CN115895932A

CN115895932A - 副干酪乳杆菌tci727及其用途

Info

Publication number: CN115895932A
Application number: CN202210823100.9A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 黄琡涵
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2021-07-13
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2042-07-13
Also published as: TW202302837A; US11938157B2; CN115607595A; TWI802194B; TWI849451B; TW202302134A; CN115895932B; US20230029084A1; CN115607595B

Abstract

本发明公开了一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TCI727，其中副干酪乳杆菌TCI727系以寄存编号DSM 33756寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。

Description

副干酪乳杆菌TCI727及其用途

技术领域

本揭露关于一种副干酪乳杆菌，特别是关于一种副干酪乳杆菌TCI727及副干酪乳杆菌TCI727/或其代谢产物用于制备促进钙质吸收的组合物的用途。

背景技术

研究指出，钙质的吸收容易受植酸抑制，其中富含植酸的食物包括豆类、谷物、种子及坚果，在肠道中这些物质会与钙结合而形成钙盐，将使得摄入食物中的钙质随着植酸排出体外，不利于个体对于摄入食物中的钙质的吸收及降低个体摄入钙的利用率。因此，黄豆及芝麻虽富含钙质，但却碍于其本身富含植酸，因而其不是优良的钙质补充来源。

基于人体缺乏植酸酶，需要靠肠道菌丛帮助分解摄入食物中的植酸成分。

此外，钙的主动运输必须藉助活化维生素D调节，增加细胞的钙离子通道蛋白，以增加钙的吸收。

发明内容

有鉴于此，在一些实施例中，一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，其系寄存于中国台湾食品工业发展研究所(寄存编号为BCRC911032)、及德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)(寄存编号为DSM33756)。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727具有植酸酶。

在另一些实施例中，一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TCI727或其代谢产物用于制备促进钙质吸收的组合物的用途，其中副干酪乳杆菌TCI727系以寄存编号为BCRC 911032寄存于中国台湾食品工业发展研究所。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物用以提供一个体有效量的植酸酶。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物用以提升一个体的维生素D含量。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物用以提升骨细胞的钙含量。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物用以提升一个体的骨钙素含量。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物用以促进一个体的钙吸收及/或骨质生成。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727的有效剂量至少为1x10⁸CFU/天的副干酪乳杆菌TCI727。

在一些实施例中，含有副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物的促进钙质吸收的组合物的型式，系为粉末、颗粒、锭剂、液体或胶体。

在一些实施例中，当组合物为粉末的型式，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物的剂量系为100mg/天。

在一些实施例中，含有副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物的促进钙质吸收的组合物，可制成食品、饮品、营养补充剂或医药品。

综上所述，根据任一实施例的副干酪乳杆菌及副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物的用途，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物能促进钙质吸收。在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物可藉由植酸酶分解植酸来促进钙质吸收，藉以避免口服补充的钙质受日常饮食中的植酸影响。此外，在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物具有提升骨细胞的钙含量，及提升个体的骨钙素含量。如此一来，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物适用于提供安全又有效的补钙益生菌。

附图说明

图1是副干酪乳杆菌TCI727、L1281、L1282及L1286于植酸钠培养基进行植酸酶的活性检测结果照片图；

图2是图1所示的副干酪乳杆菌TCI727的维生素D3含量的柱状图；

图3A是细胞实验中茜素红S染剂(Alizarin Red S)染色以观察钙沉淀的细胞钙沉淀染色结果图；

图3B是细胞实验中，基于图3A的细胞钙沉淀染色结果图，进一步量化统计后所得的相对骨质钙含量的柱状图；

图4A是人体试验中，第0周及第4周检测血液中维生素D含量的柱状图；及

图4B是人体试验中，第0周及第4周检测血液中骨钙素含量的柱状图。

其中，附图标记：

1：澄清区域

2：茜素红S染剂

生物材料的保藏

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TCI727，保藏于中国台湾食品工业发展研究所，保藏时间为2020/12/29，保藏编号为BCRC911032。

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TCI727，保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，地址：DE德国布伦瑞克市因霍芬大街7B，邮编D-31824(Inhoffenstr 7B,D-38124 Braunschweig)，保藏时间为2021/01/07，保藏编号为：DSM 33756。

具体实施方式

为了使本领域具有通常知识者能了解本发明的特点，以下就说明书及申请专利范围中提及术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有说明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。

本案使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student's t-test)进行分析。

本文所述的用语「个体」是指人类或非人的哺乳动物，较佳为人类。

本文中所述的用语「有效剂量」系指一物质在一个体引发特定功效所需要的量。如本技术领域普通技术人员所认知，有效剂量将依给予途径、赋形剂的使用以及与其它物质共享的可能而变化。

本案发明人自生乳(牛乳)中筛选出一新颖菌株，并且将此新颖菌株经16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)序列分析后依亲缘关系鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，并且经命名为Lactobacillus paracaseiTCI727(后称副干酪乳杆菌TCI727)。于此，副干酪乳杆菌TCI727系以寄存编号BCRC 911032寄存于中国台湾食品工业发展研究所，以及以寄存编号DSM 33756寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。其中，副干酪乳杆菌TCI727系具有如SEQ ID NO:1所示的16S核糖体核糖核酸(16SrRNA)序列。

副干酪乳杆菌TCI727为革兰氏阳性杆菌，可于厌氧环境下生长，属于兼性厌氧乳酸菌。副干酪乳杆菌TCI727生长的温度为35℃至37℃，并且可于酸碱值(pH值)为3至7的环境下生存。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727及/或其代谢产物能促进钙吸收。其中，促进钙吸收所指可为提供个体有效量的植酸酶、提升一个体的维生素D含量、改善一个体的维生素D含量、骨细胞的钙含量、骨钙素含量、促进一个体的钙吸收、促进一个体的骨质生成、或其任意组合。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727的代谢产物的制备方式如下所述，例如，可直接使用经历副干酪乳杆菌TCI727的代谢循环的含副干酪乳杆菌TCI727与代谢产物的培养液。

在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727的代谢产物的制备方式如下所述，例如，使用经移除副干酪乳杆菌TCI727等固体物的含代谢产物的液体。移除固体物可采用任何合宜的操作来施行，只要对培养后所产生的代谢产物的所欲效益没有不利的影响即可。一般而言，移除固体物系采用物理手段来施行，并且此物理手段可为例如：离心分离、滤膜过滤、沉淀倾析等操作。视需要地，前述物理操作可重复或合并进行，以尽可能去除培养液中的菌体等固体物。

在一些实施例中，含有副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物的促进钙质吸收的食品组合物，其系可以为健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、或特殊营养食品。含有副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物的促进钙质吸收的食品组合物可制成例如乳制品、肉类加工品、面包类、面食类、饼干、口含锭、胶囊、果汁类、茶类、运动饮料、营养饮料等产品，但不以此为限。

在一些实施例中，健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、或特殊营养食品系可以一日一次、一日多次或数日一次等不同频率食用，端视投予个体的年龄、体重及健康状况而异。亦可针对投予族群的需要，调整任一实施例的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品或特殊营养食品中的副干酪乳杆菌TCI727/或其代谢产物的含量，例如，调整至每日应服用的量。

例1：副干酪乳杆菌TCI727的筛选与鉴定

(1-1)筛选

自生乳中取适量样品于固态乳杆菌MRS培养基(BD Difco^TMLactobacilli MRSBroth，with 1.5体积％agar)上涂盘并于37℃厌氧环境(即培养环境中氧气浓度为1体积％)下培养至单一菌落(single colony)形成。于此，培养16小时后，单一菌落(singlecolony)形成。

(1-2)鉴定

从(1-1)挑取多个单一菌落后，并以乳酸菌的16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)进行各个单一菌落的菌种鉴定。在菌种鉴定的过程中，透过聚合酶连锁反应(PCR)得到各个单一菌落的16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)序列(即SEQID NO:1至SEQID NO:4)。接着，利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站，将SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的基因序列分别与其他乳杆菌菌种的16SrRNA序列进行序列比对后，可知此些单一菌落的16SrRNA序列与其他副干酪乳杆菌亚种(Lactobacillus paracasei)的16SrRNA序列的相似性如表一所示。

表一

其中，分离自生乳且与其他副干酪乳杆菌亚种(表一所示「比对的副干酪乳杆菌菌种」)的相似度达97.05％的具有SEQ ID NO：1的基因序列的单一菌落即为副干酪乳杆菌TCI727。并且，将此副干酪乳杆菌TCI727以寄存编号BCRC 911032寄存于中国台湾食品工业发展研究所，以及以寄存编号DSM 33756寄存于德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)。

其中，分离自生乳且与其他副干酪乳杆菌亚种(表一所示「比对的副干酪乳杆菌菌种」)的相似度达98.23％-98.83％的具有SEQ ID NO：2的基因序列的单一菌落，命名为副干酪乳杆菌L1281。

其中，分离自乳牛糞便且与其他副干酪乳杆菌亚种(表一所示「比对的副干酪乳杆菌菌种」)的相似度达99.71％-99.81％的具有SEQ ID NO：3的基因序列的单一菌落，命名为副干酪乳杆菌L1282。

其中，分离自人类母乳且与其他副干酪乳杆菌亚种(表一所示「比对的副干酪乳杆菌菌种」)的相似度达99.91％-100.00％的具有SEQ ID NO：4的基因序列的单一菌落，命名为副干酪乳杆菌L1286。

(1-3)采用NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)进行相似性之比对分析：

表二

基此，根据表二的比对结果显示，即使是同样从生乳分离出来的相同菌种，不同菌株还是会产生不同效果，即使TCI727和副干酪乳杆菌L1281有高达98.77％的相似度，其仍无法产生相同的效果，如例4之实验结果说明如后。

例2：个别含有副干酪乳杆菌TCI727/或副干酪乳杆菌L1281/或副干酪乳杆菌L1282/或副干酪乳杆菌L1286的菌液的制备

(2-1)材料

液态培养基:液态乳杆菌MRS培养基(BD Difco^TMLactobacilli MRS Broth)。

(2-2)实验流程

首先，以例1所得的副干酪乳杆菌TCI727作为目标菌株。

将目标菌株，接种至1L(升)液态乳杆菌MRS培养基中，并调整液态乳杆菌MRS培养基中的目标菌株的菌量，以形成其吸光值(OD600)为0.1的初始菌液。

接着，将前述初始菌液于37℃厌氧环境下恒温培养24小时后，以形成副干酪乳杆菌TCI727菌液(含有副干酪乳杆菌TCI727菌株的菌液)。

其中，以例1鉴定所得的副干酪乳杆菌L1281作为目标菌株，依照上面相同的实验流程制得副干酪乳杆菌L1281菌液。

其中，以例1鉴定所得的副干酪乳杆菌L1282作为目标菌株，依照上面相同的实验流程制得副干酪乳杆菌L1282菌液。

其中，以例1鉴定所得的副干酪乳杆菌L1286作为目标菌株，依照上面相同的实验流程制得副干酪乳杆菌L1286菌液。

例3:副干酪乳杆菌TCI727的代谢产物的制备

将例2所得的副干酪乳杆菌TCI727菌液以高速离心机(Thermo Megafuge16centrifuge)设定转速5,000xg离心20分钟，以形成去除副干酪乳杆菌TCI727的菌体的上清液以及含副干酪乳杆菌TCI727的菌体的沉淀物。

于此，可得到去除菌体的上清液(即副干酪乳杆菌TCI727的代谢产物)，以及含菌体(即副干酪乳杆菌TCI727菌体)的沉淀物。

例4：检测植酸酶的活性

检测原理:培养基中的植酸被分解而于培养基观察到澄清区域(zones ofclearing)，代表相应处的涂布菌株具有植酸酶活性；反之，培养基维持浑浊态区域，则代表相应处的涂布菌株无分解植酸的活性。

(4-1)材料

1.待测样品：取自例2所获得的副干酪乳杆菌TCI727菌液、副干酪乳杆菌L1281菌液、副干酪乳杆菌L1282菌液及副干酪乳杆菌L1286菌液。

2.含有植酸钠的培养基(后称植酸钠培养基):其组成份为10％(v/v)瘤胃液(rumen fluid，品牌:ELITE-MEDIA)，0.25％葡萄糖,0.25％纤维二糖(Sigma),0.3％淀粉(Sigma),1.8％(w/v)洋菜(BD)以及1.0％(w/v)植酸钠(sodium phytate,Sigma)。

3.试剂1:由6.25％(w/v)钼酸铵水溶液(aqueous ammonium molybdatesolution)及0.42％钒酸铵水溶液(ammonium vanadate solution)所组成。

(4-2)实验流程

1.分别将来自于例2所制得的副干酪乳杆菌TCI727菌液、副干酪乳杆菌L1281菌液、副干酪乳杆菌L1282菌液及副干酪乳杆菌L1286菌液，进行菌液浓度标准化至OD600nm＝1.0后，个别涂布于一个植酸钠培养基所画分的四个扇形区域，并于37℃且厌氧环境下培养5天。

2.接着，将2％(w/v)氯化钴水溶液覆盖植酸钠培养基表面，并于静置5分钟后去除。

3.接着，再倒入的试剂1，并于室温环境下静置5分钟。

4.将上述试剂1去除，并观察植酸钠培养基是否有澄清区域1出现。

(4-3)实验结果

由图1可得而知，相比于其他三株同菌种(亦即副干酪乳杆菌L1281、副干酪乳杆菌L1282及副干酪乳杆菌L1286)的扇形区域呈现雾状不透光的状态(其表示其上仍有植酸存在)，植酸钠培养基对应于涂布有副干酪乳杆菌TCI727菌液的区域，可见副干酪乳杆菌TCI727的菌落周围明显观察到植酸已被消除的澄清区域1，因此由检测结果可得副干酪乳杆菌TCI727具有植酸酶的活性。

故，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物可藉由植酸酶分解植酸。

例5：检测TCI727产生维生素D3的能力

实验目的:已知钙的主动运输必须藉由维生素D(Vitamin D)的调节，因此为了测试本发明的副干酪乳杆菌TCI727产生维生素D3的能力，于此利用ELISA套组检测例3所得的副干酪乳杆菌TCI727的上清液中维生素D3含量。

(5-1)维生素D3(VD3)ELISA套组检测

材料

维生素D3 ELISA检测套组(购自Cloud-clone corp；Cat.CEA920Ge)，套组内含有以下溶液:标准液(Standard)、标准稀释剂(Standard diluent)、检测试剂A(Detectionreagent A)、检测试剂B(Detection reagent B)、分析稀释剂A(Assay diluent A)、分析稀释剂B(Assay diluent B)、试剂稀释剂(Reagent diluent)、TMB液(TMB substrate)、终止液(Stop solution)、清洗液(Wash buffer):原液为浓缩液(30X)。

实验前准备

1.标准序列稀释液的制备:以1ml的标准稀释剂回溶标准液，置于室温环境10分钟使其充分溶解，轻轻摇晃(勿起泡)，回溶标准液最终达浓度为200ng/ml。取50μl回溶后之标准液加入含有950μl标准稀释剂的1.5ml微量离心管，制成最终浓度为1000pg/ml，待稀释用。准备6个新的1.5ml微量离心管，个别加入等体积(100μl)的标准稀释剂，接着在第一管微量离心管加入100μl的回溶标准液，混和均匀后再从第一管取100μl至第二管，依序稀释至第6管，最后得到浓度为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml及15.625pg/ml的标准序列稀释液。此外，空白組(Blank)为仅含有标准稀释剂(0ng/ml)。

2.第一空白组的制备：其制备流程与标准序列稀释液的制备方式相同。

3.检测试剂A操作溶液、检测试剂B操作溶液、1X清洗溶液、TMB液参照使用说明书中配置步骤。

4.1X DPBS:将10X DPBS(购自Gibco；Cat.14200-075)以灭菌后的ddH₂O稀释10倍，pH 7.0-7.2。

5.分析样品：取自例3所获得的副干酪乳杆菌TCI727的上清液，以及取自(5-1)所获得的第一空白组。将副干酪乳杆菌TCI727的上清液以及第一空白组进行适当的浓度稀释(以使分析样品的浓度落在标准曲线的线性范围内)，其中以1x DPBS在一定比例下分别对第一空白组及副干酪乳杆菌TCI727的上清液进行稀释。其中稀释后的副干酪乳杆菌TCI727的上清液以制得实验组(不含细胞)。其中稀释后的第一空白组以制得空白组(不含细胞)。空白组和实验组分别用于后续的维生素D3检测步骤中。

以下简述维生素D3检测步骤，详细操作步骤可参照维生素D3检测试剂套组内所附的使用说明书执行。

实验流程

1.将50μl/well的标准序列稀释液(如上述多个浓度)、空白组以及实验组加入96孔盘(其已预涂专一性抗维生素D3的单株抗体且是随时可使用的，包含在维生素D3检测试剂套组中)，再立即加入50μl/孔的检测试剂A操作溶液，并且将二液轻摇混合后，于37℃下反应1小时以形成已作用液体。

2.抽吸孔盘中已作用液体，再加入350μl/孔的1X清洗溶液，然后静置1-2分钟。于静置后，将孔盘倒置在纸巾上，以尽量移除孔内所有液体。

3.接着，加入100μl/孔的检测试剂B操作溶液至各孔中，并于37℃下反应30分钟。

4.进行如同步骤2所述的操作过程共5次。

5.加入90μl/孔的TMB液至各孔中，并于37℃下暗处反应10分钟。其中，此步骤需避光，且反应时间不可超过30分钟。

6.加入50μl/孔的终止液至各孔中，并轻拍孔盘使其充分混和(变色)。

7.最后，以分光亮度计(Thermo Fisher Scientific)量测各孔在O.D.450纳米的吸亮度，并将各孔的吸亮度与标准序列稀释液的吸亮度比较，以求出分析样品(各组别上清液)的维生素D3浓度。

(5-2)实验结果

请参阅图2。空白组所测得的维生素D3含量为17.49pg/ml，实验组所测得的维生素D3含量为527.73pg/ml。换言之，相比于空白组，经副干酪乳杆菌TCI727的上清液处理的实验组，维生素D3含量明显提升，为空白组的30倍(***：与空白组比较具有显著差(p<0.001))。

由此可知，当副干酪乳杆菌TCI727可透过自生合成维生素D3，并明显提升其上清液维生素D3含量，而维生素D3经文献证实有助调节钙离子运输蛋白的生成及提升钙离子帮浦的活性，从而促进肠道细胞的钙吸收。

例6：检测提升骨质钙含量的能力

(6-1)材料

1.细胞株：小鼠骨髓基质细胞株OP9(bone marrow stromal cell，后称OP9细胞)，其系购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，)的OP9细胞株(CRL-2749^TM)。

2.细胞培养基:包含90％MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，购自Gibco，产品编号Cat.12000-022)、20％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，Cat.10437-028)及1％的青霉素/链霉素(Penicillin-streptomycin，购自Gibco，Cat.15240-062)。

3.分化培养基:包含90％DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，购自Gibco，Cat.12100-038)添加额外成分使其含有10％FBS(fetal bovine Serum，购自Gibco，10438-026)及1％青霉素-链霉素(购自Gibco，Cat.15140122)、50μM抗坏血酸(ascorbicacid，购自Sigma)、10^-7M迪皮质醇(dexamethasome，购自Sigma)、及10mMβ-甘油(β-glycerol，购自Sigma)。

4.测试样品:取自于例3所制得的副干酪乳杆菌TCI727的上清液。

5.染剂:茜素红S染剂(Alizarin Red S，购自Sigma)。

6.4％甲醛(Formaldehyde)：购自景明(ECHO)，产品编号Cat.119690010。

7.磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)：购自Gibco，产品编号10437-028。

8.ddH₂O。

9.CPC缓冲液:含有10vol％Cetylpyridinium chloride(CPC)的磷酸钠溶液，其中磷酸钠的浓度为10mM。

(6-2)实验流程

诱发为硬骨细胞(osteocyte)

1.取2×10⁴个OP9细胞至每孔含有500μL的细胞培养基的24孔细胞培养盘中，于5体积％二氧化碳浓度、温度37℃的恒温箱中培养隔夜。接着，将前述细胞培养基更换为新鲜的分化培养基。

2.接续培养7天，其中每3天更换一次新鲜的分化培养基。

3.观察细胞型态，确认OP9细胞已分化为硬骨细胞后，将硬骨细胞分为空白控制组(mock)及实验组，并接续培养7天且其中每3天更换一次新鲜的分化培养基。其中，实验组的分化培养基含有测试样品，测试样品为例3所获得的副干酪乳杆菌TCI727的上清液。空白控制组(mock)则不另外加入任何测试样品，为单纯的分化培养基。

4.完成前述7天的培养后，接续茜素红S染剂(Alizarin Red S)2染色。

茜素红S染剂(Alizarin Red S)2染色以确认钙沉淀

1.小心地抽吸各孔中的分化培养基，并以PBS溶液冲洗硬骨细胞。

2.于小心地抽吸PBS溶液后，于各孔加入4％甲醛以固定硬骨细胞10分钟。

3.以ddH₂O冲洗掉4％甲醛。

4.接续制备染剂茜素红S溶液，取2g的茜素红S粉末溶于100ml的ddH₂O并以孔径0.22μm滤膜过滤后以形成过滤后茜素红S溶液。取100-200μL的过滤后茜素红S溶液加入至各孔中，并染色1分钟。

5.小心地抽吸各孔中的过滤后茜素红S溶液，并以ddH₂O冲洗以脱色。其中，于此步骤获得染色样品。

6.接着，置于显微镜下以观察染色样品中的硬骨细胞的钙沉淀，其中对应于茜素红S染剂2染色的地方，即为钙沉淀。

7.加入200μl CPC缓冲液至染色样品中，并将其放置于摆荡机上且轻轻摆荡1个小时以获得含有CPC缓冲液的染色样品。

8.分别自各组别的含有CPC缓冲液的染色样品取出100μl至96孔盘，并于O.D.550奈米的吸亮度来定量分析硬骨细胞中的钙含量。

(6-3)实验结果

请参阅图3A。在显微镜下观察个别空白控制组(mock)及实验组的钙沉淀结果，由硬骨细胞染色结果图3A显示，相比于空白控制组，在实验组所观察到的茜素红S染剂2(红色染剂)染色的总面积，明显多于空白控制组。

经由在O.D.550奈米的吸亮度的检测下，量化统计后的相对骨质钙含量的结果请参阅图3B。空白控制组为未经副干酪乳杆菌TCI727的上清液处理，也就是指空白控制组中的硬骨细胞在正常的生理代谢情况下，设定其所能产生的钙沉淀为100％。而实验组的硬骨细胞在经过副干酪乳杆菌TCI727的上清液的处理历时7天后，其相对于空白控制组所产生的钙沉淀含量为137.2％(*：与空白控制组比较具有显著差(p<0.05))。可得而知，副干酪乳杆菌TCI727的上清液在历时7天内即可明显提升硬骨细胞的钙含量。

例7：人体试验

为了评估副干酪乳杆菌TCI727样品的促进个体钙吸收的能力，以及进一步评估其对于个体骨质保健的能力，于此，进行人体试验以确认服用副干酪乳杆菌TCI727菌体对于个体促进钙吸收及骨质生成的影响。

试验设计

分为控制组及实验组，受试者共6人，其中各组别的受试者人数为三位。其中，各组别的受试者本身条件包括：骨质疏松风险高者(停经妇女及/或年龄大于60岁)、曾经检测过且被医生判定骨密度偏低者或常喝咖啡者。

控制组：受试者每日服用一次测试样品，连续服用4周，并且，于试验前(即未开始服用测试样品，并视为第0周)及试验后(即连续服用测试样品4周后，并视为第4周)分别进行试验前后的血液中钙含量及血液中骨钙素含量检测。其中，控制组中的受试者服用的测试样品，系为单纯的钙片补充组。其中，前述钙片(市售)系为磷酸钙加上柠檬酸钙，剂量为500mg/天。

实验组：受试者每日服用一次测试样品，连续服用4周，并且，于试验前(即未开始服用测试样品，并视为第0周)及试验后(即连续服用测试样品4周后，并视为第4周)分别进行试验前后的血液中钙含量及血液中骨钙素含量检测。其中，实验组中的受试者服用的测试样品，系为钙片搭配副干酪乳杆菌TCI727菌体(活菌菌粉)的合并服用。其中，前述钙片(市售)系为磷酸钙加上柠檬酸钙，剂量为500mg/天。其中，副干酪乳杆菌TCI727菌体(TCI727促钙吸收菌，以组合物的形式)的剂量为50mg/天。其中，前述副干酪乳杆菌TCI727菌体系取自例3所获得的。

其中，血液中钙含量及血液中骨钙素含量检测皆是以静脉采血方式收集血液检体，并将血液检体送至检验所(中国台湾人医事检验所)测定血液中钙含量及骨钙素含量。

7-1：副干酪乳杆菌TCI727促进个体钙吸收的能力，从而提升个体血液中维生素D浓度

检测结果

请参阅图4A。在控制组中，试验前(即图4A第0周)，3位受试者的平均血液中维生素D浓度为21.8ng/mL，而在试验后(即图4A第4周)，3位受试者的平均血液中维生素D浓度为22.2ng/mL。换言之，控制组中的受试者在测试样品系为单纯的钙片补充组的条件下，经过每日服用一次前述测试样品，且连续服用4周后，平均血液中维生素D浓度仅增加1.8％。

相对地，在实验组中，试验前(即图4A第0周)，3位受试者的平均血液中维生素D浓度为24.1ng/mL，而在试验后(即图4A第4周)，3位受试者的平均血液中维生素D浓度为25.6ng/mL。换言之，实验组中的受试者在测试样品系为钙片搭配副干酪乳杆菌TCI727菌体的合并服用的条件下，经过每日服用一次前述测试样品，且连续服用4周后，受试者平均血液中维生素D浓度大幅增加6.2％。基此，副干酪乳杆菌TCI727可透过自生维生素D以帮助个体对于钙质的吸收，从而提升个体血液中维生素D浓度及强化骨骼。

7-2：副干酪乳杆菌TCI727提升个体血液中骨钙素浓度，从而促进个体骨质生成的能力

研究显示，骨钙素(Osteocalcin)主要由造骨细胞(osteoblasts)所生成，其含量与骨质的生成具有正相关性，因而骨钙素(Osteocalcin)可做为骨质生成的生物性指标。

检测结果

请参阅图4B。在控制组中，试验前(即图4B第0周)，3位受试者的平均血液中骨钙素浓度为17.5％，而在试验后(即图4B第4周)，3位受试者的平均血液中骨钙素浓度为17.9％。换言之，控制组中的受试者在测试样品系为单纯的钙片补充组的条件下，经过每日服用一次前述测试样品，且连续服用4周后，平均血液中骨钙素浓度仅增加2.3％。

相对地，在实验组中，试验前(即图4B第0周)，3位受试者的平均血液中骨钙素浓度为16.5％，而在试验后(即图4B第4周)，3位受试者的平均血液中骨钙素浓度为18.2％。换言之，实验组中的受试者在测试样品系为钙片搭配副干酪乳杆菌TCI727菌体的合并服用的条件下，经过每日服用一次前述测试样品，且连续服用4周后，平均血液中骨钙素浓度大幅增加10.3％。基此，验证了钙片搭配副干酪乳杆菌TCI727菌体(活菌菌粉)的合并服用的情况下可促进骨质生成，且其效果优于单纯钙片补充组。

基此，人体试验结果验证了副干酪乳杆菌TCI727(TCI727促钙吸收菌)对于骨质保健的能力。

综上所述，根据任一实施例的副干酪乳杆菌及副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物的用途，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物能促进钙质吸收。在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物可藉由植酸酶分解植酸来促进钙质吸收，藉以避免口服补充的钙质受日常饮食中的植酸影响。在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物具有提升肠道细胞的维生素D3含量。此外，在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物具有提升骨细胞的钙含量。在一些实施例中，副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物具有提升个体的维生素D浓度及骨钙素含量。副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物可用于制备促进钙质吸收的组合物，其中组合物系为粉末、颗粒、锭剂、液体或胶囊的剂型。含有副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物的促进钙质吸收的组合物可制成食品、饮品、营养补充剂或医药品，其中组合物藉由口服方式给予一个体。

虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神所作些许的更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

Claims

1.一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TCI727，其特征在于，该副干酪乳杆菌TCI727系以寄存编号DSM 33756寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。

2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌TCI727，其中该副干酪乳杆菌TCI727包含SEQ IDNO:1的一核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌TCI727，其中该副干酪乳杆菌TCI727具有植酸酶。

4.一种如权利要求1所述的副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物用于制备促进钙质吸收的组合物的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其中该副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物系用以提供一个体有效量的植酸酶。

6.如权利要求4所述的用途，其中该副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物系用以提升一个体的维生素D含量。

7.如权利要求4所述的用途，其中该副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物系用以提升骨细胞的钙含量。

8.如权利要求4所述的用途，其中该副干酪乳杆菌TCI727或其代谢产物系用以促进一个体的钙吸收及/或骨质生成。

9.如权利要求4所述的用途，其中该副干酪乳杆菌TCI727的有效剂量至少为1x10⁸CFU/天的副干酪乳杆菌TCI727。

10.如权利要求4所述的用途，其中该组合物的剂型为粉末、颗粒、锭剂、液体或胶体。