回切り返し、合計１０時間反応を行った。

【００２０】得られた３２ｇの反応液のうち２ｇを用
い、生成したアンモニアはネスラー法により定量し、原
料のグリシノニトリルと生成したグリシンは液体クロマ
トグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくな
り、グリシンとアンモニアが定量的に生成していた。乾
燥菌体当たりのグリシンの生成量は９７ｇ／ｇ乾燥菌体
であり、グリシンの生成活性は９．７ｇ／ｇ・Ｈｒであ
った。残りの３０ｇは遠心濾過し、菌体を取り除いた
後、沸騰下で１／１０に濃縮し、４．９ｇのグリシンを
晶析回収した。一方、冷却回収した蒸発水溶液中のアン
モニアは１．２５ｇであった。

【００２１】

【比較例１】実施例１と同様の培養操作を菌体として、
ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９の代わりにグリ
シンの合成活性が知られるAlcaligenes faecalis （Ａ
ＴＣＣ８７５０）を用い、ε−カプロラクタムの代わり
にアセトニトリルを用いて行った。得られた培養液から
遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄後、密閉した１
００ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として５
０ｍｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍ
ｌを１７ｍｌの蒸留水に調合し、２０℃にて反応を開始
した。反応開始２時間後、ｐＨは８．５になっていた。

【００２２】この反応液を液体クロマトグラフィー法で
分析したところ、グリシノニトリルが残り、グリシンは
仕込量の１６％生成していた。そこで、反応時間をさら
に２時間延長して行ったが、グリシン量は変化しなかっ
た。このことから、密閉反応器では生成したアンモニア
が蓄積し、ｐＨが上昇すると、アセトニトリルで培養し
たAlcaligenes faecalis 等の通常の菌体の場合、ニト
リルの加水分解活性が著しく阻害されることが示唆され
た。

【００２３】

【発明の効果】本発明のグリシンの微生物学的製造方法
を用いれば、ｐＨを調整しない密閉反応条件下で、ホル
ムアルデヒド、青酸およびアンモニアとの反応で得られ
るグリシノニトリルを、ｐＨ１０以上で加水分解活性を
持つ微生物、好ましくはロドコッカス（Rhodococcus ）
属に属する微生物の作用により加水分解反応に付し、生
成するグリシンのアンモニウム水溶液からグリシンとア
ンモニアを別々に回収することで、アルカリ、酸、緩衝
液を多量に消費や廃棄をせず、生成したグリシンやアン
モニアを反応条件下で消費することなく、乾燥菌体当た
り、かつ単位時間当たり高い活性でグリシンを製造する
ことができる。

【００２４】一般には、加水分解活性のある菌体を用い
て、ｐＨを調整せずグリシノニトリルを加水分しても、
再現性良く加水分解は起こらない。また、ｐＨ調整のた
め、酸、アルカリ、緩衝液を用いると、それらを多量に
消費、廃棄する必要があり、かつ、生成するアンモニ
ア、グリシンの回収が煩雑となる。よって、高いｐＨで
も活性があり、ｐＨが大きく変化しても活性が維持され
る菌体を用いることで、乾燥菌体当たり、かつ単位時間
当たり高い活性でグリシンを製造することができると同
時に、アルカリ、酸、緩衝液を用いないことで、こうし
た塩類の廃棄をなくし、グリシンやアンモニアを定量的
に、かつ容易に分離することができた。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、
   グリシノニトリルの水溶液に微生物を作用させることを
   特徴とするグリシンの製造法。
2. 【請求項２】 ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、
   グリシノニトリルの水溶液に微生物を作用させ、酵素反
   応により生成するグリシンおよびアンモニアを回収する
   ことを特徴とするグリシンの製造法。
3. 【請求項３】 微生物がロドコッカス属の微生物である
   ことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】 微生物がロドコッカス・マリスＢＰ−４
   ７９−９（ＦＥＲＭＢＰ−５２１９）であることを特徴
   とする請求項１または２記載の方法。