JP2001340097A - グリシンを微生物学的に製造する方法 - Google Patents
グリシンを微生物学的に製造する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物を用いグリシノニトリルからグリシン
を生産するにあたり、菌体当たり、かつ単位時間当たり
活性が高く、培地や菌体を多量に廃棄せず、反応液のpH
を調整するための緩衝液を用いず、グリシンとアンモニ
アが定量的に、かつ容易に回収する方法を提供する。 【解決手段】 ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、
グリシノニトリルの水溶液にコリネバクテリウム（Cory
nebacterium ）属またはアルカリゲネス（Alcaligenes
）属に属する微生物を作用させるグリシンの製造法。
を生産するにあたり、菌体当たり、かつ単位時間当たり
活性が高く、培地や菌体を多量に廃棄せず、反応液のpH
を調整するための緩衝液を用いず、グリシンとアンモニ
アが定量的に、かつ容易に回収する方法を提供する。 【解決手段】 ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、
グリシノニトリルの水溶液にコリネバクテリウム（Cory
nebacterium ）属またはアルカリゲネス（Alcaligenes
）属に属する微生物を作用させるグリシンの製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，グリシンの微生物
学的製造方法に関する。さらに詳しくは、ホルムアルデ
ヒド、青酸、およびアンモニアの反応で得られるグリシ
ノニトリルをコリネバクテリウム属またはアルカリゲネ
ス属に属する微生物の作用による加水分解反応に付し、
ｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加
をしない反応条件で、または該反応条件と閉鎖系の反応
条件下もしくは生成するアンモニアを反応と同時に系外
に分離する反応条件下で選択的にグリシンを回収するこ
とを特徴とするグリシンの微生物学的製造方法に関す
る。得られるグリシンは食品添加物、洗浄剤、医農薬合
成原料として有用である。本発明の製造法は、有用なグ
リシンを効率よく工業的に製造するため利用することが
できる。
学的製造方法に関する。さらに詳しくは、ホルムアルデ
ヒド、青酸、およびアンモニアの反応で得られるグリシ
ノニトリルをコリネバクテリウム属またはアルカリゲネ
ス属に属する微生物の作用による加水分解反応に付し、
ｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加
をしない反応条件で、または該反応条件と閉鎖系の反応
条件下もしくは生成するアンモニアを反応と同時に系外
に分離する反応条件下で選択的にグリシンを回収するこ
とを特徴とするグリシンの微生物学的製造方法に関す
る。得られるグリシンは食品添加物、洗浄剤、医農薬合
成原料として有用である。本発明の製造法は、有用なグ
リシンを効率よく工業的に製造するため利用することが
できる。
【０００２】
【従来の技術】グリシンは、従来、ホルムアルデヒド、
青酸、およびアンモニアからシュトレッカー法にて一旦
グリシノニトリルを合成し、これを苛性ソーダ等のアル
カリで加水分解しグリシンソーダとアンモニアに変換し
た後、硫酸等の酸で中和し製造されている。この時、ア
ンモニアはアルカリで加水分解される際、蒸発して回収
され、グリシンは酸で中和後、晶析法で回収される（特
開昭４３−２９９２９号、特開昭５１−１９７１９号、
特開昭４９−１４４２０号、特開昭４９−３５３２９
号）。このように従来法は、アルカリや酸を多量に用い
る欠点に加え、中和工程で塩類が多量に副成されるため
廃棄物が多く、環境負荷が大きい欠点があった。さら
に、中和副成する塩類はグリシンに溶解度が酷似してい
るため、グリシンを精製回収する為には、晶析操作を複
数回繰り返したり母液を循環する等の煩雑な操作が必要
であった（特開昭５１−３４１１３号）。
青酸、およびアンモニアからシュトレッカー法にて一旦
グリシノニトリルを合成し、これを苛性ソーダ等のアル
カリで加水分解しグリシンソーダとアンモニアに変換し
た後、硫酸等の酸で中和し製造されている。この時、ア
ンモニアはアルカリで加水分解される際、蒸発して回収
され、グリシンは酸で中和後、晶析法で回収される（特
開昭４３−２９９２９号、特開昭５１−１９７１９号、
特開昭４９−１４４２０号、特開昭４９−３５３２９
号）。このように従来法は、アルカリや酸を多量に用い
る欠点に加え、中和工程で塩類が多量に副成されるため
廃棄物が多く、環境負荷が大きい欠点があった。さら
に、中和副成する塩類はグリシンに溶解度が酷似してい
るため、グリシンを精製回収する為には、晶析操作を複
数回繰り返したり母液を循環する等の煩雑な操作が必要
であった（特開昭５１−３４１１３号）。
【０００３】一方、グリシノニトリルを酵素的に加水分
解しグリシンを得る方法も知られている。特公昭５８−
１５１２０号明細書には、ブレビバクテリウムＲ３１２
株を苛性カリ等でｐＨ８に調整した反応液に懸濁し加水
分解反応に用いる方法が、また、特開平３−６２３９１
号明細書には、コリネバクテリウムＮ−７７４株をリン
酸緩衝液でｐＨ７．７に調整した反応液に懸濁し反応に
用いる方法が開示されている。しかし、これらの方法
は、実施例によるとグリシンを得るためには、グリシン
重量の１倍から１０倍に相当する多量の菌体を用いる必
要があり、さらに、反応液のｐＨを調整するため緩衝液
が用いられる問題があった。すなわち、多量の菌体を用
いるため培地や菌体を多量に浪費する欠点があり、ま
た、ｐＨ調整剤として緩衝液を用いるため緩衝液消費や
廃棄が避けられない欠点があった。さらに、緩衝液はア
ンモニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨
げる問題もある。
解しグリシンを得る方法も知られている。特公昭５８−
１５１２０号明細書には、ブレビバクテリウムＲ３１２
株を苛性カリ等でｐＨ８に調整した反応液に懸濁し加水
分解反応に用いる方法が、また、特開平３−６２３９１
号明細書には、コリネバクテリウムＮ−７７４株をリン
酸緩衝液でｐＨ７．７に調整した反応液に懸濁し反応に
用いる方法が開示されている。しかし、これらの方法
は、実施例によるとグリシンを得るためには、グリシン
重量の１倍から１０倍に相当する多量の菌体を用いる必
要があり、さらに、反応液のｐＨを調整するため緩衝液
が用いられる問題があった。すなわち、多量の菌体を用
いるため培地や菌体を多量に浪費する欠点があり、ま
た、ｐＨ調整剤として緩衝液を用いるため緩衝液消費や
廃棄が避けられない欠点があった。さらに、緩衝液はア
ンモニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨
げる問題もある。
【０００４】ロドコッカス属、アルスロバクター属、カ
セオバクター属、シュードモナス属、エンテロバクター
属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、コリネバ
クテリウム属、またはストレプトマイセス属の微生物を
用いる特開平３−２８０８８９号明細書においては、菌
体使用量は生成グリシン重量の約２０分の１に改良され
ているが、反応時間が約４０時間と長い欠点がある、さ
らに、緩衝液を反応に用いる問題は解決されていない。
セオバクター属、シュードモナス属、エンテロバクター
属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、コリネバ
クテリウム属、またはストレプトマイセス属の微生物を
用いる特開平３−２８０８８９号明細書においては、菌
体使用量は生成グリシン重量の約２０分の１に改良され
ているが、反応時間が約４０時間と長い欠点がある、さ
らに、緩衝液を反応に用いる問題は解決されていない。
【０００５】このように、従来の微生物を用いたグリシ
ノニトリルからグリシンを生産する方法は、乾燥菌体当
たり、かつ単位時間当たりの活性が低いため、菌体や培
地を多量に消費し廃棄する欠点があった。さらに、反応
液のｐＨを調整するために緩衝液や酸またはアルカリを
消費し、シュトレッカー法と同様に、それらの廃棄が避
けられない欠点を持っていた。また、従来の微生物を用
いた方法では、アンモニアを回収する工夫は開示されて
いないが、緩衝液や酸を用いると、緩衝液や酸がアンモ
ニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨げる
問題に加え、酸またはアルカリを使用すると、シュトレ
ッカー法と同様に、グリシンの回収を妨げることが予想
される。このように、従来の微生物を用いる方法も、工
業的に実施できるものではなかった。
ノニトリルからグリシンを生産する方法は、乾燥菌体当
たり、かつ単位時間当たりの活性が低いため、菌体や培
地を多量に消費し廃棄する欠点があった。さらに、反応
液のｐＨを調整するために緩衝液や酸またはアルカリを
消費し、シュトレッカー法と同様に、それらの廃棄が避
けられない欠点を持っていた。また、従来の微生物を用
いた方法では、アンモニアを回収する工夫は開示されて
いないが、緩衝液や酸を用いると、緩衝液や酸がアンモ
ニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨げる
問題に加え、酸またはアルカリを使用すると、シュトレ
ッカー法と同様に、グリシンの回収を妨げることが予想
される。このように、従来の微生物を用いる方法も、工
業的に実施できるものではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ホルムアル
デヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られるグ
リシノニトリルから、微生物を用いてグリシンを生産す
るにあたり、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活
性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐ
Ｈを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や
廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成
し、これらの分解および消費を伴わず、グリシンとアン
モニアを別々に回収するグリシンの製造法を提供するこ
とを目的とする。
デヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られるグ
リシノニトリルから、微生物を用いてグリシンを生産す
るにあたり、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活
性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐ
Ｈを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や
廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成
し、これらの分解および消費を伴わず、グリシンとアン
モニアを別々に回収するグリシンの製造法を提供するこ
とを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、このような
工業的諸問題を解決するため、菌体当たり、かつ単位時
間当たり高い活性を持ち、反応系で生成したグリシンや
アンモニアを分解または消費せず、グリシンとアンモニ
アを別々に、定量的に、かつ容易に回収できる反応系を
構築すべく、適した微生物の探索と反応方法の検討を鋭
意行った。驚くべきことに、ｐＨを調整するための酸、
アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件下で反応
が進行し、単位時間当たり高い活性を持つ微生物を見い
だすことがでた。さらに、こうした高活性菌体の中に、
閉鎖系の反応条件下、あるいは減圧反応蒸留や不活性ガ
スを流通しながら生成するアンモニアを反応と同時に分
離する条件下で好ましく働く微生物を見いだすことがで
き、本発明を完成するに至った。
工業的諸問題を解決するため、菌体当たり、かつ単位時
間当たり高い活性を持ち、反応系で生成したグリシンや
アンモニアを分解または消費せず、グリシンとアンモニ
アを別々に、定量的に、かつ容易に回収できる反応系を
構築すべく、適した微生物の探索と反応方法の検討を鋭
意行った。驚くべきことに、ｐＨを調整するための酸、
アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件下で反応
が進行し、単位時間当たり高い活性を持つ微生物を見い
だすことがでた。さらに、こうした高活性菌体の中に、
閉鎖系の反応条件下、あるいは減圧反応蒸留や不活性ガ
スを流通しながら生成するアンモニアを反応と同時に分
離する条件下で好ましく働く微生物を見いだすことがで
き、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明によれば、ｐＨを調整す
るための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応
条件下、または該反応条件と閉鎖的反応条件下もしくは
減圧反応蒸留や不活性ガスを流通しながら生成するアン
モニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で、ホ
ルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得
られるグリシノニトリルの水溶液にコリネバクテリウム
属またはアルカリゲネス属に属する微生物を作用させる
ことで、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活性で
あって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを
調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄
を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、こ
れらの分解および消費を伴わず、グリシンとアンモニア
を別々に回収するグリシンの製造法が提供される。
るための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応
条件下、または該反応条件と閉鎖的反応条件下もしくは
減圧反応蒸留や不活性ガスを流通しながら生成するアン
モニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で、ホ
ルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得
られるグリシノニトリルの水溶液にコリネバクテリウム
属またはアルカリゲネス属に属する微生物を作用させる
ことで、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活性で
あって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを
調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄
を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、こ
れらの分解および消費を伴わず、グリシンとアンモニア
を別々に回収するグリシンの製造法が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明について、以下具体的に説
明する。本発明に使用できる微生物として、コリネバク
テリウム（Corynebacterium ）属とアルカリゲネ（Alca
ligenes ）属に属する微生物が適していることが新たに
発見された。本発明に適した微生物として具体的には、
コリネバクテリウムｓｐ．Ｃ５株、コリネバクテリウム
・ニトリロフィラスＡＴＣＣ２１４１９株、アルカリゲ
ネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０株の微生物が使用で
きる。コリネバクテリウムｓｐ．Ｃ５株（以下、Ｃ５と
略称する）は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れ微工研菌寄第８９３１号の受託番号を付与されてお
り、微生物学的性質は、特開昭６３−１２９９８８号公
報に示すとおりである。
明する。本発明に使用できる微生物として、コリネバク
テリウム（Corynebacterium ）属とアルカリゲネ（Alca
ligenes ）属に属する微生物が適していることが新たに
発見された。本発明に適した微生物として具体的には、
コリネバクテリウムｓｐ．Ｃ５株、コリネバクテリウム
・ニトリロフィラスＡＴＣＣ２１４１９株、アルカリゲ
ネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０株の微生物が使用で
きる。コリネバクテリウムｓｐ．Ｃ５株（以下、Ｃ５と
略称する）は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れ微工研菌寄第８９３１号の受託番号を付与されてお
り、微生物学的性質は、特開昭６３−１２９９８８号公
報に示すとおりである。
【００１０】本発明に使用される微生物の培養には、通
常用いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリ
ン、有機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、
窒素源としてはアンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩お
よび有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペ
プトン、肉エキス等が用いられる。また、培地にはリン
酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバ
ルト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加され
る。培養はｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２
０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で好気的に行われ
る。本発明の微生物の培養において、上記の培地に酵素
誘導剤を加えてもよい、例えば、ラクタム化合物（γ−
ラクタム、δ−ラクタム、ε−カプロラクタム等）、ニ
トリル化合物、アミド化合物等を用いてもよい。
常用いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリ
ン、有機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、
窒素源としてはアンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩お
よび有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペ
プトン、肉エキス等が用いられる。また、培地にはリン
酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバ
ルト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加され
る。培養はｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２
０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で好気的に行われ
る。本発明の微生物の培養において、上記の培地に酵素
誘導剤を加えてもよい、例えば、ラクタム化合物（γ−
ラクタム、δ−ラクタム、ε−カプロラクタム等）、ニ
トリル化合物、アミド化合物等を用いてもよい。
【００１１】本発明の微生物は、そのまま工業使用でき
るが、適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしくは
遺伝子工学的手法により改良された変異株、例えば、酵
素を構成的に生産する変異株を育成し用いることもでき
る。本発明の菌体とは、培養液から採取した菌体または
菌体処理物（菌体の破砕物、菌体破砕物より分離した酵
素、および菌体または菌体から分離抽出された酵素を固
定化した処理物）である。培養液からの菌体の採取は、
公知の方法で行うことができる。本発明において用いる
グリシノニトリルは、公知の方法で合成することができ
る。例えば、ホルムアルデヒドと青酸およびアンモニア
から得る方法、あるいはホルムアルデヒドと青酸を反応
させ一旦グリコロニトリルを合成し、継いでアンモニア
を作用させて得る方法で合成される。どちらも、シュト
レッカー法として総称されている。
るが、適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしくは
遺伝子工学的手法により改良された変異株、例えば、酵
素を構成的に生産する変異株を育成し用いることもでき
る。本発明の菌体とは、培養液から採取した菌体または
菌体処理物（菌体の破砕物、菌体破砕物より分離した酵
素、および菌体または菌体から分離抽出された酵素を固
定化した処理物）である。培養液からの菌体の採取は、
公知の方法で行うことができる。本発明において用いる
グリシノニトリルは、公知の方法で合成することができ
る。例えば、ホルムアルデヒドと青酸およびアンモニア
から得る方法、あるいはホルムアルデヒドと青酸を反応
させ一旦グリコロニトリルを合成し、継いでアンモニア
を作用させて得る方法で合成される。どちらも、シュト
レッカー法として総称されている。
【００１２】本発明においては、上述の方法で分離した
菌体および菌体処理物はｐＨを調整しない反応条件下で
グリシノニトリル水溶液に懸濁しすることで、速やかに
加水分解反応が進行し、生成するアンモニアを反応と同
時に分離することによりグリシンを製造することができ
る。すなわち、通常、前記微生物菌体または菌体処理物
を、例えば０．０１〜５重量％、およびグリシノニトリ
ルを１〜３０重量％含むｐＨを調整しない水性懸濁液を
オートクレーブ等の閉鎖的反応容器、または生成するア
ンモニアを反応分離する装置が付属した反応容器に仕込
み、温度として例えば０〜６０℃の条件、好ましくは１
０〜５０℃の条件を用いて、反応時間を例えば１〜２４
時間、好ましくは３〜８時間反応させればよい。この場
合、グリシノニトリルを薄い濃度で仕込み経時的に追加
添加したり、反応温度を経時的に変化させてもよい。
菌体および菌体処理物はｐＨを調整しない反応条件下で
グリシノニトリル水溶液に懸濁しすることで、速やかに
加水分解反応が進行し、生成するアンモニアを反応と同
時に分離することによりグリシンを製造することができ
る。すなわち、通常、前記微生物菌体または菌体処理物
を、例えば０．０１〜５重量％、およびグリシノニトリ
ルを１〜３０重量％含むｐＨを調整しない水性懸濁液を
オートクレーブ等の閉鎖的反応容器、または生成するア
ンモニアを反応分離する装置が付属した反応容器に仕込
み、温度として例えば０〜６０℃の条件、好ましくは１
０〜５０℃の条件を用いて、反応時間を例えば１〜２４
時間、好ましくは３〜８時間反応させればよい。この場
合、グリシノニトリルを薄い濃度で仕込み経時的に追加
添加したり、反応温度を経時的に変化させてもよい。
【００１３】本発明においては、反応生成するアンモニ
アは密閉型反応容器中に一旦蓄積するか反応と同時に反
応分離することができる。反応分離方法は、反応蒸留法
や不活性ガスの流通法で実施することができる。反応蒸
留を行う場合、加水分解反応容器に、アンモニアと同伴
する水を冷却回収する冷却器の付いた単管搭、棚段搭、
または充填塔を備え、反応水溶液の沸騰圧以下、例え
ば、６０℃で２０．０ｋＰａ以下から０℃で０．６ｋＰ
ａ以下の減圧条件下で、連続的にまたは間欠的に減圧反
応蒸留することが好ましい。さらに好ましくは１２．６
ｋＰａから１．３ｋＰａの圧力条件下で、減圧反応蒸留
することができる。不活性ガスを流通する場合、不活性
ガスの吹き込みノズルと、アンモニアや同伴する水を不
活性ガスから回収する冷却トラップとを備え、微加圧か
ら減圧条件下で連続的にまたは間欠的に、アンモニアを
不活性ガスに同伴し反応液から分離することができる。
さらに、アンモニア分離を促進するため減圧反応蒸留を
不活性ガス流通条件下で行うこともできる。
アは密閉型反応容器中に一旦蓄積するか反応と同時に反
応分離することができる。反応分離方法は、反応蒸留法
や不活性ガスの流通法で実施することができる。反応蒸
留を行う場合、加水分解反応容器に、アンモニアと同伴
する水を冷却回収する冷却器の付いた単管搭、棚段搭、
または充填塔を備え、反応水溶液の沸騰圧以下、例え
ば、６０℃で２０．０ｋＰａ以下から０℃で０．６ｋＰ
ａ以下の減圧条件下で、連続的にまたは間欠的に減圧反
応蒸留することが好ましい。さらに好ましくは１２．６
ｋＰａから１．３ｋＰａの圧力条件下で、減圧反応蒸留
することができる。不活性ガスを流通する場合、不活性
ガスの吹き込みノズルと、アンモニアや同伴する水を不
活性ガスから回収する冷却トラップとを備え、微加圧か
ら減圧条件下で連続的にまたは間欠的に、アンモニアを
不活性ガスに同伴し反応液から分離することができる。
さらに、アンモニア分離を促進するため減圧反応蒸留を
不活性ガス流通条件下で行うこともできる。
【００１４】かくして、グリシノニトリルは、ほぼ１０
０％のモル収率で加水分解し、生成するアンモニアの全
部は密閉型反応容器中に、一旦グリシンのアンモニウム
塩を含むグリシンの高濃度水溶液として生成蓄積させる
ことができる。また、生成するアンモニアの全部または
殆どは、反応と同時に反応蒸留法や不活性ガスの流通法
で反応液から分離し冷却回収される。もし、グリシンア
ミドが残存する場合は、グリシンアミドの加水分解活性
をもつ菌体もしくは酵素を追添加することにより、完全
にグリシンおよびアンモニアに転換することも可能であ
る。グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度
水溶液からのグリシンの回収は、例えば、反応液から菌
体を遠心濾過、膜分離等によって除いた後、グリシンは
晶析法、イオン交換法または貧性溶媒による分別沈澱法
にて回収できる、また、アンモニアは一部の水と一緒に
蒸発後、蒸留や抽出によって回収することができる。本
発明を実施例に基づいて説明する。
０％のモル収率で加水分解し、生成するアンモニアの全
部は密閉型反応容器中に、一旦グリシンのアンモニウム
塩を含むグリシンの高濃度水溶液として生成蓄積させる
ことができる。また、生成するアンモニアの全部または
殆どは、反応と同時に反応蒸留法や不活性ガスの流通法
で反応液から分離し冷却回収される。もし、グリシンア
ミドが残存する場合は、グリシンアミドの加水分解活性
をもつ菌体もしくは酵素を追添加することにより、完全
にグリシンおよびアンモニアに転換することも可能であ
る。グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度
水溶液からのグリシンの回収は、例えば、反応液から菌
体を遠心濾過、膜分離等によって除いた後、グリシンは
晶析法、イオン交換法または貧性溶媒による分別沈澱法
にて回収できる、また、アンモニアは一部の水と一緒に
蒸発後、蒸留や抽出によって回収することができる。本
発明を実施例に基づいて説明する。
【００１５】
【実施例１】（１）グリシノニトリルの合成 ホルマリンに等量の青酸をを作用させて、一旦生成した
グリコロニトリル水溶液に、過剰量のアンモニア水溶液
を添加し３０重量％グリシノニトリル水溶液を得た。 （２）菌体の培養 コリネバクテリウム・ニトリロフィラスＡＴＣＣ２１４
１９を、下記の条件で培養した。 (1) 培地 フマル酸 １．０重量％ 肉エキス １．０ ペプトン １．０ 食塩 ０．１ ε−カプロラクタム ０．３ リン酸第一カリウム ０．２ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ 塩化アンモニウム ０．１ 硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３ 塩化マンガン・４水塩 ０．００２ 塩化コバルト・６水塩 ０．００２ ｐＨ ７．５ (2) 培養条件 ３０℃／１日
グリコロニトリル水溶液に、過剰量のアンモニア水溶液
を添加し３０重量％グリシノニトリル水溶液を得た。 （２）菌体の培養 コリネバクテリウム・ニトリロフィラスＡＴＣＣ２１４
１９を、下記の条件で培養した。 (1) 培地 フマル酸 １．０重量％ 肉エキス １．０ ペプトン １．０ 食塩 ０．１ ε−カプロラクタム ０．３ リン酸第一カリウム ０．２ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ 塩化アンモニウム ０．１ 硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３ 塩化マンガン・４水塩 ０．００２ 塩化コバルト・６水塩 ０．００２ ｐＨ ７．５ (2) 培養条件 ３０℃／１日
【００１６】（３）グリシノニトリルの加水分解 菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸
留水等で洗浄したものを反応に用いた。密閉した１００
ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として８５ｍ
ｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを
１７ｍｌの蒸留水で調合し、２０℃にて反応を開始し
た。反応開始２時間後、ｐＨは１０になっていた。この
反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノ
ニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成してい
た。
留水等で洗浄したものを反応に用いた。密閉した１００
ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として８５ｍ
ｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを
１７ｍｌの蒸留水で調合し、２０℃にて反応を開始し
た。反応開始２時間後、ｐＨは１０になっていた。この
反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノ
ニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成してい
た。
【００１７】そこで、２時間毎に反応温度を５℃昇温
し、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを
追加添加して反応液を液体クロマトグラフィー法で分析
した。この操作を４回切り返し、合計１０時間反応を行
った。得られた３２ｇの反応液のうち２ｇを用い、生成
したアンモニアはネスラー法により定量し、原料のグリ
シノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフ
ィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシ
ンとアンモニアが定量的に生成していた。乾燥菌体当た
りのグリシンの生成量は７１ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グ
リシンの生成活性は７．１ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残り
の３０ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１
／１０に濃縮し、４．９ｇのグリシンを晶析回収した。
一方、冷却回収した蒸発水溶液中のアンモニアは１．２
５ｇであった。
し、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを
追加添加して反応液を液体クロマトグラフィー法で分析
した。この操作を４回切り返し、合計１０時間反応を行
った。得られた３２ｇの反応液のうち２ｇを用い、生成
したアンモニアはネスラー法により定量し、原料のグリ
シノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフ
ィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシ
ンとアンモニアが定量的に生成していた。乾燥菌体当た
りのグリシンの生成量は７１ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グ
リシンの生成活性は７．１ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残り
の３０ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１
／１０に濃縮し、４．９ｇのグリシンを晶析回収した。
一方、冷却回収した蒸発水溶液中のアンモニアは１．２
５ｇであった。
【００１８】
【実施例２】実施例１で合成した３０重量％グリシノニ
トリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施し
た。 （１）菌体の培養 コリネバクテリウムｓｐ．Ｃ５を、下記の条件で培養し
た。 (1) 培地 フマル酸 １．０重量％ 肉エキス １．０ ペプトン １．０ 食塩 ０．１ ε−カプロラクタム ０．３ リン酸第一カリウム ０．２ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ 塩化アンモニウム ０．１ 硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３ 塩化マンガン・４水塩 ０．００２ 塩化コバルト・６水塩 ０．００２ ｐＨ ７．５ (2) 培養条件 ３０℃／１日
トリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施し
た。 （１）菌体の培養 コリネバクテリウムｓｐ．Ｃ５を、下記の条件で培養し
た。 (1) 培地 フマル酸 １．０重量％ 肉エキス １．０ ペプトン １．０ 食塩 ０．１ ε−カプロラクタム ０．３ リン酸第一カリウム ０．２ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ 塩化アンモニウム ０．１ 硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３ 塩化マンガン・４水塩 ０．００２ 塩化コバルト・６水塩 ０．００２ ｐＨ ７．５ (2) 培養条件 ３０℃／１日
【００１９】（２）グリシノニトリルの加水分解 菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸
留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた
１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフ
ラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ド
ライアイストラップに接続したミストセパレーター、温
度計、およびサンプリング管を備えた。このセパラブル
フラスコに乾燥菌体量として１．１６gを仕込み、基質
の３０重量%グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水
１７０ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素
ガスを１時間当たり３リットルフィードしながら、３０
℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液
を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリ
ルはなくなり、グリシンが定量的に生成していた。
留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた
１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフ
ラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ド
ライアイストラップに接続したミストセパレーター、温
度計、およびサンプリング管を備えた。このセパラブル
フラスコに乾燥菌体量として１．１６gを仕込み、基質
の３０重量%グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水
１７０ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素
ガスを１時間当たり３リットルフィードしながら、３０
℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液
を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリ
ルはなくなり、グリシンが定量的に生成していた。
【００２０】そこで、基質の３０重量％グリシノニトリ
ル水溶液３０ｍｌを追加添加した。この操作をさらに３
回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイスト
ラップには固体が１５ｇ回収された。固体を５０ｍｌの
水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニ
アが１４ｇ回収されていた。反応液は３００ｇ回収され
た。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニア
をネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと
生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析
した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的
に生成し、トレース量のアンモニアが残存していた。乾
燥菌体当たりのグリシンの生成量は５２ｇ／ｇ乾燥菌体
であり、グリシンの生成活性は１０ｇ／ｇ・Ｈｒであっ
た。残りの３０３ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、
沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して５６ｇのグリシンを
晶析回収した。
ル水溶液３０ｍｌを追加添加した。この操作をさらに３
回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイスト
ラップには固体が１５ｇ回収された。固体を５０ｍｌの
水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニ
アが１４ｇ回収されていた。反応液は３００ｇ回収され
た。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニア
をネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと
生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析
した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的
に生成し、トレース量のアンモニアが残存していた。乾
燥菌体当たりのグリシンの生成量は５２ｇ／ｇ乾燥菌体
であり、グリシンの生成活性は１０ｇ／ｇ・Ｈｒであっ
た。残りの３０３ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、
沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して５６ｇのグリシンを
晶析回収した。
【００２１】
【実施例３】実施例１で合成した３０重量％グリシノニ
トリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施し
た。 （１）菌体の培養 アルカリゲネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０を、下記
の条件で培養した。 (1) 培地 フマル酸 １．０重量％ 肉エキス １．０ ペプトン １．０ 食塩 ０．１ ε−カプロラクタム ０．３ リン酸第一カリウム ０．２ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ 塩化アンモニウム ０．１ 硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３ 塩化マンガン・４水塩 ０．００２ 塩化コバルト・６水塩 ０．００２ ｐＨ ７．５ (2) 培養条件 ３０℃／１日
トリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施し
た。 （１）菌体の培養 アルカリゲネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０を、下記
の条件で培養した。 (1) 培地 フマル酸 １．０重量％ 肉エキス １．０ ペプトン １．０ 食塩 ０．１ ε−カプロラクタム ０．３ リン酸第一カリウム ０．２ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ 塩化アンモニウム ０．１ 硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３ 塩化マンガン・４水塩 ０．００２ 塩化コバルト・６水塩 ０．００２ ｐＨ ７．５ (2) 培養条件 ３０℃／１日
【００２２】（２）グリシノニトリルの加水分解 菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸
留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた
１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフ
ラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ド
ライアイストラップを経て減圧ポンプに接続した単管型
の蒸留塔、圧力センサー、温度計、および液送ポンプに
接続したサンプリング管を備えた。このセパラブルフラ
スコに乾燥菌体量として１．４ｇを仕込み、基質の３０
重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０
ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素ガスを
１時間当たり3リットルフィードしながら、減圧ポンプ
でフラスコ内の圧力を１０ｋＰａに調整し、３０℃にて
反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体
クロマトグラフィー法で分析したところ、グリシノニト
リルが消失し、グリシンが定量的に生成していた。
留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた
１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフ
ラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ド
ライアイストラップを経て減圧ポンプに接続した単管型
の蒸留塔、圧力センサー、温度計、および液送ポンプに
接続したサンプリング管を備えた。このセパラブルフラ
スコに乾燥菌体量として１．４ｇを仕込み、基質の３０
重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０
ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素ガスを
１時間当たり3リットルフィードしながら、減圧ポンプ
でフラスコ内の圧力を１０ｋＰａに調整し、３０℃にて
反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体
クロマトグラフィー法で分析したところ、グリシノニト
リルが消失し、グリシンが定量的に生成していた。
【００２３】そこで、基質の３０重量％グリシノニトリ
ル水溶液３０ｍｌを追加添加した。２時間毎にこの操作
をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドラ
イアイストラップには固体が２５ｇ回収された。固体を
５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したとこ
ろ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９
４ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成し
たアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシ
ノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフィ
ー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシ
ンが定量的に生成し、トレース量のアンモニアが残存し
ていた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は４２ｇ／
ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は８ｇ／ｇ・Ｈ
ｒであった。残りの２９２ｇは遠心濾過し菌体を取り除
いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して５６ｇのグ
リシンを晶析回収した。
ル水溶液３０ｍｌを追加添加した。２時間毎にこの操作
をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドラ
イアイストラップには固体が２５ｇ回収された。固体を
５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したとこ
ろ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９
４ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成し
たアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシ
ノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフィ
ー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシ
ンが定量的に生成し、トレース量のアンモニアが残存し
ていた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は４２ｇ／
ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は８ｇ／ｇ・Ｈ
ｒであった。残りの２９２ｇは遠心濾過し菌体を取り除
いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して５６ｇのグ
リシンを晶析回収した。
【００２４】
【発明の効果】本発明の製造方法は、ｐＨを調整するた
めの酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件
下、または該反応条件と閉鎖的反応条件下もしくは減圧
反応蒸留や不活性ガスを流通しながら生成するアンモニ
アを反応と同時に系外に分離する反応条件下で、ホルム
アルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られ
るグリシノニトリルの水溶液に、コリネバクテリウム
（Corynebacterium ）属またはアルカリゲネス（Alcali
genes ）属に属する微生物を作用させることで、乾燥菌
体当たり、かつ単位時間当たり高活性であって菌体や培
地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを調整するための
酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリ
シンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解およ
び消費を伴わなず、グリシンとアンモニアを別々に回収
できる効果を有する。
めの酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件
下、または該反応条件と閉鎖的反応条件下もしくは減圧
反応蒸留や不活性ガスを流通しながら生成するアンモニ
アを反応と同時に系外に分離する反応条件下で、ホルム
アルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られ
るグリシノニトリルの水溶液に、コリネバクテリウム
（Corynebacterium ）属またはアルカリゲネス（Alcali
genes ）属に属する微生物を作用させることで、乾燥菌
体当たり、かつ単位時間当たり高活性であって菌体や培
地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを調整するための
酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリ
シンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解およ
び消費を伴わなず、グリシンとアンモニアを別々に回収
できる効果を有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 13/04 (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:05） Ｃ１２Ｒ 1:05） Ｆターム(参考） 4B064 AE03 CA02 CB01 CC12 CC22 CD01 CD12 CE01 DA10 4B065 AA12X AA24X BA22 BC05 BC16 BC18 BD24 BD32 CA17 CA41
Claims (8)
- 【請求項１】 ｐＨを調整するための酸、アルカリまた
は緩衝液の添加をしない反応条件下で、グリシノニトリ
ルの水溶液にコリネバクテリウム属またはアルカリゲネ
ス属に属する微生物を作用させることを特徴とするグリ
シンの製造法。 - 【請求項２】 反応条件がｐＨを調整するための酸、ア
ルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、かつ閉
鎖的反応条件であることを特徴とする請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 反応条件がｐＨを調整するための酸、ア
ルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、かつ反
応液中に生成するアンモニアを反応液から分離する反応
条件であることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 アンモニアを反応液から分離する方法が
反応蒸留であることを特徴とする請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 反応蒸留を減圧下で行うことを特徴とす
る請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 反応蒸留を不活性ガスの存在下で行うこ
とを特徴とする請求項４または５記載の方法。 - 【請求項７】 コリネバクテリウム属に属する微生物が
コリネバクテリウムｓｐ．５株（微工研菌寄第１０２２
４号）またはコリネバクテリウム・ニトリロフィラスＡ
ＴＣＣ２１４１９であることを特徴とする請求項１ない
し６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 アルカリゲネス属に属する微生物がアル
カリゲネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０であることを
特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000164001A JP4497659B2 (ja) | 2000-06-01 | 2000-06-01 | グリシンを微生物学的に製造する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000164001A JP4497659B2 (ja) | 2000-06-01 | 2000-06-01 | グリシンを微生物学的に製造する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001340097A true JP2001340097A (ja) | 2001-12-11 |
| JP4497659B2 JP4497659B2 (ja) | 2010-07-07 |
Family
ID=18667674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000164001A Expired - Lifetime JP4497659B2 (ja) | 2000-06-01 | 2000-06-01 | グリシンを微生物学的に製造する方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP4497659B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021506331A (ja) * | 2017-12-26 | 2021-02-22 | 味の素株式会社 | 発酵によるグリシンの製造方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5225738A (en) * | 1975-08-07 | 1977-02-25 | Sun Ventures Inc | Method of hydrolysing aromatic nitriles to carboxylic acid |
| JPH0319695A (ja) * | 1989-06-16 | 1991-01-28 | Asahi Chem Ind Co Ltd | トランス―４―シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドの製造法およびそれに用いる酵素 |
| JPH03280895A (ja) * | 1990-03-30 | 1991-12-11 | Nitto Chem Ind Co Ltd | Ｄ―α―フェニルグリシンの製造法 |
| JPH03280889A (ja) * | 1990-03-30 | 1991-12-11 | Nitto Chem Ind Co Ltd | グリシンの生物学的製造法 |
| JPH04304892A (ja) * | 1991-03-29 | 1992-10-28 | Nitto Chem Ind Co Ltd | グリシンの生物学的製造法 |
| JPH05310677A (ja) * | 1992-05-01 | 1993-11-22 | Asahi Chem Ind Co Ltd | カルバミン酸エステルの製造方法 |
| JPH1017183A (ja) * | 1996-07-02 | 1998-01-20 | Sony Corp | ウェブ接合装置 |
| JPH10179183A (ja) * | 1996-12-20 | 1998-07-07 | Daicel Chem Ind Ltd | カルボン酸の製造方法 |
-
2000
- 2000-06-01 JP JP2000164001A patent/JP4497659B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPH10179183A (ja) * | 1996-12-20 | 1998-07-07 | Daicel Chem Ind Ltd | カルボン酸の製造方法 |
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2021506331A (ja) * | 2017-12-26 | 2021-02-22 | 味の素株式会社 | 発酵によるグリシンの製造方法 |
| JP7226449B2 (ja) | 2017-12-26 | 2023-02-21 | 味の素株式会社 | 発酵によるグリシンの製造方法 |
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Legal Events
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