CN104472208B - 一种液体培育蛹虫草子座的方法 - Google Patents

一种液体培育蛹虫草子座的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食药用菌的栽培，特别是一种液体培育蛹虫草子座的方法。是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养，包括菌丝体的培养、子实体的培养等工艺步骤，本发明解决了现有技术存在的生产周期长、能耗高、安全隐患大等技术难题，具有生产周期缩短、虫草子座有效成分含量高、生长条件易于控制，便于工业化生产等优点。

Description

一种液体培育蛹虫草子座的方法
技术领域
本发明属于食药用菌的栽培，特别是一种液体培育蛹虫草子座的方法。
背景技术
蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种，又名北冬虫夏草、北蛹虫草、虫草等。世界性分布天然资源数量很少。由子座(即草部分)与菌核(即虫的尸体部分)两部分组成的复合体。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代医学认为，其独特的药理作用源于含有虫草菌素和虫草多糖。
目前，蛹虫草已在人工条件下育成了完整子座。通常采用两种方法，一种是在灭菌处理后的大米(玉米、小麦、青稞等)为主料的固体培养基上(有时添加营养液)接种培养单一的蛹虫草子座(子实体)；另一种是接种活体蚕蛹幼体培养带虫体的子座，其过程是蚕蛹接种后虫草菌丝体向虫体内蔓延，于是蛹虫就会被真菌感染，分解蛹体内的组织，以蛹体内的营养作为其生长发育的物质和能量来源，最后将蛹体内部完全分解，当蛹虫草的菌丝把蛹体内的各种组织和器官分解完毕后，菌丝体由营养生长开始转为生殖生长，最后扭结后从蛹体空壳的头部、胸部、近尾部等处伸出，形成橘黄色或橘红色的顶部略膨大的呈棒状的子座(子实体)。
上述两种生产工艺存在如下缺陷：
1、生产周期长，能耗大。栽培周期一般40-50天；
2、由于大米等原料来源广泛，品质难控制，被环境污染的原料生产虫草子座往往存在诸多食品安全隐患(如农药残留、重金属、微生物超标等)；而虫体虫草又存在受季节限制(只有产蚕蛹的春季和秋季可以生产)、接种污染率高、成品得率低等问题。
3、固体培养基中添加各种配方的营养液虽然可以促进蛹虫草的生长，但同时，营养液多元化学组分的随意添加也增加了外源药物性污染的几率，会直接影响虫草有效物质成分(如，虫草素等)的品质。目前，我家尚未颁布统一的蛹虫草质量控制标准。以虫草素指标为例，在天津、浙江、广东等省市出台的地方标准中，仅对虫草素的总含量有要求，而虫草素的测定是通过腺苷及其类似物的含量(高效液相色谱法)确定的。在没有明确规范要求下，人们通过添加腺嘌呤、腺苷等前体物质，甚至添加链霉素和激素类物质(如秋水仙素、β-蜕皮激素)等外源性药物可明显提高产品虫草素的检测结果，但尽管很多前体及营养物质能增加虫草素的产量，但目前对它们的作用机制研究的不够深入，以腺嘌呤为例，它是虫草素的前体物质，添加后是否是因为细胞摄入量增加，从而提高虫草素合成原料的含量增加产率还有待研究。因此，这种盲目添加外源物质成分的做法潜在危险性很大。
目前，国内关于蛹虫草培育方面的授权专利和公开申请技术较多，但大多数都是采用固体培养基(玉米、小麦、青稞等)或者活体蚕蛹接种培养的方法，比如，郭素萍等在“一种北虫草培育新方法”(申请号：201310311996.3)中采用液体菌种接种固体培育栽培盒培养基，经过菌丝培养、转色和出草管理生产北虫草子座。邹玉华在“一种富硒北冬虫夏草的培育方法”(申请号：200710010750.7)中，通过在大米培养基中添加微量硒元素生产富硒蛹虫草。刘彦君等在“绿色北虫草产业化生产方法”(申请号：201410079301.8)中，以小麦、大米等为主要原料，用可以重复利用的塑料盆立体周年栽培绿色北虫草。贵州大学康冀川等在“提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的方法”(申请号：200810068949.X)中，通过将大米粒度为20目和14目按照1:2质量比配合做培养基，添加特制的营养液，按照传统固体发酵方法对蛹虫草进行培养，子座长出后增加光照强度和时间，可以大幅提高虫草素含量。值得一提的是，陈国卿等在申请号为93105056.1的发明专利“北冬虫夏草菌人工栽培子实体的方法”中，提到了将北冬虫夏草接种液体培养基经过培养可得到子实体的方法，但是，在权利要求和实例说明中却没有进一步提供具体的技术工艺、控制参数和生产效果，可以理解为发明者只是给出了液体培养蛹虫草子实体的概念，并没有具体的生产技术和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生长周期短、条件易于控制的液体培育蛹虫草子座的方法，所制备的蛹虫草子座有效成分含量高。
本发明的整体技术构思是：
一种液体培育蛹虫草子座的方法，是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养；包括以下步骤：
A、菌丝体的培养
培养基采用如下原料配制：
马铃薯220-250克；葡萄糖10-20克；磷酸二氢钾0.5-1克；硫酸镁0.5-1克；维生素B120毫克；氯化钠1.5-1.8克；蛋白胨3-4.5克；水1000 ml；占发酵培养基体积30％-50％的颗粒状附着物；pH＝7.5；
培养条件如下：
温度为21℃-27℃静置48-72小时，在转速为100-150rpm、温度为21℃-27℃条件下培养4-6天；
B、子实体的培养
B1、后熟期
培养条件如下：
15℃-20℃静置，环境湿度65％-75％，暗培养5-7天，待发酵液表层菌丝二次生长到完全覆盖培养基表面后，移入培养室弱光转色；
B2、逆境催蕾期
环境空气湿度90％以上，温度20℃-24℃，光照强度50Lux-150Lux，1-2天后菌丝开始转为淡黄色，保持光照强度100Lux-550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％，经过5-7天出现原基；
B3、生长期
当原基分化为虫草子座的形状并生长到1-2cm时保持光照强度为50Lux-100Lux，温度为10℃-22℃，空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％，生长调控10天左右，生长周期为30-35天；
生产菌种选用CGMCC No.5.856或ACCC51762中的一种。
本发明的具体技术条件和工艺步骤还有：
为从发酵液中得到需要的效用物质，可以采用在培养基中添加微量元素的方法，其中较为优选的技术方案是，步骤A中的发酵培养基还包含有如下原料：
亚硒酸钠40mg-50mg/1000ml。
通过上述方法，可以在确保食品安全的前提下，提高发酵液中的硒元素的含量。
颗粒状附着物的作用是满足虫草子座生长需要的物理支撑条件，可以采用多种现有的材料，其中较为优选的技术方案是，步骤A中颗粒状附着物选用滤料陶粒。
更为优选的技术方案是，所述的滤料陶粒直径0.5-2.0mm，堆积密度1250kg/m3。
为满足虫草子座的生产需要，优选的技术方案是，步骤B2中的每天光照时间累计不小于10小时。白天可以利用自然的散射光，夜晚可以酌情利用日光灯补充光照2-4小时,在此期间可加大通风促进子座原基发育。
所述的步骤B3中每天光照时间累计不小于8小时，在此期间可采用自然通风增氧。
本发明所取得的实质性特点和显著地技术进步在于：
1、生产周期缩短，较传统的培养方法生产周期缩短10-15天。
2、通过液体发酵的生长代谢转化作用可以提高前体物质的细胞摄入量，从而可以通过单因子调控液体培养基配方的方法，在确保食品安全的前提下，提高蛹虫草子座有效成分含量，尤其是虫草素、有益微量元素等，品质有保障，经检测，有效成份虫草素较传统方法培养的产品提高4倍以上。
3、生长条件易于控制，便于工业化生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
一种液体培育蛹虫草子座的方法，是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养；包括以下步骤：
A、菌丝体的培养
培养基采用如下原料配制：
马铃薯220克；葡萄糖10克；磷酸二氢钾0.5克；硫酸镁0.5克；维生素B120毫克；氯化钠1.5克；蛋白胨3克；水1000ml；占发酵培养基体积30％的颗粒状附着物；pH＝7.5；
培养条件如下：
温度为21℃静置48小时，在转速为100rpm、21℃条件下培养4天；
B、子实体的培养
B1、后熟期
培养条件如下：
环境湿度65％，15℃静置暗培养5天，待发酵液表层菌丝二次生长到完全覆盖培养基表面后，移入培养室弱光转色；
B2、逆境催蕾期
环境空气湿度90％以上，温度20℃，光照强度50Lux-150Lux，1-2天后菌丝开始转为淡黄色，保持光照强度100Lux-500Lux，二氧化碳浓度小于0.1％，经过5-7天出现原基；
B3、生长期
当原基分化为虫草子座的形状并生长到1-2cm时保持光照强度为50Lux，温度为10℃，空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％，生长调控10天左右，生长周期为30-35天；
生产菌种选用CGMCC No.5.856。
步骤A中的发酵培养基还包含有如下原料：
亚硒酸钠40mg/1000ml。
步骤A中颗粒状附着物选用滤料陶粒，所述的滤料陶粒直径0.5-2.0mm，堆积密度1250kg/m3。
步骤B2中的每天光照时间累计不小于10小时。白天可以利用自然的散射光，夜晚可以酌情利用日光灯补充光照2-4小时,在此期间可加大通风促进子座原基发育。
所述的步骤B3中每天光照时间累计不小于8小时，在此期间可采用自然通风增氧。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
A、菌丝体的培养
培养基采用如下原料配制：
马铃薯250克；葡萄糖20克；磷酸二氢钾1克；硫酸镁1克；维生素B120毫克；氯化钠1.8克；蛋白胨4.5克；水1000ml；占发酵培养基体积50％的颗粒状附着物；pH＝7.5；
培养条件如下：
温度为27℃静置72小时，在转速为150rpm、温度为27℃条件下培养6天；
B、子实体的培养
B1、后熟期
培养条件如下：
环境湿度75％，20℃静置暗培养7天，待发酵液表层菌丝二次生长到完全覆盖培养基表面后，移入培养室弱光转色；
B2、逆境催蕾期
环境空气湿度90％以上，温度24℃，光照强度50Lux-150Lux，1-2天后菌丝开始转为淡黄色，保持光照强度100Lux-550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％，经过5-7天出现原基；
B3、生长期
当原基分化为虫草子座的形状并生长到1-2cm时保持光照强度为50Lux-100Lux，温度为22℃，空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％，生长调控10天左右，生长周期为30-35天；
生产菌种选用ACCC51762中的一种。
步骤A中的发酵培养基还包含有如下原料：
亚硒酸钠50mg/1000ml。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
一种液体培育蛹虫草子座的方法，是将蛹虫草(Cordycepsmilitaris)菌种接种到培养基上进行培养；包括以下步骤：
A、菌丝体的培养
培养基采用如下原料配制：
马铃薯230克；葡萄糖150克；磷酸二氢钾0.8克；硫酸镁0.8克；维生素B120毫克；氯化钠1.7克；蛋白胨4克；水1000ml；占发酵培养基体积40％的颗粒状附着物；pH＝7.5；
培养条件如下：
温度为24℃静置60小时，在转速为130rpm、温度为24℃条件下培养5天；
B、子实体的培养
B1、后熟期
培养条件如下：
环境湿度65％-75％，18℃静置暗培养5-7天，待发酵液表层菌丝二次生长到完全覆盖培养基表面后，移入培养室弱光转色；
B2、逆境催蕾期
环境空气湿度90％以上，温度22℃，光照强度50Lux-150Lux，1-2天后菌丝开始转为淡黄色，保持光照强度100Lux-550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％，经过5-7天出现原基；
B3、生长期
当原基分化为虫草子座的形状并生长到1-2cm时保持光照强度为50Lux-100Lux，温度为16℃，空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％，生长调控10天左右，生长周期为30-35天；
生产菌种选用CGMCC No.5.856。
步骤A中的发酵培养基还包含有如下原料：
亚硒酸钠45mg/1000ml。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
一种液体培育蛹虫草子座的方法，是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养；包括以下步骤：
A、菌丝体的培养
培养基采用如下原料配制：
马铃薯230克；葡萄糖18克；磷酸二氢钾0.6克；硫酸镁0.8克；维生素B120毫克；氯化钠1.7克；蛋白胨4.2克；水1000ml；占发酵培养基体积45％的颗粒状附着物；pH＝7.5；
培养条件如下：
温度为26℃静置70小时，在转速为140rpm、温度为26℃条件下培养5天；
B、子实体的培养
B1、后熟期
培养条件如下：
环境湿度72％，18℃静置暗培养5-7天，待发酵液表层菌丝二次生长到完全覆盖培养基表面后，移入培养室弱光转色；
B2、逆境催蕾期
环境空气湿度90％以上，温度23℃，光照强度50Lux-150Lux，1-2天后菌丝开始转为淡黄色，保持光照强度100Lux-550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％，经过5-7天出现原基；
B3、生长期
当原基分化为虫草子座的形状并生长到1-2cm时保持光照强度为50Lux-100Lux，温度为10℃-22℃，空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％，生长调控10天左右，生长周期为30-35天；
生产菌种选用ACCC51762中的一种。
步骤A中的发酵培养基还包含有如下原料：
亚硒酸钠48mg/1000ml。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
一种液体培育蛹虫草子座的方法，是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养；包括以下步骤：
A、菌丝体的培养
培养基采用如下原料配制：
马铃薯240克；葡萄糖12克；磷酸二氢钾0.6克；硫酸镁0.9克；维生素B120毫克；氯化钠1.7克；蛋白胨3.8克；水1000ml；占发酵培养基体积35％的颗粒状附着物；pH＝7.5；
培养条件如下：
温度为26℃静置60小时，在转速为130rpm、温度为24℃条件下培养5天；
B、子实体的培养
B1、后熟期
培养条件如下：
环境湿度70％，16℃静置暗培养6天，待发酵液表层菌丝二次生长到完全覆盖培养基表面后，移入培养室弱光转色；
B2、逆境催蕾期
环境空气湿度90％以上，温度23℃，光照强度50Lux-150Lux，1-2天后菌丝开始转为淡黄色，保持光照强度100Lux-550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％，经过5-7天出现原基；
B3、生长期
当原基分化为虫草子座的形状并生长到1-2cm时保持光照强度为50Lux-100Lux，温度为20℃，空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％，生长调控10天左右，生长周期为30-35天；
生产菌种选用CGMCC No.5.856。
申请人委托上海农业科学院.上海科立特农产品检测技术服务有限公司对利用本发明中公开的方法所制备的虫草进行了检测，检测依据为中华人民共和国农业行业标准NY/T2116-2012(虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法)，结果如下。
样品 虫草素(mg/kg)
对照：蛹虫草(虫体子座) 1.13×103
对照：蛹虫草(虫体子座) 1.77×103
对照：蛹虫草(大米培养子座) 1.13×103
实施例1获得的蛹虫草(液体培养子座) 7.28×103
实施例2获得的蛹虫草(液体培养子座) 6.87×103
实施例3获得的蛹虫草(液体培养子座) 7.73×103
实施例4获得的蛹虫草(液体培养子座) 8.16×103
实施例5获得的蛹虫草(液体培养子座) 6.91×103

Claims (5)

1.一种液体培育蛹虫草子座的方法，是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养；其特征在于包括以下步骤：
A、菌丝体的培养
培养基采用如下原料配制：
马铃薯220-250克；葡萄糖10-20克；磷酸二氢钾0.5-1克；硫酸镁0.5-1克；维生素B120毫克；氯化钠1.5-1.8克；蛋白胨3-4.5克；水1000ml；占发酵培养基体积30％-50％的颗粒状附着物；亚硒酸钠40mg-50mg/1000ml；pH＝7.5；
培养条件如下：
温度为21℃-27℃静置48-72小时，在转速为100-150rpm、温度为21℃-27℃条件下培养4-6天；
B、子实体的培养
B1、后熟期
培养条件如下：
15℃-20℃静置，环境湿度65％-75％，暗培养5-7天，待发酵液表层菌丝二次生长到完全覆盖培养基表面后，移入培养室弱光转色；
B2、逆境催蕾期
环境空气湿度90％以上，温度20℃-24℃，光照强度50Lux-150Lux，1-2天后菌丝开始转为淡黄色，保持光照强度100Lux-550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％，经过5-7天出现原基；
B3、生长期
当原基分化为虫草子座的形状并生长到1-2cm时保持光照强度为50Lux-100Lux，温度为10℃-22℃，空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％，生长周期为30-35天；
生产菌种选用CGMCC No.5.856或ACCC51762中的一种。
2.根据权利要求1所述的液体培育蛹虫草子座的方法，其特征在于所述的步骤A中颗粒状附着物选用滤料陶粒。
3.根据权利要求2所述的液体培育蛹虫草子座的方法，其特征在于所述的滤料陶粒直径0.5-2.0mm，堆积密度1250kg/m3。
4.根据权利要求1所述的液体培育蛹虫草子座的方法，其特征在于所述的步骤B2中的每天光照时间累计不小于10小时。
5.根据权利要求1所述的液体培育蛹虫草子座的方法，其特征在于所述的步骤B3中每天光照时间累计不小于8小时。
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