CN105648005B - 双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法 - Google Patents

双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。本发明以双髻鲨软骨为原料，通过总蛋白提取、丙酮分级沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Gly‑Phe‑Thr‑Gly‑Pro‑Pro‑Gly‑Phe‑Asn‑Gly，ESI‑MS测定分子量为950.03 Da；制备的高活性抗氧化肽具有较强的自由基清除活性和良好的脂质过氧化抑制作用，可以作为药品、保健食品或食品添加剂等进行开发。

Description

双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗氧化活性肽的制备方法，具体涉及一种双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。
背景技术
鲨鱼全身是宝，有的种类肉质鲜美，是餐桌上常见的菜肴。鱼皮具有良好的韧性，是皮革加工业的原料。现代医学证明鲨鱼软骨具有很大的药用价值，1992年美国首先将鲨鱼软骨粉直接用于临床治疗肿瘤。双髻鲨（Sphyrna lewini）为软骨鱼纲，真鲨目，双髻鲨科，在我国主要分布于黄海、东海和南海。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种能够清除自由基和抑制脂质过氧化作用的双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，其包括以下步骤：
1）双髻鲨软骨总蛋白粗提物的制备：称取双髻鲨软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的双髻鲨软骨浸于4～6倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中（含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7～8），于4 ℃下搅拌抽提36～48h。提取液在4 ℃下以4000～6000 r/min离心15～25 min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4 ℃、10000～12000 r/min离心15～25 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质。将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液于4 ℃下透析24～48 h，透析袋内溶液即为双髻鲨软骨总蛋白粗提物。
2）双髻鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备：取双髻鲨软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20 ℃下静置4～6 h后，于4 ℃、10000～12000 r/min高速离心20 min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得双髻鲨软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白。
3）双髻鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解：取双髻鲨软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3～5 mL溶于Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH 7.5～8.5），按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0～3.0%加入胰蛋白酶（1.9×104 U/g），于40 ℃酶解3～5 h，然后于90 ℃、10 min灭酶活，酶解液于4 ℃、10000～12000 r/min离心15～25 min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液。
4）双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得抗氧化肽。
作为优选，所述的步骤1）中的双髻鲨为双髻鲨（Sphyrna lewini）。
作为优选，所述步骤4）的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
离子交换树脂层析：将上述超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55 mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1 mol/L、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速为0.6～0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物；
凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6～0.8mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；
RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对DPPH自由基和羟基自由基的清除活性得1个高活性抗氧化肽Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)，ESI-MS测定分子量为950.03 Da。
再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量10～15 μL；色谱柱Zorbax SB- C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈梯度洗脱（0～32min乙腈浓度由0匀速升至50%）；洗脱速度0.6~1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。
与现有技术相比，本发明所提供的双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品的添加剂。
附图说明
图1是本发明的DEAE-52离子交换树脂层析图。
图2是本发明的葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析图。
图3葡聚糖凝胶Sephadex G-15制备酶解物的RP-HPLC分析。
图4 Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)的质谱图。
图5Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)的抗脂质氧化能力。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例：
双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下：双髻鲨软骨→软骨总蛋白→软骨60%丙酮沉淀蛋白→胰蛋白酶酶解→酶解物→超滤→离子交换层析→凝胶过滤层析→高效液相色谱制备→抗氧化肽。
1）双髻鲨软骨总蛋白粗提物的制备：称取双髻鲨（Sphyrna lewini）软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的双髻鲨软骨浸于4倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中（含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7.0），于4 ℃下搅拌抽提48 h。提取液在4 ℃下以5000 r/min离心20 min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4 ℃、12000 r/min离心20 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质。将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液于4 ℃下透析48 h，透析袋内溶液即为双髻鲨软骨总蛋白粗提物。
2）双髻鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备：取双髻鲨软骨总蛋白粗提物，在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20 ℃下静置5 h后，于4 ℃、10000 r/min高速离心20 min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得双髻鲨软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，得60%丙酮分级沉淀蛋白。
3）双髻鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解：取双髻鲨软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:4mL溶于Tris-盐酸缓冲液（0.05mol/L，pH 8.0），按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.5%加入胰蛋白酶（1.9×104 U/g），于40 ℃酶解4 h，然后于90 ℃、10 min灭酶活，酶解液于4 ℃、12000 r/min离心20 min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液。
4）双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分（SP60-I），得到超滤酶解液，将超滤酶解液依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得抗氧化肽。
①离子交换树脂层析：将SP60-I溶于双蒸水配成浓度为50 mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1 mol/L、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速为0.6 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟自由基清除能力，选择抗氧化能力最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物SP60-3（图1）；
②凝胶柱层析：将SP60-3溶于双蒸水配成浓度为50 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6～0.8 mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟自由基清除能力，选择抗氧化能力最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物SP60-3-1（图2）；
③RP-HPLC纯化：将SP60-3-1用双蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（RP-HPLC条件为：进样量15 μL；色谱柱Zorbax SB- C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈梯度洗脱（0～32min乙腈浓度由0匀速升至50%）；洗脱速度0.8 mL/min；紫外检测波长280 nm），根据对DPPH自由基和羟自由基的清除活性得1个高活性抗氧化肽DCPE-B（图3）。
④结构检测：收集DPPH自由基和羟自由基清除活性最高的抗氧化肽DCPE-B，经RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)，ESI-MS测定分子量为950.03 Da（[M+H]+ 951.24Da）（图4）。
将制得的双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly(GFTGPPGFNG)进行自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验，实验结果表明：Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)对DPPH 自由基（EC50 2.76 mg/mL）、羟基自由基（EC50 0.22 mg/mL）、ABTS自由基（EC50 0.08 mg/mL）和超氧阴离子自由基（EC50 0.13mg/mL）具有良好的清除作用；同时，Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly(GFTGPPGFNG)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用（图5）。
最后，还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋学院
<120> 双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法
<130> zjou-wb-201511-102
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Phe Thr Gly Pro Pro Gly Phe Asn Gly
1 5 10

Claims (4)

1.双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，所述双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的氨基酸序列为Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly，所述双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法包括以下步骤：
1）双髻鲨软骨总蛋白粗提物的制备：称取双髻鲨软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的双髻鲨软骨浸于4～6倍体积的1.0mol/L盐酸胍溶液中，于4℃下搅拌抽提36～48h；提取液在4℃下以4000～6000r/min离心15～25min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4℃、10000～12000r/min离心15～25min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质；将滤液装入分子截留量为8000的透析袋中，用Tris-HCl，pH值为7.6，缓冲液于4℃下透析24～48h，透析袋内溶液即为双髻鲨软骨总蛋白粗提物；
2）双髻鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备：取双髻鲨软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20℃下静置4～6h后，于4℃、10000～12000r/min高速离心20min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得双髻鲨软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白；
3）双髻鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解：取双髻鲨软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3～5mL溶于0.05mol/L、pH值为7.5～8.5Tris-HCl的缓冲液，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0～3.0%加入1.9×104U/g的胰蛋白酶，于40℃酶解3～5h，然后于90℃、10min灭酶活，酶解液于4℃、10000～12000r/min离心15～25min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液；
4）双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得抗氧化肽；
所述步骤4）的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：离子交换树脂层析：将上述超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/LNaCl溶液进行洗脱，流速为0.6～0.8mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物；
凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6～0.8mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；
反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，收集DPPH自由基和羟自由基清除活性最高的抗氧化肽，经RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly，ESI-MS测定分子量为950.03Da。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的盐酸胍溶液含0.02mol/LMES和0.02mol/LEDTA，pH值为7～8。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的双髻鲨为双髻鲨即Sphyrnalewini。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述反相高效液相色谱的条件为：进样量10～15μL；色谱柱是规格为250mm×4.6mm、填料颗粒直径为5μm的ZorbaxSB-C18；流动相为水-乙腈梯度洗脱，0～32min乙腈浓度，由0匀速升至50%；洗脱速度0.6~1.0mL/min；紫外检测波长280nm。
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