CN116196269B - 一种治疗混合性阴道炎的生物蛋白凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种治疗混合性阴道炎的生物蛋白凝胶及其制备方法，包括如下重量份组分：玻尿酸钠1‑7份、黄原胶20‑25份、医用甘油3‑7份、1,2己二醇2‑5份、1,2戊二醇2‑5份、蒸馏水350‑380份和细胞因子‑外泌体混合液550‑700份。发明通过玻尿酸钠、黄原胶、医用甘油、1,2己二醇、1,2戊二醇和细胞因子‑外泌体混合液制备的生物蛋白凝胶，能够有效、快速地治疗混合感染性阴道炎，可快速修复生殖道粘膜，调节生殖道黏膜免疫系统作用，不引起疾病复发，疗效稳定、快速。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种治疗混合性阴道炎的生物蛋白凝胶及其制备方法。
背景技术
随着年龄的增长，人体也慢慢进行衰老，人的衰老体现在皮肤上最为直观，免疫力降底，免疫系统容易出现混乱。尤其是女性，到40岁之后随着卵巢功能的下降，生殖道黏膜免疫系统特别容易出现混乱，随即带来的是各种生殖道疾病如：混合性阴道炎等。市场上的很多女性生殖道凝胶中往往会加入激素或者抗生素类成分，好处是可快速产生效果，但是副作用大，容易破坏生殖道环境和粘膜自身分泌功能，会导致生殖道局部免疫能力下降，容易导致生殖道疾病复发。如：霉菌性阴道炎要氟康唑凝胶，其作用是通过抗生素起到消炎的效果，但是容易破坏生殖道环境从而导致妇科疾病反复发作。
间充质干细胞(MSC)是属于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，具有强大的分泌能力，其分泌的细胞外泌体可以促进其它细胞修复受损组织、调节免疫系统、神经系统、抑制炎症等。所以，外泌体正在被研究并广泛应用于组织再生、免疫调节等领域。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提出一种治疗混合性阴道炎的生物蛋白凝胶及其制备方法，采用脐带间充质干细胞分泌的外泌体制备的一种生殖道妇科凝胶，可以快速促进胶原蛋白生成修复生殖道黏膜，提高生殖道黏膜的分泌功能和局部的免疫能力，实现生殖道组织的修复与再生。
本发明提供了一种用脐带间充质干细胞分泌的外泌体制备的生物蛋白凝胶，应用于混合感染性的生殖道时，可以快速修复生殖道粘膜，提高生殖道黏膜的分泌功能和局部的免疫能力实现生殖道组织的修复与再生，可有效阻止病菌的黏附、繁殖，从根本上以阻断炎症进程为目标来治疗阴道炎，同时也避免了使用抗生素引发的耐药性、二重感染、过敏反应及对机体的毒副作用等弊端。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种治疗混合性阴道炎的生物蛋白凝胶，包括如下重量份组分：
进一步的，包括如下重量份组分：
进一步的，还包括水解绿藻蛋白90-140份；所述水解绿藻蛋白的制备方法，包括：取绿藻烘干，脱脂处理后，加入醋酸溶液和胃蛋白酶，超声水解，离心，取上清液，浓缩，得水解绿藻蛋白。
更进一步的，所述超声水解的条件为：水解温度45-55℃，水解时间1-2h，超声功率220-240W；醋酸溶液的质量浓度为3-5％，醋酸溶液的加入量为1-2w/w％，胃蛋白酶的加入量为2-3w/w％。
进一步的，所述细胞因子-外泌体混合液的浓度为45-50mg/mL。
进一步的，所述细胞因子-外泌体混合液是由间充质干细胞因子培养液和间充质干细胞分泌的外泌体混合而得；所述细胞因子培养液和所述外泌体混合后，还加入右旋糖和乙酰六肽，低温混合，所述右旋糖的添加量为200-300μg/mL，乙酰六肽的添加量为80-150μg/mL。
进一步的，所述细胞因子培养液的制备方法为：使用注射用水重悬间充质干细胞后，低温静置，离心，收集上清液，过滤，得细胞因子培养液；悬浮获得的细胞浓度在0.5×107～5.0×108个/mL即可；
所述外泌体的获得方法为：将间充质干细胞传代扩增后，离心，收集上清液，二次离心，得外泌体。
更进一步的，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；所述传代扩增至5～7代后，3000g-4000g转速离心30-40min，收集上清液，100000g-120000g转速离心80-90min。
本发明提供一种上述的生物蛋白凝胶的制备方法，包括如下制备步骤：按配方，在玻尿酸钠和黄原胶中加入蒸馏水混合，搅拌，灭菌，冷却，加入医用甘油、1,2己二醇、1,2戊二醇和细胞因子-外泌体混合液，得所述生物蛋白凝胶；或按配方，在玻尿酸钠和黄原胶中加入蒸馏水混合，搅拌，灭菌，冷却，加入医用甘油、1,2己二醇、1,2戊二醇、细胞因子-外泌体混合液和水解绿藻蛋白，得所述生物蛋白凝胶。
本发明还提供一种上述的生物蛋白凝胶在治疗混合性阴道炎的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过玻尿酸钠、黄原胶、医用甘油、1,2己二醇、1,2戊二醇、细胞因子-外泌体混合液和水解绿藻蛋白制备的生物蛋白凝胶，能够有效、快速地治疗混合感染性阴道炎，可快速修复生殖道粘膜，调节生殖道黏膜免疫系统作用，不引起疾病复发，疗效稳定、快速，可从根本上以阻断炎症进程为目标来治疗阴道炎，同时也避免了使用抗生素引发的耐药性、二重感染、过敏反应及对机体的毒副作用等弊端。
本发明获得的生物蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有良好的抑制效果，尤其是对金黄色葡萄球菌具有稳定、长久地抑制作用。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-水解绿藻蛋白的制备
取小球藻烘干，粉碎，按料液比1：10g/mL，在粉碎的小球藻中加入石油醚进行常温脱脂2h后，在脱脂处理过的小球藻中加入质量浓度3.5％的醋酸溶液(1.8w/w％)和胃蛋白酶(2.6w/w％)，以超声功率220W，水解温度50℃，进行超声水解1.5h，10000r/min离心10min(4℃)，取上清液，浓缩，得水解绿藻蛋白。
实施例2-细胞因子-外泌体混合液的制备
细胞因子培养液的制备方法为：取脐带间充质干细胞，在5％CO2、37℃条件下培养，培养至3代，使用注射用水重悬间充质干细胞，使细胞浓度在1.0×108，在超低温环境下冻融至细胞破碎，以3000g的转速离心30min，收集上清液，过滤，得细胞因子培养液；
所述外泌体的获得方法为：将脐带间充质干细胞在5％CO2、37℃条件下传代扩增至5代后，以3000g的转速离心30min，收集上清液，将得到的上清液以100000g的转速离心80min，收集上清液，得外泌体。
细胞因子-外泌体混合液：将细胞因子培养液和外泌体混合(v/v＝1：1)，调节浓度为45mg/mL，加入220μg/mL右旋糖和120μg/mL乙酰六肽-8，低温保存。
外泌体的制备过程，以及细胞因子培养液和外泌体混合加入右旋糖和乙酰六肽后，均在0～8℃条件下进行。
实施例3-细胞因子-外泌体混合液的制备
细胞因子培养液的制备方法为：取脐带间充质干细胞，在5％CO2、37℃条件下培养，培养至3代，使用注射用水重悬间充质干细胞，使细胞浓度在1.0×108，在超低温环境下冻融至细胞破碎，以3000g的转速离心30min，收集上清液，过滤，得细胞因子培养液；
所述外泌体的获得方法为：将脐带间充质干细胞在5％CO2、37℃条件下传代扩增至5代后，以3000g的转速离心30min，收集上清液，将得到的上清液以100000g的转速离心80min，收集上清液，得外泌体。
细胞因子-外泌体混合液：将细胞因子培养液和外泌体混合(v/v＝1：1)，调节浓度为50mg/mL，低温保存。
外泌体的制备过程在0～8℃条件下进行。
实施例4-快速修复衰老生殖道的生物蛋白凝胶的制备
配方如下：
注：配方4-6选用实施例1的水解绿藻蛋白，配方1-6选用实施例2的细胞因子-外泌体混合液，配方7选用实施例3的细胞因子-外泌体混合液。
上述生物蛋白凝胶的制备方法为：按上述配方，在玻尿酸钠和黄原胶中加入蒸馏水混合，搅拌使玻尿酸钠、黄原胶溶胀呈均匀粘性胶状，115℃、30min灭菌冷却至室温后，加入医用甘油、1,2己二醇、1,2戊二醇、GC-04和细胞因子-外泌体混合液(或加入医用甘油、1,2己二醇、1,2戊二醇、GC-04、细胞因子-外泌体混合液和水解绿藻蛋白)，得生物蛋白凝胶。
实施例5-抑菌效果
采用梯度稀释比浊法，分别将金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠李糖乳杆菌配制成1×106CFU/mL的菌悬液，分别取0.2mL菌悬液涂布至培养基后，盖上直径5.5mm的圆形滤纸片，分别滴加上述不同配方的生物蛋白凝胶2μL，以滴加等量生理盐水作为对照，分别统计抑菌圈直径，测定3次取平均值，结果如表2。
表2生物蛋白凝胶的体外抑菌效果
由上表2可知，配方3、4、7的生物蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠李糖乳杆菌的生长有不同程度的抑制作用，并随着培养时间的延长，对不同菌种的抑制效果也有所不同，配方3对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到31.80mm，对白色念珠菌的抑菌圈直径为15.75mm，配方4对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为27.12mm，对白色念珠菌的抑菌圈直径达到16.58mm，虽然配方3抑制金黄色葡萄球菌体外生长的效果较好，但从金黄色葡萄球菌来看，配方4在培养36h后，其对金黄色葡萄球菌并未下降，甚至有所提高，且其对白色念珠菌的抑制效果优于配方3，虽然配方4对鼠李糖乳杆菌的抑制效果高于配方3，综合来看，配方4的效果最优，尤其是对金黄色葡萄球菌具有稳定、长久地抑制作用。
与配方7相比，在制备细胞因子培养液和外泌体混合时加入右旋糖和乙酰六肽-8，有助于提高细胞因子和外泌体的活性，进而提高生物蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌致病菌的抑制效果。
配方1和配方5在24h对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为27.53mm和28.62mm。
实施例6-安全性验证
选取SPF级雌性SD大鼠20只，体重为160～180g，于试验前一周进行适应性饲养，阴道内灌注给药，给药量为0.3g/kg，1天1次，连续给药一周，观察配方4制备的生物蛋白凝胶对大鼠阴道刺激的情况。
经安全性验证，配方4制备的生物蛋白凝胶对大鼠阴道无刺激性、红肿情况，产品安全。
实施例7-治疗效果
使用配方4制备的生物蛋白凝胶作为治疗药剂，依据临床诊断选取混合性阴道炎的确诊患者50名，所有患者知情并自愿参与。此外，患者未使用任何其它药物。每天每位患者使用阴道给药器插入阴道深处并将凝胶推出，使用后保持仰卧体位30min，1次1支，1天1次，时间在30分钟左右，具体疗效见下表3。
表3混合性阴道炎的治疗效果
由上表3可知，经过配方4的生物蛋白凝胶的持续性治疗，4天后30位患者无瘙痒情况，28位患者无疼痛情况，20位患者无充血或水肿情况，22位患者无外阴灼热情况，8位患者症状的分泌物情况正常，表明本发明通过玻尿酸钠、黄原胶、医用甘油、1,2己二醇、1,2戊二醇、细胞因子-外泌体混合液和水解绿藻蛋白制备的生物蛋白凝胶，能够有效、快速地治疗混合感染性阴道炎，持续治疗4天后，约40％的患者症状有缓解，约60％的患者症状消失，一个月后复查病情稳定未复发，本发明提供的一种用脐带间充质干细胞分泌的外泌体制备的生物蛋白凝胶，应用于混合感染性的生殖道时，可以快速修复生殖道粘膜，提高生殖道黏膜的分泌功能和局部的免疫能力实现生殖道组织的修复与再生，可有效阻止病菌的黏附、繁殖，从根本上以阻断炎症进程为目标来治疗阴道炎，疗效稳定，疾病不复发。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种治疗混合性阴道炎的生物蛋白凝胶，其特征在于，包括如下重量份组分：玻尿酸钠1-7份，黄原胶20-25份，医用甘油3-7份，1,2己二醇2-5份，1,2戊二醇2-5份，蒸馏水350-380份，细胞因子-外泌体混合液550-700份和水解绿藻蛋白90-140份；
所述水解绿藻蛋白的制备方法，包括：取绿藻烘干，脱脂处理后，加入醋酸溶液和胃蛋白酶，超声水解，离心，取上清液，浓缩，得水解绿藻蛋白；
所述细胞因子-外泌体混合液是由间充质干细胞因子培养液和间充质干细胞分泌的外泌体混合而得；
所述细胞因子培养液的制备方法为：使用注射用水重悬间充质干细胞后，在超低温环境下冻融至细胞破碎，离心，收集上清液，过滤，得细胞因子培养液；
所述外泌体的获得方法为：将间充质干细胞传代扩增后，离心，收集上清液，二次离心，得外泌体；
所述细胞因子培养液和所述外泌体混合后，还加入右旋糖和乙酰六肽，低温混合，所述右旋糖的添加量为200-300 µg/mL，乙酰六肽的添加量为80-150 µg/mL。
2. 根据权利要求1所述的生物蛋白凝胶，其特征在于，其中，玻尿酸钠为5份，黄原胶为22份，医用甘油为5份，1,2己二醇为3份，1,2戊二醇为3份，蒸馏水为 360份和细胞因子-外泌体混合液为660份。
3.根据权利要求1所述的生物蛋白凝胶，其特征在于，所述超声水解的条件为：水解温度45-55℃，水解时间1-2h，超声功率220-240W；醋酸溶液的质量浓度为3-5%，醋酸溶液的加入量为1-2w/w%，胃蛋白酶的加入量为2-3w/w%。
4. 根据权利要求1或2所述的生物蛋白凝胶，其特征在于，所述细胞因子-外泌体混合液的浓度为45-50 mg/mL。
5.根据权利要求1所述的生物蛋白凝胶，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；所述传代扩增至5~7代后，3000g-4000g转速离心30-40min，收集上清液，100000g-120000g转速离心80-90min。
6.根据权利要求1~5任意一项所述的生物蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：按配方，在玻尿酸钠和黄原胶中加入蒸馏水混合，搅拌，灭菌，冷却，加入医用甘油、1,2己二醇、1,2戊二醇、细胞因子-外泌体混合液和水解绿藻蛋白，得所述生物蛋白凝胶。
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