CN110003039A - 一种转化液中l-天冬酰胺的分离纯化方法 - Google Patents

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郭小雷
杨军
张楚扬
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Abstract

本发明公开了一种转化液中L‑天冬酰胺的分离纯化方法，包括以下步骤：(1)将生物酶法制备L‑天冬酰胺的转化液依次经微滤膜和超滤膜过滤；(2)将超滤膜过滤后的清液用活性炭脱色，得到脱色清液；(3)将脱色清液经电渗析膜处理，得到电渗析处理液；(4)将电渗析处理液采用大孔吸附树脂洗脱，洗脱液浓缩，加入95％乙醇，降温结晶，离心，得到L‑天冬酰胺粗品；(5)将L‑天冬酰胺粗品加入乙醇水溶液浆洗，离心，得到纯化后的L‑天冬酰胺。采用本发明的方法可以制备得到含量在99％以上的L‑天冬酰胺精品。

Description

一种转化液中L-天冬酰胺的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种转化液中L-天冬酰胺的分离纯化方法。
背景技术
L-天冬酰胺是一种非必需氨基酸，可以用于制作代糖，能与还原糖或羰基发生美拉德反应，生产丙烯酰胺，用于薯条、面包等烘焙食品中。医学上，L-天冬酰胺常用于降压、利尿剂等使用，另外，L-天冬酰胺能通过解除谷氨酰胺抑制引发的细胞凋亡，从而实现肿瘤的治疗。
目前，L-天冬酰胺的制备主要采用提取法、化学合成法以及生物酶法。其中，提取法是通过富含L-天冬酰胺的天然材料如白羽扇豆、草木犀等中分离；该方法受原料影响大，工艺复杂难以控制。化学合成法主要通过L-天冬氨酸与氨水进行酰胺化制得，但该方法产生大量废液，在目前绿色制造的大背景下难以产生工业效益。生物酶法主要通过天冬酰胺合成酶催化铵离子或谷氨酰胺的氨基进行转移；生物酶法具有环境友好、反应温和易于控制等优势。CN105925520A中构建大肠杆菌基因工程菌，将延胡索酸转化为L-天冬酰胺，产物浓度高达160g/L以上，但残留延胡索酸和L-天冬氨酸。张奇等通过分子生物学方法克隆来源于大肠杆菌的天冬酰胺合成酶基因，并构建基因工程菌全细胞高密度催化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺，L-天冬氨酸转化率为95.8％(“生物转化法制备L-天冬酰胺”，中国生物工程杂志，2016，36(1)：63-67)。但生物酶法存在的问题主要是底物L-天冬氨酸的残留不易控制，转化液中同时存在L-天冬酰胺和L-天冬氨酸，分离纯化L-天冬酰胺的难度较大。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种转化液中L-天冬酰胺的分离纯化方法。采用本发明的方法可以制备得到含量在99％以上的L-天冬酰胺精品。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种转化液中L-天冬酰胺的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)将生物酶法制备L-天冬酰胺的转化液依次经微滤膜和超滤膜过滤；
(2)将超滤膜过滤后的清液用活性炭脱色，得到脱色清液；
(3)将脱色清液经电渗析膜处理，得到电渗析处理液；
(4)将电渗析处理液采用大孔吸附树脂洗脱，洗脱液浓缩，加入95％乙醇，降温结晶，离心，得到L-天冬酰胺粗品；
(5)将L-天冬酰胺粗品加入乙醇水溶液浆洗，离心，得到纯化后的L-天冬酰胺。
优选的，步骤(1)中，所述微滤膜为陶瓷膜或有机管式膜，其中，陶瓷膜孔径为50-200nm，有机管式膜孔径为30-100nm；所述超滤膜为聚醚砜材质，截留分子量为3000-10000D。
优选的，步骤(1)中，采用微滤膜和超滤膜处理时控制温度不超过35℃。
在微滤膜和超滤膜处理时，控制温度不超过35℃是为了保证酶的活性，以备再次使用。同时，L-天冬酰胺在水溶液遇热易分解，所以将温度控制在不超过35℃可以避免L-天冬酰胺发生分解，影响纯化收率。
优选的，步骤(2)中，所述活性炭为粉状活性炭，目数为200-400目，碘值800-1300，亚甲基蓝吸附值≥15，脱色温度为30-50℃。
经试验发现，采用上述性能的活性炭，其脱色效果最优。
优选的，步骤(3)中，所述电渗析为单极或双极膜电渗析，PITC柱前衍生法检测L-天冬氨酸和L-天冬酰胺，待浓缩池中L-天冬氨酸的含量降至0.5g/L以下时，结束电渗析处理。
优选的，步骤(4)中，所述大孔吸附树脂为弱极性或中极性苯乙烯系吸附树脂。包括不仅限于三星树脂DM301、CAD-40、DM130、AB-8，争光树脂DM130、CAD-45。
优选的，步骤(4)中，将洗脱液在40-60℃下采用真空浓缩至L-天冬酰胺的浓度为50-100g/L。
优选的，步骤(4)中，所述95％乙醇加入的量为浓缩后洗脱液体积的0.5-2倍，降温至8-20℃，保持搅拌，冷却结晶。
优选的，步骤(5)中，所述乙醇水溶液的体积浓度为60-90％；所述乙醇水溶液的加入量为L-天冬酰胺粗品重量的2-6倍。
浆洗是将L-天冬酰胺粗品与乙醇水溶液混合，搅拌均匀的过程，浆洗的作用是洗去粗品表面吸附或晶体内部部分包含的杂质。乙醇水溶液的浓度对杂质的去除和粗品精制的收率有影响，经试验发现，乙醇水溶液的体积浓度为60-90％时，L-天冬酰胺精品的收率较高。
本发明的有益效果：
采用本发明的方法可以有效的从生物酶法制备L-天冬酰胺的转化液中将L-天冬酰胺分离纯化出来，不需要重结晶进行精制，一次结晶即得到成品，制备的L-天冬酰胺精品含量在99％以上；而且产品总收率在84％以上。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本文中的“转化液”是指采用生物酶法制备L-天冬酰胺的转化液；即以L-天冬氨酸为底物，经天冬酰胺合成酶催化制备的转化液。
正如背景技术部分所介绍的，采用生物酶法制备L-天冬酰胺具有环境友好、反应温和易于控制等优势。但生物酶法制备L-天冬酰胺的转化液中同时存在L-天冬酰胺和L-天冬氨酸，分离纯化L-天冬酰胺的难度较大。现有技术中对于L-天冬氨酸与L-天冬酰胺的分离，主要使用离子交换树脂处理，其分离效率不高，酸碱废水量大。
基于此，本发明提供了一种转化液中L-天冬酰胺的分离纯化方法，在本发明的一种实施方案中，所述分离纯化方法包括以下步骤：
(1)L-天冬酰胺转化液经微滤膜、超滤膜过滤，过滤过程中控制温度；所采用的微滤膜为陶瓷膜或有机管式膜，陶瓷膜孔径为50-200nm，有机管式膜孔径为30-100nm；超滤膜为聚醚砜材质，截留分子量为3000-10000D。微滤膜和超滤膜处理时控制温度不超过35℃。
(2)超滤膜过滤清液用活性炭脱色，保温搅拌，除去活性炭后得到脱色清液；所采用的活性炭为食品级或医药级粉状活性炭，目数为200-400目，碘值800-1300，亚甲基蓝吸附值≥15，脱色温度为30-50℃，活性炭的添加量为0.5-3％(质量/体积，g/100ml)，脱色时间为0.5-1.0h。
(3)脱色清液经电渗析膜设备处理，监测过程中浓缩池和阴极池的L-天冬氨酸和L-天冬酰胺变化；所述电渗析为单极或双极膜电渗析，PITC柱前衍生法检测L-天冬氨酸和L-天冬酰胺，待浓缩池中L-天冬氨酸的含量降至0.5g/L以下时，结束电渗析处理。液相色谱柱为天津博纳艾杰尔Venusil AA，流动相A—7.6g无水乙酸钠+925ml高纯水，用冰醋酸调pH至6.50，再加70ml乙腈混合均匀，流动相B—80％乙腈；柱温40℃，流速1ml/min。
(4)电渗析处理液流通大孔吸附树脂，得到洗脱液；将洗脱液在40-60℃下采用真空浓缩至L-天冬酰胺的浓度为50-100g/L，加入95％乙醇，加入的体积为浓缩后洗脱液体积的0.5-2倍，降温至8-20℃，保持搅拌，冷却结晶，离心得到L-天冬酰胺粗品。
(5)将L-天冬酰胺粗品加入体积浓度为60-90％的乙醇水溶液进行浆洗，乙醇水溶液的加入量为L-天冬酰胺粗品重量的2-6倍，离心，得到L-天冬酰胺精品。
本发明的转化液中L-天冬酰胺的分离纯化方法中，各步骤相辅相成，是一个有机的整体，其中，首先将转化液采用特定孔径的微滤膜进行初滤，用于去除转化液中的菌体(或粗酶)及大分子蛋白，然后用超滤膜进行再次过滤，以除去小分子蛋白和大分子色素；超滤膜过滤后的清液采用活性炭进行脱色处理，用于将转化液中的色素除去；将脱色后的清液采用电渗析法去除L-天冬氨酸和部分的无机盐；再将电渗析处理液通过大孔树脂进行洗脱，进一步去除色素、小分子蛋白等物质；然后将洗脱液进行真空浓缩-醇析结晶，用于浓缩、结晶获得粗品；最后将粗品进行浆洗，所述浆洗是指将粗品与乙醇水溶液混合，搅拌均匀的过程，其作用是洗去粗品表面吸附或晶体内部部分包含的杂质，从而得到L-天冬酰胺精品。
本发明的L-天冬酰胺的分离纯化方法中，各处理步骤的顺序是需要严格限定的，其中，电渗析处理是除去L-天冬氨酸的关键步骤，因此，在电渗析处理前需要尽可能多的去除杂质，以免影响电渗析中膜的分离效率。经试验发现，在电渗析处理前采用微滤、超滤和活性炭处理，可以有效去除转化液中含量最大的的杂质，有效提高了电渗析中膜的分离效率；大孔树脂吸附过程容易受到其他杂质影响，因此将大孔树脂吸附设置在电渗析处理之后。该处理过程不能进行各工段的调整，否则会影响L-天冬酰胺的纯化效率和产品品质。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：
L-天冬酰胺转化液中L-天冬酰胺含量52g/L，L-天冬氨酸含量为2.9g/L，体积为20L。温度控制30℃，经50nm陶瓷膜和截留分子量6000D的超滤膜处理后，体积为29.5L，L-天冬酰胺含量31.8g/L，L-天冬氨酸含量为1.8g/L。加入1％的糖用粉状活性炭，50℃脱色1h，透光率T430nm＝94.2％。双极膜电渗析处理脱色清液，电流密度为30mA/cm2，直至L-天冬氨酸含量降至0.4g/L，将处理液流通CAD-40大孔吸附树脂，透光率T430nm＝98.2％。流通液在50℃真空浓缩至L-天冬酰胺浓度为95g/L，匀速滴加2倍体积的95％乙醇，降温至10℃，保持搅拌2h，离心收集粗品1230g。粗品加入2倍重量即2.46kg的90％乙醇常温浆洗，再次离心收集晶体烘干得精品879.5g，经HPLC检测含量为99.06％，总收率为84.6％。
实施例2：
L-天冬酰胺转化液中L-天冬酰胺含量39.2g/L，L-天冬氨酸含量为2.1g/L，体积为30L。温度控制35℃，经30nm有机管式膜和截留分子量3000D的超滤膜处理后，体积为43.6L，L-天冬酰胺含量24.5g/L，L-天冬氨酸含量为1.3g/L。加入1.5％的竹质粉状活性炭ZX-301，60℃脱色1h，透光率T430nm＝95.6％。双极膜电渗析处理脱色清液，电流密度为20mA/cm2，直至L-天冬氨酸含量降至0.35g/L，将处理液流通DM130大孔吸附树脂，透光率T430nm＝98.7％。流通液在60℃真空浓缩至L-天冬酰胺浓度为100g/L，匀速滴加2.5倍体积的95％乙醇，降温至10℃，保持搅拌2h，离心收集粗品1251.7g。粗品加入2倍重量即2.5kg的85％乙醇常温浆洗，再次离心收集晶体烘干得精品998.8g，经HPLC检测含量为99.28％，总收率为84.9％。
实施例3：
L-天冬酰胺转化液中L-天冬酰胺含量48g/L，L-天冬氨酸含量为2.3g/L，体积为40L。温度控制25℃，经100nm陶瓷膜和截留分子量8000D的超滤膜处理。向处理后的清液中加入1％的糖用粉状活性炭，40℃脱色1h，透光率T430nm＝95.8％。双极膜电渗析处理脱色清液，电流密度为30mA/cm2，直至L-天冬氨酸含量降至0.3g/L，将处理液流通DM301大孔吸附树脂，透光率T430nm＝99.2％。流通液在50℃真空浓缩至L-天冬酰胺浓度为100g/L，匀速滴加2倍体积的95％乙醇，降温至10℃，保持搅拌2h，离心收集粗品1749.8g。粗品加入2倍重量即3.50kg的90％乙醇常温浆洗，再次离心收集晶体烘干得精品1697.3g，经HPLC检测含量为99.50％，总收率为88.4％。
对比例1：
L-天冬酰胺转化液中L-天冬酰胺含量48g/L，L-天冬氨酸含量为2.3g/L，体积为20L。加入1％的糖用粉状活性炭，40℃脱色1h。双极膜电渗析处理脱色清液，电流密度为30mA/cm2，直至L-天冬氨酸含量降至0.3g/L，将处理液流通DM301大孔吸附树脂。流通液在50℃真空浓缩至L-天冬酰胺浓度为100g/L，匀速滴加2倍体积的95％乙醇，降温至10℃，保持搅拌2h，离心收集粗品。粗品加入2倍重量90％乙醇常温浆洗，再次离心收集晶体烘干得精品683.5g，经HPLC检测含量为98.20％，总收率为71.2％。
对比例2：
L-天冬酰胺转化液中L-天冬酰胺含量48g/L，L-天冬氨酸含量为2.3g/L，体积为20L。温度控制25℃，经100nm陶瓷膜和截留分子量8000D的超滤膜处理。双极膜电渗析处理超滤后的清液，电流密度为30mA/cm2，直至L-天冬氨酸含量降至0.3g/L，将处理液流通DM301大孔吸附树脂。流通液在50℃真空浓缩至L-天冬酰胺浓度为100g/L，匀速滴加2倍体积的95％乙醇，降温至10℃，保持搅拌2h，离心收集粗品。粗品加入2倍重量的90％乙醇常温浆洗，再次离心收集晶体烘干得精品705.6g，经HPLC检测含量为98.34％，总收率为73.5％。
对比例3：
L-天冬酰胺转化液中L-天冬酰胺含量48g/L，L-天冬氨酸含量为2.3g/L，体积为20L。温度控制25℃，经100nm陶瓷膜和截留分子量8000D的超滤膜处理。向处理后的清液中加入1％的糖用粉状活性炭，40℃脱色1h。双极膜电渗析处理脱色清液，电流密度为30mA/cm2，直至L-天冬氨酸含量降至0.3g/L。将电渗析处理液在50℃真空浓缩至L-天冬酰胺浓度为100g/L，匀速滴加2倍体积的95％乙醇，降温至10℃，保持搅拌2h，离心收集粗品。粗品加入2倍重量的90％乙醇常温浆洗，再次离心收集晶体烘干得精品720g，经HPLC检测含量为98.45％，总收率为75.0％。
对比例4：
L-天冬酰胺转化液中L-天冬酰胺含量48g/L，L-天冬氨酸含量为2.3g/L，体积为20L。将转化液流通DM301大孔吸附树脂洗脱，采用双极膜电渗析处理洗脱液，电流密度为30mA/cm2，直至L-天冬氨酸含量降至0.5g/L。电渗处理液在50℃真空浓缩至L-天冬酰胺浓度为100g/L，匀速滴加2倍体积的95％乙醇，降温至10℃，保持搅拌2h，离心收集粗品。粗品加入2倍重量的90％乙醇常温浆洗，再次离心收集晶体烘干得精品657.6g，经HPLC检测含量为98.12％，总收率为68.5％。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种转化液中L-天冬酰胺的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生物酶法制备L-天冬酰胺的转化液依次经微滤膜和超滤膜过滤；
(2)将超滤膜过滤后的清液用活性炭脱色，得到脱色清液；
(3)将脱色清液经电渗析膜处理，得到电渗析处理液；
(4)将电渗析处理液采用大孔吸附树脂洗脱，洗脱液浓缩，加入95％乙醇，降温结晶，离心，得到L-天冬酰胺粗品；
(5)将L-天冬酰胺粗品加入乙醇水溶液浆洗，离心，得到纯化后的L-天冬酰胺。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述微滤膜为陶瓷膜或有机管式膜；所述超滤膜为聚醚砜材质。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔径为50-200nm，有机管式膜孔径为30-100nm；所述超滤膜的截留分子量为3000-10000D。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用微滤膜和超滤膜处理时控制温度不超过35℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述活性炭为粉状活性炭，目数为200-400目，碘值800-1300，亚甲基蓝吸附值≥15，脱色温度为30-50℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述电渗析为单极或双极膜电渗析，PITC柱前衍生法检测L-天冬氨酸和L-天冬酰胺，待浓缩池中L-天冬氨酸的含量降至0.5g/L以下时，结束电渗析处理。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述大孔吸附树脂为弱极性或中极性苯乙烯系吸附树脂。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，将洗脱液在40-60℃下采用真空浓缩至L-天冬酰胺的浓度为50-100g/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述95％乙醇加入的量为浓缩后洗脱液体积的0.5-2倍，降温至8-20℃，保持搅拌，冷却结晶。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述乙醇水溶液的体积浓度为60-90％；所述乙醇水溶液的加入量为L-天冬酰胺粗品重量的2-6倍。
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