KR101937758B1 - 락토바실러스 퍼멘텀 ubc-u32, 및 이의 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32, 및 이의 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 용도에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32(Lactobacillus fermentum UBC-U32)(기탁번호: KCTC13617BP) 균주, 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료/개선용 약학적 또는 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32는 다른 균주와 비교하여 항균활성, 내산성, 내담즙산성 및 내열성이 우수할 뿐만 아니라, 퇴행성 뇌질환에 대하여 치료 효과를 나타내는 것이 특징이다.

Description

락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32, 및 이의 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 용도{Lactobacillus fermentum UBC-U32, and use thereof in prevention and treatment of neurodegenerative disease}
본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32, 및 이의 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 용도에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32(Lactobacillus fermentum UBC-U32)(기탁번호: KCTC13617BP) 균주, 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료/개선용 약학적 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
최근 노인인구가 급격한 증가로 인한 사회적 문제 및 복지정책상 국가적 의료비 부담 및 경제적 인구감소로 인한 경쟁력 약화가 예상 되는바 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매 같은 퇴행성 뇌질환을 가진 노인층이 증가 추세이다. 알츠하이머병 치매는 서서히 발병하여 기억력 감퇴와 행동장애 같은 시공간적 행동망실이 점진적으로 진행하는 유전병인데, 언어장애, 일상생활 불편, 기억감퇴 등의 치매증상을 보이며. 이 병은 아직까지 병인, 병리가 정확히 규명되지 않았지만 노화 및 환경인자인 식생활 변화에 기인하고 있다고 알려져 있다. 알츠하이머병의 주 발병 원인으로 아밀로이드베터와 타우인데 특히 올리고머 아밀로이드의 신경독성이 가장 강력한 인자이다. 그러나 아직까지 퇴행성 뇌질환의 근본적인 발병 원인을 치료할 수 있는 치료제는 개발되어 있지 않고, 아세틸콜린 분해 억제제의 경우는 치매의 일부분인 감퇴된 인지 능력을 개선해 줄 뿐, 작용점이 다른 알츠하이머 질환의 근본적인 발병 원인을 치료하지는 못하는 한계가 있다. 한편 인지장애는 오감기능의 퇴보로 언어, 시공간 인지감소, 판단력 및 추상적 사고력등 지적능력이 감퇴되는 증상으로 최근에 장-뇌축간 부조화로 인한 장내 세균총의 교란과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
유산균은 항균 펩타이드성분, 장내 정상균총의 유지, 장내 균총의 개선, 항당뇨 및 항고지혈증 효과, 발암 억제, 대장염 억제, 그리고 숙주의 면역체계의 비특이적 활성 등의 효과를 나타낸다고 보고되고 있다. 그 중에서도 락토바실러스 속 균주는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질 내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로 오래전부터 알려져 왔다. 한편, 김치 등과 같은 발효식품류의 유산균은 발효에 관여하는 유산균으로서 면역증강제, 피부개선, 항당뇨, 항균, 항산화, 항암 효과, 항비만 효과, 고혈압 예방 또는 변비 예방 효과 등이 있는 것으로 보고되고 있다.(Makino S, Hemmi J, Kano H, Kashiwagi M, Hojo K, Asami Y. Anti-Fatigue Effects of Yogurt Fermented with Lactobacillus delbureckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 in Healthy People Suffering from Summer Heat Fatigue)
이러한 유산균의 기능이 보고되면서, 최근 인체에 안전성과 고기능성이 충족된 유산균 균주들이 개발되어 이를 의약품, 천연물 또는 식품에 적용하려는 연구가 진행되고 있다. 그러나, 선행기술에 개시된 유산균 또는 유산균에 의해 발효된 산물들은 생체내의 아밀로이드 침착이나 신경염증위주로 적용한 결과이어서 실제 인체내의 복합적이고 강력한 뇌세포 세포사멸에 담당하는 올리고머 아밀로이드의 독성에 대한 뇌질환의 치료 효과가 크게 높지 않아 상업적으로 적용하는데에 한계가 있다.
따라서, 뇌질환의 치료 효과가 상업적인 치료제와 비슷한 인간형 동물 모델로부터 장내세균총의 교란, 장 누수 증후군을 개선할 수 있는 유산균의 스크리닝 및 이를 통한 의약품, 기능성 식품 등의 개발이 필요하다.
Makino S, Hemmi J, Kano H, Kashiwagi M, Hojo K, Asami Y. Anti-Fatigue Effects of Yogurt Fermented with Lactobacillus delbureckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 in Healthy People Suffering from Summer Heat Fatigue
이에 본 발명자는 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환의 발병 및 악화를 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 내열성, 내담즙성 및 내산성 또한 우수하여 상업적으로 이용가치가 높은 균주를 개발한 결과, 장내 미생물인 신규한 락토바실러스 속 유비씨-유32(Lactobacillus sp. UBC-U32)균주가 알츠하이머병 동물모델에서 뇌인지장애를 개선하고, 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환 마커의 올리고머 아밀로이드 발현을 억제하고 뇌인지 능력 개선 효과가 있을 뿐만 아니라, 기존의 균주들과 비교하여 내산성, 내담즙성 및 내열성이 현저히 우수하여 상업적으로 이용가치가 높음을 밝혀 냄으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32(Lactobacillus fermentum UBC-U32)(기탁번호: KCTC13617BP) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 인지기능 증진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 감염성 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품첨가용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32의 배양물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32(Lactobacillus fermentum UBC-U32)(기탁번호: KCTC13617BP) 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 인지기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 감염성 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32의 배양물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32(Lactobacillus fermentum UBC-U32) 균주를 제공한다.
본 발명의 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32는 내산성, 내담즙성 및 내열성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32는 서열번호 1로 표시되는 16S rDNA를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 균주는 그 기탁번호가 KCTC13617BP 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 균주는 그 출처가 제한되지 않으나, 발효식품으로부터 분리된 것일 수 있으며, 예를 들어 김치, 된장, 고추장, 간장, 치즈, 젓갈 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 균주가 퇴행성 뇌질환의 치료효과가 뛰어남을 확인하였을 뿐만 아니라, 기존의 다른 균주들과 비교하여 내산성 및 내담즙성이 우수하여 안정적으로 장내에 도달하여 그 효과를 나타낼 수 있으며, 우수한 내열성을 나타내므로 프로바이오틱스 최종 제품으로의 제품 가공이 용이함을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32의 배양물을 제공한다.
본 발명에서 용어 '배양'이란 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서는 '발효'를 포함하는 개념이다.
상기 '락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32'의 균체는 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 유산균에 대한 임의의 가공형태를 포함하는 것으로 예를 들어 균체 파쇄물, 건조물, 동결물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 용어 '배양물'은 '발효물'을 포함하는 의미이며, 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등의 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다.
이에 더하여, 본 발명은 상기 균주(락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32(Lactobacillus fermentum UBC-U32))를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 또는 감염성 염증 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "조성물"은 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32의 균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어 “퇴행성 뇌질환”은 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 당뇨성 치매, 알코올성 치매, 혈관성 치매, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 퇴행성 뇌질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러가지 증상을 유발하는 질환으로 대부분 질병의 발병이 서서히 시작하며 출생 후 오랜 기간 정상적인 기능을 하다가 증상이 나타난다. 또한 일단 발병하면 사망 시까지 수년 또는 수십 년에 걸쳐 지속적으로 병이 진행하며, 가족력이 있는 경우가 많다.
본 발명의 “감염성 염증 질환”은 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 폐렴, 폐결핵, 결핵, 감기, 인플루엔자, 기도 감염, 비염, 비인두염, 중이염, 기관지염, 임파선염, 이하선염, 림프절염, 구순염, 구내염, 관절염, 근육염, 피부염, 혈관염, 치은염, 치근막염, 각막염, 결막염, 창상 감염, 복막염, 간염, 골수염, 봉소염, 수막염, 뇌염, 뇌농양, 뇌척수염, 뇌막염, 골수염, 신장염, 심장염, 심내막염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 요로염, 방광염, 질염, 자궁경부염, 난관염, 감염성 홍반, 세균성 이질, 농양 및 궤양, 균혈증, 설사, 이질, 위장염, 위장관염, 비뇨생식기 농양, 개방성 창상 또는 상처의 감염, 화농성 염증, 농양, 종기, 농피증, 농가진, 모낭염, 봉소염, 수술 후 상처 감염, 피부열상증후군, 피부화상증후군, 혈전성 혈소판 감소증, 용혈성 요독 증후군, 신부전증, 신우신염, 사구체신염, 신경계 농양, 중이염, 부비동염, 인두염, 편도선염, 유양돌기염, 연조직염, 치성 감염, 누낭염, 늑막염, 복부 농양, 간농양, 담낭염, 비장 농양, 심낭염, 심근염, 태반염, 양수염, 유방염, 유선염, 산욕열, 독소성 쇼크증후군(toxic shock syndrome), 라임(lyme)병, 가스회저, 아테롬성 동맥경화증, 마이코박테리움 아비움 증후군(MAC), 장출혈성 대장균(EHEC) 감염증, 장병원성 대장균(EPEC) 감염증, 장침습성 대장균 감염증(EIEC), 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 감염증, 반코마이신 내성 황색포도상구균(VRSA) 감염증 및 리즈테리아증(listerosis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
본 발명의 감염성 염증 질환은 바람직하게 박테리아 감염으로 유발되는 염증성 질환일 수 잇으며, 가장 바람직하게는 에스케리치아 속( Escherichia genus), 리스테리아 속(Listeria genus), 살모넬라 속(Salmonella genus), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus genus), 슈도모나스속(Pseudomonas), 또는 나이세리아속(Neisseria)의 박테리아 감염으로 유발되는 질환일 수 있다.
본 발명의 용어 “질염”(Disease of vagina)은 세균성 질염(Bacterial Vaginosis), 진균성 질염(Fungal Vaginitis) 및 트리코모나스 질염(Tricomonas vaginitis)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 Escherichia coli 와 병원균인 임균(Neisseria gonorrhoeae)의 감염에 의해 발병하는 질염일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 질염을 유발하는 균(에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 및 나이세리아 고노헤아(Neisseria gonorrhea))을 포함하여 본 발명의 균주 UBC-U32 균주의 항균력을 시험한 결과, 그 항균 효과가 우수함을 확인하였는 바, 본 발명의 균주를 이용하여 감염성 염증 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 균주를 뇌 조직 내 해마세포주에 처리한 경우, 세포 생존이 우수한 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 뇌 조직에 처리한 경우 대뇌피질 및 해마영역에서 oAβ가 감소하여 UBC-32가 뇌에서 과도한 모노머 oAβ생성을 억제하거나 플라크 이전에 아밀로이드 생성을 억제하는 효과가 있고, 치매 마우스 모델에 대해서 뇌 인지기능 및 운동능력이 우수하게 회복되는 효과를 확인하였는 바,
이로써 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 균주가 퇴행성 뇌질환 예방, 개선 또는 치료에 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 상기 조성물은 사용목적 내지 양상에 따라 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들면 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 균주를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 퇴행성 뇌질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 균주의 유효한 양으로는 0.001 내지 1000 mg/kg b.w./day일 수 있고, 바람직하게 1 내지 2000mg/kg b.w./day일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성 성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있고, 바람직하게는 경구투여 일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA).
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 퇴행성 뇌질환을 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주(락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32(Lactobacillus fermentum UBC-U32))를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 또는 감염성 염증 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물 또는 인지기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
‘인지(cognition)’란 뇌에서 어떤 정보를 받아들여서 저장하고, 저장된 정보를 찾고 사용하는 모든 과정을 일컫는 말로 우리가 살아가면서 생각하고, 말하고, 기억하고, 판단하고, 실행하는 모든 과정들이 ‘인지’에 포함된다. 인지기능이란 뇌가 정보를 받아 저장하고 저장된 정보를 찾아 사용하는 모든 과정으로 기억하고 생각하고 판단하고 실행하는 능력을 말한다. 이러한 인지기능은 크게 주의, 언어, 시공간, 기억, 실행기능(또는 관리기능)으로 나눌 수 있다.
본 발명의 인지기능이란 학습능력, 기억능력 또는 집중력을 포함한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 균주를 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives), 유산균 음료, 발효유 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 바람직하게 본원 발명의 상기 식품은 발효유, 요구르트, 음료수, 우유음료, 식품 첨가물 및 건강기능 식품일 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 균주를 유산균음료, 발효유, 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 유비씨-유32 균주와 퇴행성 뇌질환에 개선효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지, 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면,스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 균주를 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 식품 조성물에서 유효성분인 본 발명의 균주 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.1~50 중량%, 더 바람직하게는 0.5~25 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 균주를 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
상기 본원 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물에 있어서, 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 증상완화)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 유비씨-유32 균주를 108CFU/g 내지 1010CFU/g 농도로 포함할 수 있다. 본 발명의 균주의 유효용량은 상기 농도 범위에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "항균"은 미생물을 포함하는 균의 생육 또는 증식을 억제하여 균의 감염을 예방 또는 치료하는 활성을 의미한다.
본 발명에서 용어 "병원성"은 병원체가 기주에 감염되어 질병을 일으키는 능력을 의미하며, 세균 또는 효모의 침투성, 증식성 및 독소생산성 등을 총칭할 수 있다.
본 발명에서 용어 "그람양성 병원성 세균", "그람음성 병원성 세균" 및 "병원성 효모"는 각각 기주를 감염시킬 경우 기주에 질병 농양, 봉와직염 등의 화농성 질환, 폐렴, 뇌수막염 등의 감염 질환, 패혈증, 식중독, 질염 및 피부 진균증 등을 일으킬 수 있는 그람양성 세균, 그람음성 세균 및 효모를 의미한다.
구체적으로 상기 그람양성 병원성 세균은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 메티실린내성 황색포도상구균(MRSA), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis), 장내구균(Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis), 반코마이신내성 장내구균(VRE), 고초균(Bacillus subtilis), 리스테리아균(Listeria monocytogenes) 또는 충치균(Streptococcus mutans)일 수 있으며, 상기 그람음성 병원성 세균은 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라균(Salmonella enterica, Salmonella typhimurium), 또는 나이세리아 고노헤아(Neisseria gonorrheae)일 수 있으며, 상기 병원성 효모는 칸디다균(Candida albicans)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에서는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium), 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 나이세리아 고노헤아(Neisseria gonorrheae)에 대해 본 발명의 UBC-U32 균주가 항균활성을 갖는 것을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태는, 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유,라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 분말형태의 락토바실러스 퍼멘텀 유비씨-유32은 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다.
먼저, 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 유비씨-유32은 통상적인 락토바실러스 속 미생물의 배양방법에 의해 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 또는 미네랄(무기염류)이 포함된 배지를 사용할 수 있으며, 상기 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄은 유산균 생육에 상승작용을 일으키는 물질이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 이는 해당 분야에 공지되어있다. 예를 들어 탄소원으로는 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 만노오스(mannose) 프럭토오스(fructose), 락토오스(lactose), 자일로오스(xylose), 갈락토오스(galactose), 트레할로오스(trehalose), 리보오스(ribose), 에리트리톨(erythritol), 람노오스(rhamnose), 라피노스(raffinose), 물엿 또는 아라비노오스(arabinose) 일 수 있다.
또한 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물(beef extract), 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 카시톤(casitone), 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.
상기 배지에는 인(Phosphorus)원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 소듐 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한,배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기의 통상의 배양 배지에 첨가되는 비타민은 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 비타민은 통상의 배양 배지에 상기에서 언급된 탄소원, 질소원,미네랄등과 함께 첨가되거나, 멸균하여 준비된 배지에 별도로 첨가될 수 있다.
본 발명에서 배양배지는 공지의 유산균 배양배지에 의한 것일 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예컨대, GP 배지, GMSMM 배지, MRS(Man-Rogosa-Sharp) 배지, APT(All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지 등 일 수 있다. 상기 배지들은 당업자가 의도하는 바에 의해 배지를 구성하는 물질의 조성 및 물질함량을 선택조절하여 변형된 배지 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 배양방법은 바람직하게는 GP 배지 또는 GMSMM 배지를 이용하는 것일 수 있다.
미생물의 배양은 통상의 락토바실러스속 미생물의 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대, 10℃ 내지 45℃에서 1시간 내지 30시간 정도 배양할 수 있다. 바람직하게는 25℃ 내지 40℃에서 5시간 내지 30시간 배양할 수 있다.
또한, 배양 조건 중 pH는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 pH 3 내지 8 일 수 있으며, 보다 바람직하게 pH 4.3 내지 5.5 에서 배양될 수 있다.
배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
본 발명의 분말형태의 균주의 배양방법은 바람직하게는 도 6에 도시된 공정 순서에 따른 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적인 공정 순서 및 조건은 실시예 11에 자세히 기술되어 있다.
상기 배양방법은 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 유비씨-유32의 균체수 증가, 즉 대량생산을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물, 생균제 조성물, 또는 식품첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 균주는 유산균으로 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도, 즉, 정장용, 생균제 또는 식품첨가용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 상기 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하 여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등을 포함한다. 조성물 내 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 균주의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를들어, 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32, 이의 파쇄물 및 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다.
담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여 방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따 라 적절히 선택할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합 사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage)등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료 는 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32와 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32를 혼합 하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛형으로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식, 발효유, 빵 등의 식품에 대한 식품첨가제로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물은 발효제품 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 상기 발효제품은 치즈, 김치, 발효생식제품 등을 포함한다. 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 이용한 발효제품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다.예컨대, 현미와 율무 등의 곡류 분말에 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이를 포함하는 2-3종의 혼합 유산균을 처리하여 적정 온도에서 발효시킨 후, 백태, 찹쌀, 수수 등의 다양한 농산물을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 발효 생식제품을 제조할 수 있다.
본 발명의 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32는 다른 락토바실러스 퍼멘텀 균주와 비교하여 항산화 활성, 항균활성, 내산성, 내담즙산성 및 내열성이 우수할 뿐만 아니라, 퇴행성 뇌질환에 대하여 치료 효과가 우수하다.
도 1은 락토바실러스 속 유비씨-유32 배양액의 항균 활성도에 관한 것이다.
도 2는 헤마 세포에 올리고머 아밀로이드를 처리하여 세포 독성을 유도하였을 때 락토바실러스 속 UBC-U32를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 치매 마우스에 락토바실러스 속 UBC-U32를 처리하였을 때, 뇌조직 아밀로이드의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 치매 마우스에 락토바실러스 속 UBC-U32를 처리하였을 때, 행동변화를 추적한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 치매 마우스에 락토바실러스 속 UBC-U32를 처리하여, 웨터 모리즈 메이즈(Water morris maze)분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 락토바실러스 속 유비씨-유32 제조공정 모식도를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유산균의 분리 및 동정
1-1. 발효식품으로부터 유산균의 분리
국내의 농가 및 가정집에서 배추김치, 무김치, 열무김치 그리고 된장, 고추장, 간장, 치즈 내지 젓갈 샘플들을 획득하였다. 상기 샘플을 각각 호모게나이저(homogenizer)로 일정하게 파쇄하였다. 그 다음, 파쇄물 1g을 MRS 액체 배지(MRS borth; Difco, USA) 10 ml에 넣고 현탁하였다. 그 다음 통상적인 방법인 펩톤수를 이용하여 희석하였다. 희석액을 MRS고체 한천배지(MRS agar plate; Difco, USA)에 접종 및 도말하여, 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적 조건으로 배양하였다. 그 다음 콜로니를 형성한 균주를 분리하였다.
1-2. 분리 유산균의 배양성 선별
상기에서 분리한 균주들 중에서 산업적 이용성이 가능한 수준의 유산균을 1차적으로 검증하였다. 순수 분리된 단일 코로니를 MRS 액체 배지에 접종하여 2일 동안 35℃에서 배양하였다. 배양 후 1일째와 2일째에 ml당 1억 CFU 미만의 생산성을 나타내는 균주들은 배제하는 것으로 배양성이 우수한 균주들을 1차 선별하였다.
1-3. 우수 유산균의 동정
상기 실시예 1-2에서 1차 선별된 42종 균주들의 생리학적 특성 및 16S 리보좀 RNA서열을 분석하였다. 분류학적 동정은 Hammes 등[The prokaryotes, 1563-1578, 2nd Edition, Springer-Verlag Co.(1992)]의 방법에 따라 실시하였다. 그 결과를 토대로 균주의 종을 확정하였고, 각기 균주명 및 일련번호를 지정하였다.
실시예 2: 유산균의 항염증 및 항산화 효과
발효식품인 김치, 된장, 고추장, 간장, 치즈 내지 젓갈으로부터 분리한 유산균의 항산화 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 염증억제 활성을 측정하였다.
2-1. 유산균이 염증 억제에 미치는 영향
상기 실시예 1에서 선별한 유산균이 염증 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
마우스 해마세포주인 HT22세포를 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지(웰진, LM001-51,대구)에서 배양한 뒤, 12-well 플레이트에 웰 당 2×104 세포수가 되도록 분주하였다. 이 후, 각 웰에 유산균(1×104 CFU/㎖) 배양여액 100 μl을 분주하고, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)로부터 분리한 LPS(lipopolysaccharide)을 0.2 ㎎/㎖의 농도로 첨가하여 배양하였다. 그 다음, NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 발현량을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였다. NF-κB는 염증반응에 의한 조직의 손상과 알츠하이머병와 같은 노화관련 질환을 유발하는 물질로 알려져 있다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, S17, S18, S41, S20, S34, S31, S32, S42 유산균들은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성활성을 강하게 저해하여 NF-κB의 활성화를 강하게 억제하는 항염증 반응이 우수하였고 이 중에서 Lactobacillus fermentum인 S18이 가장 우수하였다.
장관세포에서 NF-κB가 활성화되어 알츠하이머병, 우울증, 자폐증, 파킨슨병 등과 같은 퇴행성 뇌질환 및 치매를 동반할 가능성이 훨씬 높아질 수 있으므로, 상기 실험 결과에 따라 NF-κB의 활성화를 강하게 억제하는 본 발명의 균주가 퇴행성 뇌질환 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
2-2. 유산균이 항산화에 미치는 영향
상기 실시예 1에서 선별한 유산균의 항산화 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 에탄올에 0.2mM 농도가 되도록 녹여 DPPH 용액을 제조하였다. 상기 DPPH 용액 0.1 ㎖에 유산균 현탁액(1×108 CFU/㎖) 또는 대조군인 비타민 C 용액(1 g/㎖)을 넣고 20분 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 배양액을 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 그 다음, 540 ㎚에서 상등액의 흡광도를 측정하였고, 유산균의 항산화 활성을 계산하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 일련번호 S5, S10, S17, S18, S19, S20, S21, S25, S27, S28, S33, S41, S42 균주들이 우수한 활성을 나타냈고 이중 Lactobacillus fermentum S18이 가장 우수한 것으로 나타났다.
일련번호 항염증 항산화력 일련번호 항염증 항산화력
S1 + + S22 - -
S2 - + S23 - -
S3 - - S24 - -
S4 - - S25 - ++
S5 + ++ S26 - -
S6 - + S27 - ++
S7 - - S28 - ++
S8 - - S29 - -
S9 - - S30 + +
S10 - ++ S31 ++ +
S11 - + S32 ++ +
S12 - - S33 + ++
S13 - - S34 ++ -
S14 - - S35 - -
S15 - - S36 - +
S16 + + S37 - -
S17 ++ ++ S38 + +
S18 +++ +++ S39 - -
S19 + + S40 - -
S20 ++ ++ S41 ++ ++
S21 - ++ S42 ++ ++
*very strongly (++; >90%); strongly (+; >60-90%); weakly (+/-; >60%)
이를 통해, 상기 유산균들은 항산화 효과, 항염증 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 장내세균총의 유해균이 생산하는 내독소인 LPS의 생성을 억제하며, 항산화력을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
상기 S18 균주는 내독소의 염증생성 억제, 항산화와 같은 다양한 유익한 장내 항상성 작용을 통해 장기능을 더욱 개선하는 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이하에서는, 이 중 가장 우수한 효과를 나타내는 일련번호 S18인 Lactobacillus fermentum 균주를 이용하여 실험을 실시하였다.
실시예 3: Lactobacillus fermentum S18의 항균력 시험
Lactobacillus fermentum S18의 균주를 반복 배양하고, 이 후 반복된 계대 배양에 따라 콜로니 순수 분리를 진행하여 생산 재현성을 확보하는 것을 우선하였다.또한 표 2의 항염증 우수 콜로니 8 종을 선별하여 길리랜드와 스펙(Gilliland & Speck, J. Food Prot., 40(12), 820, 1977)에 의거하여 유해균에 대한 항균력을 측정하였다.
그 결과, 도 1에서, S18(UBC32)외에 S17(UBC31), S20(UBC33), S31(UBC25), S32(UBC24), S34(UBC09), S41(UBC41), S42(UBC42) 항염증 우수 콜로니를 선발하여 항균력을 측정하였고, 특히 UBC32의 항균력은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에 대해 30.21%, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에 대해 41.21%, 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 38.21%, 녹농균 Pseudomonas aeruginosa는 36.43%, 질염균인 Neisseria gonorrhea의 억제력은 45.21%인 것으로 나타났다(표 2).
상기 항균력 시험 결과에 따라, 본 발명의 UBC-U32 균주가 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인되었는 바, 상기 균주에 대한 항균제 뿐만 아니라 상기 균에 의해 유발되는 설사, 염증, 질염 등의 감염성 염증 질환 예방 및 치료에 이용될 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 도 1의 결과에 따라, 우수한 항균 효과를 나타낸 UBC32를 최종적으로 결정하였고, Lactobacillus fermentum S18의 시드 균주로 확보하였으며, 락토바실러스 속 유비씨-유32(Lactobacillus fermentum UBC-U32, UBC32)로 명명하였다(기탁번호: KCTC 13617BP). 이후 실험은 락토바실러스 속 유비씨-유32를 이용하여 실시하였다.
세균 대조군 시험군(UBC32) 억제율(%)
CFU/ml pH CFU/ml pH
E.coli ATCC 9637 1.15x106 6.5 5.23x105 4.88 30.21
Salmonella typhimurium ATCC 11806 2.56x106 6.51 1.0x103 4.67 41.21
Staphylococcus aureus ATCC 29737 3.12x106 6.48 1.0x103 4.82 38.21
Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004 2x106 6.11 2.12x104 4.24 36.43
Neisseria gonorrhea ATCC 49226 2.5x106 6.02 2x104 4.24 45.21
실시예 4: Lactobacillus fermentum UBC-U32 생화학적 특성 검사
락토바실러스 속 유비씨-유32(Lactobacillus fermentum UBC-U32, UBC32) 균주는 그람 양성 간균으로, 산소 유무와 상관없이 잘 생장하였고, 카탈라제와 운동성은 음성이었다. 또한, 15℃와 45℃에서 생장하였으며, 글루코스 (glucose)로부터 가스를 생성하였고, 알긴산으로부터 암모니아를 생성하지 않아 Lactobacillus 속(genus)에 속하였다. 그 다음 종(species)을 정하기 위하여 API 50CHL kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 50종의 당 발효 시험을 실시한 결과, 락토스 등 19종으로부터 산을 생성하였다. ATB 동정시스템에 입력하여 조사한 결과와 16S rRNA Gene Sequence를 이용하여 얻어진 결과가 일치하여 락토바실러스 퍼맨텀으로 판명하였다. 또한 혐기성 간균으로 포자를 형성하지 않는 호기적 조건에서도 생존성을 나타내었다. 또한 10~42℃에서 생존하였고, pH 2에서 2시간 동안 안정한 균주였다.
그 다음, 락토바실러스 속 유비씨-유32의 화학분류학적 특성을 확인하기 위하여, 16S rDNA을 측정하였다. 그 결과 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 락토바실러스 속 유비씨-유32의 16S rDNA 염기서열을 Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정하였다. 그 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 락토바실러스 퍼맨텀 균주는 검색되지 않았고, 락토바실러스 퍼맨텀 균주 JCM 1120의 16S rDNA 부분 서열과 99%의 상동성을 보였다.
또한, 생리학적 특성 중 탄소원 이용성을 API Kit(모델명: API 50 CHL; 제조사: BioMerieux’USA)에 의한 당 발효 시험으로 분석하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. 락토바실러스 속 유비씨-유32의 탄소원 이용성 결과를 나타낸 것이고, "+"는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타내고, "-"는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 나타내고, "±는 탄소원 이용성 여부가 모호한 경우를 나타낸 것이다.
탄소원 Lactobacillus sp. UBC-U32 탄소원 Lactobacillus sp. UBC-U32
glycerol - salicin +
erythritol - cellobiose -
D-arabinose + maltose +
L-rabinose - lactose +
D-ribose + melibiose - -
D-xylose - sucrose -
L-xylose - trehalose -
D-adonitol - inulin -
methyl-
β-D-xylopyranoside		 - melezitose -
D-galactose + rafinose +
D-glucose + starch -
D-fructose + glycogen -
D-mannose + xylitol -
L-sorbose - gentiobiose -
L-rhamnose - D-turanose -
dulcitol - D-lyxose -
inositol - D-tagatose -
mannitol - D-fucose -
sorbitol - L-fucose -
α-methyl-D-mannoside - D-arabitol -
α-methly-D-glucoside - L-arabitol -
N-acetyl-glucosamine - gluconate -
amygdalin - 2-keto-gluconate -
arbutin - 5-keto-gluconate -
esculin - -
실시예 5: Lactobacillus fermentum UBC-U32 생장 검사
유산균의 생장은 생균수, pH를 측정하여 시험하였다. 생균수는 10% 탈지분유 150ml에 유산균을 1 ml용 마이크로피펫으로 1방울 접종 후 34, 37, 40℃에서 3시간 간격으로 24시간까지 배양하였다. 그 다음 각 시료를 0.1% 펩톤용액에 희석하여 BCP plate count agar 평판 배지에 부어 굳혔다. 이 후, 35℃에서 48시간 동안 배양하여 계수하였다. 각 온도 및 시간별로 pH 변화를 측정하여 확인한 결과, 최적온도는 40℃이고 발효유의 최적 pH조건인 pH 4.2 내지 4.4에 도달하는데 16시간을 소요하였다.
실시예 6: Lactobacillus fermentum UBC-U32이 헤마세포주 생존에 미치는 영향
뇌 조직 내에 존재 해마세포의 생존에 Lactobacillus fermentum UBC-U32이 미치는 영향을 확인하기 위해, 다음과 같이 실험을 실시하였다.
해마세포주인 HT22 cell를 10% FBS, 0.1% 항생제 (스트렙토마이신, 페니실린), 고농도 당이 함유된 DMEM(웰진, LM001-51)배지에서 24well 플레이트로 배양하였다. 각 웰에 세포를 1x103 cells/ml 농도로 분주하여, 37℃, 5% CO2 incubator에 넣고, 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 정상세포주에 1μM 올리고머 아밀로이드(oAβ)를 처리하였다(대조군). 또한 락토바실러스 속 유비씨-유32(UBC32)외에 대조군으로써 항염증과 항산화력이 우수한 S42(UBC42), 항산화능이 우수한 S21(UBC27), 항염증이 우수한 S34(UBC38) 유산균들의 각각의 효능 이외에 배양능력을 감안하여 선발하고 배양액을 동결건조하여, 제조한 분말을 각각 PBS에 25 μg/ml 농도로 녹여 처리하였다. 그 다음 해마세포의 사멸정도를 확인하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 정상군은 해마세포가 잘 자라고 있는데 반해. 1μM oAβ만 처리한 경우(대조군)에는 세포독성으로 인해 세포사멸이 많이 유도된 것으로 나타났다. 또한 UBC38, UBC42, UBC32를 처리한 경우에는 대조군에 비해 세포 생존이 높은 것으로 나타났으며, 특히 UBC32를 처리한 경우에 세포 생존이 가장 우수한 것으로 나타났다.
이를 통해, 락토바실러스 속 유비씨-유32 균주가 신경독성에 의한 해마세포 사멸을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
알츠하이머의 주증상인 기억력 장애가 해마 및 측두엽의 변연계에서 choline성 신경전달 물질이 소실되어 생긴다고 알려져 있는 바, 상기 해마세포 사멸을 억제함으로써 알츠하이머를 포함한 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 7: Lactobacillus fermentum UBC-U32이 뇌 조직에 미치는 영향
Lactobacillus fermentum UBC-U32(UBC32) 균이 뇌 조직에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험을 실시하였다.
3개월령 Tg-APP/PS/Tau 마우스를 대조군과 UBC32 투여군으로 나누었다. 먼저 마우스에 1% CMC (carboxymethyl cellulose)를 처리하였고, UBC32 2g/Kg/day으로 10주 동안 경구 투여하였다. 분당서울대병원 전임상 사육 프로토콜에 따라 진행하였으며, 5개월이 되는 날, 뇌를 적출하여 조직학적 검사를 실시하였다.
각 마우스에서 적출한 뇌 조직을 paraffin 포매를 실시하여 면역조직형광염색을 실시하였다. 뇌 조직을 formalin으로 고정한 후, 50 ㎛ 두께로 절단한 다음, 각각의 조직을 유리슬라이드에 올려놓았다. 모노머 Aβ(monomer amyloid-β)의 발현량을 비교하기 위해서, BAM-10 monoclonal Aβ antibody 1차 항체를 처리하였다. 그 다음 QD525 플로브 표지한 2차 항체(녹색형광)를 처리하였다. 플라크 단백질의 변화를 측정하기 위해, 형광염색시약인 MX04 (청색)을 처리하였다. 또한 올리고머 아밀로이드의 변화를 측정하기 위해, 이에 민감하게 반응하는 ob5 압타머를 절편화된 뇌조직에 처리한 뒤, 4℃ 냉장실에서 12시간 동안 반응시켰다. 그 다음 공초점현미경을 이용하여, 0.5X10배율로 관찰하였다.
그 결과 도 3a 내지 도 3c에 나타난 바와 같이, CMC를 처리한 경우에는 전체 뇌 조직 중에 대뇌피질 (cortex), 해마(Hippocampus)에서 모노머 Aβ(도 3a)와 플라크(도 3b)가 증가하는 것으로 나타난 반면, UBC32를 처리한 경우에는 모노머 Aβ 및 플라크가 감소하는 것으로 나타났다. 또한 대조군에서의 많은 양의 올리고머 아밀로이드 oAβ가 증가하는 것으로 나타났으며, UBC32를 처리한 경우에는 대뇌피질과 해마영역에서 oAβ가 감소하는 것으로 나타났다(도 3c).
이를 통해, UBC32가 뇌에서 과도한 모노머 Aβ 생성을 억제하거나, 플라크 이전에 아밀로이드 생성을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
Aβ 단백질은 신경전달물질인 아세틸콜린을 만드는 대뇌 부분과 대뇌피질의 신경세포를 파괴하여 아세틸콜린의 활성 상태를 감소시키며, 활성산소종(reactive oxygen species :ROS)을 생성하여 산화적 손상을 유발함으로써 신경세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 산화적 세포사멸뿐만 아니라 염증에 관련하는 기전이 뇌세포 손상을 일으키는 주요한 원인이 된다.
따라서, 위 실험결과를 통해 UBC-U32 균주가 베타아밀로이드 생성을 억제하여 퇴행성 뇌질환 치료에 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 8: Lactobacillus fermentum UBC-U32이 치매에 미치는 영향
락토바실러스 속 유비씨-유32가 치매에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 치매 마우스 모델을 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
정상 마우스, 치매 마우스(3xTg-AD)를 사용하였다. 치매 마우스 모델에 UBC27, UBC38, UBC42, UBC32 유산균 배양액을 각각 2g/Kg/day으로 10주 동안 경구 투여하였고, 도네피질(donepezil)을 25mg/Kg 으로 처리하였다.
그 다음, 치매동물의 인지능력 분석장비인 스테인레스 원통(직경 150cm x 높이 60cm)과 도피대(지름 10cm, 높이 30cm) 구조이며, 물미로 실험인 웨터메리즈 메이즈 (water morris maze, Harvard Apparatus, USA)를 실시하였다. 수조의 물온도는 22±2℃, 높이는 플랫폼 위 2cm까지이며, 마우스가 도피대에 앉으면 몸이 물 밖으로 나올 수 있도록 하였다.
물미로 실험은 마우스가 수조 주변의 표지물을 이용하여 도피대를 찾아가기 때문에 주변의 환경 변화가 없도록 표지물을 실험기간동안 일정하게 유지하였다. 또한, 마우스가 도피대를 찾아가 20초 이상 머무르면 찾아갈 때까지 걸린 시간을 탈출잠복기(escape latency)로 하였다. 동일한 실험을 하루 3회 실시하여 나온 평균값을 평균 탈출잠복기로 하였다. 탈출 잠복기는 수조 위 상부에 카메라를 설치하여 컴퓨터 프로그램(스마트 비디오 추적시스템 V3.0, PanLab SL, Barcelona, Spain)을 통하여 추적하였다. 실험은 6일 동안, 매일 3회 실시하였으며, 이때 마우스를 수조에 넣은 위치를 순차적으로 다르게 하여 우연에 의한 가능성을 최소화하였다.
그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 정상마우스, 치매 마우스, UBC32 처리 마우스, 도네피질 처리 마우스의 행동을 추적한 결과, UBC32를 처리한 경우에 치매 대조군(3xTg-AD)에 비하여 뇌인지 개선시간이 유의하게 짧아져 정상군과 유사한 수준으로 감소하는 것으로 나타났다
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 정상군, 치매군(3xT6g-AD), UBC27, UBC38, UBC42, UBC32, 도네피질처리군(25mg/Kg) 평균탈출시간은 6일째 각각 28±2초, 340±35초, 245±32초, 189±34초, 72±2초, 52±3 및 267±24초인 것으로 나타났다. UBC32를 처리한 경우에는 기존의 치매 치료제인 도네피질을 처리한 경우보다, 개선시간이 현저하게 짧은 것으로 나타났다.
이를 통해, UBC32가 뇌인지 회복효과를 나타내며, 기존의 도네피질보다 우수한 뇌 인지 개선효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9: Lactobacillus fermentum UBC-U32의 항생제 내성시험
항생제 내성시험은 트립틱 소이 브로스 (tryptic soy broth, Difco, USA)를 사용하여, 2배 희석법으로 생장여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC)치를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 속 유비씨-유32는 다른 계열의 항생제에 비해 아미노글로코사이드계열 중 아미카신, 겐타마이신, 가나마이신, 네오마이신에 대해 특히 높은 내성을 나타내었다.
항생제 종류 최소억제농도 (μg/ml)
아미노글로코사이드계열 -
아미카신 310
겐타마이신 600
가나마이신 3800
네오마이신 3600
스트렙토마이신 900
벡터-락탐계열 -
페니실린-G 30
메치실린 360
옥사실린 50
암피실린 1310
그램-양성 스펙트럼 -
바시트라신 110
리팜피신 120
노보바이오신 20
린코마이신 760
폴리마이신B 1300
클로람페니콜 280
실시예 10: Lactobacillus fermentum UBC-U32의 특성 비교
본 발명의 락토바실러스 속 유비씨-유32 균주의 특성을 확인하기 위하여, 4종의 락토바실러스 퍼멘텀 균주(Lactobacillus fermentum KCTC 3112, Lactobacillus fermentum ACTC 11739, Lactobacillus fermentum ACTC 11976, Lactobacillus fermentum KCTC 5468) 특성을 비교하였다. 생체 외 프로바이오틱스 특성 확인 실험으로 사람의 소화기관을 안정적으로 많은 수의 균이 살아서 장내까지 도달하기 위해 가져야 할 위액과 담즙에 대한 내성을 가져야 하므로 내산성, 내담즙성 실험을 많이 사용하고 있다.
10-1. Lactobacillus fermentum UBC-U32의 내산성 비교
상기 실시예 1에 기재된 조건에 따라, 락토바실러스 속 유비씨-유32 원말(100억 CFU/g), 각 균주들의 원말을 조제하여 내산성 시험을 실시하였다.
상기 조제한 원말을 1g씩 인공조제된 위액(pH 2.0) 100ml에 넣고 30분, 60분, 120분 동안 50rpm으로 교반하여 반응시켰다. 그 다음 각 반응액을 1ml씩 취하여, 1M 포스페이트 buffer로 희석하고, MRS 고체배지에 도말하여 반응액 ml당 생균수(ⅹ108CFU/ml)를 분석하였다.
그 결과 하기 표 5에 나타난 바와 같이, pH 2.0 및 pH 3.0 인공위액에서 동일한 속의 fermentum 4종과 비교한 결과, 다른 균주들이 시간에 따라 균수가 감소하는 정도에 비해, UBC32 균주의 감소 정도가 적은 것으로 나타났다. 이를 통해, UBC32 균주가 높은 내산성 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
Strain pH 반응시간(min)
0 30 60 120
Lactobacillus fermentum KCTC 3112 2.0 1.33 0.88 0.67 0.23
3.0 1.35 0.90 0.72 0.52
Lactobacillus fermentum ACTC 11739 2.0 1.33 0.60 0.33 0.26
3.0 1.37 0.92 0.70 0.34
Lactobacillus fermentum ACTC 11976 2.0 1.37 0.67 0.41 0.33
3.0 1.40 0.73 0.50 0.48
Lactobacillus fermentum KCTC 5468 2.0 1.33 0.54 0.40 0.29
3.0 1.32 0.83 0.62 0.51
Lactobacillus fermentum UBC-U32 2.0 1.31 1.23 0.92 0.77
3.0 1.41 1.33 1.19 0.95
10-2. Lactobacillus fermentum UBC-U32의 내담즙산 비교
상기 실시예 1에 기재된 조건에 따라, 락토바실러스 속 유비씨-유32 원말(100억 CFU/g), 각 균주들의 원말을 조제하여 내담즙산성 시험을 실시하였다.
구체적인 실험 방법은 조제한 원말 1g을 0.3% 인공조제된 담즙산 용액(0.3% 옥스갈)위액에 넣고 30분, 60분, 120분 동안 50rpm으로 교반하여 반응시켰다. 그 다음 각 반응액을 1ml씩 취하여 1M 포스페이트 buffer로 희석하고 MRS 고체배지에 도말하여 반응액 ml당 생균수(ⅹ108CFU/ml)를 분석하였다.
그 결과 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 동일한 속의 fermentum 4종과 비교한 결과, 다른 균주의 경우, 시간에 따라 균수가 감소하였으나, 락토바실러스 속 유비씨-유32의 경우 시간에 따라 균수가 가장 적게 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해, UBC32 균주가 높은 내담즙산성 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
Strain 반응시간(min)
0 30 60 120
Lactobacillus fermentum KCTC 3112 1.43 1.10 0.82 0.57
Lactobacillus fermentum ACTC 11739 1.39 0.85 0.54 0.33
Lactobacillus fermentum ACTC 11976 1.33 0.93 0.89 0.69
Lactobacillus fermentum KCTC 5468 1.35 1.11 0.86 0.54
Lactobacillus fermentum UBC-U32 1.52 1.33 1.12 1.01
따라서, 상기 시험을 통하여 본 발명의 UBC-U32 균주가 소화기관을 안정적으로 거져 많은 수의 균이 살아서 장내까지 도달할 수 있음을 확인하였다.
10-3. Lactobacillus fermentum UBC-U32의 내열성 비교
균주 제조상에 발생하는 발열 반응과 균주 안정성에 미치는 영향 그리고 체온 내에서 견디는 능력을 고려하여 열에 대한 안정성 시험을 실시하였다.
상기 실시예 1의 조건에 따라 각 균주의 원말(기준: 100억 CFU/g)을 조제하였다. 그 다음 조제한 원말 1g을 55±2℃의 배양기에서 3일 동안 노출하여 통상의 방법에 따라 생균수(ⅹ108CFU/g)를 분석하였다.
그 결과 하기 표 7에 나타난 바와 같이, 55℃의 가온 조건에서 타 균주의 경우 시간에 따라 균수가 급격하게 감소한 반면, UBC32 균주는 시간에 따라 감소하는 정도가 가장 적은 것으로 나타났다. 이를 통해, UBC32 균주가 가장 우수한 내열성 균주인 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 UBC32 균주는 55℃에서 우수한 내열성을 나타내므로 프로바이오틱스 최종 제품으로의 제품 가공이 용이함을 확인하였다.
Strain 반응시간(d)
0 1 2 3
Lactobacillus fermentum KCTC 3112 103 46 21 20
Lactobacillus fermentum ACTC 11739 107 72 33 29
Lactobacillus fermentum ACTC 11976 114 57 33 26
Lactobacillus fermentum KCTC 5468 109 88 58 53
Lactobacillus fermentum UBC-U32 102 101 95 87
실시예 11: Lactobacillus fermentum UBC-U32 생산 공정
락토바실러스 속 유비씨-유32를 고수율로 생산하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
먼저 당류 5-30g/L, 말토덱스트린 1-10g/L, 소듐아세테이트 1-10g/L, 마그네슘 설페이트 0.1-3g/L, 소금 0.1-1g/L, 물엿 1-20g/L, 계면활성제 1-10g/L 등의 농도로 배양용 배지 조성물을 조제하였다.
-80℃ 딥프리저에 보관된 배양용액을 3분 내 급속 해동하여 MRS (1.0 % 펩톤(peptone), 1.0 % beef extract(육분말), 0.4 % yeast extract (효모분말), 2.0 % glucose (당), 0.5 % sodium acetate trihydrate(소듐 아세트산 삼가수믈), 0.1 % polysorbate 80 (폴리소르베이트 89; Tween 80), 0.2 % dipotassium hydrogen phosphate (이가 포타슘 수산화 인산물), 0.2 % triammonium citrate (삼암모니움 스크레이트), 0.02 % magnesium sulfate heptahydrate (마그네슘 황산 헵하이드렝이트), 0.005 % manganese sulfate tetrahydrate (마그네슘 황산 테트라하이드레이트), 1.0 % agar (아가) (pH6.2)(밀리포어, 머크, USA)를 멸균시킨 평판 배지에서 35℃로 3일 동안 배양시켰다. 그 다음 단일 콜로니를 접종하여 GP broth(1% 포도당, 0.4% 펩톤, 0.25% 소금)의 멸균된 액체 배지 200㎖가 들어 있는 250㎖ 삼각 플라스크에 콜로니를 무균 상태로 접종하여, 35℃, 간헐진탕 배양기에서 14시간 동안 순수 배양하여, 1차 종균배양액으로 사용하였다. 이 때 1차 시드 배양액의 최종 pH는 4.9이었으며, 기본적으로 4.9±0.2pH를 유지하고 있어야 한다. 1차 시드 배지와 동일한 배지를 2차 시드 배지로 사용하였다. 2L의 2차 시드 액체 배지를 3L의 발효조에 넣고 121℃에서 15분 동안 멸균하여 2차 종균 배양을 실시하였다. 2차 시드 배양 조건은 발효조내 질소가스가 완충된 상태로 35℃, 100rpm이었으며, 18시간 동안 무균 배양하여 2차 종균 배양액으로 사용하였다. 이 때 2차 종균 배양액의 최종 pH는 5.2이었으며 기본적으로 5.2±0.2pH에서 재현성을 확인할 수 있었다.
종료된 2차 종균 배양액은 미리 준비된 본 배양 배지에 곧바로 무균 접종하였다. 본 발명의 본배양 배지 조건은 다음과 같다. 7.5L BE 발효조 내에 GMSMM broth(포도당 2%, 말토덱스트린 0.5% 소듐아세테이트 0.1, 마그네슘 설페이트 0.25, 물엿 1%, 소금 0.25%, PEG 0.5%, pH 6.0), 5L 액체 배지를 121℃에서 15분 동안 멸균하여 본 배양액으로 사용하였다. 2차 시드 배양액 1L를 무균적으로 7.5L BE 발효조에 접종하여 10시간 동안 35℃, 100rpm의 조건으로 혐기 배양하였다. 이 때 가장 최적의 배양 시간에서 최종 pH는 4.8이었고 4.8±0.2 사이에서 pH를 유지하고 있어야 한다. 본 배양액은 시간별로 3㎖씩 취득하여 균주 분석을 통해 최종 생산성을 확인하였다.
그 결과 표 8에 나타난 바와 같이, 본 배양 8시간 이 후로는 급격한 pH 하락과 동시에 생산성도 하락하는 것으로 나타났다. 이를 통해, 본 발명 균주의 배양 시간은 8시간과 pH는 4.6으로 제한하는 것이 바람직하다는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 실시예의 본 배양 조건에서 배양 8시간째에 균주 생산성은 15억 cfu(콜로니형성단위)/ml인 것을 확인하였다.
배양시간(h) pH 생산성(ⅹ108cfu/ml)
0 6.0 0
1 5.8 0
2 5.7 1
3 5.7 1
4 5.5 5
5 5.2 7
6 5.1 10
7 5.0 13
8 4.8 15
9 4.5 13
10 4.3 10
그 다음, 배양이 완료된 본 배양액을 25℃로 급속 냉각시킨 다음 원심분리기(10,000rpm, 10분)를 이용하여 균체를 회수하여 냉장 보관하였다. 스킨 밀크 1kg과 락토오스 2kg을 증류수 10L에 용해시켜 분산매로 조제하고 멸균 처리 후 분산매 800ml을 취해서 원심분리가 완료된 균체와 균질하게 혼합 및 교반(100rpm)하여 농축 균액을 조제하였다. 조제된 균액을 동결건조기에 넣고 2일 동안 동결건조 분말화 공정을 진행하였다. 동결건조된 균체를 수거하여 전분과 혼합하여 메쉬망(여과망)으로 거른 다음 알루미늄 비닐로 포장하여 냉장 보관하였다. 이 과정을 도 6에 도식도로 나타내었다.
실시예 12: Lactobacillus fermentum UBC-U32의 스케일 업(scale-up) 생산
상기 실시예 5에 기재된 균주 생산 방법과 동일한 과정으로 균주를 대량 생산하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
75L BE 발효조 내에 GMSMM broth(포도당 2%, 말토덱스트린 0.5%, 소듐아세테이트 0.1, 마그네슘 설페이트 0.25, 물엿 1%, 소금 0.25%, PEG 0.5%, pH 6.0) 50L 액체 배지를 121℃에서 15분 동안 멸균하여 본 배양액으로 사용하였다. 2차 시드 배양액 10L를 무균적으로 75L BE 발효조에 접종하여 10시간 동안 35℃, 100rpm의 조건으로 혐기 배양하였다. 본 배양액은 시간별로 3㎖씩 취득하여 균주 분석을 통해 최종 생산성을 확인하였다.
그 결과 표 9에 나타난 바와 같이, 7.5L 발효조와 동일하게 배양 8시간 째에 가장 높은 15억 cfu/ml 생산성을 이루었고, 배양 8시간 이 후부터 실시예 10과 동일한 패턴으로 하락하는 것으로 나타났다.
이에, 배양 배지 조성과 배양 공정 그리고 적절한 배양 시간의 조절에 의해서, 본 발명의 균주 생산성이 최적화되는 배양 조건을 확보할 수 있었다.
배양시간(h) pH 생산성(ⅹ108cfu/ml)
0 6.0 0
1 5.9 0
2 5.8 0
3 5.8 1
4 5.7 2
5 5.5 5
6 5.1 9
7 4.9 12
8 4.8 15
9 4.6 13
10 4.4 10
한국생명공학연구원 KCTC13617BP 20180807
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Claims (20)

  1. 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32(Lactobacillus fermentum UBC-U32)(기탁번호: KCTC13617BP) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32는 내산성, 내담즙성 및 내열성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32는 서열번호 1로 표시되는 16S rDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32의 균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 당뇨성 치매, 알코올성 치매, 혈관성 치매, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32의 균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 당뇨성 치매, 알코올성 치매, 혈관성 치매, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  10. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하는 인지기능 증진용 식품 조성물.
  11. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하며, 에스케리치아 속( Escherichia genus), 살모넬라 속(Salmonella genus), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus genus), 슈도모나스속(Pseudomonas), 및 나이세리아속(Neisseria)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 박테리아에 대해 항균활성을 갖는 항균용 조성물.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 박테리아는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium), 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 나이세리아 고노헤아(Neisseria gonorrheae)로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  14. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하며, 에스케리치아 속( Escherichia genus), 살모넬라 속(Salmonella genus), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus genus), 슈도모나스속(Pseudomonas), 및 나이세리아속(Neisseria)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 박테리아에 의해 유발되는 감염성 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32을 유효성분으로 포함하며, 에스케리치아 속( Escherichia genus), 살모넬라 속(Salmonella genus), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus genus), 슈도모나스속(Pseudomonas), 및 나이세리아속(Neisseria)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 박테리아에 의해 유발되는 감염성 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 감염성 염증 질환은 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 폐렴, 폐결핵, 결핵, 감기, 인플루엔자, 기도 감염, 비염, 비인두염, 중이염, 기관지염, 임파선염, 이하선염, 림프절염, 구순염, 구내염, 관절염, 근육염, 피부염, 혈관염, 치은염, 치근막염, 각막염, 결막염, 창상 감염, 복막염, 간염, 골수염, 봉소염, 수막염, 뇌염, 뇌농양, 뇌척수염, 뇌막염, 골수염, 신장염, 심장염, 심내막염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 요로염, 방광염, 질염, 자궁경부염, 난관염, 감염성 홍반, 세균성 이질, 농양 및 궤양, 균혈증, 설사, 이질, 위장염, 위장관염, 비뇨생식기 농양, 개방성 창상 또는 상처의 감염, 화농성 염증, 농양, 종기, 농피증, 농가진, 모낭염, 봉소염, 수술 후 상처 감염, 피부열상증후군, 피부화상증후군, 혈전성 혈소판 감소증, 용혈성 요독 증후군, 신부전증, 신우신염, 사구체신염, 신경계 농양, 중이염, 부비동염, 인두염, 편도선염, 유양돌기염, 연조직염, 치성 감염, 누낭염, 늑막염, 복부 농양, 간농양, 담낭염, 비장 농양, 심낭염, 심근염, 태반염, 양수염, 유방염, 유선염, 산욕열, 독소성 쇼크증후군(toxic shock syndrome), 라임(lyme)병, 가스회저, 아테롬성 동맥경화증, 마이코박테리움 아비움 증후군(MAC), 장출혈성 대장균(EHEC) 감염증, 장병원성 대장균(EPEC) 감염증, 장침습성 대장균 감염증(EIEC), 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 감염증, 반코마이신 내성 황색포도상구균(VRSA) 감염증 및 리즈테리아증(listerosis)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32의 배양물
  18. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물.
  19. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물.
  20. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 UBC-U32 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품첨가용 조성물.
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