KR20130105433A - 대장균의 고농도 배양방법 - Google Patents

대장균의 고농도 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 단백질을 발현시키는 형질전환된 대장균으로부터 재조합 단백질의 생산을 최대화하기 위하여 대장균의 균체증식 단계와 재조합 단백질 발현유도 단계를 포함하여, 대장균의 균체증식을 최대화할 수 있는 형질전환된 대장균의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 배양방법을 사용하면, 목적하는 재조합 단백질을 생산하기 위한 형질전환된 대장균을 높은 배양농도로 증식시켜서, 균체의 생산성을 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라 목적하는 재조합 단백질의 생산수율을 증대시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 재조합 단백질의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

대장균의 고농도 배양방법{Method of culturing E. coli for high density}
본 발명은 대장균의 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 재조합 단백질을 발현시키는 형질전환된 대장균으로부터 재조합 단백질의 생산을 최대화하기 위하여 대장균의 균체증식 단계와 재조합 단백질 발현유도 단계를 포함하여, 대장균의 균체증식을 최대화할 수 있는 대장균의 배양방법에 관한 것이다.
대장균은 빠른 성장 속도와 축적된 발효 및 유전 공학 기술로 인하여 다양한 유용 단백질의 대량생산을 위하여 현재 가장 널리 이용되고 있는 숙주세포로 많이 이용되고 있다. 재조합 단백질을 고효율로 생산하기 위해서는 재조합 대장균을 고농도로 배양하는 것이 요구되는데 이를 위하여 복합배지(complex medium), 합성배지(synthetic medium), 반합성배지(semi-synthetic medium)등 다양한 조성의 배지와 정속주입(constant feeding), 계단식 증가(stepwise increase), 지수적 증가(exponential), 비 성장속도(specific growth rate control)에 의한 조절, pH 및 용존산소에 의한 조절(pH-stat, DO-stat), 포도당 및 초산농도에 의한 조절(glucose, acetic acid concentration control)등 다양한 배지주입 방법들이 개발되어 있다. 그러나 실질적으로는 각각의 재조합 균주에 대하여 특이적으로 작용하는 배양방법과 최적조건이 존재하여 배지 주입방법의 선택과 배지를 포함한 배양 방법의 최적화를 시켜주는 것이 고수율의 단백질 생산에 중요하다.
일반적으로, 재조합 대장균에 의한 재조합 단백질의 생산시, 해당 프로모터 및 발현 단백질의 특성에 따라 세포의 성장과 단위 세포당 발현량이 영향을 받게 된다. 강력한 프로모터에 의하여 단백질의 발현이 조절되는 시스템의 경우, 재조합 단백질의 발현속도가 빠르게 되면 숙주 세포의 에너지 대사 균형에 영향을 주어 세포의 성장을 저해할 수 있다. 특히 발현 단백질이 숙주세포에 직접 악영향을 끼치는 경우에는 세포 성장이 더욱 저해된다.
강력한 유도성 프로모터에 의한 단백질의 발현은 상기한 원인들로 인하여 숙주세포 자체에 큰 부담으로 작용하게 되는 바, 이러한 부담을 최소화 시킬수록 재조합 단백질의 대량생산이 달성된다. 상술한 조건을 고려한 최적의 발현 시기는 동일한 발현 벡터와 동일한 숙주세포를 사용하더라도, 발현되는 단백질의 특성에 따라 그 시기가 다를 수가 있으며, 발현 시기가 세포성장 및 발현에 미치는 영향의 경중에 있어서도 다를 수 있다. 또한 세포의 성장속도 및 세포의 균체량은 단백질 생산에 영향을 미친다. 동일한 발현량을 갖는 단위 세포 (singel cell)의 경우 보다 많은 균체의 생산은 단백질 생산 수율을 높일 수 있다. 따라서, 고농도 세포 균체량을 얻기 위한 최적의 배양 조건의 확립은 재조합 미생물을 이용한 재조합 단백질 생산에 매우 중요하다.
형질전환 대장균의 단백질 합성은 성장환경과 관련된 균체 내의 여러 생리/생태학적인 요인들 [플라스미드 안정성 및 카피수, 전사 및 해독 효율, 발현단백질의 용해도, 단백질분해(proteolysis), 막 보전(membrane integrity) 등]과 밀접한 관계가 있으므로 수율 및 생산성을 극대화하는 최적 배양조건을 확립해야 한다. 따라서 재조합 단백질을 고수율로 발현시키기 위해서는 고농도로 배양된 재조합 대장균의 배양액에 IPTG등 적당한 발현유도인자의 투입과 단백질 생산에 적당한 조성의 배지를 적합한 방법에 의하여 주입해야 하며 필요에 따라 그 조성과 방법 등을 달리하여 재조합 단백질을 생산해야 한다 (Yee and Blanch, 1992, Bio/Technol. 10, 1550-1556).
대장균에서 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 대표적으로 3가지로 구분될 수 있는데 첫째는 대장균 세포내로 수용성으로 발현시키는 방법이고 둘째는 시그날 서열을 이용하여 대장균의 periplasm으로 발현시키는 방법이 있다. 마지막으로 IB(Inclusion body)형태로 발현시키는 방법이 있는데, 일반적으로 고수율로 단백질을 발현시키기 위하여 마지막 방법을 가장 많이 이용한다.
IB형태로 발현을 시키는 경우 대장균의 고농도의 성장이 필수적이다. 구체적으로는, 세포당 단백질 발현율이 비슷하다고 봤을 때 대장균이 고농도로 성장하면 할수록 단백질을 고수율로 얻을 수가 있기 때문에 대장균을 고농도로 성장시키기 위한 다양한 시도들이 존재하였다. 대한민국 등록특허 제10-0235315호는 인성장 호르몬을 과발현하기 위하여 융합단백질을 이용하였으나 1리터당 균체 질량이 약 90~100g인 것으로 확인되었다. 또한 두 단계에 걸친 발효 조건을 이용한 재조합 단백질 생산 공정에서 보면 마지막 흡광도(OD600) 값이 150을 넘지 않는 것을 확인할 수 있으며 (Microb Cell Fact. 2008 Aug 7;7:26), salmosin 이라는 단백질 발현을 위한 고농도 배양 조건에서도 1리터당 65.70g의 IB를 얻을 수밖에 없었다 (J Microbiol Biotechnol. 2011 Oct;21(10):1053-6). 그리고 IFN gamma를 생산하기 위한 배양조건에서도 배양 후 균체의 양이 1리터에 약 100g 수준밖에 되지 않았다 (J Ind Microbiol Biotechnol. 2004 Feb;31(2):63-9. Epub 2004 Feb 19). 즉, 여전히 보다 고농도의 대장균 배양방법이 필요하다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 재조합 단백질을 고수율로 생산하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 형질전환된 대장균의 균체증식 단계와 재조합 단백질 발현유도 단계를 구별하여 서로 다른 배지를 사용하여 배양할 경우, 상기 형질전환된 대장균으로부터 재조합 단백질을 대량으로 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 대장균을 고농도로 배양할 수 있는 대장균의 배양방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 대장균을 고농도로 배양할 수 있는 대장균의 배양방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (ⅰ) 균체 성장용 배지를 이용하여 배지의 pH가 0.1 이상 증가할 때까지 대장균을 회분식으로 배양하는 단계; (ⅱ) 배지의 pH가 증가하는 시점에서 1차 주입배지를 부가하면서 유가식으로 배양하여 대장균을 증식시키는 단계; 및, (ⅲ) 배양액의 흡광도(OD600)가 150이상인 시점에서 2차 주입배지를 부가하면서 유가식으로 배양하는 단계를 포함하는, 형질전환된 대장균의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 목적상 상기 대장균은 재조합 단백질을 발현하는 형질전환된 대장균일 수 있다.
본 발명의 용어 "균체 성장용 배지"란, 대장균의 균체를 증식시키기 위한 배지를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 균체 성장용 배지는 대장균의 성장환경을 조성하기 위한 초기 배양배지 및 pH를 조절하고 대장균의 성장을 촉진하기 위한 Trace metal 용액을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 초기 배양배지는 특별히 이에 제한되지 않으나, 트립톤, 효모추출물, NaCl, KH2PO4 및 (NH4)2HPO4를 포함함이 바람직하고, 상기 Trace metal 용액은 특별히 이에 제한되지 않으나 Citric acid, FeCl2, H3BO3, MnCl2, CuCl2, Na2MoO4, CoCl2, ZnCl2 및 EDTA를 포함함이 바람직하다. 아울러, 상기 균체 성장용 배지에 포함된 각 구성성분의 함량은 바람직하게는 트립톤 20g/L, 효모추출물 10g/ℓ, NaCl 10g/ℓ, KH2PO4 207.5g/ℓ, (NH4)2HPO4 50g/ℓ, Citric acid 268g/ℓ, FeCl2 270g/ℓ, H3BO3 30g/ℓ, MnCl2 100g/ℓ, CuCl2 15g/ℓ, Na2MoO4 25g/ℓ, CoCl2 25g/ℓ, ZnCl2 20g/ℓ 및 EDTA 0.5M일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않으며, 당업자가 필요에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은, 상기 (ⅲ) 단계와 동시에 또는 그 후에, 재조합 단백질을 발현하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, (ⅲ)단계와 동시에 재조합 단백질을 발현시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2차 주입배지에 단백질 발현 유도 물질을 첨가하는 방식으로 이루어질 수 있다. 또한, 바람직하게는 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 IPTG의 첨가량은 0.1 내지 0.5 mM인 것일 수 있다. 상기 IPTG의 첨가는 배양액의 흡광도(OD600)가 120이상인 시점에 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 면역글로불린 Fc 단편을 발현시킬 수 있는 형질전환된 대장균 HM11201(KCCM-10660P)을 대표 균주로 선택하여 상기 균주에서 면역글로불린 Fc 단편을 발현시키기 위하여, (ⅲ)단계에서 주입하는 2차 주입배지에 IPTG를 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다.
본 발명의 용어 "형질전환된 대장균"이란, 목적하는 재조합 단백질을 발현 및 생산할 수 있도록 상기 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현벡터의 형태 또는 염색체에 삽입되는 형태로 도입된 대장균을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 형질전환된 대장균에 도입된 폴리뉴클레오티드 및 발현벡터와 상기 대장균으로부터 생산될 수 있는 재조합 단백질은 특별히 제한되지 않으나, 보다 용이하게 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 락토오스 작용자(Lac operator)를 포함하는 발현벡터가 도입되어, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)에 의하여 목적하는 재조합 단백질의 발현을 유도할 수 있도록 구성됨이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 형질전환된 대장균은 면역글로불린 Fc 단편을 발현시킬 수 있는 대장균 HM11201(KCCM-10660P)을 사용하였다(대한민국 등록특허 제824505호).
본 발명의 용어 "회분식 배양(batch culture)"이란, 배양용기 내에 배양할 미생물과 함께 최초의 원료 및 영양물질을 포함하는 배양액을 모두 가한 후 1회 배양하는 방법을 의미하는데, 상기 원료 및 영양물질을 추가하는 것이 불가능하다는 단점이 있는 반면, 배양조건의 조절이 불가능하거나 또는 오염의 우려가 있는 배양의 경우 성공율이 높다는 장점이 있어, 초기 개발단계 또는 실험실 수준의 연구에 사용된다. 본 발명의 목적상 상기 회분식 배양은 형질전환된 대장균의 균체가 본격적인 증식에 돌입하여 배지의 pH가 증가되는 시점까지 수행된다. 이때, 배지의 pH 증가는 특별히 이에 제한되지 않으나 회분식 배양시에 유지되는 초기 pH에서 0.1 이상의 값이 증가한 경우에 해당한다.
본 발명의 용어 "1차 주입배지"란, 균체 성장용 배지를 이용한 회분식으로 배양을 수행하여 배지의 pH가 증가하고, 대장균이 증식하는 시작하는 시점에서 상기 대장균의 증식을 촉진하기 위하여 유가식 배양방법으로 부가하는 배지를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 1차 주입배지는 효모추출물과 포도당을 포함하고, 상기 균체 성장용 배지에 추가로 부가하여 사용될 수 있다. 상기 효모추출물, 포도당 등의 성분의 함량은 특별히 제한되지 않고, 당업자가 필요에 따라 적절하게 선택할 수 있으나, 바람직하게는 200 내지 400g/ℓ의 효모추출물 및 700 내지 800g/ℓ의 포도당을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "2차 주입배지"란, 일정수준으로 증식된 대장균으로부터 목적하는 재조합 단백질의 발현을 유도 및 생산하기 위하여 유가식 배양방법으로 부가하는 배지를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 2차 주입배지는 효모추출물과 포도당을 포함하고, 상기 균체 성장용 배지에 추가로 부가하여 사용되며, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 IPTG 등을 포함할 수도 있으며, 상기 효모추출물, 포도당, IPTG 등의 성분의 함량은 특별히 제한되지 않고, 당업자가 필요에 따라 적절하게 선택할 수 있으나, 바람직하게는 200 내지 400g/ℓ의 효모추출물, 500 내지 700g/ℓ의 포도당을 포함할 수 있으며, 추가로 0.1 내지 0.5mM의 IPTG를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "유가식 배양(fed-batch culture)"이란, 배양의 진행과 동시에 영양배지를 발효조에 서서히 첨가하면서 배양종료까지 발효조에서 배양액을 뽑지 않는 배양방법을 의미하는데, 특정 물질의 첨가속도를 미생물에 의한 소비속도와 비례하게 함으로써 배양 중 그 성분의 농도를 임의의 설정값으로 제어할 수가 있다는 장점이 있어, 기질저해, 생성물저해, 증식저해를 일으키는 배양연구에 사용되거나 빵효모, 아미노산, 항생물질 등의 발효산업에 사용된다. 본 발명의 목적상 상기 유가식 배양은 일정수준으로 증식된 대장균으로부터 목적하는 재조합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 배양조건은 회분식 배양과 유가식 배양과정이 분리되지 않고 하나의 공정으로 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 형질전환된 대장균의 배양방법은 균체 성장용 배지를 이용하여 회분식으로 재조합 대장균을 배양하다가 pH 상승시 1차 주입배지 및 2차 주입배지를 순차적으로 첨가하는 방식의 pH-stat 배양법이 될 수 있는데, 이때 1차 주입배지의 주입방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 1차 주입배지의 부가량을 단계적으로 증가시키는 방법을 사용할 수 있다. 2차 주입배지의 주입방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 2차 주입배지의 부가량을 단계적으로 감소시키는 방법을 사용할 수 있다. 이러한 pH-stat 배양법은 기존의 DO-stat 발효방법과 달리 발효조내 영양성분의 고갈정도를 pH로 지표 삼아, pH 상승시 영양분을 공급하여 보충하는 방법으로 용존 산소량은 고려하지 않는 방법이다. 기존의 DO-stat의 경우 용존산소의 고갈시 배양배지를 공급하나 대장균의 경우 혐기성 혹은 호기성에서도 균체성장이 이루어지는 점에서, 적합한 균체성장의 지표로 삼기에는 부정확한 단점이 있었다. 이에 본 발명에서는 영양배지의 고갈만을 의미하는 pH의 변화량만을 균체성장의 지표로 삼았으며, 보다 정확한 기준으로 고농도 배양방법을 본 발명은 제공하고 있다.
구체적으로 본 발명의 대장균 배양방법은 상기 (ⅱ)단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 200 내지 400 mL/hr이고, 교반속도는 400 내지 800 rpm일 수 있으며, 상기 (ⅲ)단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 200 내지 400 mL/hr이고, 교반속도는 400 내지 800 rpm인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 (ⅱ)단계에서 1차 주입배지의 주입속도 및 교반속도를 균주의 특수 생장율(specific growth rate)에 맞추어 1차 주입배지의 주입속도는 200 내지 400 mL/hr 범위, 교반속도는 400 내지 800 rpm 범위에서 단계별로 증가시키는 방법으로서, 예를 들어, 상기 단계는 5, 4, 또는 3단계일 수 있으며 바람직하게는 3단계일 수 있다. 상기 3단계에 걸쳐 주입속도 및 교반속도를 증가시키는 방법은, 구체적으로 1단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 200 내지 300 mL/hr, 교반속도는 400 내지 600 rpm으로 배양하고, 2단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 250 내지 350 ml/hr, 교반속도는 500 내지 700 rpm으로 배양하며, 3단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 300 내지 400 ml/hr, 교반속도는 600 내지 800 rpm인 것일 수 있다. 더더욱 바람직하게는, 1단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 200 내지 270 mL/hr, 교반속도는 400 내지 550 rpm으로 배양하고, 2단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 270 내지 300 ml/hr, 교반속도는 550 내지 650 rpm으로 배양하며, 3단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 300 내지 350 ml/hr, 교반속도는 650 내지 800 rpm인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 대장균 배양방법은 더욱 바람직하게는 상기 (ⅲ)단계에서 영양 배지 고갈에 따른 단백질의 발현을 유도하는 단계로, 2차 주입배지의 주입속도 및 교반속도를 pH의 변화에 따라 2차 주입배지의 주입속도는 200 내지 400 mL/hr 범위, 교반속도는 400 내지 800 rpm 범위에서 단계별로 감소시키는 방법으로서, 예를 들어 상기 단계는 5, 4, 또는 3단계일 수 있으며 바람직하게는 3단계일 수 있다. 상기 3단계에 걸쳐 주입속도 및 교반속도를 감소시키는 방법은, 구체적으로 1단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 300 내지 400 ml/hr, 교반속도는 600 내지 800 rpm 으로 배양하고, 2단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 250 내지 300 ml/hr, 교반속도는 500 내지 700 rpm으로 배양하며, 3단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 200 내지 300 mL/hr, 교반속도는 400 내지 600 rpm인 것일 수 있다. 더더욱 바람직하게는, 1단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 300 내지 350 ml/hr, 교반속도는 650 내지 800 rpm 으로 배양하고, 2단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 270 내지 300 ml/hr, 교반속도는 550 내지 650 rpm으로 배양하며, 3단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 200 내지 270 mL/hr, 교반속도는 400 내지 550 rpm인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 형질전환된 대장균 HM11201을 초기 배양배지에 Trace metal 용액이 부가된 균체 성장용 배지를 사용하여 37℃ 및 공기공급 속도 1vvm의 조건에서 회분식으로 배양하다가 pH가 증가하는 시점에서 1차 주입배지를 부가하는 유가식 배양을 수행하면서 25 내지 30시간 동안 배양하여 흡광도(OD600) 값이 120 내지 180이 되도록 형질전환된 대장균을 배양하고(실시예 1-1), 상기 흡광도(OD600) 값이 120 내지 180인 시점에서 2차 주입배지를 부가하는 유가식 배양을 다양한 조건으로 수행하여 목적하는 재조합 단백질을 생산하였다(실시예 1-2). 특히, 150이상의 흡광도(OD600) 값을 나타낸 후에 재조합 단백질의 발현을 유도하면, 최종적으로 200이상의 흡광도(OD600)를 나타내도록 배양할 수 있고, 200g/ℓ이상의 농도로 균체를 수득할 수 있었다.
본 발명의 배양방법을 사용하면, 목적하는 재조합 단백질을 생산하기 위한 형질전환된 대장균을 높은 배양농도로 증식시켜서, 균체의 생산성을 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라 목적하는 재조합 단백질의 생산수율을 증대시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 재조합 단백질의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 형질전환된 대장균 HM11201(KCCM-10660P)의 (A) 배양 프로파일 및 (B) 전기영동 분석결과를 나타낸다. (A) 배양 프로파일에서 검은선은 온도, 붉은선은 pH, 초록선은 교반속도, 파란선은 공기주입속도를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: HM11201 발효 방법
면역글로불린 Fc 단편을 발현시킬 수 있는 형질전환된 대장균 HM11201(KCCM-10660P)을 대표 균주로 선택하여 고농도 배양 및 고수율의 단백질 발현을 위하여, pH조절 및 단계적 증가에 의한 배지 주입 방법을 최적화하고자 하였다.
실시예 1-1: 형질전환된 대장균의 고농도 배양조건의 확립
형질전환된 대장균을 초기 배양배지(트립톤 20g/L, 효모추출물 10g/ℓ, NaCl 10g/ℓ, KH2PO4 207.5g/ℓ, (NH4)2HPO4 50g/ℓ, pH6.7)에 1차 주입배지(300 내지 400g/ℓ의 효모추출물 및 700 내지 800g/ℓ의 포도당)와 Trace metal 용액(Citric acid 268g/ℓ, FeCl2 270g/ℓ, H3BO3 30g/ℓ, MnCl2 100g/ℓ, CuCl2 15g/ℓ, Na2MoO4 25g/ℓ, CoCl2 25g/ℓ, ZnCl2 20g/ℓ 및 EDTA 0.5M)이 부가된 균체 성장용 배지를 사용하여 37℃ 및 공기공급 속도 1vvm의 조건에서 회분식으로 배양하였다.
일정 수준 이상의 농도로 균체가 증식하여 pH가 증가한 경우에는, 배지내의 영양 성분, 특히 탄소원의 고갈로 인하여 대장균 대사의 변화 및 성장저해 그리고 장기간 방치 시 세포의 파괴(lysis)가 유발되기 때문에, 이를 해결하고자 상기 주입배지를 균주의 특수 생장율(specific growth rate)에 맞추어 단계별로 주입하여 유가식으로 배양하였다. 주입배지의 주입량이 균주의 생장속도를 능가할 경우, 배지내의 아세트산의 축적으로 인하여 대장균 대사 및 성장을 저해하기 때문에 주입속도를 단계별로 증가시키면서 추가하였고, 교반속도 또한 단계별로 증가 시켰다. 구체적으로 50ℓ 발효기를 사용할 경우, 세포수가 7 X 109 cell/ml 이상 증식 되었을때, 1차 주입배지의 주입속도를 200 내지 300 mL/hr, 교반속도는 400 내지 600으로 배양하였고, 세포수가 2 X 1010 ~ 3 X 1010 cell/ml로 증식 된 단계에서는 주입배지의 주입속도를 250 내지 350 ml/hr으로 증가하였고, 교반속도는 500 내지 700 rpm으로 조절하여 배양하였다. 또한, 세포수가 3.0 X 1010 ~ 4.5 X 1010 cell/ml로 증식 된 단계에서는 1차 주입배지의 주입속도는 300 내지 400 ml/hr 교반속도는 600 내지 800 rpm으로 배양하였으며, 4.5 X 1010 cell/ml 이상으로 증식된 단계부터는 1차 배지 주입속도 및 교반속도를 세포의 성장에 저해되지 않는 범위내에서 최대한으로 설정하여 일정하게 유지하였다.
상술한 바와 같이 배양한 결과, 25 내지 30시간동안 배양하여 흡광도(OD600) 값이 120 내지 180이 되도록 형질전환된 대장균을 배양할 수 있음을 확인하였다.
실시예 1-2: 재조합 단백질의 고수율 발현을 위한 배양 조건의 확립
상기 실시예 1-1에서 배양된 형질전환된 대장균 HM11201로부터 최적의 단백질 발현 조건을 확립하기 위하여 2차 주입배지의 주입 속도 및 조성을 최적화 하였다.
2차 주입배지의 조성을 최적화한 결과 200 내지 400g/ℓ의 효모추출물 및 500 내지 700g/ℓ의 포도당을 포함하는 2차 주입배지를 사용할 경우 재조합 단백질을 고수율로 발현시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 배지 내의 영양분의 고갈과 교반조건의 조절을 통하여 균주의 성장 단계에서 재조합 단백질의 생산단계로의 전환을 유도하기 위하여 배지 주입 속도와 교반속도를 단계별로 감소시켜 주입하여 유가식으로 배양하였다. 구체적으로, 단계별 주입속도 및 교반속도의 조절은 pH 증가 및 알칼라인 용액의 투입량에 따라 조절하였고, 1단계는 약 300 내지 400 ㎖/hr의 주입속도 및 600 내지 800 rpm의 교반속도이고, 2단계는 약 250 내지 350 ㎖/hr의 주입속도 및 500 내지 700 rpm의 교반속도이며, 3단계는 약 200 내지 300 ㎖/hr의 주입속도 및 400 내지 600 rpm의 교반속도를 순차적으로 적용하여 감소시켰을 뿐만 아니라, 단백질 발현을 유도하기 위하여 0.1~0.5mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 추가하였다.
재조합 단백질의 발현을 촉진시키기 위한 배양공정의 후반부에는 대장균의 활성이 저하되는데, 이때 과도한 주입배지를 투입할 경우 대장균이 희석되고 배지내 초산이 축적되어 대장균의 성장이 저하됨은 물론 재조합 단백질의 발현이 억제되었다. 이를 방지하기 위하여, 배양공정의 후반부에 주입배지의 주입속도를 감소시켜서 대장균에 공급하는 영양성분을 감소시키는 방법을 사용하였다. 이처럼 영양성분의 공급이 감소되면 대장균의 물질대사가 변화되어 암모늄 이온이 배지로 방출되고, 배지로 방출된 암모늄 이온으로 인하여 배지의 pH가 증가됨을 확인하였다. 상기 배지의 pH를 인위적으로 조절하지 않아도 배양이 종료될 때까지 pH 6.8 내지 7.5의 범위로 배지의 pH가 유지됨을 확인하였다(도 1). 도 1은 형질전환된 대장균 HM11201(KCCM-10660P)의 배양 프로파일 및 전기영동 분석결과를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 배양시간이 경과함에 따라 형질전환된 대장균으로부터 목적하는 재조합 단백질이 생산되고, 그의 생산량은 배양시간에 비례하여 증가함을 알 수 있었다.
한편, 주입배지의 조성 및 IPTG 주입 시기 등을 다양하게 변화시키면서, 형질전환된 대장균을 배양한 결과, 상기 대장균을 증식시키기 위한 배양 전반부의 시간을 늘려 최대한 대장균을 고농도로 증식시킨 후에 목적하는 재조합 단백질의 발현을 유도하는 배양 후반부를 진행할 경우에, 대장균의 증식을 최대화하여 균체의 생산량을 증가시킬 수 있었다(표 1). 최종 OD600과 균체 생산량 및 단백질 수득량은 총 45시간 배양하여 측정하였다.
주입배지의 조성 및 발현유도 시기의 변화에 따른 균체 생산량
조건 A B C D
1차 주입배지 200g/L(효모)
700g/L(포도당)		 200g/L(효모)
700g/L(포도당)		 400g/L(효모)
700g/L(포도당)		 200g/L(효모)
800g/L(포도당)
2차 주입배지 200g/L(효모)
700g/L(포도당)		 400g/L(효모)
500g/L(포도당)		 200g/L(효모)
700g/L(포도당)		 300g/L(효모)
700g/L(포도당)
OD600 on 20hrs 94.7 103.0 142 146
Induction
OD600 		20hr
94.7		 25hr
122.6		 25hr
163		 30hr
183
Final OD600 182.4 186.6 229.2 268
최종 균체 생산량(g/L) 184 189 207 263.6
단백질 수득량(g/L) 1.72 - - 2.46
상기 표 1에서 보듯이, 주입배지의 조성 및 발현유도 시기에 따라, 최종 흡광도(OD600) 값이 200 이상을 나타내고, 발효 배지 1리터당 200g 이상의 균체를 얻을 수 있었다.
또한, 도 1에서 보듯이 면역글로불린 Fc 단편의 발현 수준도 높게 유지될 뿐만 아니라 균체 생산량을 약 1.5배 증가시킬 수 있어 실제로 생산 수율을 향상시킬 수 있는 효과적인 배양 조건이라고 할 수 있으며, 본 방법에 의한 배양이 단백질의 고수율 발현에 유리하다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. (ⅰ) 균체 성장용 배지를 이용하여 배지의 pH가 0.1 이상 증가할 때까지 대장균을 회분식으로 배양하는 단계;
    (ⅱ) 배지의 pH가 증가하는 시점에서 1차 주입배지를 부가하면서 유가식으로 배양하여 대장균을 증식시키는 단계; 및,
    (ⅲ) 배양액의 흡광도(OD600)가 150이상인 시점에서 2차 주입배지를 부가하면서 유가식으로 배양하는 단계를 포함하는, 대장균의 배양방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 대장균은 재조합 단백질을 발현하는 형질전환된 대장균인 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 형질전환된 대장균은 HM11201(KCCM-10660P)인 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 (ⅲ)단계와 동시에 또는 그 후에, 재조합 단백질을 발현하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 형질전환된 대장균은 락토오스 작용자(Lac operator)를 포함하는 발현벡터가 도입된 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 IPTG의 첨가량은 0.1 내지 0.5mM인 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 IPTG는 배양액의 흡광도(OD600)가 120 이상인 시점에 첨가하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (ⅱ)단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 200 내지 400 mL/hr이고, 교반속도는 400 내지 800 rpm인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 주입속도 및 교반속도는 단계별로 증가시키는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 (ⅱ)단계에서 1차 주입배지의 주입속도 및 교반속도를 3단계에 걸쳐 증가시키는 방법으로서, 1단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 200 내지 300 mL/hr, 교반속도는 400 내지 600 rpm으로 배양하고, 2단계에서 1차 주입배지의 주입속도는 250 내지 350 mL/hr, 교반속도는 500 내지 700 rpm을 배양하며, 3단계에서는 1차 주입배지의 주입속도는 300 내지 400 mL/hr, 교반속도는 600 내지 800 rpm인 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 (ⅲ)단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 200 내지 400 mL/hr이고, 교반속도는 400 내지 800 rpm인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 주입속도 및 교반속도는 단계별로 감소시키는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 (ⅲ)단계에서 2차 주입배지의 주입속도 및 교반속도를 3단계에 걸쳐 감소시키는 방법으로서, 1단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 300 내지 400 mL/hr, 교반속도는 600 내지 800 rpm으로 배양하고, 2단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 250 내지 350 mL/hr, 교반속도는 500 내지 700 rpm으로 배양하며, 3단계에서 2차 주입배지의 주입속도는 200 내지 300 mL/hr, 교반속도는 400 내지 600 rpm인 것인, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    균체 성장용 배지는, 트립톤, 효모추출물, NaCl, KH2PO4 및 (NH4)2HPO4를 포함하는 초기 배양배지에 시트르산(citric acid), FeCl2, H3BO3, MnCl2, CuCl2, Na2MoO4, CoCl2, ZnCl2 및 EDTA를 포함하는 Trace metal 용액이 부가된 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 1차 주입배지는 200 내지 400g/ℓ의 효모추출물 및 700 내지 800g/ℓ의 포도당을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 2차 주입배지는 200 내지 400g/ℓ의 효모추출물 및 500 내지 700g/ℓ의 포도당을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 형질전환된 대장균의 최종 배지내 농도는 200이상의 흡광도(OD600)인 것인 방법.
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