CN105648036A - 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。该方法包括如下步骤：1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；2)然后将平板分离得到的单菌落接种96微孔板初筛半固体培养基，初筛得到L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；3)对初筛得到的菌株接种24孔板液体培养，结合纸层析法复筛得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；4)对复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵，结合氧化显色法确认酶活性。本发明方法适用于L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选，筛选的菌株具有耐碱性能，在细胞生产过程中避免了繁琐pH值控制步骤。同时也为同类生物酶产生菌的高通量筛选提供参考。
Description
技术领域
本发明属于微生物制药领域，涉及一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。
背景技术
L-天冬氨酸β-脱羧酶(Asd)，又称L-天冬氨酸1-脱羧酶，能催化脱去L-天冬氨酸的羧基，生成L-丙氨酸(L-Ala)。L-丙氨酸在医药和食品工业上的应用相当广泛，随着需求量的增加和发酵工业的发展，L-丙氨酸的生产方法由蛋白质水解提取法、发酵法发展到酶法生产，即利用L-天冬氨酸β-脱羧酶将L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸。用Asd转化生产L-Ala可分为游离细胞法和固定化细胞转化法。日本已经在1982年用卡拉胶固定Pseudomonas.dacunhae细胞用于L-Asp连续生产L-Ala。国内刘景晶等(参见高丽娟等人于2007年在《工业微生物》37(5)：54-59中发表的文章)用卡拉胶固定含有Asd活性的Pseudomonas.dacunhae细胞，在pH6.2～pH7.25范围内和底物浓度为0.4mol/L-0.5mol/L时，固定化细胞表现出最高酶活力。
然而在L-丙氨酸酶法转化过程中，脱羧反应使反应液pH值不断上升，偏离了酶反应的最适pH值范围，导致细胞的酶活力降低，这对工艺过程控制和生物反应器提出更高要求。由于海洋微生物具有陆生微生物无法比拟的生态群落结构多样性和物种多样性，所以从海洋环境中筛选具有特殊耐受性质的生物酶产生菌是目前微生物领域研究的特点，本发明基于该理念，建立了从海洋生境中快速筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶的高通量方法，并且筛选的菌株具有耐碱性能，在细胞生产过程中避免了繁琐pH值控制步骤。
发明内容
本发明的目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。
本发明所提供的L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，具体而言，可包括如下步骤：
1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；
2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据培养基的浑浊程度筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；
3)将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用纸层析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；
4)将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然后氧化显色法测定L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活性。
在上述方法中，步骤1)中，所述微生物样品来自海绵、珊瑚、海底淤泥，所述富集培养基含有质量百分含量1％-2％的NaCl；
步骤2)中，所述初筛半固体培养基含有质量百分含量0.05％的CaCl2；
步骤3)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤2)初筛得到的菌株接种到复筛培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24小时；
步骤4)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤3)复筛得到的菌株接种到摇瓶发酵培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24小时；
在上述方法中，步骤1)中所述富集培养的方式为：将微生物样品用富集培养基洗涤三次，然后接种到富集培养基，温度20℃-37℃、转速100-200转/分钟振荡培养2-4天；所述富集培养基各组分的质量百分含量为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，NaCl1.5％，pH8.5-9.0。
步骤3)中，所述复筛培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，pH8.5-9.0。
步骤4)中，所述摇瓶发酵培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，pH8.5-9.0。
步骤3)与步骤4)中，所述生物转化液各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，pH8.5-9.0。
本发明的再一个目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的初筛半固体培养基。所述初筛半固体培养基各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2％，葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，琼脂0.8％，pH8.5-9.0；将所述初筛半固体培养基分装于96孔酶标板，制得初筛半固体培养基孔板。
所述初筛半固体培养基在对耐碱L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供的L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌高通量筛选方法，可以用于快速筛选具有耐碱性能的L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌，以解决酶法生产L-Ala过程中pH值不断上升酶活性降低的问题，省略工艺过程不断调节pH值步骤；该高通量筛选方法填补了目前国内在该方面研究的空白，同时也为同类生物酶产生菌的高通量筛选提供参考。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。
实施例1L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的筛选
一、样品中微生物的富集与分离
富集培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，NaCl1.5％，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min，冷却后备用；
分离培养基平板：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl1.5％，琼脂2％，pH8.5-9.0，121℃灭菌20min，然后倒平皿制作分离平板，20mL/皿，冷却凝固后待用；
1、采样
文献报道海洋微生物具有陆生微生物无法比拟的生态群落结构多样性和物种多样性，故选取了烟台黄海海域作为采样地点，采集了海绵、珊瑚、海底淤泥等共10个样品。
2、富集
样品取回实验室后，将样品用100mL富集培养基洗涤三次，然后置于1000mL无菌三角瓶中，温度30℃、转速150转/分钟振荡培养3d，该步骤可将样品中的微量微生物进行富集培养。
3、平板分离
将富集后的菌液用无菌生理盐水十倍梯度稀释后涂布分离培养基平板，30℃培养3d，作为筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的菌种资源库。
二、96微孔板穿刺培养初筛
1、初筛培养基孔板的制备
初筛半固体培养基配方：L-天冬氨酸2％，葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，琼脂0.8％，pH8.5-9.0。
将初筛半固体培养基121℃灭菌20min，冷却至50℃左右，然后采用96孔酶标板制备初筛培养基孔板，即向酶标板的每个微孔中加入300μL初筛培养基，冷却凝固后备用。
2、穿刺培养初筛
用无菌牙签从步骤一涂布的分离平板中逐个挑取单菌落，穿刺接种初筛培养基孔板，总共接种480株，30℃培养16h，观察微孔中培养基的透明度，L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌所在的微孔培养基变浑浊，根据浑浊程度判定L-天冬氨酸β-脱羧酶的活性。
其实验原理为：穿刺菌株所产生的L-天冬氨酸β-脱羧酶作用于培养基中的L-天冬氨酸，脱羧产生的CO2，在半固体培养基中呈离子态CO3 2-，CO3 2-与培养基中的Ca2+反应生成难溶的CaCO3，可使培养基变浑浊，故可根据浑浊程度粗略判定L-天冬氨酸β-脱羧酶的活性，该法快速简捷，可在96微孔板中实现高通量的初筛。
本实施例选取了24株浑浊度较高的菌株，进入下一步的复筛。
三、24孔板液体培养结合纸层析复筛
1、复筛培养基孔板的制备
复筛培养基配方：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，pH8.5-9.0。
将复筛培养基121℃灭菌20min，冷却后向24孔细胞培养板的每个微孔中加入500μL复筛培养基即得复筛培养基孔板。
2、生物转化
生物转化液：L-天冬氨酸2％，KH2PO40.05％，K2HPO4·H2O0.14％，pH8.5-9.0。
生物转化反应：将步骤二初筛得到的24株菌株接种到复筛培养基孔板，30℃培养箱中静置培养24h，离心收集菌体，用生物转化液洗涤后再与0.5mL生物转化液混合,混合物30℃孵育24h，离心取上清分析生成的L-丙氨酸。
3、纸层析半定量分析L-丙氨酸含量
将上述反应液点样于新华3号滤纸上，同时点样0.5％L-丙氨酸标准溶液作为阳性对照。展开剂为正丁醇:冰醋酸:水＝4:1:1，显色剂为0.5％茚三酮丙酮溶液。首先根据阳性对照Rf值确定L-丙氨酸斑点位置，然后根据凝胶成像系统和图像分析软件分析斑点的颜色深浅，进而确定菌株生物转化生成L-丙氨酸的能力。
选取斑点最大颜色最深的一株菌进行摇瓶发酵试验，进一步确认酶活性。
四、摇瓶发酵结合氧化显色法确认酶活性
1、摇瓶发酵培养
摇瓶发酵培养基配方：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，pH8.5-9.0。
将摇瓶发酵培养基121℃灭菌20min，冷却后分装于1L三角瓶中，250mL/瓶。
2、生物转化
生物转化液：L-天冬氨酸2％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，pH8.5-9.0。
生物转化反应：将步骤三复筛得到的高产菌株接种到摇瓶发酵培养基，30℃恒温摇床培养24h，振荡速度转速150转/分钟。离心收集菌体，用生物转化液洗涤后再与50mL生物转化液混合，30℃孵育24h，离心后取上清液氧化显色法测定酶活性。
3、氧化显色法测定酶活性：
参考《药物生物技术》1996,3(2):105-108“氧化显色法测定L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力”，酶活单位定义为:采用所述文献操作方法，每克湿细胞每小时催化生成1微克分子的L-丙氨酸为一个酶活力单位1U。最终测得本实施例的酶活为83.5U。
实施例2对实施例1所得L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的菌种鉴定
一、菌株形态及生理生化特征鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》的方法，对菌株进行菌株形态及生理生化特征鉴定
1、菌体形态特征实施例1所得L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌为革兰氏阴性菌，细胞呈短杆状，极端鞭毛，无芽孢；在肉汤琼脂平板上可形成扁平的圆形菌落，呈微黄色，表面较粗糙，陈旧培养物有臭味。
2、生理生化特征鉴定结果如表1所示。
表1L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的生理生化特征
二、菌株16SrDNA序列分析
将菌株在LB培养基中培养过夜后，用溶菌酶裂解法提取细菌总DNA，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行16SrDNA测序。将测得16SrDNA序列与GenBank数据库中相关种、属的序列比较，进而确定该菌株为恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)。
实施例3对比例：生物转化生产L-丙氨酸的性能考察
本对比例考察了试验菌株与对照菌株转化生产L-丙氨酸的性能差异。其中试验菌株为实施例1筛选到的高产菌株对照菌株恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)，对照菌株Pseudomonasdacunhae购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号1511C0005000003137，该菌株是L-丙氨酸的生产菌株。
1、摇瓶发酵培养
摇瓶发酵培养基配方：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，pH6.5-7.0。将摇瓶发酵培养基121℃灭菌20min，冷却后分装于1L三角瓶中，250mL/瓶。然后将分装好的培养基分别接种试验菌株与对照菌株，30℃恒温摇床培养24小时，振荡速度转速150转/分钟。
2、生物转化反应
向试验菌株发酵液与对照菌株发酵液中添加10gL-天冬氨酸，30℃孵育72h，分别在添加L-天冬氨酸12h、24h、48h、72h后取样，测定样品pH值，并采用实施例1步骤四所述氧化显色法测定酶活性。测定结果如表2所示。结果表明随着转化反应的进行，试验菌株与对照菌株的发酵液pH值都不断上升，然而对照菌株的酶活性不断下降，转化72h后酶活降至初始酶活的30％，而试验菌株的酶活比较稳定，转化72h后酶活仅降低14％，表现了优异的耐碱性与稳定性。
表2试验菌株与对照菌株酶活对照表
Claims (8)
1.一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，包括如下步骤：
1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；
2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据培养基的浑浊程度筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；
3)将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用纸层析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；
4)将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然后氧化显色法测定L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述微生物样品来自海绵、珊瑚、海底淤泥，所述富集培养基含有质量百分含量1％-2％的NaCl；
步骤2)中，所述初筛半固体培养基含有质量百分含量0.05％的CaCl2；
步骤3)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤2)初筛得到的菌株接种到复筛培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24小时；
步骤4)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤3)复筛得到的菌株接种到摇瓶发酵培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述富集培养的方式为：将微生物样品用富集培养基洗涤三次，然后接种到富集培养基，温度20℃-37℃、转速100-200转/分钟振荡培养2-4天；所述富集培养基各组分的质量百分含量为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，NaCl1.5％，pH8.5-9.0。
4.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述复筛培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，pH8.5-9.0。
5.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述摇瓶发酵培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，pH8.5-9.0。
6.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于：步骤3)与步骤4)中，所述生物转化液各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，pH8.5-9.0。
7.一种初筛半固体培养基，其特征在于：所述初筛半固体培养基各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2％，葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％，K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，琼脂0.8％，pH8.5-9.0；将所述初筛半固体培养基分装于96孔酶标板，制得初筛半固体培养基孔板。
8.权利要求7所述的初筛半固体培养基在对耐碱L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选中的应用。
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