FI105045B - Menetelmä sytolyyttisten T-lymfosyyttien muodostamiseksi - Google Patents

Description

105045

Menetelmä sytolyyttisten T-lymfosyyttien muodostukseksi Keksinnön tekninen ala Tämä keksintö koskee ex vivo menetelmää nisäkkään 5 sytolyyttisten T-lymfosyyttien jakautuneen populaation muodostamiseksi, joilla lymfosyyteillä on lyyttinen spesifisyys soluille, joissa on spesifinen antigeeni. Keksintö mahdollistaa adoptiivisen immuunihoidon sellaiselle yksilölle, jolla on syöpä tai virusinfektio; jolloin otetaan 10 näyte spesifiselle antigeenille altistettuja perifeerisiä imusoluja, viljellään imusoluja ex vivo kasvatusalustassa, joka sisältää interleukiini-7(IL-7)-polypeptidiä tai sen johdannaista konsentraationa, joka on riittävä aktivoimaan CTL-aktiivisuuden imusoluissa. Aktivoituja imusoluja voi-15 daan antaa hoidon tarpeessa olevalle yksilölle.

Keksinnön tausta

Normaalien hiirien lepäävien imusolujen in vitro -soluviljelmän, jossa on joko interleukiini-2:ta (IL-2) tai interleukiini-4:ää (IL-4), on osoitettu saavan aikaan 20 kasvainsoluille sytotoksisten imusolujen populaatioita.

Näitä soluja kutsutaan yleensä lymfokiiniaktivoiduiksi tappajasoluiksi (LAK) . IL-2 ja IL-4 ovat eri T-soluista saatuja sytokiineja tai paremminkin lymfokiineja. Sekä V,,: IL-2:lla että IL-4:llä on osoitettu olevan joitakin pääl- 25 lekkäisiä aktiivisuuksia. Esimerkiksi IL-2 tunnistettiin ··· alunperin T-solun kasvutekijäksi, mutta sen jälkeen sen on • 1 .··1· osoitettu kiinnittyvän sellaisiin erilaisiin solutyyppei- « · « *·.·. hin, kuten B-soluihin, monosyytteihin, ihon Langerhansin • · 4···, soluihin, oligodendrogliaalisiin soluihin ja NK-soluihin ja • # 1 30 edistävän niiden lisääntymistä tai toimintaa. Lisäksi IL- 4:n ajateltiin alunperin toimivan pääasiassa indusoimalla • · '···1 B-solujen proliferaatiota ja kypsymistä, IL-4:n on sen jäi- - · 1 keen osoitettu vuorovaikuttavan hematopoeettisten varsi-solujen, makrofaagien, syöttösolujen ja T-solujen kanssa.

• · 35 Nisäkkään interleukiini-7 (IL-7) on aikaisemmin r · < i i nimetty lymfopoietiini-1:ksi. Ihmisen ja hiiren IL-7:n i « · * · IM ( · « ·

M I

2 105045 kloonaus ja ekspressio on kuvattu US-patentissa 4 965 195, joka on julkaistu 23. lokakuuta 1990, ja jonka sisältö liitetään tähän viitteeksi. Interleukiini-7 on lymfopoi-eettinen kasvutekijä, joka eristettiin ja kloonattiin ensin 5 sen perusteella, että se kykeni stimuloimaan B- ja T-solu-jen kantamuotojen kasvua luuytimessä. Julkaistu PCT-hakemus WO89/03 884 (5. toukokuuta 1989) ja EP-A-0 314 415 (3. toukokuuta 1989) viittaavat DNA:ihin, vektoreihin ja niihin liittyviin menetelmiin nisäkkään IL-7-polypeptidien 10 tuottamiseksi rekombinantti-DNA-tekniikalla. Näiden julkaistujen patenttihakemusten asiaankuuluvat sisällöt liitetään tähän viitteeksi. Hiiren IL-7:n kloonauksen raportoivat tieteellisessä kirjallisuudessa ensimmäisinä Namen et ai., Nature 333:571 (1988) ja ihmisen IL-7:n kloonauksen 15 Goodwin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:302 (1989).

Hiiren IL-7:n puhdistaminen muuttuneiden luuydinperuskudos-solulinjojen supernatanteista osoitti ilmeiseksi molekyy-lipainoksi noin 25 000 daltonia (katso esimerkiksi Namen et ai., J. Exp. Med. 167:988 (1988)). Namen et al.:n ja 20 Goodwin et ai.:n raportoimat kloonatut DNAt viittaavat ! siihen, että hiiren ja ihmisen IL-7-polypeptidien minimi- molekyylipainot ovat 14 897 ja 17 387 daltonia, tässä järjestyksessä, lukuunottamatta glykosylaatiota.

Riittävien IL-7-määrien kloonaus, karakterisointi «Il * 25 ja ekspressio on antanut käyttöön riittävän rekombinantin ··· ^ ;*·.· polypeptidin sen biologisten aktiivisuuksien kirjon kuvaa- • · .··*. misen aloittamiseksi. IL-7 määriteltiin alunperin sen kyvyn mukaan stimuloida esi-B-solujen (B220+) proliferaatiota, • · *..1^ jotka solut saatiin pitkäaikaisesta luuydinviljelmästä ’ 30 (katso Whitlock et ai., J. Immunol. Methods 67:353 - 69 (1984)). IL-7 ei pystynyt kuitenkaan stimuloimaan kypsien • · ’···* B-solujen proliferaatiota tai indusoimaan esi-B-solujen II· erilaistumista pinnan Ig+-soluiksi (Lee et ai., J. Immunol. 142:3875 - 83 (1989) ) .

,···, 35 Uudemmat viitteet ovat osoittaneet, että T-solu- sukuperäiset solut reagoivat IL-7:ään. Esimerkiksi useim- • 4 «

I I I

I I I

a • * a i · 3 105045 pien pintafenotyyppien lepäävät sikiötymosyytit ja kypsät tymosyytit lisääntyvät nopeasti reaktiona IL-7:lle tavallaan riippumatta IL-2:sta, IL-4:stä tai IL-6:sta (Conlon et ai., Blood 74:1368 - 73 (1989)). Lisäksi kypsät periferiset 5 T-solut reagoivat IL-7:ään lähes optimaalisten mito-geenikonsentraatioiden läsnä ollessa (Chazen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:5923 - 27 (1989)). Morissey et ai., J. Exp. Med. 169:101 - 16 (1989), ovat osoittaneet, että IL-7 voi saada aikaan ko-stimulatorisen signaalin CON A:n io aiheuttamalle, puhdistettujen hiiren T-solujen in vitro -jakautumisvasteelle indusoimalla IL-2-tuotannon. Lisäksi Chazen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:5923 - 27 (1989), ovat vielä osoittaneet, että IL-7 yhdessä PMA:n kanssa voi suoraan stimuloida T-soluaktivaatiota ilman toi-15 sen sytokiinilähetin väliintuloa. Suuret konsentraatiot neutralisoivia IL-2:n tai IL-4:n vasta-aineita eivät inhiboineet reaktiota IL-7:n ja PMA:n yhdistelmälle, ja reaktio oli hyvin vastustuskykyinen CsA:n immunosupressiivisille vaikutuksille; CsA on lääke, joka inhiboi muutamien lymfo-20 kiinigeenien transkriptiota mukaan lukien IL-2:ta, IL-4:ää ja interferoni- :aa koodaavat geenit.

Laaja kirjo hiiren solulinjoja ja primaarisia solu-linjoja ilmentävät IL-7-reseptoreita. Nämä solulinjat kä-sittävät soluja sekä imu- että ydinlähtökohdista. Siksi sy-25 tokiini-IL-7:llä on mahdollisuuksia suureen määrään ak- ·· » tiivisuuksia monilla eri solutyypeillä.

Imusukuisten solujen erilaistuminen käsittää moni- #·· mutkaisen ja vielä huonosti ymmärretyn sarjan tapahtumia.

• · .·;·. Vaikka tavallisen edeltäjän tai varsisolun uskotaan antavan • · · 30 alun sekä B- että T-lymfosyyteille, erilaistumisprosessiin ... liittyvät vaiheet ovat jääneet saavuttamattomiksi. Varhai- • · '···1 set CD4“/CD8”-tymosyytit voivat vallata säteilytetyn vas- '···' taanottajan kateenkorvan uudelleen ja erilaistua useiksi eri tymosyytti-alipopulaatioiksi. Erilaistumisprosessiin 35 osallistuvia tekijöitä ei tunneta.

< ( I

I a · · aa· • 1 4 105045

Conlon et al., Blood 74:1368 - 73 (1989), viittaa-vat hiiren tymosyyttien jakautumisvasteeseen hiiren IL-7:ään. IL-7 yksin oli mitogeeninen tymosyyteille ja IL-7-vastetta lisättiin vielä CON A:11a. Conlon et ai., 5 osoittivat lisäksi, että IL-7 stimuloi CD4'/CD8”-solujen proliferaatiota, joiden solujen uskotaan edustavan vähiten erilaistunutta tymosyytti-alipopulaatiota. Lisäksi tymosyyttien vaste IL-7:ään ei näyttänyt johtuvan muiden tunnettujen T-solun kasvutekijöiden, kuten IL-2:n ja IL-4:n, 10 tuotannosta. Tämä IL-7-aktiivisuus on päinvastainen muille lymfikiiniaktiivisuuksille, kuten IL-l:lle tai IL-6:lle, joiden on osoitettu lisäävän T-solun vastaanottavaisuutta joko IL-2:n ja IL-4:n tuotannolla tai IL-2-reseptorin säätelyllä tai molemmilla.

15 Adoptiivisen immuunihoidon tekniikka ja sen eri laiset muunnelmat on kuvattu esimerkiksi viitteessä Rosenberg, Scientific American, ss. 62 - 69 (toukokuu, 1990).

Adoptiivisen immuunihoidon malli kehitettiin ensin käyttäen IL-2:ta. Menetelmä kehitettiin hiirillä. Lyhyesti selostet-20 tuna terveeltä syngeeniseltä hiireltä poistetaan perna, eristetään lymfosyytit ja viljellään eristettyjä lymfosyyttejä kasvatusalustassa, joka sisältää IL-2:ta. IL-2 indusoi tiettyjä imusoluja ja NK-soluja viljelmässä, josta tulee sytolyyttinen ja kasvaimia tuhoava. Aktivoidut lymfosyytit 25 3a IL-2 injektoidaan kasvainta kantaviin hiiriin syövän im- :*·.· muunihoitomenetelmänä. Ihmisillä tehdyissä kliinisissä tut- • · .***. kimuksissa on eristetty lymfosyytit potilaan kokoverestä, • · · aktivoitu lymfosyytit viljelmässä IL-2: n kanssa LAK- • · aktiivisuuden indusoimiseksi ja hoidettu potilaita noin 50 « · · 30 miljardilla LAK-solulla infusoituna laskimonsisäisesti yh- ... dessä ihmisen IL-2:n kanssa. Monissa kliinisissä tutkimuk- • · "···* sissa havaittiin IL-2:n infuusio yhdessä aktivoitujen lym- fosyyttien kanssa välttämättömäksi.

Rosenberg ja hänen kolleegansa ovat yrittäneet hoi- < « 35 taa eri syöpiä aktivoiduilla LAK-soluilla yhdessä IL-2:n e ( < kanssa ja antamalla ainoastaan IL-2:ta. Heidän tuloksensa

«II J

• 4 · « · • · f · • · · 5 105045 ovat tähän menessä osoittaneet täydellistä syövän väliaikaista lievenemistä 14:llä potilaalla 177:stä aktivoiduilla LAK-soluilla yhdessä IL-2:n kanssa ja neljässä syövässä 130:stä ainoastaan IL-2:lla. Kun osittaiset väliaikaiset 5 lievenemiset otetaan huomioon, potilaista, jotka saivat aktivoituja LAK-soluja ja IL-2:ta, 25 %:n tila parani ja potilaista, jotka saivat ainoastaan IL-2:ta, 17 %:n tila parani. Nämä tutkimukset jatkuvat.

Adoptiivisella immuunihoitotekniikalla on raportoi-10 tu olevan sivuvaikutuksia, kun lymfosyytit aktivoidaan IL-2:lla ja annetaan samanaikaisesti IL-2:n kanssa. Näihin sivuvaikutuksiin kuuluu lymfosyyttien proliferaatio kudoksissa, joka häiritsee elintärkeiden elinten toimintaa. IL-2:n antaminen johtaa nesteen vuotamiseen verestä kudoksiin, 15 josta seuraa painon nousu.

Siksi alalla on tarvetta paremmin määrittää IL-7-polypeptidien tarkat fysiologiset ja immunologiset toiminnot. Lisäksi alalla on tarvetta parantaa immuunihoidollisia tekniikoita erilaisilla sytokiineilla erilaisissa al-20 tistusolosuhteissa, erilaisilla yhdistelmillä ja erilaisilla farmakokineettisillä parametreillä. Tämä keksintö tehtiin yrityksenä löytää käyttö IL-7-polypeptideille yksin tai yhdessä muiden sytokiinien tai muiden tekijöiden kans-: i : sa.

r i 25 Keksinnön yhteenveto ··· .*·.· Keksinnön mukaiselle ex vivo menetelmälle sytolyyt- • * tisten T-lymfosyyttien jakautuneen populaation muodostami- « · ··.·. seksi on tunnusomaista, että saatetaan spesifiselle anti- • · geenille aikaisemmin altistettu T-solupopulaatio kosketuk- S · · ' 30 seen kasvatusalustan kanssa, joka sisältää biologisesti te hokkaan määrän IL-7-polypeptidiä tai sen johdannaista. Yk- • · *·♦·* silö, jolla on syöpä tai virusinfektio, voidaan hoitaa

f t I

adoptiivisella immuunihoidolla CTL:illä (sytolyyttisillä T-lymfosyyteillä) , jotka on aktivoitu IL-7-polypeptidin tai • « 35 sen johdannaisen läsnä ollessa. Otetaan syngeenisiä perife->·< erisiä imusoluja, jotka ovat aikaisemmin olleet alttiina

• t I

• · · • · « • · # · · 6 105045 kasvainsolupopulaatiolle tai virusinfektiolle (toisin sanoen spesifiselle antigeenille), viljellään imusoluja ex vivo kasvatusalustassa, joka sisältää riittävän määrän konspesifistä IL-7-polypeptidiä tai sen johdannaista CTL-5 aktiivisuuden indusoimiseksi imusoluissa, ja annetaan CTL-aktiivisuuden ilmentäviä imusoluja yksilölle. Edullisesti kasvatusalusta sisältää lisäksi noin 3 ng/cm3:aa konspesifistä IL-2-polypeptidiä tai sen johdannaista ja/tai noin 10 ng/cm3:aa konspesifistä IL-4-polypeptidiä tai sen 10 johdannaista.

Edullisesti syngeeniset perifeeriset imusolut saadaan kasvaimen tai virusinfektoidun paikan viereisestä kuivaavasta imusolmukkeesta.

Sytolyyttisia T-lymfosyyttisoluja (CTL), jotka on 15 aktivoitu joko yksistään IL-7:ää tai IL-7:n ja IL-2:n yhdistelmää sisältävällä ex vivo -viljelmällä ja joilla on spesifinen hajotusaktiivisuus kasvainsoluille, voidaan käyttää syövän adoptiiviseen immuunihoitoon. Lisäksi on vielä mahdollista lisätä mitoottisesti inaktivoituja kas-20 vainsoluja ex vivo -viljelmään solujen CTL-aktiivisuuden lisäämiseksi.

Vaihe, jossa annetaan CTL-aktiivisuuden ilmentäviä imusoluja yksilölle, voi käsittää lisäksi sytokiinin anta-.'j : misen yksilölle, jolloin sytokiini on IL-7-polypeptidi tai 25 sen johdannainen, IL-7-polypeptidin tai sen johdannaisen ja • · · IL-2-polypeptidin tai sen johdannaisen tai IL-4-polypepti- • · .···. din tai sen johdannaisen yhdistelmä tai IL-7-polypeptidin • · tai sen johdannaisen ja IL-2-polypeptidin tai sen johdan- • · *.,! naisen ja IL-4-polypeptidin tai sen johdannaisen yhdistel- • · ·

( I I

• 30 mä. Edulliset päivittäiset sytokiiniannokset ovat IL-2:lle noin 10 - noin 2 000 μg/kg/pvä, IL-4:lle ja IL-7:lle noin 4 • · · ·...· - noin 1 000 μg/kg/pvä. Edullisimmin IL-2:n päivittäisannos annetaan joka päivä kolmena eri annoksena ja IL-4 ja IL-7 : annetaan kumpikin kahdesti päivässä (bid) .

il ,··, 35 Syövän adoptiiviseen immuunihoitoon voidaan saada syngeenisten lymfosyyttien populaatio. Syngeenisten lymfo- • · « II· • · · « · · • · * · « 7 105045 syyttien populaatio saadaan perifeerisistä imusoluista, edullisesti perifeerisistä imusoluista, jotka kuivattavat tiettyä kasvainpaikkaa. Syngeenisiä perifeerisiä imusoluja viljellään ex vivo riittävässä määrässä konspesifistä IL-7-5 polypeptidiä tai sen johdannaista CTL-aktiivisuuden in-dusoimiseksi imusoluissa, jolloin CTL-aktiivisuus määritetään CD8-positiivisilla T-soluilla. Edullisesti kasvatusalusta sisältää lisäksi noin 3 ng/cm3:aa konspesifistä IL-2-polypeptidiä tai sen johdannaista ja/tai IL-4-polypep-10 tidiä tai sen johdannaista ja mahdollisesti mitoottisesti inaktivoituja kasvainsoluja.

Keksinnön mukaisesti muodostetaan populaatio jakautuneita ja aktivoituneita sytolyyttisia T-lymfosyytteja, joilla on spesifistä antigeeniä ilmentäviä kohdesoluja 15 (esim. kasvainsolut ja virusinfektoidut solut) hajottava ominaisuus. Soluja tuotetaan ex vivo menetelmällä, jossa saadaan aikaisemmin kasvainsolupopulaatiolle tai virusinfektiolle altistuneita syngeenisiä perifeerisiä imusoluja ja viljellään imusoluja ex vivo kasvatusalustassa, joka si-20 sältää riittävän määrän konspesifistä IL-7-polypeptidiä tai sen johdannaista CTL-aktiivisuuden indusoimiseksi imusoluissa. Solut ovat käyttökelpoisia syöpien ja virusinfektioiden adoptiiviseen immuunihoitoon. Soluille on lisäk-; : si tunnusomaista CD8-positiivisten T-solujen populaatio ja _ 25 lähes puuttuvat NK-solut. Edullisesti kasvatusalusta sisäl- ··· tää lisäksi noin 3 ng/cm3:aa konspesifistä IL-2- • · .··*. polypeptidiä tai sen johdannaista ja mahdollisesti mitoot- tisesti inaktivoituja spesifisiä kasvainsoluja. Edullisesti · IL-7-polypeptidin tai ekvipotentin tai sen aktiivisen joh- * * * ’ 30 dannaisen kasvatusalustassa oleva määrä on noin 2,5 ng/cm3 '- noin 20 ng/cm3. Edullisimmin IL-7-polypeptidin tai ekvi-• · *·”’ potentin tai sen aktiivisen johdannaisen määrä on noin 10 ng/cm3.

Piirustusten lyhyt kuvaus < · 35 Kuvio 1 esittää eri vaikuttaja/kohde-suhteiden so- • · · lutitrausten vertailua kuivaavan imusolmukkeen soluille t · · • · « · • f * 8 105045 (DLN) tai kontrolli-imusolmukesoluille, joita on viljelty kasvatusalustassa, jossa on ollut 2,5; 10 tai 20 ng/cm3 IL-7:ää tai ei ollenkaan IL-7:ää (kontrolli). Tiedot vertailevat 1024-kasvainsolujen prosentuaalista hajoamista, 5 kun niitä käsitellään in vitro kontrolli-CLN:illä, 20 ng/cm3:lla IL-7:ää inkuboiduilla CLN:illä, kontrolli-DLNillä tai DLN:illä, joita on inkuboitu 2,5; 10 tai 20 ng/cm3:lla IL-7:ää. Nämä tiedot osoittavat, että suurin hajoavuus annetulle vaikuttajasolujen ja kohdesolujen suh-10 teelle saadaan, kun DLN:iä inkuboidaan IL-7:ssä.

Kuvio 2 vertailee kasvaimen kasvunopeuksia in vivo hiirissä, joihin on siirretty kasvainsoluja ja jotka on käsitelty CLN:ien ja DLN:ien eri jäsenillä, joita on viljelty 20 ng/cm3: ssa hiiren rekombinantti-IL-7:ää, verrattuna 15 CLN:iin ja DLN:iin, joita on viljelty ainoastaan kasvatusalustassa. Parasta kasvaimia vastustavaa hoidollista aktiivisuutta osoittivat IL-7:n kanssa inkuboidut DLNt. Täydellinen kasvainregressio tapahtui hiirillä, jotka saivat joko 3 x 106 tai 6 x 106 DLN-solua, joita oli aikaisem-20 min inkuboitu 20 ng/cm3:11a hiiren IL-7:ää.

Kuvio 3 esittää keskimääräisen kasvainkoon vertailua useita päiviä sen jälkeen, kun kasvainsoluja oli injektoitu C3H-hiiriin, joita oli käsitelty myös useilla kon- ' ' sentraatioilla 10 ng/cm3:ssa IL-7:ää viljeltyjä CLN:iä ja . 25 DLN:iä verrattuna CLN:iin ja DLN:iin, joita oli viljelty • · · ·*·,· ainoastaan kasvatusalustassa. Nämä tiedot valaisevat stimu- • .·**. loitujen sytotoksisten T-lymfosyyttien suhteellisia kasvai- '··· mia tuhoavia ominaisuuksia. Täydellinen kasvainkoon regres- • · sio tapahtui vain, kun hiiriin injektoitiin 6 x 106 DLN-’ 30 solua, joita oli aikaisemmin inkuboitu 10 ng/cm :11a IL- 7 :ää.

·«· • · *···’ Kuvio 4 kuvaa keskimääräisen kasvainkoon vertailua • i i in vivo useita päiviä kasvainsolujen siirtämisen DLN-so-luilla, joita oli viljelty 2,5 ng/cm3 IL-7:ää sisältävässä * < « .··. 35 kasvatusalustassa, verrattuna soluihin, joita oli viljelty < « i « i « II» • « · # I ·

~ IM

I · « ·

• K

9 105045 kasvatusalustassa ilman IL-7:ää. Paras hoidollinen vaikutus havaittiin DLN:illä, joita oli inkuboitu IL-7:n kanssa.

Kuviot 5-14 kuvaavat tietoja kokeesta, jossa C3H-hiirien kuivaavien imusolmukkeiden soluja (DLN) saatiin 5 C3H-hiiristä, joihin oli kahdeksan päivää aikaisemmin injektoitu 2 x 106 elävää 1024-kasvainsolua (kuhunkin hiireen) . DLN-soluja viljeltiin ex vivo kasvatusalustassa, joka sisälsi joko IL-2:ta, IL-7:ää tai IL-2:n ja IL-7:n yhdistelmää. Kontrolli-imusolmukkeiden (CLN) vastaavat vil-io jelmät, jotka saatiin kasvaimelle altistumattomista C3H-hiiristä, muodostettiin ja niitä inkuboitiin ex vivo pelkästään kasvatusalustassa tai kasvatusalustassa, joka sisälsi joko IL-2:ta tai IL-2:n ja IL-7:n yhdistelmää. Kun solupopulaatiot olivat olleet neljä päivää viljelmässä, 15 niiden in vitro kasvaimia vastustava sytolyyttinen aktiivisuus määritettiin 51Cr-vapautusanalyysillä ja in vivo kasvaimia vastustava aktiivisuus mittaamalla yksittäisen massan kasvainregressio. Tästä kokeesta saadut tiedot ovat esillä kuvioissa 5-14.

20 Kuvio 5 kuvaa DLN- ja CLN-soluryhmien hajotusaktii visuutta, kun soluja viljeltiin ilman sytokiinia tai 2 ng/cm3:ssa IL-2:ta. Nämä tiedot osoittavat, että DLNrillä on suurempi hajotusaktiivisuus CLN:iin nähden ja että ',;/ IL-2:n kanssa inkuboiduilla DLNrillä oli tämän ryhmän paras r 25 hajotusaktiivisuus.

···

Kuvio 6 vertailee C3H-hiiriin injektoidun 1024-kas- • · .***. vaimen keskimääräistä kasvainkokoa. Hiiret saivat vaihte- • · • · * leviä hoidollisia konsentraatioita CLNriä tai DLNriä, joita • · oli aikaisemmin inkuboitu 2 ng/cm3:n kanssa IL-2:ta tai il- • * * ' 30 man sytokiinia. Nämä tiedot osoittavat, että DLN-soluilla on suurempi kasvaimia vastustava aktiivisuus kuin • · ’···* CLN-soluilla. IL-2:n läsnäolo DLN-solujen kasvatusalustassa i i * ei merkittävästi lisännyt DLN-solujen kasvaimia vastustavaa aktiivisuutta.

( · ."·. 35 Kuvio 7 esittää DLNrien ja CLNrien hajotusaktiivi- t·' suuden, kun soluja inkuboitiin joko 2 ng/cm3:lla IL-7:ää * · * • » « · « » 10 105045 tai yhdistelmällä 2 ng/cm3:aa IL-2:ta ja 10 ng/cm1 2:aa IL-7:ää. Nämä tiedot osoittavat, että 2 ng/cm3:ssa IL-7:ää inkuboitujen DLN:ien hajotusaktiivisuus on suurempi kuin ilman lisättyjä sytokiineja viljeltyjen DNL:ien.

5 Kuvio 8 kuvaa eri solujen in vivo kasvaimia vastus tavan aktiivisuuden vertailua, kun soluja on inkuboitu IL-7:llä tai IL-2:n ja IL-7:n yhdistelmällä. Keskimääräistä kasvainkokoa vertailtiin useita päiviä kasvainsolujen siirtämisen jälkeen. Nämä tiedot valaisevat sitä, että IL-7:n 10 kanssa inkuboidut DLNt osoittivat suurempaa kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta verrattuna DLN:iin, joita inkuboitiin ilman lisättyjä sytokiineja, tai CLNriin, joita inkuboitiin IL-7:n tai IL-2:n ja IL-7:n yhdistelmän kanssa.

Kuvio 9 vertaa joko ilman sytokiinia tai IL-7:n 15 läsnä ollessa konsentraatiossa 10 ng/cm3 inkuboitujen DLN:ien ja CLN:ien hajotusaktiivisuutta. IL-7:llä inkuboidut DLNt osoittivat suurempaa hajotusaktiivisuutta tässä . in vitro -mallissa.

Kuvio 10 vertaa ilman sytokiinia tai 10 ng/cm1 :ssa 20 IL-7:ää inkuboitujen DLN:ien ja CLN:ien in vivo kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta. Suurimman kasvaimia tuhoavan aktiivisuuden täydelliseen paranemiseen asti osoittivat 6 x 103 DLN-solua, jotka injektoitiin C3H-hiiriin sen jälkeen, kun DLN:iä oli inkuboitu neljä päivää 10 ng/cm3:ssa 25 IL-7:ää.

• M

Kuvio 11 kuvaa tietoja, jotka vertaavat ilman syto- • · .···. kiinien läsnäoloa tai 20 ng/cm :ssa IL-7:ää tai • · .VI. 2 ng/cm3:ssa IL-2:ta ja 10 ng/cm3:ssa IL-7:ää inkuboitujen i « *,,* DLNrien ja CLN:ien in vitro hajotusaktiivisuutta. Suurinta I I « '·' 30 hajotusaktiivisuutta osoittivat IL-7:n korkeamman konsen- traation läsnä ollessa inkuboidut DLNt.

• · ·

Kuvio 12 esittää in vivo tietoja, jotka vertaavat • · f .

joko ilman sytokiinia tai 20 ng/cm :ssa IL-7:ää inkuboitu- .·. : neiden DLNrien ja CLNrien kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta.

« · · /··. 35 Suurin kasvaimia tuhoava aktiivisuus saatiin DLN:illä, joi- • · ta oli inkuboitu IL-7:n kanssa.

tM ♦ · · « « « · · 2 « · • · 3 « « « 11 105045

Kuvio 13 osoittaa in vitro hajotusaktiivisuuden olevan suurempi DLNrillä, joita on inkuboitu 2 ng/cm3:lla IL-2:ta ja 10 ng/cm3:lla IL-7:ää.

Kuvio 14 esittää tietoja, jotka vertaavat eri 5 DLNrien ja CLN:ien in vivo kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta. DLNrillä, joita inkuboitiin IL-2:n ja IL-7:n läsnä ollessa, oli paras kasvaimia vastustava aktiivisuus.

Kuviot 15 - 18 kuvaavat tietoja kokeesta, jossa verrattiin pitkäaikaisviljelmän olosuhteissa, joihin kuului 10 sytokiinilisäys, pidettyjen DLN:ien ja CLNrien in vivo kasvaimia vastustavaa aktiivisuutta ja in vitro hajotusaktiivisuutta. Soluja ei olisi voitu pitää pitkäaikaisvil-jelmän olosuhteissa ilman sytokiinilisäystä, koska imusolut kuolevat toinen toisensa jälkeen noin viikossa ilman syto-15 kiinin lisäystä kasvatusalustaan. Pitkäaikaisviljelmät saattavat lisäksi sisältää säteilytettyjä spesifisiä kas-vainsoluja (BIO.5-soluja säteilytettiin 2 000 radin gammasäteilyllä) .

Kuvio 15 kuvaa DLN:ien ja CLNrien in vivo kasvaimia 20 vastustavia aktiivisuuksia. Nämä tiedot osoittavat, että vain spesifinen kasvain (BIO.5), ei ei-ristireaktiivinen kasvain (BIO.2), voidaan poistaa aikaisemmin spesifiselle (BIO.5) kasvaimelle altistuneiden DLNrien lyhytaikaisilla viljelmillä.

25 Kuvio 16 esittää DLN-solujen pitkäaikaisviljelmien • · · ·*..· (viisi viikkoa) , joissa on osoitettua sytokiinia, in vitro • · ,···, hajotusaktiivisuuden. Spesifinen hajotusaktiivisuus esi- tettiin spesifisiä BIO. 5-kasvainsoluja vasten paremminkin « · kuin epäspesifisiä BIO.2-kasvainsoluja vasten.

* » · * 30 Kuvio 17 esittää pitkäaikaisviljelmän olosuhteissa, osoitetun sytokiinin kanssa pidettyjen DLN-solujen vir- • · taussytometrisen analyysin. DLN-soluista, joita pidettiin • « · IL-7:n kanssa, tuli pääasiassa CD8-positiivisten T-solujen .·. : populaatio.

« · .···, 35 Kuvio 18 esittää pitkäaikaisviljelmän olosuhteissa, « « osoitetun sytokiinin kanssa pidettyjen DLNrien in vivo kas- » « « ( « · « «M • « • • 12 105045 vaimienvastustustiedot. DLN-solut, joita viljeltiin pitkän aikaa IL-7:ää sisältävässä kasvatusalustassa olivat immuu-nihoidollisesti tehokkaita spesifisen (BIO.5) kasvainal-tistuksen poistamisessa, mutta eivät epäspesifisen (BIO.2) 5 kasvainaltistuksen poistamisessa.

Kuvio 19 esittää valokuvat saman hiiren DLN-soluis-ta yhdeksän viikon jälkeen vastaavassa viljelmässä. Kuvio 19a kuvaa hiiren IL-7:n kanssa kasvaneita DLN-soluja, kuvio 19b esittää hiiren IL-7:n ja hiiren IL-2:n kanssa kas-10 vaneita soluja ja kuvio 19c esittää vain IL-2:n kanssa kasvaneita soluja. Solut eivät selviäisi viljelmässä, johon ei ole lisätty sytokiinia, yhdeksää viikkoa, joka ajankohta on esitetty kolmessa valokuvassa.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 15 Tämä keksintö koskee menetelmää nisäkkään aktivoi tujen sytolyyttisten T-lymfosyyttien populaation muodostamiseksi, kun kyseisillä lymfosyyteilla on spesifistä antigeeniä ilmentävien solujen hajotusaktiivisuus, jossa menetelmässä saatetaan aikaisemmin spesifiselle antigeenille 20 altistunut T-solupopulaatio kosketukseen biologisesti tehokkaan määrän kanssa IL-7-polypeptidiä tai sen johdannaista. Edullisesti nisäkkään sytotoksiset T-lymfosyytit ovat ihmisen soluja ja ne saadaan perifeerisestä kuivaavasta imusolmukkeesta, joka kuivaa kasvainpaikkaa, kuten kiinteä 25 kasvain, tai kuivaa virusinfektoitunutta paikkaa. Kuivaavan ·♦· ;*·.· imusolmukkeen solut sisältävät aikaisemmin spesifiselle an- • · .··*. tigeenille altistuneiden T-lymfosyyttisolujen populaation.

··· ··.·. Spesifistä antigeeniä ilmentävät kasvainsolut tai virusin- • * *..I fektoidut solut tai virus.

• · · • · · * 30 Nisäkkään sytotoksisten T-lymfosyyttien populaatio tarvitsee aikaisempaa altistusta spesifiselle antigeenille, • * *···* jota virus, virusinfektoidut nisäkässolut tai kasvainsolut M* ·...' ilmentävät. Kuivaava imusolmuke myötävirtaan (veren- .’· : kierrolla tai imunesteen virtaamisella) kasvaimen kasvu- • · .···. 35 paikasta tai virusinfektiopaikasta sisältää DLN-soluja (kuivaava imusolmuke). DLN-solut aktivoidaan ex vivo kek- • · · • · · · * · « * • * • · · 13 105045 sinnön menetelmällä. Syngeeniset CLN-solut (kontrolli-imusolmuke) ilman aikaisempaa altistusta spesifiselle antigeenille ovat vähemmän tehokkaita keksinnön menetelmän mukaisen ex vivo aktivaation jälkeen IL-7-polypeptidillä tai 5 sen johdannaisella. CLN-solut voivat toimia kokeellisena kontrollina soluille, jotka eivät ole aikaisemmin altistuneet spesifiselle antigeenille.

Spesifiselle antigeenille aikaisemmin altistuneet nisäkkään sytolyyttiset T-lymfosyytit saadaan edullisesti 10 kuivaavasta imusolmukkeesta. On myös mahdollista saada perifeerisiä verilymfosyytteja, jotka ovat altistuneet spesifiselle antigeenille. Tässä yhteydessä mitä tahansa aikaisemmin spesifiselle antigeenille altistunutta nisäkkään T-lymfosyyttia riippumatta siitä, mistä tai miten se on 15 saatu, pidetään aikaisemmin spesifiselle antigeenille altistuneena DLN-soluna. DLN-solut saadaan jakautumaan ex vivo viljelmässä inkuboimalla niitä kasvatusalustassa, joka sisältää biologisesti tehokkaan määrän IL-7-polypeptidiä tai sen johdannaista. Kasvatusalusta voi lisäksi sisältää 20 noin 3 ng/cm3:aa IL-2-polypeptidiä tai sen johdannaista ja/tai populaation mitoottisesti inaktivoituja spesifisiä kasvainsoluja, jotka ilmentävät spesifistä antigeeniä. Kas-vainsolut voidaan inaktivoida mitoottisesti esimerkiksi sä-teilyttämällä vähintään noin 500 radin gammasäteilyllä, 25 edullisesti noin 2 000 radin gammasäteilyllä. Muut säteily-määrät ja -muodot voivat myös tehokkaasti inaktivoida kas- • · .*··. vainsolut mitoottisesti niin, että niistä tulee kykenemät- # · i tömiä solujakautumiseen, mutta ovat vielä metabolisesti ak- t · tiivisia. Toinen keino mitoottisesti inaktivoida spesifiset • · i * 30 kasvainsolut on käsitellä ne kemiallisella aineella, kuten mitomysiini C:llä.

• · ’···’ Kasvatusalusta sisältää IL-7-polypeptidin tai sen • · · johdannaisen. IL-7 voidaan tuottaa millä tahansa tarkoi- .’.f| tuksenmukaisella menetelmällä, esimerkiksi ekspressiolla * · .. 35 nisäkässolulinjassa tai prokaryootissa, kuten alalla tun- « · '·' netut menetelmät kuvaavat. Il-7-polypeptidin tai sen joh- * * * • · * « i · a a · * · « · « a « 14 105045 dannaisen pitäisi olla konspesifinen tarkoittaen sitä, että sillä on aminohapposekvenssi olennaisilta osiltaan samanlainen kuin aktivoidut DLN-solut vastaanottavan tietyn lajin IL-7-polypeptideillä. Tämä tarkoittaa sitä, että ihmi-5 sen käyttöön IL-7-polypeptidilla tai muulla sytokiinilla pitäisi olla olennaisilta osiltaan ihmisen sekvenssi, jotta minimoidaan sytokiinin tunnistaminen vieraaksi aineeksi.

Ihmisen ja hiiren IL-7:ien aminohapposekvenssit on esitetty taulukoissa 1 ja 2 alla: 10 Taulukko 1: Ihmisen IL-7 ASP CYS ASP ILE GLU 5 GLY LYS ASP GLY LYS GLN TYR GLU SER VAL LEU MET VAL SER ILE 20 ASP GLN LEU LEU ASP SER MET LYS GLU ILE GLY SER ASN CYS LEU 35 ASN ASN GLU PHE ASN PHE PHE LYS ARG HIS ILE CYS ASP ALA ASN 50 LYS GLU GLY MET PHE LEU PHE ARG ALA ALA ARG LYS LEU ARG GLN 65 15 PHE LEU LYS MET ASN SER THR GLY ASP PHE ASP LEU HIS LEU LEU 80 LYS VAL SER GLU GLY THR THR ILE LEU LEU ASN CYS THR GLY GLN 95 VAL LYS GLY ARG LYS PRO ALA ALA LEU GLY GLU ALA GLN PRO THR 110 LYS SER LEU GLU GLU ASN LYS SER LEU LYS GLU GLN LYS LYS LEU 125 ASN ASP LEU CYS PHE LEU LYS ARG LEU LEU GLN GLU ILE LYS THR 140 CYS TRP ASN LYS ILE LEU MET GLY THR LYS GLU HIS 152 20 Taulukko 2: Hiiren IL-7 GLU CYS HIS ILE LYS 5 ASP LYS GLU GLY LYS ALA TYR GLU SER VAL LEU MET ILE SER ILE 20 ASP GLU LEU ASP LYS MET THR GLY THR ASP SER ASN CYS PRO ASN 35 , ASN GLU PRO ASN PHE PHE ARG LYS HIS VAL CYS ASP ASP THR LYS 50 GLU ALA ALA PHE LEU ASN ARG ALA ALA ARG LYS LEU LYS GLN PHE 65 25 LEU LYS MET ASN ILE SER GLU GLU PHE ASN VAL HIS LEU LEU THR 80 ...1 VAL SER GLN GLY THR GLN THR LEU VAL ASN CYS THR SER LYS GLU 95 : GLU LYS ASN VAL LYS GLU GLN LYS LYS ASN ASP ALA CYS PHE LEU 110 '· “· LYS ARG LEU LEU ARG GLU ILE LYS THR CYS TRP ASN LYS ILE LEU 125 :***: LYS GLY SER ILE 129 ·*· • · · • · · « · , . »

Erilaisia edellä mainittujen polypeptidien biologi- 30 sesti aktiivisia johdannaisia tai vastaavia yhdisteitä voidaan myös käyttää tämän keksinnön menetelmässä. Kuten tässä ··« on käytetty, konspesifinen IL-7 tai sen johdannaiset kuulu- • · · ·,,/ vat polypeptideihin, joilla on huomattava aminohappo- « : sekvenssihomologia tämän tietyn nisäkäslajin luontaisen IL- .···, 35 7-polypeptidin kanssa ja olennaisilta osiltaan vastaava • · biologinen aktiivisuus. Esimerkiksi konspesifisellä ihmisen · · i » * • · · " rii * · • ·

I t I

15 105045 IL-7-polypeptidillä tai polypeptijohdannaisella on aminohapposekvenssi olennaisilta osiltaan samanlainen kuin ihmisen luontaisella IL-7-polypeptidillä niin, että saajan immuunijärjestelmä ei pitäisi tunnistaa sitä vieraaksi ai-5 neeksi. Olennaisilta osiltaan vastaava biologinen aktiivisuus tarkoittaa samanlaisia tuloksia standardibio-analyyseissä ja analyyseissä, joissa mitataan IL-7-resep-torin sitoutumisaffiniteettia. IL-7-johdannaisiin kuuluvat lisäksi monet ei-polypeptidiyhdisteet, jotka osoittavat IL-10 7:n biologista aktiivisuutta. Näihin yhdisteisiin kuuluvat IL-7-reseptorivaikuttajat. IL-7-reseptori on kuvattu viitteessä Goodwin et ai., Cell 60:941 1990.

IL-7-polypeptidit tuotetaan edullisesti rekombi-nantti-DNA-tekniikoilla. Rekombinantti-DNA-ekspressiojär-15 jestelmässä laitetaan konspesifistä IL-7-polypeptidiä tai sen polypeptidijohdannaista, jolla on IL-7:n biologinen aktiivisuus, koodaava klooni ekspressiovektoriin. Ekspres-siovektori laitetaan isäntäsoluun. Isäntäsolun proteiini-synteesi järjestelmä syntetisoi rekombinantti-IL-7-polypep-20 tidiä.

Rekombinanttiekspressiovektoreihin kuuluvat synteettiset tai cDNA:sta saadut DNA-fragmentit, jotka koo-daavat IL-7-polypeptidejä tai sen biologisesti aktiivisia ; *'; johdannaisia. IL-7-polypeptidiä tai sen johdannaista koo- t i 25 daava DNA on toimintakelpoisesti kytkeytyneenä sopivaan

«M

: transkription tai translaation säätely- tai rakennenukleo- • · I··. tidisekvenssiin, kuten nisäkkään, mikrobin, viruksen tai m · .Γϋ hyönteisen geeneistä saatuun. Esimerkkejä säätelysekvens- • ' · seistä ovat geneettinen sekvenssi, jolla on säätelytehtävä • · · *·’ " 30 geeniekspressiossa (esim. transkriptiopromoottorit tai -enhanserit), optionaalinen operaattorisekvenssi trans- t ·· ·,„· kription kontrolloimiseksi, sekvenssi, joka koodaa sopivia . i r f mRNA:n ribosomaalisia sitoutumispaikkoja ja tarkoituksen- ; mukaiset sekvenssit, jotka kontrolloivat transkription ja « · » 35 translaation alkamista ja loppumista. Nukleotidit ovat toi- S « mintakelpoisesti kytkeytyneenä silloin, kun säätelysek- i i · « · I · ' • I * I * • · • i · 16 105045 venssi liittyy toiminnallisesti rakennegeeniin. Esimerkiksi DNA-sekvenssi signaalipeptidiä (sekretoorinen johtaja-sekvenssi) varten voi olla toimintakelpoisesti kytkeytyneenä rakennegeeni-DNA-sekvenssiin IL-7-polypeptidiä tai 5 sen johdannaista varten, jos signaalipeptidi ekspressoidaan prekursoriaminohapposekvenssinä, joka ottaa osaa IL-7-poly-peptidin erittämiseen. Lisäksi promoottorinukleotidisek-venssi on toimintakelpoisesti kytkeytyneenä koodaavaan sekvenssiin (esim. rakennegeeni-DNA) , jos promoottorinukleoti-10 disekvenssi kontrolloi rakennegeenin nukleotidisekvenssin transkriptiota. Lisäksi vielä ribosomin sitoutumispaikka voi olla toimintakelpoisesti kytkeytyneenä rakennegeenin nukleotidia koodaavaan sekvenssiin (esim. IL-7-polypepti-di) , jos ribosomin sitoutumispaikka sijaitsee vektorissa 15 translaation edistämiseksi.

Sopivia isäntäsoluja konspesifisten IL-7-polypepti-dien tai niiden johdannaisten ekspressiota varten ovat mm. prokaryootit, hiiva tai korkeammat eukaryoottisolut tarkoituksenmukaisten promoottoreiden kontrolloimina. Prokaryoot-20 teihin kuuluvat Gram-negatiiviset ja Gram-positiiviset organismit, kuten E. coli tai basillit. Sopivia prokary-oottisia isäntäsoluja transformaatiota varten ovat esimer- ; iti : kiksi E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ja monet muut lajit suvuissa Pseudomonas, Streptomyces ja ' · “ 25 Staphylococcus. Korkeampiin eukaryoottisiin soluihin kuu- • · · luvat perustetut nisäkäslähtökohtaiset solulinjat, kuten « · · • *.· jäljempänä on kuvattu. Soluvapaita translaatiojärjestelmiä :T: voitaisiin myös käyttää nisäkkään konspesifisten IL-7-po- lypeptidien ja niiden johdannaisten tuottamiseksi käyttäen 30 RNArita, jotka on saatu tässä esiintuoduista DNA-konstruk- ·«· .···. teista. Tarkoituksenmukaiset kloonaus- ja ekspressiovek- • · ** torit käytettäväksi bakteeri-, sieni-, hiiva- ja nisäkässo- tl* luisäntien kanssa on kuvattu esimerkiksi viitteessä Pouwels :,,t: et ai., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New .·!. 35 York, 1985.

C I I * I ( I r · « I a 17 105045

Kun IL-7-polypeptidiä tai sen johdannaista ekspres-soidaan hiivaisäntäsolussa, nukleotidisekvenssi (esim. ra-kennegeeni), joka koodaa IL-7-polypeptidin tai sen johdannaisen ekspressiota, saattaa sisältää johtajasekvenssin.

5 Johtajasekvenssi mahdollistaa tulkitun polypeptidin parem man ekstrasellulaarisen erityksen hiivaisäntäsolulla.

Vaihtoehtoisesti prokaryoottisessa isäntäsolussa, kuten E. coli, IL-7-polypeptidi tai sen johdannainen saattaa sisältää N-loppuisen metioniinitähteen rekombinantti-10 polypeptidin ekspression helpottamiseksi prokaryoottisessa isäntäsolussa. N-loppuinen Met voidaan lohkaista ekspres-soidusta rekombinantti-IL-7-polypeptidistä tai sen johdannaisesta. Lisäksi prokaryoottisia isäntäsoluja voidaan käyttää sellaisten IL-7-polypeptidien tai niiden johdan-15 naisten ekspressioon, jotka vaadi ekstensiivistä prote- olyyttistä käsittelyä ja disulfidikäsittelyä.

Rekombinanttiekspressiovektorit, jotka sisältävät rekombinantti-IL-7:n rakennegeenin nukleotidisekvenssin tai sen johdannaisen, transfektoidaan tai muutetaan sopivan 20 isäntämikro-organismin tai nisäkässolulinjan lähes homo geeniseksi viljelmäksi. Esimerkkejä sopivista isäntäso-luista ovat bakteerit, kuten E. coli, hiiva, kuten S. cere-;;; visiae, tai nisäkkään solulinja, kuten kiinalaisen hamste- rin munasarjan solut (CHO) .

25 Muutetut isäntäsolut ovat soluja, jotka on muutettu ··# tai transfektoitu IL-7:n tai sen johdannaisen rakennegeenin < · · : \· nukleotidisekvensseillä. Ekspressoidut IL-7-polypeptidit sijoitetaan isäntäsoluun ja/tai eritetään viljelmäsuperna- 9 tanttiin riippuen isäntäsolun luonteesta ja isäntäsoluun .··*. 30 insertoidun geenin rakenteesta.

.'···. Prokaryoottisiin isäntäsoluihin transfektoidut eks- *!* pressiovektorit käsittävät yleensä yhden tai useamman fe- f c r.'·: notyyppisen valittavissa olevan markkerin. Fenotyyppinen I t f !tfi! valittavissa oleva markkeri on esimerkiksi geeni, joka koo- 35 daa antibioottiresistanssin antavia tai autotrofisen tar- i..< peen tyydyttäviä proteiineja, ja isännän tunnistama repii- I « 1 18 105045 kaation alku amplifikaation tunnistamiseksi isännässä. Muita hyödyllisiä ekspressiovektoreita prokaryoottisille isän-täsoluille ovat kaupallisesti saatavilla olevista plasmi-deista saatu bakteerista lähtöisin oleva valikoitavissa 5 oleva markkeri. Tämä valikoitavissa oleva markkeri voi käsittää kloonausvektorin pBR322 (ATCC 37017) geneettiset elementit. pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasykliini-resistanssin geenit ja antaa näin käyttöön yksinkertaiset keinot muutettujen solujen tunnistamiseksi. pBR322:n 10 "selkäranka"-jaksot ovat liittyneenä tarkoituksenmukaiseen promoottoriin ja IL-7:n rakennegeenisekvenssiin. Muihin kaupallisiin vektoreihin kuuluvat esimerkiksi pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) ja pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA).

15 Promoottorisekvenssejä käytetään tavallisesti re- kombinantin prokaryootti-isäntäsolun ekspressiovektoreihin. Tavallisia promoottorisekvenssejä ovat mm. β-laktamaasi (penisillinaasi), laktoosipromoottorijärjestelmä (Chang et ai., Nature 275:615, 1978 ja Goeddel et ai., Nature 20 251:544, 1979), tryptofaani(trp)promoottorijärjestelmä (Goeddel et ai., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980 ja EPÄ 36,776) ja tac-promoottori (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 412, ' 1982). Erittäin käyttökelpoinen prokaryootti-isäntäsolun

I I

W 25 ekspressiojärjestelmä käyttää faagi PL-promoottoria ja

• · I

cl857ts termolabiilia repressorisekvenssiä. American Type I ' I Culture Collectionista saatavilla olevat plasmidivektorit, :*·*: jotka käsittävät PL-promoottorin johdannaiset, sisältävät plasmidin pHUB2 (E. coli -kannassa JMB9 (ATCC 37092) oleva) ,···. 30 ja pPLc28:n (E. coli -kannassa RR1 (ATCC 53082) oleva).

.*··. Konspesifiset nisäkkään IL-7-polypeptidit ja joh- • · dannaispolypeptidit voidaan ekspressoida hiivaisäntäsoluis-sa, edullisesti Saccharomyces-suvun soluissa (esim. S. ce-:<it: revisiae) . Muitakin hiivasukuja, kuten Pichiaa tai Kluyve- 35 romycestä, voidaan käyttää. Hiivavektorit sisältävät usein 4 4 replikaatiosekvenssin alun 2μ-1ιϋν3ρΐ33ΐτυ^Ϊ3ίθ, autono- 4 · 4 · · 19 105045 misesti replikoituvan sekvenssin (ARS), promoottorialueen, sekvenssit polyadenylaatiota varten ja sekvenssit transkription päätöstä varten. Edullisesti hiivavektorit sisältävät replikaatiosekvenssin alun ja valikoitavissa 5 olevan markkerin. Sopivia promoottorisekvenssejä hiivavek-toreille ovat mm. metallitioniinin, 3-fosfoglyseraatti-kinaasin (Hintzeman et ai., J. Biol. Chem. 255:2013, 1980) ja muiden glykolyyttisten entsyymien (Hess et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968 ja Holland et ai., Biochem.

10 17:4900, 1978), kuten enolaasin, glyseraldehydi-3-fosfaat- tidehydrogenaasin, heksokinaasin, pyruvaattidekarboksy-laasin, fosfofruktokinaasin, glukoosi-6-fosfaatti-isome-raasin, 3-fosfoglyseraattimutaasin, pyruvaattikinaasin, triosefosfaatti-isomeraasin, fosfoglukoosi-isomeraasin ja 15 glukokinaasin promoottorit. Muita sopivia vektoreita ja promoottoreita käytettäväksi hiivaekspressiossa on kuvattu lisää viitteessä Hitzeman, EP-A-73 657.

Hiivavektorit voidaan koota esimerkiksi käyttäen DNA-sekvenssejä pBR322:sta selektioon ja replikaatioon E.

20 colissa (Ampr-geeni ja replikaation alku). Muita hiivan DNA-sekvenssejä, jotka voidaan sisällyttää hiivaekspressio-rakenteeseen, ovat mm. glukoosi-repressiivinen ADH2- promoottori ja α-tekijän sekretoorinen johtajasekvenssi. ADH2-promoottori on kuvattu viitteissä Russell et ai., J. Biol.

25 Chem. 258:2674, 1982 ja Beier et ai., Nature 300:724, 1982.

• · ·

Hiivan α-tekijän johtajasekvenssi ohjaa heterologisten po-lypeptidien eritystä, α-tekijän johtajasekvenssi lisätään usein promoottorisekvenssin ja rakennegeenisekvenssin vä- • liin. Katso esim. Kurjan et ai., Cell 30:933, 1982 ja Bit- .··. 30 ter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:5330, 1984. Joh- • · tajasekvenssiä voidaan modifioida lähellä sen 3'-päätä si- 9 · sältämään yhden tai useamman restriktiopaikan. Tämä käsit- I c tää johtavasekvenssin fuusion rakennegeeniin.

i i i

Ammatti-ihmiset tuntevat hiivan transformaatiopro-35 tokollat. Yksi sellainen protokolla on kuvattu viitteessä Hinnen et ai., Proc, Natl. Acad. Sei. USA 75:1929, 1978.

»i 9 9

< I

4 11 20 105045

Hinnen et ai. -protokolla valikoi trp+-transformantteja selektiivisellä alustalla, kun selektiivinen alusta koostuu 0,67 % hiivan typpialustaa, 0,5 % casaminohappoja, 2 % glukoosia, 10 μg/cm3 adeniinia ja 20 μς/οιη3 urasiilia.

5 Hiivaisäntäsoluja, jotka on transformoitu ADH2-pro- moottorisekvenssin sisältävillä vektoreilla, voidaan kasvattaa ekspression indusoimiseksi "rikkaassa" alustassa. Yksi esimerkki rikkaasta alustasta koostuu 1 %:sta hii-vauutetta, 2 %:sta peptonia ja 1 %:sta glukoosia, johon on 10 lisätty 80 μg/cm3 adeniinia ja 80 μg/cm3 urasiilia. ADH2-promoottorin derepressio tapahtuu, kun glukoosi on käytetty loppuun alustasta.

Nisäkäs- tai hyönteisisäntäsoluviljelmäjärjestelmiä voidaan myös käyttää rekombinantti-IL-7-polypeptidin tai 15 sen johdannaisten ekspressoimiseen. Esimerkkejä sopivista nisäkäsisäntäsolulinjoista ovat apinan munuaissolujen COS-7-linjat (Gluzman Cell 23:175, 1981), L-solut, C127-solut, 3T3-solut, kiinalaisen hamsterin munasarjan (CHO) solut, HeLa-solut ja BHK-solulinjat. Sopivat nisäk-20 kään ekspressiovektorit sisältävät ei-kopioitavia elementtejä, kuten replikaation alun, promoottorisekvenssin, ra-kennegeeniin liittyneen enhanserin, muita 5':n tai 3':n ^ viereisiä ei-kopioitavia sekvenssejä, kuten ribosomin si- toutumispaikat, polyadenylaatiopaikka, silmukkadonorin ja -25 akseptorin paikat ja transkription päätössekvenssit.

Ml „.· Transkription ja translaation kontrollisekvenssit • · : ; '1 nisäkäsisäntäsolun ekspressiovektoreissa voidaan saada vi- ruslähteistä. Esimerkiksi tavallisesti käytetyt nisäkäs- solun promoottorisekvenssit ja enhanserisekvenssit saadaan ···. 30 polyoomasta, adenovirus 2:sta, ihmisapinavirus 40:stä ,···. (SV40) ja ihmisen sytomegaloviruksesta. SV40-viruksen ge- • · *t* nomista saatuja DNA-sekvenssejä, esimerkiksi SV40-lähtöis- t · tä, aikaista ja myöhäistä promoottoria, enhanseria, sil-:,.,1 mukkaa ja polyadenylaatiopaikkoja voidaan käyttää nisäkäs- 35 isäntäsolun rakennegeenisekvenssin ekspressioon vaadittujen « < i muiden geneettisten elementtien aikaansaamiseksi. Viruksen I · 21 105045 aikaiset ja myöhäiset promoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska molempia saadaan helposti viruksen genomista fragmenttina, joka saattaa sisältää myös viruksen replikaation alkukohdan (Fiers et ai., Nature 273:113, 5 1978) . Pienempiä tai suurempia SV40-fragmentteja voidaan myös käyttää edellyttäen, että SV40-viruksen replikaatio-paikan alkukohdassa sijaitseva 250 ep:n sekvenssi, joka ulottuu Hind III -paikasta Bgl I -paikkaa kohden, sisältyy niihin.

10 Lisäksi konspesifisiä nisäkkään genomin IL-7-pro- moottori-, kontrolli- ja/tai signaalisekvenssejä voidaan käyttää hyväksi edellyttäen, että sellaiset kontrollisek-venssit ovat yhteensopivia valitun isäntäsolun kanssa. Esi-merkkivektorit voidaan rakentaa, kuten on tuotu esiin viit-15 teessä Okayama ja Berg, Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983.

IL-2-polypeptidit ja niiden polypeptidijohdannaiset ja IL-4-polypeptidit ja niiden polypeptidijohdannaiset voidaan valmistaa paljolti samalla tavalla kuin on tässä kuvattu IL-7-polypeptidien kohdalla. Lisäksi IL-2-johdan-20 naiset sisältävät ei-polypeptidisiä yhdisteitä, jotka voivat toimia kuten IL-2-reseptorivaikuttajat. IL-2-reseptori on kuvattu esimerkiksi EP-patenttihakemuksessa A-0 162 699,

4 I I

joka on julkaistu 23. syyskuuta, 1988.

Nisäkkään DLN- tai CLN-solut eivät selviä in vitro · i i · '· 25 soluviljelmässä yli 7-10 päivää normaaleissa viljel- • · · ·...· mäolosuhteissa. IL-7-polypeptidin tai sen johdannaisen li- • t · • *.· sääminen kasvatusalustaan mahdollistaa solujen pitkän ajan ;*! ϊ selviytymisen ja kasvun reilusti yli 10 päivän samoissa tai samankaltaisissa olosuhteissa. Lisäksi edelleen kons-30 pesifisen IL-2-polypeptidin tai sen johdannaisen tai IL-4- .··· .···. polypeptidin tai sen johdannaisen lisääminen ei vähennä • · • IL-7:n solujen selviytymistä pidentäviä vaikutuksia. Hiiren ' ' IL-2:n lisääminen hiiren DLN-viljelmiin pidensi solujen pitkän ajan selviytymistä, mutta solut näyttivät olevan 35 sairaalloisia ja visuaalisesti kasautuneita, kun niitä tut-kittiin mikroskoopilla. Lisäksi DLN-solut, joita inkuboi- 22 105045 tiin ex vivo vain IL-2:n kanssa pitkiä aikoja, eivät osoittaneet merkittävää CTL- tai LAK-aktiivisuutta vastakohtana DLN-soluille, joita pidettiin pitkäaikaisviljelmässä, jossa oli vähintään IL-7:ää lisättynä sytokiininä. Lisäksi mi-5 toottisesti inaktivoitujen kasvainsolujen populaation lisääminen ei myöskään vaikuta haitallisesti DLN-solujen selviytymiseen viljelmässä IL-7-polypeptidin läsnä ollessa. Itse asiassa DLNt soluviljelmässä ovat usein sytolyyttisiä lisätyille kasvainsoluille, jotka ilmentävät spesifistä an-10 tigeeniä, ja olemme havainneet, että mitoottisesti inaktivoitujen spesifisten kasvainsolujen lisääminen edistää DLN-solujen selviytymistä viljelmässä indusoimalla viljeltyjen DLN-solujen proliferaatiota.

Jakautuneilla nisäkkään sytolyyttisillä T-lymfosyy-15 teillä on hajotusominaisuus soluille (esim. kasvainsolut), jotka ilmentävät spesifistä antigeeniä. Sytolyyttiset T-solut saadaan kuivaavista imusolmukkeista tai muista lähteistä (esim. periferinen veri tai perna), jotka ovat aikaisemmin altistuneet spesifiselle antigeenille. Ex vivo -20 altistamisen jälkeen kasvatusalustalle, joka sisältää IL-7-polypeptidin tai sen johdannaisen, sytolyyttisistä T-so-luista tulee aktivoituneita ja ne säilyttävät spesifistä « « * ;;; antigeeniä ilmentävien kohdesolujen hajotusominaisuutensa.

« · : IL-7:n tai sen johdannaisen läsnä ollessa kasvatusalustassa

« « I

'1 25 inkuboitujen aktivoituneiden ja jakautuneiden CTL-solujen «·· ·...· hajotusaktiivisuus on merkittävästi suurempi kuin samojen 4 « · • solujen aktiivisuus, kun niitä on inkuboitu kasvatusalus- tässä IL-2-polypeptidin kanssa. IL-7:n läsnä ollessa inku- boidut CLN-solut ilmentävät CD8+ LAK -aktiivisuutta. Kui- .·*·. 30 tenkin spesifinen antigeeni -ohjatut T-solut ovat edulli- ··· ,···. siä. IL-7-polypeptidin läsnä ollessa inkuboitujen sellais- • · *t* ten solujen pitkäaikaisvil jelmät ilmentävät minimi- t f LAK(lymfikiini-aktivoitu tappaja)-aktiivisuutta ja pää-

4 C C

asiallisesti spesifistä antigeeniä ilmentäville kohde- i 35 soluille (esim. kasvainsolut, virusinfektoidut solut tai 1.·, virukset) spesifistä CTL-aktiivisuutta. NK-solujen kuin

4 I

23 105045 myös CD8-positiivisten lymfosyyttien välittämä LAK-aktii-visuus on tunnusomaista IL-2-aktivaatiolle, ja se on IL-2-aktivoitujen lymfosyyttien pääasiallinen aktiivisuus. IL-7-aktivoiduilla sytolyyttisillä T-soluilla on pääasiallisesti 5 CTL-aktiivisuutta, jolle on ominaista kohdesolujen, kuten kasvainsolujen, antigeenispesifisyys. CTL-aktiivisuutta edistetään edelleen IL-2-polypeptidin tai sen johdannaisten ja/tai IL-4-polypeptidin tai sen johdannaisten lisäämisellä kasvatusalustaan. Kuitenkin in vivo hoidollinen tehokkuus io lisääntyy minimaalisesti (esim. 2x), kun lisätään vielä IL-2:ta ja/tai IL-4:ää. Lisäksi vielä mitoottisesti inaktivoi-tujen spesifisten kasvainsolujen lisääminen antaa käyttöön spesifisen antigeenin lähteen viljelmässä olevien sytolyyt-tisten T-lymfosyyttien jakautumisen auttamiseksi. Tämä voi 15 vielä lisätä viljelmässä olevien DLN-solujen CTL-aktiivi suutta .

Syngeenisiä periferisiä imusoluja (esim. DLN-solu-ja) saadaan yksilöstä sen jälkeen, kun imusoluilla on ollut mahdollisuus olla alttiina spesifiselle antigeenille. Sel-20 laisia soluja voidaan saada esimerkiksi kuivaavasta imusolmukkeesta, kuten imusolmukkeesta, joka kuivaa kasvainta tai , virusinfektoitua paikkaa. Perifeerisiä imusoluja voidaan

I I I

'saada esimerkiksi imemällä tai poistamalla kuivaava imusol-muke, minkä jälkeen tehdään dissektio. Imusolut kuivaavasta 4 r 25 imusolmukkeesta voidaan laittaa imusolujen yksisolususpen- • · t sioon mekaanisilla keinoilla, kuten siivilällä. Solut voi-

4 I

| daan lajitella solulajittelijassa ei-toivottujen fibroplasia’: tien poistamiseksi ja laittaa ne sitten kasvatusalustaan, joka sisältää IL-7-polypeptidin tai sen johdannaisen.

,···, 30 Kuivaavasta imusolmukkeesta saadut solut sisältävät t · ,'···. usein T-solujen populaation, joka on aikaisemmin altistunut I · *!' spesifiselle antigeenille. Standardikasvatusalusta (esim.

t I

r,v: RPMI 1640, ImM natriumpyruvaattia, 2 mM glutamiinia, 0,1 mM

4*4 — t(i' ei-välttämättömiä aminohappoja, 50 U/cm penisilliiniä, 50 35 U/cm3 streptomysiiniä, 10 % sikiövasikan seerumia ja 5 x 10"5 M 2-merkaptoetanolia) lisätään soluihin. Toinen esi- 14 1 24 105045 merkki standardikasvatusalustasta on minimikasvualusta. Viljelmäolosuhteet ovat solun selviytymiselle ja prolife-raatiolle optimaaliset, kuten kostuttavassa inkubaatto-rissa, 6 % CC^ssa ilmanpaineessa noin 37 °C:n lämpö- 5 tilassa.

IL-7-polypeptidi tai sen johdannainen, jolla on IL-7:n biologinen aktiivisuus, lisätään kasvatusalustaan. Lisätyn IL-7-polypeptidin määrä on riittävä indusoimaan CTL-aktiivisuuden viljellyissä imusoluissa. Edullisesti 10 kasvatusalustaan annostellun ihmisen IL-7:n määrä on noin 2,5 ng/cm3 - noin 20 ng/cm3. Edullisimmin annosteltavan IL-7-polypeptidin määrä on noin 10 ng/cm3. Muita yhdisteitä voidaan lisätä kasvatusalustaan edistämään solujen selviytymistä viljelmässä ja lisä-CTL-aktiivisuuden aktivoimisek-15 si. Kasvatusalustaan lisättävien IL-7-johdannaisten määrä : riippuu johdannaisen spesifisestä aktiivisuudesta. Esimer kiksi johdannaista, joka on likimäärin yhtä tehokas kuin luontainen ihmisen IL-7, lisätään samassa konsentraatiossa painon mukaan. Muita yhdisteitä ovat mm. konspesifinen IL-20 2-polypeptidi tai sen johdannainen ja/tai konspesifinen IL- 4-polypeptidi tai sen johdannainen ja/tai populaatio mi-toottisesti inaktivoituja kasvainsoluja, joilla on spesifinen antigeeni. Lisätyn sytokiinin edulliset viljelmäkon-sentraatiot ovat noin 0,5 - noin 20 ng/cm3 IL-2:lle ja noin j 25 1 - noin 20 ng/cm3 IL-4:lle.

• f ·

Konspesifinen IL-2-polypeptidi tai sen johdannainen « · · j on mikä tahansa polypeptidi tai muu orgaaninen molekyyli, joka ilmentää IL-2:n biologista aktiivisuutta. IL-2:n bio-logiselle aktiivisuudelle on tunnusomaista kyky sitoutua .·**. 30 lajille ominaiseen IL-2-reseptoripolypeptidiin. IL-2:n bio- .···. loginen aktiivisuus voidaan mitata myös stimuloimalla CTLL- • · tai HT2-solujen proliferaatiota in vitro. Sekä CTLL-että C r :.r<: HT2-solulinjat ovat selviytymisen kannalta riippuvaisia IL- 2-aktiivisuuden läsnäolosta alustassa.

i 35 Mitoottisesti inaktivoitujen kasvainsolujen popu- laatiossa soluilla on sama spesifinen antigeeni, joka ai- I « < « · 25 105045 kaisemmin altistettiin lymfosyyteille. Mitoottinen inakti-vointi tarkoittaa, että kasvainsolut saattavat olla elossa (toisin sanoen ne kykenevät solumetaboliaan ja hengitykseen) , mutta ovat suurin piirtein kykenemättömiä soluja-5 kautumiseen ja pesäkkeiden kasvattamiseen. Siten mitootti-sesti inaktivoidut kasvainsolut antavat käyttöön spesifisen antigeenin lähteen kasvatusalustaan ilman kykyä vallata ja peittää sytolyyttisiä T-lymfosyyttejä ja muita viljelmän solutyyppejä.

10 Solut, joita on kasvatettu tässä kuvatuissa viljel- mäolosuhteissa, kykenevät selviytymään merkittävästi pidemmän aikaa silloin, kun kasvatusalustassa on IL-7-poly-peptidiä tai sen johdannaista, kuin ilman lisättyä IL-7:n biologista aktiivisuutta. Kasvatetut imusolmukesolut tai T-15 lymfosyytit pystyvät selviytymään in vitro enintään 7-10 päivää optirniviljelmäolosuhteissa ilman lisättyä IL-7:n biologista aktiivisuutta. Samat solut ovat toisaalta kykeneväisiä vähintään 18 viikon jatkuvaan kasvatukseen IL-7:n biologisen aktiivisuuden läsnä ollessa. Kuvaan 19 pai-20 netut valokuvat esittävät mikrovalokuvia yhdeksän viikkoa vanhoista hiiren DLNrien viljelmistä, joita on kasvatettu hiiren IL-2:n, hiiren IL-7:n tai hiiren IL-2:n ja hiiren IL-7:n yhdistelmän läsnä ollessa. Vain solut, joita on vil-'’ jelty IL-7:n läsnä ollessa (yhdessä tai ilman IL-2:ta) säi- 25 lyivät aktiivisina, niillä oli enemmän valejalkoja vil- ··· jelmän alustaan kiinnittymistä varten ja ne säilyttivät « · •enemmän spesifistä (toisin sanoen antigeenispesifistä) sy-tolyyttistä aktiivisuutta. Solut, joita viljeltiin joko ilman IL-2:n tai IL-7:n lisäystä, eivät selviytyneet eikä .··*. 30 niitä voitu tutkia.

• · ;»·· ,···. Populaatio soluja, jotka saatiin kuivaavasta imu- • f *** solmukkeesta ja jotka ex vivo -viljeltyinä osoittivat

« I

V*: CTL-aktiivisuutta, tunnistettiin CD8-positiivisilla T-so- 4 * 4 :,,,· luilla kohdistettuina soluihin, joilla on spesifinen anti- 35 geeni, ja epäspesifisellä LAK-aktiivisuuden (jota välittää f ,··, epäspesifinen hajotusaktiivisuus) suhteellisella puutteel- • · • · 26 105045 la, joka aktiivisuus tunnistetaan NK-soluilla. CTL-aktii-visuutta ajatellaan välittävän antigeenispesifiset syto-lyyttiset T-solut, jotka ilmentävät hajotusaktiivisuutta ainoastaan niitä soluja kohtaan, jotka ilmentävät spesi-5 fistä antigeeniä. CTL-aktiivisuus on halutumpi hajotusaktiivisuuden muoto kuin LAK-aktiivisuus, koska se on kohde-solu- tai antigeenispesifinen. Siten immuunihoidolla soluilla, joilla on CTL-aktiivisuus, on vähemmän sivuvaikutuksia kuin vastaavalla hajotusaktiivisuudella soluilla, 10 joilla on epäspesifinen LAK-aktiivisuus.

Aktivoidut, viljellyt T-imusolut, joita on viljelty biologisesti tehokkaan määrän läsnä ollessa IL-7-polypep-tidiä tai sen biologisesti aktiivista johdannaista, annetaan yksilölle immuunihoidon muodossa. Tietty sytokiini tai 15 sytokiinit, joita on käytetty CTL-aktiivisuuden aktivoimiseen ex vivo soluissa (esim. IL-7 ja mahdollisesti IL-4 ja/tai IL-2), voidaan antaa yhdessä solujen kanssa. Edulliset sytokiinien päivittäisannokset ovat noin 10 - noin 2 000 μg/kg/päivä IL-2:lie, noin 4 - noin 1 000 μg/kg/päivä 20 IL-4:lle ja IL-7:lle. Edullisimmin IL-2:n päivittäisannos annetaan joka päivä kolmena eri annoksena ja IL-4 ja IL-7 annetaan kahdesti päivässä (bid).

Imusolut vaativat aktivaation viljelmässä IL-7-po-'' lypeptidin tai sen johdannaisen läsnä ollessa vähintään 25 neljän päivän ajan. Solujen aktivoitu populaatio annetaan • · · laskimonsisäisellä infuusiolla yksilöön tai injektoimalla • · * | suoraan kasvainpaikkaan. Solujen aktivoitu populaatio voi- daan antaa yhtä hyvin muilla hyväksyttävillä antamiskei-noilla.

.···. 30 Spesifistä antigeeniä ilmentävät solut ovat CTL-ak- • * tiivisuuden kohde. Spesifinen antigeeni voi olla esimer- • « ’*/ kiksi kasvainantigeeni, jota ilmentää kasvainsolujen spe- V'i sifinen populaatio, tai virusantigeeni, jota ilmentää vi-

4 ( I

;iit! ruksella infektoituneiden isäntäsolu j en populaatio. Esi- 35 merkkejä tunnetuista kasvainantigeeneistä ovat Meth A, kas- lii vain A5 ja P815 kasvain A5 ja tunnettuja virusantigeeneja i ·

I I I

27 105045 ovat mm. flunssa-, lehmänrokko- ja lymfokoriomeningitis-virus. Spesifistä antigeeniä ilmentävistä soluista tulee kohdesolu aktivoitujen imusolujen CTL-aktiivisuudelle.

Seuraavien esimerkkien on tarkoitus valaista tämän 5 keksinnön eri näkökantoja.

Esimerkki 1 Tämä esimerkki valaisee niitä vaikutuksia, joita IL-7-polypeptidin sisällyttäminen DLNrien in vitro kasvatusalustaan saa aikaan. IL-7:n lisääminen kasvatusalustaan io edistää kasvaimia vastustavaa CTL-aktiivisuutta in vitro ja kasvaimia vastustavaa hoidollista tehokkuutta in vivo. C3H-hiiriin injektoitiin 3 x 106 1024-kasvainsolua. Kymmenen päivää myöhemmin kuivaavat imusolmukkeet (DLN) poistettiin kirurgisesti steriileissä olosuhteissa, dissosioitiin yksi-15 solususpensioon ja laitettiin kudosviljelmään. Rekombinant-ti ihmisen IL-7, kuten on kuvattu US-patentissa 4965195 ja jonka sisältö liitetään tähän viitteeksi, lisättiin kasvatusalustaan konsentraatioissa 0 (kontrolli); 2,5; 10 ja 20 ng/cm3. Vastaavat viljelmät C3H-hiiristä, jotka eivät ol-20 leet aikaisemmin altistuneet 1024-kasvaimelle, saatuja kontrolli-imusolmukesoluja (CLN) laitettiin samaan kasvatusalustaan.

f < f ';·*' Neljän päivän jälkeen viljelmässä, viljelmistä ana- ( r lysoitiin in vitro sytolyyttinen aktiivisuus. Sytolyyttinen

I I

.' · V 25 aktiivisuus määritettiin kuuden turmin 51Cr-vapautus- « · · !t(|! analyysillä, kuten on kuvattu viitteessä Lynch et ai., J.

;***; Immunol. 136:1521, 1986. CLN-solut, joita kasvatettiin il- man IL-7:ää, eivät osoittaneet kasvaimia vastustavaa syto- lyyttistä aktiivisuutta. CLN-solut, joita kasvatettiin 20 ,···. 30 ng/cm3:n kanssa IL-7:ää, osoitti vain "kohtuullista" syto- « lyyttistä aktiivisuutta, joka vastaa jäljelle jäänyttä, IL- • · **’ 7:n indusoimaa hiiren LAK-aktiivisuutta. DLN-solut, joita i i kasvatettiin yksistään alustassa, osoittivat kasvaimia vas-! ! tustavaa sytolyyttistä aktiivisuutta ilman kasvatusalustaan /;>, 35 lisättyä IL-7:ää. Kuitenkin sytolyyttinen aktiivisuus kas- i f i voi merkittävästi, kun kasvatusalustaan lisättiin IL-7:ää.

i i I

< « · 28 105045

Sytolyyttiset tiedot on esitetty kuviossa 1. Kuvio 1 vertaa sytolyyttisiä aktiivisuuksia (toisin sanoen prosentuaalista hajoamista) useilla vaikuttajasolu/kohdesolu-suhteilla CLN:ille, joita kasvatettiin ilman IL-7:ää, CLNrille, joita 5 kasvatettiin 20 ng/cm3:n kanssa IL-7:ää, DLN:ille, joita kasvatettiin ilman IL-7:ää, ja DLN:ille, joita kasvatettiin eri IL-7-konsentraatioiden kanssa. DLNt, joita kasvatettiin IL-7:n kanssa, osoittivat suurinta hajotusaktiivisuutta kaikilla vaikuttaja/kohde-suhteilla.

10 Kasvatettujen solujen in vivo -tehokkuus määritet tiin siirtämällä adoptiivisesti (laskimonsisäisellä injektiolla) asteittainen lukumäärä DLN-soluja (1 x 106, 3 x 106 tai 6 x 106 solua), joita oli kasvatettu yhdessä tai ilman IL-7:ää, C3H-hiiriryhmiin (neljä hiirtä ryhmässä). Hiiriä 15 oli aikaisemmin säteilytetty ei aivan kuolettavalla annoksella (500 radia) endogeenisen primaarin immuunivasteen syntymisen ehkäisemiseksi. Kontrollihiiret (säteilytetty 500 radilla) eivät saaneet joko ollenkaan soluja tai sitten 6 x 106 CLN-solua, joita oli kasvatettu neljä päivää kasva-20 tusalustassa 20 ng/cm3:n kanssa IL-7:ää tai ilman IL-7:ää. Hiiriin siirrettiin kaikissa käsittelyryhmissä intrader-maalisella injektiolla 5 x 105 eläviä 1024-kasvainsoluja. Kasvaimen kasvunopeudet määritettiin seuraavan 36 päivän jaksolla mittaamalla kasvaimen koko (mm2) .

< . 25 Kasvainaltistus kasvoi samoilla nopeuksilla sätei- **« lytetyissä hiirissä, jotka eivät saaneet ollenkaan soluja !***: tai jotka saivat 6 x 106 CLN-solua tai 6 x 106 CLN-solua, * jotka oli kasvatettu 20 ng/cm3:n kanssa IL-7:ää (kuvio 2).

Kasvaimen kasvamisnopeudet olivat merkittävästi pienempiä ,···, 30 hiirissä, jotka saivat joko 1 x 106, 3 x 106 tai 6 x 106 • · DLN-solua, jotka oli kasvatettu ilman IL-7:ää, mutta kas- 9 9 *Γ vainsoluja ei havaittu (kuvio 2). Hiirien, jotka saivat jo- ko 3 x 106 tai 6 x 106 DLN-solua, joita oli kasvatettu

III R

!<it! 20 ng/cm :ssa IL-7:ää, havaittiin torjuvan kasvainaltistus t««*, 35 kaikissa tapauksissa. Hiiret, jotka saivat 1 x 106 DLN-so- « · « lua, joita oli kasvatettu 20 ng/cm3:ssa IL-7:ää, kasvatti- • « • ·

III

105045 29 vat kasvainaltistusta samalla nopeudella kuin hiiret, jotka saivat 6 x 106 DLN-solua, joita oli kasvatettu yksistään alustassa. Nämä tiedot osoittavat, että DLN-solut, joita kasvatettiin IL-7:n kanssa, olivat hoidollisesti suunnil-5 leen kuusi kertaa tehokkaampia in vivo kuin samat DLN-solut, joita oli kasvatettu ilman IL-7:ää.

Kuviot 3 ja 4 osoittavat samankaltaisia kasvaimen kasvunopeushavaintoja, kun kasvatusalusta sisälsi 10 ng/cm3:aa ja 2,5 ng/cm3:aa IL-7:ää tässä järjestyksessä. 10 Nämä tiedot (kuviot 1-4) osoittavat, että kasvaimia vastustavan sytotoksisen T-lymfosyytti(CTL)aktiivisuuden hoidollinen tehokkuus kasvaa noin kuusinkertaisesti DLN-solu-jen ex vivo -kasvatuksella kasvatusalustassa, joka sisältää IL-7:ää, verrattuna DLN-soluviljelmiin yksistään alustassa. 15 IL-7-kasvatettujen DLN-solujen in vivo kasvaimia vastustavaa tehokkuutta ei voida lukea IL-7-indusoidun epäspesifisen LAK-aktiivisuuden ansioksi, koska hiiret, jotka saivat 20 ng/cm3:n kanssa IL-7:ää kasvatettuja CLN-soluja, kasvattivat kasvainaltistusta samanlaisella nopeudella kuin kont-20 rollihiiret, jotka saivat ilman IL-7:ää kasvatettuja CLN-soluja.

Esimerkki 2 !!) Tämä esimerkki valaisee niitä vaikutuksia, joita

I C

( IL-2-polypeptidin sisällyttäminen kasvatusalustaan yhdessä '; 25 IL-7-polypeptidin kanssa saa aikaan, kun sytolyyttisiä < · T-soluja kasvatetaan ex vivo. DLNt ja CLNt saatiin C3H-hii- i i t ί *.· ristä, kuten on kuvattu esimerkissä 1. DLN-solut oli ai- ,· ! tistettu kahdeksan päivää aikaisemmin 2 x 10 elävälle

1024-kasvainsolulle. DLN- ja CLN-solut dissosioitiin yksi-!'·'· 30 solususpensioon ja niitä kasvatettiin täydellisessä RPMI

r · · 1640 -alustassa. Kasvatusalustaan lisättiin jokin seuraa- : · i f· c vista (A) kontrollialusta ilman lisättyä sytokiinia, (B) 2 ng/cm3:aa IL-2:ta, (C) 20 ng/cm3:aa IL-7:ää, (D)

f t I

10 ng/cm3:aa IL-7:ää, (E) 2 ng/cm3:aa IL-7:ää tai (F) 35 2 ng/cm3;aa IL-2:ta ja 10 ng/cm3:aa IL-7:ää. Neljän päivän jälkeen viljelmässä soluosat jokaisesta viljelmästä analy-

IIC

30 105045 soitiin kasvaimia vastustavan sytolyyttisen aktiivisuuden suhteen kuuden tunnin 51Cr-vapautusanalyysillä, kuten on kuvattu esimerkissä 1.

Kuvio 5 osoittaa, että alustassa ilman sytokiinia 5 kasvatetuilla CLN-soluilla ei havaittu kasvaimia vastustavaa vaikuttajasoluaktiivisuutta ja että 2 ng/cm3:aa IL-2:ta sisältävässä alustassa kasvatetuilla CLN-soluilla havaittiin vähän LAK-aktiivisuutta. Kasvaimia vastustava CTL-ak-tiivisuus saatiin aikaan DLN-soluilla, joita oli kasvatettu 10 yksistään alustassa, ja tämä CTL-aktiivisuus lisääntyi merkittävästi, kun kasvatusalustaan lisättiin 2 ng/cm3:aa IL-2:ta (B) (kuvio 5).

Hoidollinen tehokkuus in vivo mitattiin mittaamalla 1024-kasvaimen koko samalla tavalla kuin esimerkissä 1. Ku-15 vio 6 osoittaa, että hiiret, jotka saivat viljelmässä ilman lisättyä sytokiinia kasvaneita CLN-soluja ja 2 ng/cm3:n kanssa IL-2:ta (B) kasvaneita CLN-soluja, kasvattivat kas-vainaltistusta samanlaisilla nopeuksilla kuin säteilytetyt kontrollihiiret, jotka eivät saaneet ollenkaan soluja. Ku-20 vio 6 valaisee lisäksi sitä, että tässä kokeessa kasvatettujen DLN-solujen hoidollinen tehokkuus oli häviävän pieni, koska 6 x 106 ilman sytokiinia kasvatettua DLN-solua kas-1 vatti kasvainta samalla nopeudella kuin kontrolliryhmät.

" I", Vastaanottajat, jotka saivat vähemmän kontrolli-DLN-soluja, ' '· 25 kasvattivat kasvainaltistusta samanlaisilla tai suuremmilla » · · nopeuksilla kuin mitä havaittiin kontrolliryhmillä. IL-2:n « i · ί (2 ng/cm3) kanssa kasvatetut DLN-solut kasvattivat kasvai- 4 · · V · naltistusta pienemmällä nopeudella kuin kontrolliryhmät (kuvio 6).

30 Kuviot 7, 9 ja 11 osoittavat, että DLN-soluilla, ( · · **. joita kasvatettiin alustassa, joka sisälsi joko 2, 10 tai ·· t· 20 ng/cm : aa IL-7:ää tässä järjestyksessä, oli selvästi « * suurempi kasvaimia vastustava sytolyyttinen aktiivisuus verrattuna yksistään alustassa kasvatettuihin DLN-soluihin. 35 DLN~solupopulaatioiden in vivo hoidollisen tehokkuuden (määritettynä kasvaimen kasvunopeuksilla hiirillä, jotka 31 105045 saivat titratun määrän vaikuttajasoluja) havaittiin lisääntyvän noin kuusinkertaisesti DLN-soluilla, joita kasvatettiin 2 ng/cm3:n kanssa IL-7:ää ja 10 ng/cm3:n kanssa IL-7:ää, ja noin 12-kertaisesti DLN-soluilla, joita kasvatet-5 tiin 20 ng/cm3:n kanssa IL-7:ää (katso kuvioita 8, 10 ja 12). CLN-solut, joita kasvatettiin 10 ng/cm3:ssa IL-7:ää ja 2 ng/cm3:ssa IL-2:ta, eivät välittäneet osoitettavissa olevaa hoidollista vaikutusta in vivo, mutta osoittivat merkittävää kasvaimia tuhoavaa LAK-aktiivisuutta in vitro 10 (kuvio 13). DLN-solut, joita kasvatettiin 10 ng/cm3:ssa IL-7:ää ja 2 ng/cm3:ssa IL-2:ta, osoittivat hoidollisen tehokkuuden 12-kertaista lisääntymistä verrattuna DLN-soluihin, joita kasvatettiin yksistään alustassa (kuvio 14).

Nämä tiedot osoittavat, että DLN-solupopulaatioista 15 neljän päivän ex vivo -kasvatusjakson aikana saadun kasvaimia vastustavan CTL-aktiivisuuden hoidollinen tehokkuus voidaan kohottaa noin 6 - noin 12-kertaiseksi kasvattamalla DLN-soluja kasvatusalustassa, joka sisältää joko IL-7:ää tai yhdistelmän pääasiallisesti IL-7:ää ja IL-2:ta. Kuiten-20 kin DLN-solut, joita kasvatettiin kasvatusalustassa IL-2:n kanssa ainoana lisättynä sytokiinina (toisin sanoen ilman IL-7:ää), olivat hoidollisesti vain marginaalisesti aktiivisempia in vivo. Lisääntynyt hoidollinen tehokkuus ei voi olla LAK-aktiivisuuden ansiota, koska joko 2 ng/cm3:ssa IL- ' ‘ 25 2: ta tai 10 ng/cm3:ssa IL-7:ää ja 2 ng/cm3:aa IL-2:ta kas- ' »· vatettujen CLN-solujen antaminen kasvatti kasvainaltistusta · ; ’.· samanlaisilla nopeuksilla kuin säteilytetyt kontrollihii- • ·· -'fi I ret, joita ei käsitelty soluilla tai jotka käsiteltiin il man sytokiinia kasvatetuilla CLN-soluilla.

’*· 30 Esimerkki 3

M

··. Tämä esimerkki valaisee pitkäaikaisviljelmän olo- • suhteissa pidettyjen DLN- ja CLN-solujen antamaa kasvaimia vastustavaa CTL-aktiivisuutta. B10-hiiriin injektoitiin I < f BIO.5-kasvainsoluja. DLN-solut saatiin yhdeksän päivää myö-35 hemmin. Vastaavat CLN-solut saatiin BlO-hiiristä, joita ei altistettu BIO.5-kasvainsoluille. Lymfosyyttisolut lai- I « « 105045 32 tettiin yksisolususpensioon ja niitä kasvatettiin neljä päivää täydellisessä RPMI 1640 -alustassa. Neljän päivän jälkeen viljelmäolosuhteissa ilman lisättyä sytokiinia DLN-solut siirrettiin erilaisiin viljelmäolosuhteisiin, joissa 5 oli lisättyä sytokiinia ja/tai mitoottisesti inaktivoituja kasvainsoluja, kuten on osoitettu. DLN-soluviljelmiä inku-boitiin mitoottisesti inaktivoitujen kasvainsolujen kanssa, mutta ilman lisättyä sytokiinia kasvainsolut valtasivat viljelmän. Päinvastoin DLN-soluviljelmät, joita inkuboitiin 10 sekä lisätyn IL-7:n ja mitoottisesti inaktivoitujen kasvainsolujen että mahdollisesti muiden sytokiinien kanssa, pysyivät DLN-soluviljelminä. In vivo kasvaimia vastustava tehokkuus määritettiin mittaamalla kasvainkoko samalla tavalla kuin esimerkeissä 1 ja 2 käyttäen spesifisiä BIO.5-15 kasvainsoluja ja ei-ristireaktiivisia BIO.2-kasvainsolu-linjoja.

Kuvio 15 osoittaa, että DLN-solut torjuivat BIO.5-kasvainsolut, mutta eivät BIO.2-kasvainaltistuksia. CLN-solut, kuten odotettua, eivät välittäneet kummankaan kas-20 vainsolulinjan torjumista.

Pitkäaikaiset DLN- ja CLN-viljelmät perustettiin B10-hiiristä saaduilla soluilla. Säteilytetyt (2 000 radia) !'! spesifiset BIO. 5-kasvainsolut lisättiin jokaiseen viljel- mään vastaaja:stimulaattori-suhteella 5:1. Kasvatusalustaan i''"' 25 ei joko ollut lisätty sytokiinia tai oli lisätty 5 ng/cm3:aa IL-2:ta, 10 ng/cm3:aa IL-7:ää tai 10 ng/cm3:aa IL- I i · i ’,· 7:ää ja 2 ng/cm3:aa IL-2:ta. Säteilytetyt kasvainsolut li- : sättiin jokaiseen DLN-viljelmään. Säteilymäärä (2 000 ra dia) ei ole tarpeeksi aiheuttamaan kasvainsolujen täy- '"· 30 dellistä mitoottista inhibitiota. Kasvainsolut valtasivat 1 > · ·*. täydellisesti DLN-viljelmän ilman lisättyä sytokiinia. Muut • · DLN-viljelmät, joihin oli lisätty jonkin muotoista sytokii-> '> nia, eliminoivat lisätyt kasvainsolut ja jatkoivat jakautu- mistä. DLN-viljelmät pidettiin samoissa sytokiini-35 konsentraatioissa, mutta ilman riittävää säteilytettyjen kasvainsolujen in vitro -stimulaatiota.

I 4 4 33 105045 DLN-viljelmiä, joihin oli lisätty sytokiinia, jatkettiin viisi viikkoa ja sitten niistä analysoitiin in vitro sytolyyttinen aktiivisuus. Kuvio 16 osoittaa, että kasvaimia vastustava spesifinen CTL-aktiivisuus määritettiin 5 kaikissa tapauksissa viiden viikon kasvatuksen jälkeen. Sy-tolyyttistä aktiivisuutta ei määritetty, kun oli siirretty epäspesifisiä BIO.2-kasvainsoluja. Näiden DLN-solupopu- laatioiden virtaussytometrinen analyysi (kuvio 17) paljasti niiden olevan pääasiassa CD8+ T -soluja. io Määritettiin, voivatko pitkäaikaisviljelmässä pide tyt DLN-solut välittää kasvaimen torjuntaa in vivo. Syn-geeniset B10-hiiret säteilytettiin 500 radilla. DLN-solujen (2 x 106 solua) pitkän ajan (viisi viikkoa) viljelmät annettiin i.v. säteilytetyille hiirille. Hiiriin siirrettiin 15 5 x 105 kasvainsolua, jotka annettiin ihonsisäisellä injek tiolla. Kasvaimen kasvu määritettiin mittaamalla kasvaimen koko. Joko BIO.5- (spesifisiä) tai BIO.2(epäspesifisiä)-kasvainsoluja käytettiin siirtoon. Vain DLN-solut, joita pidettiin kasvatusalustassa, jossa oli IL-7:ää, pystyivät 20 torjumaan spesifisen (toisin sanoen BIO.5) kasvain-altistuksen mutta ei epäspesifistä (toisin sanoen BIO.2) kasvainaltistusta (kuvio 18). Se, että kasvatusalustassa oli lisäksi IL-2:ta ei haitannut IL-7:n suotuisia vaiku-tuksia.

( ( '< 25 Nämä tiedot osoittavat, että hoidollisesti tehokas < » · kasvaimia vastustava CTL-aktiivisuus voidaan säilyttää pit- f < · • kiä ajanjaksoja (vähintään viisi viikkoa) ex vivo kas- vatusalustassa, joka sisältää joko yksistään IL-7:ää tai IL-7:ää yhdessä IL-2:n kanssa. Tärkein osatekijä näyttää ··. 30 olevan IL-7:n sisällyttäminen kasvatusalustaan, koska yk- • * ··. sistään IL-2:ta sisältävässä alustassa viljellyt DLN-solut ’* eivät tukeneet imusolujen kasvua riittävässä määrin, jotta Λ; niiden in vivo immuunihoidollinen tehokkuus olisi voitu analysoida.

r « r III

Claims (4)

1. Ex vivo menetelmä nisäkkään sytolyyttisten T-lymfosyyttien jakautuneen populaation muodostamiseksi, 5 joilla lymfosyyteillä on lyyttinen spesifisyys soluille, joissa on spesifinen antigeeni, tunnettu siitä, että saatetaan spesifiselle antigeenille aikaisemmin altistettu T-solupopulaatio kosketukseen kasvatusalustan kanssa, joka sisältää biologisesti tehokkaan määrän IL-7-10 polypeptidiä tai sen johdannaista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ex vivo menetelmä, tunnettu siitä, että kasvatusalusta sisältää lisäksi IL-2-polypeptidiä tai sen johdannaista.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ex vivo menetel-15 mä, tunnettu siitä, että IL-7-polypeptidin tai sen johdannaisen konsentraatio on noin 2,5 ng/cm3 - noin 20 ng/cm3.

3, 105045

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ex vivo menetelmä, tunnettu siitä, että kasvatusalusta sisältää 20 lisäksi tehokkaan määrän sytolyyttisesti stimuloivaa ainetta, joka on IL-2-polypeptidi tai sen johdannainen, IL-4-po- ,·. lypeptidi tai sen johdannainen, mitoottisesti inaktivoitu • * spesifinen kasvainsolu tai näiden yhdistelmä. t * · * · • · i « • · · · ► · • · · >1 · I · • · • · · • · * » · I · « ' · < < . «f I I I I < < 35 1 0 5 0 4 5