CN102559794A - 一种赖氨酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种赖氨酸的制备方法。本发明提供的制备方法通过干法制糖的产物进行赖氨酸发酵，并将发酵过程分为四个阶段(产赖氨酸微生物数量的上升阶段，产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段、产赖氨酸微生物数量的维持阶段和产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段)，并对这四个阶段采取不同的通气量控制，从而使产赖氨酸微生物能够更好地生产赖氨酸，从而提高了赖氨酸的发酵效率，最终降低了赖氨酸的生产成本。此外，由于对发酵过程的控制进行了调整，使干法制糖的产物能够有效的进行发酵，从而能够发挥出干法制糖成本低廉的特点，从整体上更进一步地提高了赖氨酸制备工艺的经济性。

Description

一种赖氨酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种赖氨酸的制备方法。

背景技术

L-赖氨酸(以下简称赖氨酸)是人和动物营养的八种必需氨基酸之一。它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。

目前主要用于医药、食品和饲料工业，从消费结构上看，赖氨酸在饲料中的消费占了近90％，而在食品及医药中间体的消费仅占10％。

赖氨酸多是通过微生物发酵来制备的，一般通过将产赖氨酸微生物接种至发酵液中，并持续通入空气，以发酵产生赖氨酸，并根据发酵液中碳源和氮源的残留量，添加碳源和/或氮源。但目前赖氨酸生产在通入空气的量方面还未有明确的控制方法，导致发酵效率还较低、生产成本居高不下。

因此，迫切地需要开发一种新型的赖氨酸的制备方法，以提高赖氨酸的发酵效率，从而降低赖氨酸的生产成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的赖氨酸生产发酵效率低的缺陷，提供一种发酵效率高的赖氨酸的制备方法。

本发明的发明人对赖氨酸的发酵过程进行了仔细的研究，发现在赖氨酸的发酵过程中，产赖氨酸微生物的生长实际上可分为四个阶段，即，产赖氨酸微生物数量的上升阶段、产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段、产赖氨酸微生物数量的维持阶段和产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段；在这四个阶段中，产赖氨酸微生物的生长状态不尽相同，在产赖氨酸微生物数量的上升阶段，产赖氨酸微生物主要以生长为主，供氧须满足微生物呼吸的需氧量，若微生物的需氧量得不到满足，则会抑制微生物的生长，从而引起乳酸等副产物的积累，导致发酵效率下降；而在产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和产赖氨酸微生物数量的维持阶段，微生物的生长速率减缓，并主要以产赖氨酸为主，微生物的需氧量有所减少，如果再提高通气量，不但不能促进赖氨酸的产生，反而会使菌体加快衰老降低最终产酸水平，并且会造成能源的浪费；在产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段中，微生物的数量再次出现下降，微生物的呼吸强度减弱，氧气的消耗会减少，则需要降低通气量以减缓微生物的衰老，以尽可能多的生产赖氨酸，并且还可以节省能源消耗。

基于上述发现，本发明提供了一种赖氨酸的制备方法，该方法包括：将产赖氨酸微生物接种至发酵液中并发酵产生赖氨酸，在发酵过程中根据发酵液中碳源和氮源的量，添加碳源和/或氮源，其中，发酵产生赖氨酸的过程包括：产赖氨酸微生物数量的上升阶段、产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段、产赖氨酸微生物数量的维持阶段和产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段；其中，在产赖氨酸微生物数量的上升阶段中，通气量随发酵液体积的增加而增大；在产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和产赖氨酸微生物数量的维持阶段中，通气量为产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的100-120％；在产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段中，通气量少于产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量。

本发明提供的赖氨酸的制备方法通过将发酵过程分为四个阶段(产赖氨酸微生物数量的上升阶段，产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段、产赖氨酸微生物数量的维持阶段和产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段)，并对这四个阶段采取不同的通气量控制，从而使产赖氨酸微生物能够更好地生产赖氨酸，从而提高了赖氨酸的发酵效率，最终降低了赖氨酸的生产成本。

具体实施方式

本发明提供了一种赖氨酸的制备方法，该方法包括：将产赖氨酸微生物接种至发酵液中并发酵产生赖氨酸，在发酵过程中根据发酵液中碳源和氮源的量，添加碳源和/或氮源，其中，发酵产生赖氨酸的过程包括：产赖氨酸微生物数量的上升阶段、产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段、产赖氨酸微生物数量的维持阶段和产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段；其中，在产赖氨酸微生物数量的上升阶段中，通气量随发酵液体积的增大而增加；在产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和产赖氨酸微生物数量的维持阶段中，通气量为产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的100-120％；在产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段中，通气量少于产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量。

术语“通气量”是指单位时间内(通常为每分钟)通入到发酵容器中的气体体积，单位为立方米空气/分钟。

在本发明中，由于在发酵过程中需要不断的添加碳源和氮源，以维持发酵液中的营养水平，从而利用产赖氨酸微生物来生产赖氨酸，因此，发酵液的体积是不断的增加的，并且在产赖氨酸微生物数量的上升阶段，产赖氨酸微生物主要以生长为主，供氧须满足微生物呼吸的需氧量，若微生物的需氧量得不到满足，则会抑制微生物的生长，从而引起乳酸等副产物的积累，导致发酵效率下降。本发明的发明人经过大量的研究发现，根据发酵液的体积变化来调节通气量，可以使产赖氨酸微生物在数量上升阶段中处于较适的溶氧环境。

因此优选地，在产赖氨酸微生物数量的上升阶段中，通气量Q(立方米/分钟)与发酵液的体积V(立方米)满足下述公式：Q＝kV-50，k单位时间内每立方米的发酵液的通气量，k为0.6-1.0立方米空气/立方米发酵液/分钟，优选为0.6-0.8立方米空气/立方米发酵液/分钟，V为100-500立方米，优选为150-450立方米。

在产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段，微生物的比生长速率明显减缓而对碳源和氮源的消耗增加，因此呈现出数量的下降趋势。在产赖氨酸微生物数量的维持阶段中，由于碳源和氮源的添加，发酵液的体积已经达到了发酵罐能容纳的最大体积(一般为发酵罐容积的70-75％)，需要放出部分发酵液使发酵液的体积维持在发酵罐能容纳的最大体积，此法有利于发酵控制和提高产量。在这两个阶段中，微生物的生长速率减缓，并主要以产赖氨酸为主，微生物的需氧量有所减少，如果继续根据发酵液的体积变化调整通气量，不但不能促进赖氨酸的产生，反而会使产酸率下降，并且会造成通风能源的浪费，因此，优选情况下，在产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和产赖氨酸微生物数量的维持阶段中，通气量可以为产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的100-120％，更优选为产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的105-115％。

在产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段中，微生物的生长繁殖减弱，微生物的数量呈现出再次下降趋势，微生物的呼吸强度减弱，氧气的消耗会减少，高的通气量会加速微生物的衰老，从而对生产赖氨酸产生不利的影响。因此，在这一阶段需要降低通气量以减缓微生物的衰老，以尽可能多的生产赖氨酸，并且还可以节省能源消耗。优选情况下在产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段中，通气量可以为产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的65-95％，更优选为75-85％。

所述发酵液中微生物数量的检测方法为本领域技术人员所公知的检测微生物数量的方法：在发酵过程中，取一定量的含有产赖氨酸微生物的发酵液，并对发酵液进行稀释，之后在分光光度计(如722型可见光分光光度计)上，在波长562纳米可见光下测定吸光值，即通常说的OD值。之后将得到的OD值×稀释倍数÷发酵液的总体积，计算得到的数值反映单位体积发酵液中产赖氨酸微生物的数量。

在某一特定波长下，微生物数量与OD值成线性关系，因此微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是optical delnsity(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。不同的微生物其最大吸收波长不同，通常在最大吸收波长下对其进行检测，400-700nm都是微生物测定的范围。

此外，为了判断发酵所处的阶段，该方法还可以包括多次检测发酵过程中产赖氨酸微生物的数量，根据相邻两次产赖氨酸微生物数量的值判断发酵生产赖氨酸的过程所处的阶段。在判断出发酵所处的阶段后，来相应调整发酵过程主要控制参数，即通气量。所述多次检测可以为间歇式的检测，例如，相邻两次检测的时间间隔没有特别限定，一般不大于120分钟，优选情况下，为了更准确的判断发酵所处的阶段，相邻两次检测的时间间隔为20-100分钟，更优选情况下，相邻两次检测的时间间隔为20-30分钟；也可以采用在线实时监控的方法对发酵过程中产赖氨酸微生物的数量实时进行检测。

根据本发明，例如，所述发酵液可以含有淀粉质原料糖化清液、糖蜜、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸。根据本发明，所述发酵液中各组分的含量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升发酵液中，淀粉质原料糖化清液的含量可以为40-60克，糖蜜的含量可以为30-50克，玉米浆的含量可以为20-40克，硫酸铵的含量可以为20-40克，磷酸氢二钾的含量可以为0.5-1.5克，硫酸镁的含量可以为0.4-0.6克，苏氨酸的含量可以为0.1-0.3克，蛋氨酸的含量可以为0.1-0.3克，谷氨酸的含量可以为0.2-0.4克。

根据本发明，所述发酵的条件可以包括：发酵温度可以为35-38℃，发酵压力可以为0.05-0.1兆帕，pH可以为6.7-7.0。

按照本发明，所述发酵液的制备方法没有特别的限制，只要能够适于发酵生产赖氨酸即可，优选根据上述比例配制发酵液。其中，所述淀粉质原料糖化清液优选通过干法制糖工艺制备。所述干法制糖工艺是指淀粉质原料不经浸泡直接进行破碎和酶解，干法制糖的优点是工艺简单设备投资少，生产的成本较低。

根据本发明，所述淀粉质原料糖化清液的制备方法可以包括：将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。优选地，所述粉碎使淀粉质原料过30目筛的通过率大于75％，更优选过30目筛的通过率为100％。所述调浆的方法为本领域技术人员所熟知，但优选地，所述调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为9-17Bé°。术语“波美度”是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数。

根据本发明，所述第一次水解中，以每克粉碎后的产物的干重计，所述淀粉酶的用量可以为10-30酶活力单位，所述酶解的温度可以为88-92℃，所述酶解的时间可以为90-120分钟，所述酶解的pH值可以为5.5-6.0。所述固液分离的条件没有特别的限定，优选地，所述固液分离的条件使得到的液相组分中的固含量为19-22重量％，更优选为20-21重量％。

根据本发明，所述第二次水解中，以每克液相组分计，所述糖化酶的用量可以为110-130酶活力单位，所述酶解的温度为可以55-65℃，所述酶解的时间可以为420-600分钟，所述酶解的pH值可以为4.0-4.5。

本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原性糖所需的酶量为一个酶活力单位。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶。

根据本发明，所述糖化酶优选为α-1，4-葡萄糖水解酶。

按照本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备赖氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种。

根据本发明，在发酵过程中，根据发酵液中碳源和氮源的量，添加碳源和/或氮源，添加的碳源的种类为本领域技术人员所公知，优选地，所述碳源为淀粉质原料糖化清液，所述淀粉质原料糖化清液的制备方法如上文所述，在此不再赘述。所述碳源(淀粉质原料糖化清液)的添加量，可以使发酵液中还原性糖的浓度控制在5-10克/升。添加的氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述添加的氮源可以为铵盐，所述铵盐的添加量可以使铵根离子的浓度控制在0.5-1.0克/升。

此外，还可以根据发酵液液位的要求向发酵液中补充适量的水，水的量的可选择范围较宽，可以根据实际需要而定。

按照本发明，所述产赖氨酸微生物的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以发酵液定容体积为基准，产赖氨酸微生物的种子液可以为10-20％，更优选12-15％。种子液中微生物数量以菌密度OD值计(稀释25倍后使用722分光光度计在562纳米波长下检测)为0.75-0.9，优选为0.8-0.85。

本发明发酵所使用的产赖氨酸的微生物的种类为本领域技术人员所公知，例如，可以为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌，可以使用商购的菌种，例如，购自江南大学的菌株原种FB42(黄色短杆菌)。

所述产赖氨酸微生物可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵液中之前，将产赖氨酸微生物经过种子罐培养，之后将得到的种子液加入到发酵液中。

产赖氨酸微生物在种子罐中培养，根据本发明，所述种子罐培养基中各组分的含量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升培养基中，淀粉质原料糖化清液的含量可以为30-40克，玉米浆的含量可以为70-90克，磷酸氢二钾的含量可以为0.5-1.5克，硫酸镁的含量可以为0.4-0.6克，苏氨酸的含量可以为0.1-0.3克，蛋氨酸的含量可以为0.1-0.3克，谷氨酸的含量可以为0.2-0.4克。培养的程度可以通过取样显微镜镜检、OD值测定对产赖氨酸微生物的生长进行观察，当通过上述方法测定菌体形态正常、OD值达到0.75以上时停止培养。

下面通过具体的实施例对本发明进行更加详细的说明。

在下述实施例中，将所取发酵液进行25倍稀释，采用分光光度计(如722型可见光分光光度计)，在波长562纳米可见光下测定吸光值，即通常说的OD(optical density)值。之后将得到的OD值×稀释倍数÷发酵液的总体积，计算得到的数值反映单位体积发酵液中产赖氨酸微生物的数量。并通过检测其中还原性糖含量、铵根离子含量实时监测碳源和氮源的含量。

按照GB/T 5009.7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的含量。

按照GB3595-83的方法测定发酵液中铵根离子的含量。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。

(1)将收获的100重量份玉米通过机械加工将玉米颗粒粉碎，使玉米粉过30目筛的通过率为80％。

(2)将粉碎后的产物加水调浆至12Be°，相对于每克粉碎产物的干重，加入20个酶活力单位的淀粉酶(诺维信公司，a-淀粉酶)，在85℃、pH为5.5的条件下酶解100分钟，得到酶解产物。其中，将酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液(固含量为20重量％)；之后加入115个酶活力单位的糖化酶(α-1，4-葡萄糖水解酶，诺维信公司)，在60℃、pH为4.5的条件下酶解420分钟，得到淀粉质原料糖化清液A1。

(3)使用步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液A1配置种子罐培养基，具体组成为：相对于1000升的水，淀粉质原料糖化清液的含量为35重量份，玉米浆(干重为35重量％)的含量为80重量份，磷酸氢二钾的含量为1.0重量份，硫酸镁的含量为0.5重量份，苏氨酸的含量为0.2重量份，蛋氨酸的含量为0.2重量份，谷氨酸的含量为0.3重量份。将培养基加热到121℃消毒，维持20分钟后降温至37℃并保持恒定。开启搅拌，调节罐压为0.1Mpa，按照通风量与培养基1∶0.5体积比通入无菌空气，用氨水调节pH至6.8并保持恒定。接入黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)进行培养，过程中每隔120分钟取样镜检并检测OD值，当OD值达到0.8，停止培养。

(4)使用步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液A1配置发酵液，具体组成为：相对于1000升的水，淀粉质原料糖化清液的含量为50重量份，糖蜜(产地新疆)的含量为40重量份，玉米浆(干重为35重量％)的含量为30重量份，硫酸铵的含量为30重量份，磷酸氢二钾的含量为1.0重量份，硫酸镁的含量为0.5重量份，苏氨酸的含量为0.2重量份，蛋氨酸的含量为0.2重量份，谷氨酸的含量为0.3重量份。培养基加热到121℃消毒30分钟后降温至37℃并保持恒定，用氨水调节pH至6.9。

(5)使用步骤(3)所得的种子液，接入步骤(4)所得的发酵培养基中进行发酵培养，接种量为发酵液体积的15％。发酵液的初始定容体积为130立方米，其中底料为按照步骤(4)所得的发酵培养基110立方米，种子液是按照步骤(3)所得的种子液20立方米。将罐压调整到0.1MPa，发酵温度控制为37℃进行发酵。多次取正在培养的发酵液测定产赖氨酸微生物的数量，根据相邻两次的值进行比较，以判断发酵所处的阶段(第0小时至第10小时，每隔30分钟检测一次，第10小时以后至第24小时，每隔60分钟检测一次，第24小时以后至第48小时，每隔120分钟检测一次，从第48小时以后至发酵结束，每隔60分钟检测一次)。在发酵过程中，根据发酵液中碳源和氮源的含量变化，添加碳源(步骤(2)中得到的生物质原料水解糖)和氮源(硫酸铵)，使碳源的含量控制为6克/升(以还原性糖计)，使氮源的含量控制为0.6克/升(以铵根离子计)，并用液氨调节pH维持在6.9。在产赖氨酸微生物数量的上升阶段中，通气量根据发酵液体积进行调节：起始体积为130立方米，则通气量为40立方米空气/分钟(单位通气量为0.7立方米空气/立方米的发酵液/分钟)，随着碳源与氮源的添加，发酵液体积增加，通气量也相应的进行调节。到发酵第10小时时产赖氨酸微生物的数量开始下降，此时发酵液的体积为165立方米，通气量为65立方米/分钟。在产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和维持阶段中，通气量维持在68立方米/分钟，是上升阶段结束时通气量的105％。此后(产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段)，逐渐减低通气量至54立方米/分钟(产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的83％)，直到发酵到第52小时发酵结束。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。

按照实施例1的方法制备赖氨酸，不同的是：发酵液的初始总体积为120立方米，起始通气量为30立方米空气/分钟(单位通气量为0.67立方米空气/立方米的发酵液/分钟)。罐压为0.08MPa，发酵温度控制为36℃，并用液氨调节PH维持在6.8。发酵过程中多次测定产赖氨酸微生物的数量，根据相邻两次的值进行比较，以判断发酵所处的阶段(第0小时至第14小时，每隔30分钟检测一次，第14小时以后至第24小时，每隔60分钟检测一次，第24小时以后至第48小时，每隔120分钟检测一次，第48小时以后至发酵结束，每隔60分钟检测一次)。在产赖氨酸微生物数量的上升阶段中，通气量根据发酵液体积进行调节：，随着碳源与氮源的添加，发酵液体积增加，通气量也相应的进行调节。到发酵第14小时时产赖氨酸微生物的数量开始下降，此时发酵液的体积为174立方米，通气量为67立方米/分钟，在产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和维持阶段中，通气量维持在72立方米/分钟，是上升阶段结束时通气量的108％。此后(产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段)，通气量降低至50立方米(产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的75％)，直到发酵到第50小时发酵结束。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。

按照实施例1的方法制备赖氨酸，不同的是：发酵液的初始总体积为110立方米，起始通气量为25立方米空气/分钟(单位通气量为0.68立方米空气/立方米的发酵液/分钟)。在发酵过程中，温度控制在37.5℃，液氨调节PH维持在6.7。根据发酵液中碳源和氮源的含量变化，添加碳源(步骤(2)中得到的生物质原料水解糖)和氮源(硫酸铵)，使碳源的含量控制为7克/升(以还原性糖计)，使氮源的含量控制为0.7克/升(以铵根离子计)，此外，到发酵第12小时时产赖氨酸微生物的数量开始下降，此时发酵液的体积为150立方米，通气量为52立方米/分钟，在产赖氨酸微生物数量保持平稳并在此出现产赖氨酸微生物的数量下降的阶段(产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和维持阶段)中，通气量为57立方米/分钟，是上升阶段结束时通气量的110％。此后(产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段)，减低通气量至42立方米/分钟(产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的80％)，直到发酵到第48小时发酵结束。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。

按照实施例1的方法制备赖氨酸，不同的是，发酵液的初始总体积为140立方米，起始通气量为50立方米空气/分钟(单位通气量为0.72立方米空气/立方米的发酵液/分钟)。到发酵第12小时时产赖氨酸微生物的数量开始下降，此时发酵液的体积为180立方米，通气量为80立方米/分钟，在产赖氨酸微生物数量保持平稳并在此出现产赖氨酸微生物的数量下降阶段(产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和维持阶段)中，通气量维持在85立方米/分钟，是上升阶段结束时通气量的106％。此后(产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段)，减低通气量至62立方米/分钟(产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的78％)，直到发酵到第54小时发酵结束。

对比例1

本对比例用于说明现有技术的赖氨酸的制备方法。

按照实施例1的方法制备赖氨酸，不同的是，发酵过程中，通气量始终保持在为40立方米/分钟的条件下发酵。

实施例5-8

根据GB 10794-89标准检测发酵过程中的赖氨酸含量(以赖氨酸盐酸盐计)，并计算赖氨酸发酵转化率。转化率(％)＝(发酵终点赖氨酸含量×发酵液的放罐体积+中间放料赖氨酸含量×中间放料发酵液体积)/总糖的重量×100％，其中总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量；中间放料赖氨酸重量包括几次放料赖氨酸重量之和。结果如表1所示。

对比例2

根据与实施例5-8相同的方法检测对比例1发酵后发酵液的赖氨酸含量并计算单罐产量和转化率，结果如表1所示。

表1

终点赖氨酸含量表明发酵结束时单位体积发酵液内产生的赖氨酸(以赖氨酸盐酸盐计)的量，是衡量单位体积发酵液中所含赖氨酸量的指标。相同发酵周期，终点赖氨酸含量高，则说明发酵产酸速率高。

单罐产量＝终点赖氨酸含量×发酵液放罐体积+中间放料赖氨酸含量×中间放料发酵液体积，是衡量罐批之间赖氨酸生产总量的指标。

从上表1的数据可以看出，采用本发明的方法发酵得到的赖氨酸的酸度和转化率均高于采用现有方法得到的赖氨酸，且单罐产量和转化率大幅度提高。由此说明，本发明的方法通过根据生产赖氨酸的发酵过程中微生物数量的变化趋势来判断发酵的状态，并在不同的发酵状态中控制不同的通气量，从而使产赖氨酸微生物在发酵过程中的生长和产酸阶段都处于最适环境中，而达到有效发挥其最佳效用，而提高了发酵效率、提高了单罐产量增加了设备利用率，并且提高了原料利用率。

Claims (19)

1.一种赖氨酸的制备方法，该方法包括：将产赖氨酸微生物接种至发酵液中并发酵产生赖氨酸，在发酵过程中根据发酵液中碳源和氮源的量，补充碳源和/或氮源，其特征在于，发酵产生赖氨酸的过程包括：产赖氨酸微生物数量的上升阶段、产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段、产赖氨酸微生物数量的维持阶段和产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段；其中，在产赖氨酸微生物数量的上升阶段中，通气量随发酵液体积的增大而增加；在产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和产赖氨酸微生物数量的维持阶段中，通气量为产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的100-120％；在产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段中，通气量少于产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在产赖氨酸微生物数量的上升阶段中，通气量Q与发酵液的体积V满足下述公式：Q＝kV-50，k为单位时间内每立方米的发酵液的通气量，k为0.6-1.0立方米空气/立方米的发酵液/分钟，V为100-500立方米。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，在产赖氨酸微生物数量的上升阶段中，k为0.6-0.8立方米空气/立方米的发酵液/分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在产赖氨酸微生物数量的第一下降阶段和产赖氨酸微生物数量的维持阶段中，通气量为产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的105-115％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，在产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段中，通气量为产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的65-95％。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，在产赖氨酸微生物数量的第二下降阶段中，通气量为产赖氨酸微生物数量的上升阶段结束时的通气量的75-85％。

7.根据权利要求1-6中的任意一项所述的方法，其中，该方法包括多次检测发酵过程中产赖氨酸微生物的数量，根据相邻两次产赖氨酸微生物数量的值判断发酵生产赖氨酸的过程所处的阶段。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，相邻两次检测的时间间隔不大于120分钟。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，相邻两次检测的时间间隔为20-100分钟。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：发酵温度为35-38℃，发酵压力为0.05-0.1兆帕，pH为6.7-7.0。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述碳源为淀粉质原料糖化清液，所述淀粉质原料糖化清液的制备方法包括：将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述粉碎使淀粉质原料过30目筛的通过率大于75％。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述调浆的方法包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度为9-17Bé°。

14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一次水解中，以每克粉碎后的产物的干重计，所述淀粉酶的用量为10-30酶活力单位，所述酶解的温度为88-92℃，所述酶解的时间为90-120分钟，所述酶解的pH值为5.5-6.0。

15.根据权利要求11所述的方法，其中，固液分离的条件使得到的液相组分中的固含量为19-22重量％。

16.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第二次水解中，以每克液相组分计，所述糖化酶的用量为110-130酶活力单位，所述酶解的温度为55-65℃，所述酶解的时间为420-600分钟，所述酶解的pH值为4.0-4.5。

17.根据权利要求11所述的方法，其中，所述碳源的添加量，使发酵液中还原性糖的浓度控制在5-10克/升。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述添加的氮源为铵盐，所述铵盐的添加量使铵根离子的浓度控制在0.5-1.0克/升。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述产赖氨酸微生物为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌。