CN112980823B - 一种适于工业化的固定化天冬氨酸酶以及利用其生产l-天冬氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种一步纯化固定化方法来固定天冬氨酸酶，并利用其生产L‑天冬氨酸，该方法能够有效避免引入其他无关蛋白带来的安全风险，且不需要对酶进行纯化，相对传统固定化方法更节约，更有效，可显著提高单位酶活，显著缩短反应时间，提高生产效率，具有广阔的推广前景。

Description

一种适于工业化的固定化天冬氨酸酶以及利用其生产L-天冬 氨酸的方法

技术领域

本发明涉及酶固定化技术及氨基酸生产领域，具体涉及一种利用固定化天冬氨酸酶生产天冬氨酸的方法。

背景技术

天门冬氨酸(Aspartic acid),又称氨基丁二酸。L-天门冬氨酸是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一,可作为氨解毒剂、肝机能促进剂、疲劳恢复剂等医药品和添加剂用于各种清凉饮料的生产,还可作为生化试剂,培养基和有机合成中间体。L-天门冬氨酸与L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)合成的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)。由天门冬氨酸合成的天门冬氨酸钾镁盐(脉安定)可用于治疗心率失常、心动过速、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、肝炎和肝硬化等疾病,天门冬氨酸氨基氢的取代衍生物可以作为治疗神经类疾病和大脑疾病的药物,它的聚合物聚天门冬氨酸是目前正在大力推广的一种新型绿色阻垢剂和水处理剂。

天门冬氨酸的生产主要包括化学法和生物催化法。化学法主要用于生产天门冬氨酸的外消旋体DL-天门冬氨酸。生物催化法包括游离细胞、固定化细胞及固定化酶法。目前工业上主要利用游离细胞或固定化细胞方法生产L-天冬氨酸，底物多为富马酸。固定化细胞生产L-天冬氨酸具有工艺简单、产量高、能够反复利用等优点。但由于细胞内还存在富马酸酶，可以催化富马酸生成苹果酸，生产过程中会产生苹果酸杂质，给天冬氨酸的提纯带来困难，因此这两种方法都需要对细胞进行筛选或基因工程改造。姜岷等2015年申请的专利“一种无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌及其构建方法与应用”(专利号：CN105316273 B)报道了一种无苹果酸副产品的大肠杆菌的构建办法。利用细胞催化生产L-天冬氨酸的另一个问题在于细胞中存在大量细菌蛋白，这些蛋白会不可避免地残留到L-天冬氨酸终产品中，给产品的后期应用，尤其是作为药品原料带来一定的风险。

TETSUYA TOSA等于1973年报道了利用固定化的天冬氨酸酶制备L-天冬氨酸的方法，不过其使用的菌体破碎后的粗酶制品，并未对天冬氨酸酶进行提纯，仍存在菌体蛋白残留带来的风险。这也是目前传统固定化酶生产工艺面临的共同问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明创新的采用了一步纯化固定化方法来固定天冬氨酸酶，并利用其生产L-天冬氨酸。本发明的方法能够有效避免引入其他无关蛋白带来的安全风险，且不需要对酶进行纯化，相对传统固定化方法更节约，更有效。另外，和传统菌体转化生产门冬氨酸生产工艺相比，本方法生产的固定化天冬氨酸酶可显著提高单位酶活，显著缩短反应时间，提高生产效率。

本发明的一个方面，提供了一种如下的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将天冬氨酸酶基因与甲酰甘氨酸合成酶识别序列融合，所述甲酰甘氨酸合成酶识别序列包含醛基化标签并可被甲酰甘氨酸合成酶识别；

(2)将步骤(1)获得的融合基因和甲酰甘氨酸合成酶基因分别连接到原核表达载体上；

(3)将步骤(2)构建好的表达载体转入宿主细胞，对两种酶进行同步诱导表达；

(4)离心收集诱导后的菌体，破碎，离心收集上清，与氨基载体混合进行固定化；

(5)淋洗步骤(4)获得的固定化天冬氨酸酶，冷藏保存备用。

在一种实施方案中，所述氨基载体优选为LX-1000EA、LX-1000HA、LX-1000NH或LX-1000EPHA。

在一种实施方案中，所述天冬氨酸酶基因来源于大肠杆菌，所述甲酰甘氨酸合成酶基因来源于肺炎链球菌属。

在一种实施方案中，所述天冬氨酸酶基因为大肠杆菌天冬氨酸酶基因的天然形式、基因重组形式或突变形式。

在一种实施方案中，步骤(1)中所述醛基化标签为：5’CTGTGCACACCATCGCGG 3’。

在一种实施方案中，步骤(2)具体为：将步骤(1)融合后的基因连接到pET30a表达载体获得ASPase-30a表达载体，将甲酰甘氨酸合成酶基因利用Gateway系统，先连接到Topo载体，再重组至PDEST17表达载体上，获得FGE-pdest17表达载体。

在一种实施方案中，步骤(3)具体为：将步骤(2)构建好的表达载体转入大肠杆菌，所述同步诱导表达的方法为：将大肠杆菌在含有氨苄霉素和卡那霉素的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入IPTG或乳糖对两种酶进行诱导。优选地，诱导剂为IPTG时浓度为0.2～1mM，诱导剂为乳糖时浓度为0.1～1mM，诱导条件为4-37℃，2-24h。

在一种实施方案中，步骤(4)中所述上清和氨基载体的质量比为20:1-1:1，反应温度4-30℃，pH6.5-9.0，反应时间2-24h。

在一种实施方案中，步骤(5)中所述的淋洗液为H₂O或或缓冲液。

进一步的，本发明的另一个方面，还提供一种利用固定化天门冬氨酸酶生产L-天冬氨酸的方法，具体包括以下步骤：

(1)配置50-250g/L富马酸溶液，氨水调pH；

(2)加入利用上述改进的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法制备的固定化天门冬氨酸酶，搅拌，反应；

(3)反应完成后，过滤固定化天门冬氨酸酶，重复利用；

(4)转化液经加热，调节pH，冷却析晶，淋洗，烘干后得L-天冬氨酸成品。

在一种实施方案中，步骤(1)中pH为7.5-9.0，反应液中加入1-2mM的Mg²⁺或Mn²⁺；

在一种实施方案中，优选地，步骤(2)中固定化酶:富马酸比例为1:200-1:10，反应温度为30-40℃；

在一种实施方案中，优选地，步骤(3)搅拌使用桨式或锚式搅拌，反应时间为0.5-24h，反应终点以富马酸含量小于2mg/ml计；固定化酶可反复使用20批以上。

本发明的技术方案具有如下优点：

1.和传统细胞法生产L-天冬氨酸工艺相比，本发明未增加工艺步骤；

2.生产过程中未用到戊二醛等有机试剂，有效降低生产成本，并且有利于降低工业化过程对环境可能造成的污染；

3.不需要对菌种进行基因敲除，节省了操作步骤，显著缩短反应时间，大大提高生产效率；

4.转化液中引入的外源蛋白量明显减少，为后续L-天冬氨酸的纯化提供了有利条件，减少了外源蛋白残留带来的安全性风险。

附图说明

图1是本发明天冬氨酸酶固定化前后蛋白电泳图；

其中，1：菌体破碎后沉淀；2：菌体破碎后上清；3：固定化后上清。图中箭头所示条带即为天冬氨酸酶。

图2是本发明游离细胞和固定化酶转化液中E.coli.菌体蛋白残留水平图；

图3是本发明固定化酶法转化和游离细胞转化速率对比图。

具体实施方式

为了更好的阐释本发明的目的、技术方案及优点，提供下述实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1基因获得和载体构建

NCBI网站获得大肠杆菌天冬氨酸酶基因序列(ASPase基因，Accession No.NC_000913.3)和肺炎链球菌属甲酰甘氨酸合成酶基因序列(FGE基因，Accession No.NC_000962.3)，送第三方服务机构(苏州金唯智生物科技有限公司)合成上述两种基因全长序列，其中ASPase基因3’端终止密码子前加固定化用标签序列5’CTGTGCACACCATCGCGG 3’，随后基因两侧分别加BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。合成好的ASPase基因利用酶切连接的方法连接入pET30a载体获得ASP-30a载体。

FGE基因利用Gateway系统，先连接到Topo载体，再重组至PDEST17载体上，获得FGE-pdest17载体。测序确认序列正确。

实施例2表达菌株的筛选

取测序确认正确的ASP-30a和FGE-pdest17质粒各100ng，分别与100μl BL21(DE3)、BL21(DE)plys、Rosetta(DE3)菌株感受态细胞混匀，冰上静置30min，42℃热击30sec，室温静置5min后加液体LB培养基，37℃摇床摇培30min，5000rpm离心1min，弃上清，沉淀用200μl无菌水重悬后，涂布含有50μg/mL氨苄霉素和30μg/mL卡那霉素的固体LB平板。37℃过夜培养。第二天挑取阳性单克隆，用含有50μg/mL氨苄霉素和30μg/mL卡那霉素的液体LB培养基培养过夜，加入IPTG，使终浓度为1mM/L，25℃诱导蛋白表达4h。取1mL培养液12000g离心1min，100μl蒸馏水重悬，加入100μl 2×SDS蛋白上样缓冲液，混匀，95℃加热10min，12000g离心5min，取上清进行SDS-PAGE检测ASPase和FGE的表达水平。挑选二者皆有表达并且表达量高的菌株作为候选菌株。

实施例3蛋白诱导发酵

取实施例2获得的候选菌株，于含有50μg/ml氨苄霉素和30μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃过夜培养。第二天取20ml培养液，进一步扩培至1L。待菌体浓度达到OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入IPTG，使终浓度为0.5mM。25℃诱导6h。将菌株发酵液6000g离心10min，弃上清，菌体用20mM磷酸盐缓冲液pH7.5，重悬，菌体浓度7.5％。菌体悬液进入高压均质机破碎。破碎后的均质液进入高速冷冻离心机离心，4℃，12000g，10min，保留上清，即酶液。测定酶液活性结果如表1所示：

表1

表达菌体	酶活(U/ml酶液)
		BL21(DE3)	580
BL21(DE3)plys	504
		Rosetta(DE3)	986

由此可见，Rosetta(DE3)菌株表现出最佳的发酵酶活，而常用的BL21菌种并不是诱导表达天冬氨酸酶基因的优选菌种。

实施例4固定化载体的筛选

选取不同氨基载体作为候选载体，首先利用20mM磷酸盐缓冲液在pH6.5-8.5条件下，浸泡1h，过滤。处理好的载体和实施例3中Rosetta(DE3)菌株发酵的酶液(调整浓度为7.5％)以1:10比例(质量：体积)混合，20℃，100rpm搅拌4小时后，过滤，以20mM磷酸盐缓冲液清洗3次，过滤即得固定化酶。测定不同载体所得固定化酶酶活(表2)。酶活测定方法如下：

取富马酸1克加超纯水15ml，加入预先配置好的0.1M MgSO4200微升，用氨水调PH7.9±0.1，搅拌至完全溶解，加水定容至20ml。取980微升底物，恒温摇床37℃预热10min，加入20微升菌体悬液或均质液，恒温摇床振荡，37℃反应10min，加入500微升甲醇灭活，液相测定天冬氨酸含量。

1U酶活定义为单位酶量在单位时间内催化生成的1毫摩尔门冬氨酸。

表2

载体	酶活(U)
		LX-1000HA(蓝晓科技)	9001
LX-1000EA(蓝晓科技)	9265
		LX-1000NH(蓝晓科技)	8754
LX-1000EPHA(蓝晓科技)	8932
		ReliZymeTM-HA403(Resindion公司)	7663
ReliZymeTM-EA403(Resindion公司)	7930
		ECA-1(百赛生物)	7525
ECA-2(百赛生物)	7126
		ECA-3(百赛生物)	7380
MI-BS1(创科生物)	8297
		MI-BS2(创科生物)	8039
SQ-HA01(善泉生物)	8562
		SQ-EA01(善泉生物)	8398

根据酶活测定显示，不同厂家不同种类的氨基载体对酶活有不同程度的影响，选择LX-1000EA用于进一步实验。

实施例4 ASPase的一步纯化固定化

LX-1000EA氨基载体首先利用20mM磷酸盐缓冲液pH6.5-8.5浸泡1h，过滤。处理好的载体以1：20-1：0.5的比例与实施例3中Rosetta(DE3)菌株发酵的天门冬氨酸酶酶液混合，20℃，100rpm搅拌4小时后，过滤，以20mM磷酸盐缓冲液清洗3次，过滤即得固定化天冬氨酸酶。如图1所示，电泳结果显示本发明的ASPase特异性良好，可选择性被氨基载体固定，而其他杂蛋白则不被吸附。

实施例5利用固定化天冬氨酸酶转化L-天冬氨酸

使用250ml烧杯配置200ml浓度200g/L富马酸溶液，用氨水调pH到7.9±0.1，水温预热到37℃备用。向反应器中加入实施例4中制备的固定化酶1.0g。反应器中加入配置好的富马酸溶液200ml。称取硫酸镁0.024g，加入反应器中，开始计时转化(0小时)。转化过程中温度控制在37±1℃，pH值控制在7.9±0.1，转化期间每0.5小时记录一次温度、在线PH。转化0.5小时开始取样，测富马酸含量、苹果酸含量、天门冬氨酸含量,随后每0.5小时取样检测富马酸含量、苹果酸含量、天门冬氨酸含量,当富马酸含量＜1.5mg/ml时准备放料。使用真空抽滤将料液从反应器底部抽出(保证固定化酶留在反应器中)，取样用于检测每批次产物中富马酸浓度、门冬氨酸浓度、苹果酸浓度以及E.coli.菌体蛋白残留(实施例6中详述)，并计算每批次中富马酸转化L-天冬氨酸的转化率(表3)。使用50ml水淋洗固定化酶淋洗完毕后重复进行下一批转化。

初步试验，按本方法生产的固定化酶至少可重复使用20批以上。

表3

实施例6游离细胞和固定化酶转化液E.coli.菌体蛋白残留检测

将实施例5中第1批次转化液和对比例中转化液用E.coli.菌体蛋白残留检测试剂盒(E.coli.HCP ELISA Kit，Cat#F410，Cygnus)测定宿主蛋白残留，具体测定方法如下：

将试剂盒同时取出于室温平衡20min。取出所需量的Anti-E coli coatedmicrotiter strip，用移液器依次加入25μL/孔标准品、质控样品和供试品溶液，每个样品平行双复孔。将Anti-E coli:HRP加入Anti-E coli coated microtiter strips，每孔100μL。用封板膜或96孔板盖封住包被板，置于微孔板振荡器上，室温，震荡1h30min±10min。洗板：快速倒置甩去板内溶液,在干净吸水纸上倒扣停留5-10s，拍去残留溶液，用洗瓶加入1×Wash Solution,至孔满，立即甩去板内洗液。重复该步骤共洗4次，在干净吸水纸上拍去残留洗液。每孔加入100μL TMB Substrate,避光室温显色30min。每孔加入100μL StopSolution。450波长处读取吸光度值。按标准品浓度-吸光度平均值绘制标准曲线，用二项式曲线或适宜的其它非线性曲线拟合计算样品稀释液测定值。

每样3个重复，测定结果如图2显示，固定化天门冬氨酸酶转化液中未检出蛋白残留，说明本发明方法制备的固定化酶较游离细胞生产工艺具有更高的产品质量和更好的安全性。

对比例1游离细胞转化L-天冬氨酸实验

本发明中用于效果对比的游离细胞均为无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌细胞。

使用250ml烧杯配置200ml浓度200g/L富马酸溶液，用氨水调pH到7.9±0.1，水温预热到37℃备用。向反应器中加入游离细胞1.0g。反应器中加入配置好的富马酸溶液200ml。称取硫酸镁0.024g，加入反应器中，开始计时转化(0小时)。转化过程中温度控制在37±1℃，pH值控制在7.9±0.1，转化期间每1小时记录一次温度、在线PH。转化2小时开始取样，测富马酸含量、苹果酸含量、天门冬氨酸含量。随后每1小时取样检测富马酸含量、苹果酸含量、天门冬氨酸含量。当富马酸含量＜1.5mg/ml时准备放料。使用真空抽滤将料液从反应器底部抽出，取样用于检测E.coli.菌体蛋白残留。

同实施例6，每样3个重复，测定结果如图3显示，游离的L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌细胞转化L-天冬氨酸的时间相对于固定化酶延长了约10倍，说明本发明方法显著提高了生产效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将天冬氨酸酶基因与甲酰甘氨酸合成酶识别序列融合，所述甲酰甘氨酸合成酶识别序列包含醛基化标签并可被甲酰甘氨酸合成酶识别；

(2)将步骤(1)融合后的基因和甲酰甘氨酸合成酶基因分别连接到原核表达载体上；

(3)将构建好的载体转入大肠杆菌，对两种酶进行同步诱导表达；

(4)离心收集诱导完的菌体，破碎后离心收集上清，与氨基载体混合进行固定化，所述上清和氨基载体的质量比为20:1-1:1，反应温度4～30℃，pH6.5-9.0，反应时间2-24h。

2.如权利要求1所述的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于：所述天冬氨酸酶基因为大肠杆菌天冬氨酸酶基因的天然形式、基因重组形式或突变形式；所述甲酰甘氨酸合成酶基因来源于肺炎链球菌属。

3.如权利要求1所述的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于：步骤(1)中所述醛基化标签为：5’CTGTGCACACCATCGCGG 3’。

4.如权利要求1所述的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于：步骤(1)融合后的基因连接到pET30a载体获得ASPase-30a表达载体，甲酰甘氨酸合成酶基因利用Gateway系统，先连接到Topo载体，再重组至PDEST17载体上，获得FGE-pdest17载体。

5.如权利要求1所述的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于：步骤(3)中所述同步诱导表达的方法为：将转入了构建载体的宿主细胞在含有氨苄霉素和卡那霉素的液体LB培养基中培养至OD600＝0.6-0.8时，加入IPTG或乳糖对两种酶进行诱导。

6.如权利要求5所述的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于：当诱导剂为IPTG时浓度为0.2～1mM，当诱导剂为乳糖时浓度为0.1～1mM，于4-37℃诱导2～24h。

7.一种利用固定化天门冬氨酸酶生产L-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

(1)配置50-250g/L富马酸溶液，氨水调pH；

(2)加入按照权利要求1-6任一所述的方法制备的固定化天门冬氨酸酶，其中，所述固定化天门冬氨酸酶与富马酸比例为1:200-1:10，使用桨式或锚式搅拌，在30-40℃条件下反应0.5-24h；

(3)反应终点以富马酸含量小于2mg/ml计，反应完成后，过滤固定化天门冬氨酸酶，重复利用；

(4)转化液经加热，调节pH，冷却析晶，淋洗，烘干后得L-天冬氨酸成品。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中pH为7.5-9.0，

反应液中加入1-2mM的Mg²⁺或Mn²⁺。

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