CN1113517A - 转录因子aprf - Google Patents

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Abstract

哺乳动物转录因子APRF，制备它的方法，编码 所述产物的DNA，含所述DNA的复制和表达载 体，用所述复制和表达载体转化或转染的宿主细胞， 寻找APRF功能抑制药剂的确定和筛选方法以及抗 所述APRF功能的抑制药剂。本发明的肽可用于补 充或抑制APRF的功能，筛选抗APRF功能的抑制 药剂。以本发明的所述产物为活性成分的抑制剂也 可用于治疗与细胞激活素即IL-6有关的疾病，即炎 症疾病。

Description

本发明涉及新的转录因子，急性期反应因子（下文缩写为APRF），编码它的DNA，寻找抗APRF功能的抑制剂的测定和筛选方法以及抗所述APRF功能的抑制剂。
更具体地说，本发明涉及与细胞中白细胞介素6（下文缩写为IL-6）的信号传递有关的转录因子APRF，及其制备方法，编码它的DNA，含所述DNA的复制和表达载体，用所述复制和表达载体转化或转染的宿主细胞，寻找抗APRF功能的抑制剂的测定和筛选方法以及抗所述APRF功能的抑制剂。
生物信号传递物通过将生物活性物质刺激的信号传递到细胞中，从而介导细胞应答。狭义上讲，生物信号传递物是指一种物质，它从生物活性物质的受体收到信号并调节细胞核内的基因表达。在所述的生物信号传递物质中，与核DNA结合并调节基因表达的蛋白质被称为转录因子。在本发明中，称这些因子为转录因子。
通常转录因子本身是蛋白质。转录因子具有从一级生物活性媒介物到细胞，将信息（信号）传递给核内DNA的功能，并具有在转录阶段，调节二级蛋白质表达的功能。即当第一生物活性物质作用于细胞并表达第二蛋白质时，转录因子在细胞内起作用。通过所述转录因子的转录包括提高（加速）表达和降低（限制）表达。在本发明中，通过第一蛋白质的作用调节其表达的第二蛋白质被称为可诱导蛋白质，该蛋白质的相应基因被称为可诱导基因。例如，由IL-6诱导的蛋白质，如结合珠蛋白被称为IL-6诱导蛋白，而所述蛋白质的基因如结合珠蛋白基因被称为IL-6诱导的基因。
由IL-6促进其表达的蛋白质实例有上述的结合珠蛋白，hemopequisin，C-反应蛋白，α2-巨球蛋白，α1-酸性糖蛋白，以及已知的在炎症的急性期明显出现的那些蛋白质。相反，血清白蛋白是由IL-6抑制其表达的一种蛋白质实例。
转录物质与可诱导基因DNA的特定序列结合，然后调节所述可诱导基因的表达。通常，由转录因子结合的DNA序列位于启动子区附近。可诱导基因的上游。由转录因子结合的DNA序列与转录因子的种类有内在一致性。在文献1（Montminy，M，Science 261，1694（1993））中描述了近期的转录因子研究。
迄今，已知NF-IL-6是与IL-6的细胞内信号传递有关的转录因子（参见文献2：Akira，S等人，EMBO，J.9，1897（1990），文献3：Poli，V.等人，Cell，63，643（1990），文献4：Kinoshita，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89，1473（1992）等）。
然而，在上述文献中，还没有关于转录物质直接从IL-6受体将转录信号传递给IL-6诱导基因的描述。另一方面，已知序列：CTGGGA位于该IL-6可诱导基因的上游。因此，在文献5（Wegenka，U.M.等人，Mol.Cell Biol.，13，276，1993）中提供了某些由IL-6激活并结合所述序列的物质，但在该文献中，尽管提出了所述蛋白质因子的存在，但未弄清所述因子的序列、结构、物理或化学特性如分子量。在该文献中，未公开转录因子APRF这种物质本身。
转录物质存在于细胞内，并且当生物活性物质（第一蛋白质）与上文描述的细胞受体结合后，通常它通过被磷酸化，移到核内并与适当DNA序列结合，而调节可诱导基因的转录。因此，可以影响所述转录物质的作用如抑制的物质，可被作为与上述生物活性物质有关的疾病的治疗药剂。
从上述角度看，本发明人的目的在于与炎症等疾病有关的IL-6。本发明人分离并纯化了APRF并确定了部分氨基酸序列，克隆了所述基因，确定了作为转录因子的APRF的全部核苷酸序列和推测的全部氨基酸序列，并首次得到作为物质的APRF本身。
本发明人继续研究并建立了利用APRF确定和寻找可用于治疗由IL-6诱导的疾病（如炎症疾病，白血病，癌，由活化的破骨细胞诱发的骨破折，肺动脉高压等）的物质的方法。而且本发明人还得到了所述抑制剂。本发明是以这些知识为基础完成的。
本发明提供实质上纯化的哺乳动物转录因子APRF。
实质上纯化的形式指，例如对于SEQ ID NO 1或5所述多肽的情况下，在制品中的多肽，其中制品中90%以上，如95%，98%，或99%的多肽是SEQ ID NO.1或5的多肽。
上述本发明的APRF具有新的一级氨基酸序列。当用计算机将本发明多肽的氨基酸序列与Swiss Prot（Swiss Prot Release 2.0）数据库中的所有已知序列进行比较时，没有具有等同于本发明的多肽的氨基酸序列的多肽。此外，当用计算机与Gen Bank（Gen Bank Release 70.0）数据库中的所有已知序列进行比较时，也没有编码等同于本发明多肽的核苷酸序列。
本发明APRF的详细描述如下：可以用下文描述的具体方法完成有关APRF的分离、纯化、部分氨基酸序列的确定，CDNA的克隆，全部氨基酸序列的确定。该方法综述如下。
即给小鼠施用IL-6，并在施用15分钟后将其杀死。从肝中提取核蛋白部分。用固定有具下列序列的DNA寡聚物的柱纯化提取物：CCTTCCGGAATTC
然后在聚丙烯酰胺凝胶上电泳纯化。
用赖氨酰内肽酶水解纯化的产物。用高效液体色谱分离由此得到的消化产物并分离各个峰。用自动氨基酸序列分析仪从N-末端开始确定上述得到的肽片段的氨基酸序列。
根据上述确定的部分氨基酸序列合成相应的DNA寡聚物。用DNA寡聚物从哺乳动物肝或胎盘的CDNA文库中分离APRF的CDNA。从APRF的CDNA序列确定APRF蛋白质的氨基酸序列。
在本发明中，哺乳动物的实例是人、小鼠、大鼠等。虽然在相同的种中，但根据生产的组织或细胞也可以产生其中有某些氨基酸被取代，缺失或插入的APRF。本发明也包括上述亚类APRF。
本发明包括作为一个实施方案的人APRF。本发明具体包括具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽、其同系物，其片段。
本发明提供了编码上述人APRF的DNA。本发明还提供具有SEQ ID NO.2和3所示核苷酸序列的DNA可与所述DNA和其片段杂交的DNA。
特别是，根据发明有提供
（1）具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽，
（2）编码上述（1）多肽的DNA，
（3）具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA，和
（4）具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的DNA，
为实施方案。
本发明包括作为实施方案的小鼠APRF。具体地说，本发明包括具有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的多肽，其同系物和其片段。
此外，本发明还提供编码所述小鼠APRF多肽的DNA。具体地说，提供分别具有SEQ ID NO.6或7所示核苷酸序列的DNA，可与所述核苷酸和其片段杂交的DNA。
特别是，根据本发明提供
（5）包括SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的多肽
（6）编码上述（5）多肽的DNA
（7）具有SEQ ID NO.6所示核苷醇序列的DNA，和
（8）具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的DNA，为实施方案。
在本发明说明书中，具有SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的（1）和（5）中所述多肽，不仅包括具有SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的多肽（天然成熟蛋白质），也包括在其N-或C-末端增加了适当的不同的氨基酸或少于20%的SEQ ID NO.1或5所示全部氨基酸的氨基酸序列，优选的是少于5%的氨基酸序列的多肽，以及包括下文所述的其同系物和片段的衍生物（其中改变（缺失，其他氨基酸序列的取代，加入其他氨基酸序列，插入等）了与功能无关的氨基酸或氨基酸序列），假设它们具有等同的生物和药物学特性。
SEQ ID NO.1或5的多肽同系物一般是一个大于至少有100，优选的至少150，例如200，250或300个连续氨基酸的区域，且至少70%，优选的至少80或90%并最好至少95%同源于SEQ ID NO.1或5所示多肽。下文将称上述多肽同系物为本发明多肽。
此外，本发明的多肽片段至少是10，优选的至少15，例如20，25，30，40，50或60个氨基酸长，并也为下文所用术语“本发明多肽”所包括。
除具有SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的多肽外的多肽和本发明所述的其片段，具有等同于SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的多肽的生理学和药理学特性。因此，本发明不仅提供具有SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的多肽，而且提供具有等同生理学或药物学特性的同源多肽。
可以与SEQ ID NO.2，3，6或7所示DNA杂交的DNA有不只一个至少100，优选的至少150，例如200，250，或300个连续核苷酸序列的区域，且至少70%，优选的至少80或90%，而且最好至少95%同源于SEQ ID NO.2，3，6或7所示的DNA。下文称上述DNA同系物为本发明的DNA。
本发明的DNA片段指核苷酸部份含至少10，优选的15，如20，25，30或40个本发明DNA的核苷酸，并且上述片段等同于本发明的DNA。
本发明的DNA（在（2）或（6）中说明的）包括编码SEQ ID NO.1或5所示多肽的一组核苷酸序列。
正如熟知的，有一到六种密码子编码一种氨基酸（如，已知蛋氨酸（Met）是一种密码子。而亮氨酸（Leu）有六种密码子）。
可图示说明编码SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的代表性核苷酸序列，SEQ ID NO2，3，6或7所示的核苷酸序列。本发明的DNA包括选择随意密码子而不改变所编码的氨基酸序列的DNA。通过改变核苷酸序列，有可能提高多肽的产率。
（3）或（7）中说明的DNA分别是（2）或（6）所示DNA的实施方案，并且是天然形式的序列。
（4）和（8）所示的DNA表示（3）或（7）中定义的带非转译区的DNA序列。
可以用已知方法，如基因重组、化学合成法等制备本发明的DNA（包括其片段，下文中相同）。在下列实施例中详细说明制备方法。例如，可以按下列方法制备具有SEQ ID NO.3和7中所示核苷酸序列的DNA，即：
（ⅰ）从生产本发明多肽的细胞中分离mRNA，
（ⅱ）从由此得到的mRNA制备第一条链（单链RNA），
然后制备第二条链（双链DNA）（合成cDNA），
（ⅲ）将由此得到的CDNA插入适当的质粒载体中，
（ⅳ）用由此得到的重组DNA转化宿主细胞（制备cDNA文库）
（ⅴ）用杂交方法从cDNA文库分离含所需DNA的质粒，和
（ⅵ）确定所需的核苷酸序列。
详细地说，用哺乳动物，如人或大鼠，被认为表达APRF的组织：优选的，可以用肝，巨噬细胞，胎盘组织细胞或细胞系，按Okayama，H等人（在Methods in Enzymology，Vol.154，P3，（1987）中描述的）的方法，或用Chirgwin，J.M.等人（在Biochem.，18，5294（1979）描述的）的方法完成步骤（ⅰ）。
步骤（ⅱ），（ⅲ）和（ⅳ）是制备CDNA文库的系列步骤，并可按Gubler &Hoffman（Gene，Vol.25，PP263，1983）的方法，经轻微改动来完成。作为在步骤（ⅲ）中所用的质粒载体的实例，可以使用已知的许多在E.Coli菌株中发挥功能的载体（如pBR322）和在枯草芽孢杆菌中发挥功能的载体（如pUB110），和最好使用在E.coli中发挥功能的λ-ZAP Ⅱ等。在步骤（ⅳ）中，可以使用任何宿主细胞，最好用按Gene 96，23，（1990）中描述的方法制备的DH5感受态细胞。最近，可以从市场上得到各种动物组织的CDNA文库。例如，可以从Clontech买到小鼠肝λgt11的CDNA文库和人胎盘的CDNA文库。最好用市场上的所述CDNA文库。
可以用本身已知的方法，如噬菌斑杂交法，菌落杂交法（Gene，10，63（1980））完成步骤（Ⅴ）。其他动物的APRF DNA，其同系物，其片段可作为适当的探针。
步骤（ⅵ）本身是已知的，可以按双脱氧终止子法或Maxam-Gilbert的方法完成。
一旦确定了SEQ ID NO.2，3，6和7中所示的核苷酸序列，可用化学合成法，PCR法或利用本发明的DNA片段为探针的杂交法得到本发明的DNA。此外，将插入本发明的DNA的载体DNA转化到适当的宿主中，然后培养转化体，可以得到所需量的本发明DNA。
本发明的另一实施方案提供含本发明DNA的复制和表达载体。所述载体可以是带复制原点，以及选择性地含有表达所述DNA的启动子和启动子调节子的例如质粒，病毒或噬菌体载体。该载体可含一个或多个选择标记基因，如氨苄青霉素抗性基因。
本发明还提供由用于复制和表达本发明DNA的载体（包括含其开放阅读框架的DNA SEQ ID NO.2，3，6或7）转化或转染的宿主细胞。在转化中使用的宿主细胞可以是细菌、酵母、昆虫或哺乳动物的细胞。可用通常所用的各方法完成转化。
在有效表达的条件下培养所述转化体细胞可以表达（生产）和积累本发明的多肽（包括其片段下文中相同）。根据所用的宿主细胞，培养条件也是熟知的。利用所述多肽的物理、化学和生物学特性，可以用常规的分离方法分离并纯化所述转化体细胞生产并积累的细胞内或细胞外的所需多肽。因此，可以以工业规模制备本发明的多肽，即APRF。因而，本发明还提供用基因重组制备多肽APRF的方法。
可以通过
（1）从培养细胞中分离和纯化，
（2）化学合成，或
（3）基因重组
优选的，通过（3）中描述的用于工业化的方法制备本发明的多肽（如SEQ ID NO.1或5中所示的）。
更优选的用如下的表达系统（宿主-载体系统）用基因重组制备本发明的多肽。
例如，通过将编码蛋白质的DNA（如具有SEQ ID NO.2或6所示核苷酸序列的DNA）连接至适当启动子（如trp启动子，lac启动子，λPL启动子，T7启动子等）的下游，然后插入在E.coli菌株中发挥作用的载体（如pBR322，pUC18，pUC19等）之中以制备表达载体，从而完成在E.coli中的表达。
然后，可以在适当的培养基中培养用由此得到的表达载体转化的E.coli菌株（如E.coli DH1菌株E.coli JM 109菌株，E.coli HB101菌株）以得到所需的多肽。若利用细菌的信号肽，也可在外周胞质中产生所需的多肽。此外，也很容易生产与其他多肽的融合蛋白。
另外，通过将SEQ ID NO.3或7中所示的DNA插入适当载体（如反转录病毒载体，乳头瘤病毒载体，牛痘病毒载体，SV40载体等）中的适当启动子（如，SV40 启动子，LTR启动子，金属硫蛋白启动子等）的下游，以得到表达载体，用由此得到的表达载体转化适当的哺乳动物细胞（如猴COS-7细胞，中国仓鼠CHO细胞，小鼠L细胞等），然后在适宜的培养基中培养转化体以便在该培养基内得到所需的多肽，从而完成在哺乳动物细胞中的表达。
如上所述，通过在核内结合IL-6诱导基因的特定DNA部分，本发明的多肽，即转录因子APRF具有调节与细胞内信号传送有关的转录的功能。因此，APRF可用于如阐明由于IL-6的作用诱导的疾病病理，用于研究或研制用于治疗所述疾病的所述抑制剂。
利用本发明，可以完成寻找并确定抑制APRF作用的物质。本发明还提供用于寻找抑制APRF功能的物质的筛选方法。
APRF的功能包括其自身的磷酸化，传递到核内，与DNA结合。所述的抑制指对至少一种上述APRF功能的抑制。本发明人发现：APRF存在于特定细胞内，当IL-6作用于细胞时，通过磷酸化而被激活。已知当该因子被磷酸化后，转录因子进入核内，然后与特定的DNA序列结合。因此，通过抑制磷酸化阶段，或向核内的传递或APRF的自身表达阶段等，可达到抑制目的。
再者，本发明还提供含APRF功能抑制剂为活性成分的药剂。
上述活性成分包括，例如，具有含SEQ ID NO.1或5的氨基酸序列的多肽，其同系物，其片段，从所述多肽的同系物或片段免疫过的哺乳动物中得到的抗体，可结合APRF的核酸或其衍生物，APRF基因的反义核酸，含反义核酸的表达载体，可降解APRF的mRNA的核糖酶（ribozyme）
可以很容易地用常规方法，如根据APRF的氨基酸序列合成作为合适免疫原的肽或本发明施用该肽免疫动物来制备抑制APRF功能的APRF抗体。
上述得到的抗体是有用的APRF功能抑制剂，并且对于了解APRF本身在细胞或活体中的行为也是很重要的。可以按所述抗体的识别部分设计低分子的APRF抑制剂。本发明包括所述的低分子APRF抑制剂。
为了抑制APRF的功能，将APRF基因本身的反义核酸或用所述反义核酸转染的适当表达载体施用于细胞或活体。可以用所述的反义核酸或含所述反义链的表达载体作为本发明APRF功能抑制剂的活性成分。
另外，降解本发明APRF mRNA的核糖酶也抑制APRF的功能，因此，也可用核糖酶作为APRF功能抑制剂的活性成分。
可以用经基因重组方法部分修饰的APRF蛋白质或其衍生物互补或抑制APRF在细胞或活体内的功能。将经基因重组方法部分修饰的APRF基因或其基因衍生物施用于细胞或活体可达到相同的目的。
本发明还提供含抑制本发明APRF功能的抑制剂的抑制药剂。可以以使其在细胞或活体内发挥功能的适当剂型（施用形式）施用所述的抑制药剂。例如，可将该药剂制成脂质体等，在其表面进行适当的修饰以使活性成分被直接摄入核内，也可根据剂型从适当的途径施用。
通过使用本发明的抑制剂，找到了治疗由IL-6诱导的疾病的新方法。
APRF是本发明人最新分离并测定的一种与IL-6的细胞内信号传送有关的蛋白质。另一方面，在某些情况下，一种特定的转录因子还涉及其他生物活性物质的信号传递。因此，APRF的抑制作用不仅可用于IL-6诱导的疾病，也可用于由其他生物活性物质诱发的疾病，其中APRF介导信号传递。本发明人独立发现实际上，APRF的磷酸化作用是由除IL-6外的其他细胞激活素，如制瘤素M，白血病抑制因子，白细胞介素11，睫状神经营养因子等诱导的。也可用本发明有的APRF功能抑制药剂治疗由所述细胞激活素诱导的疾病。
实施例
下列实施例详细具体地说明但不限制本发明。
实施例1：APRF的分离
从施用人IL-6并在施用后15分钟杀死的小鼠肝的核提取物中分离APRF。
（1）分离核提取物
用稍微改动的Wegenka，U.M.等人（Mol.Cell. Biol.，13，276（1993））的方法制备核提取物。
给小鼠静脉内施用人IL-6（5μg/小鼠），并在施用15分钟后杀死。立即将小鼠肝免疫接种到含1mM原钒酸盐的冰冷HANKS溶液中。然后用在冰上发动机驱动的Teflonglass均浆器、经20个循环将匀浆缓冲液中的肝匀浆，所述匀浆缓冲液含10mMHEPES（PH7.6），0.5mM亚精胺，0.15mM精胺，25mM KCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM二硫苏糖醇（DTT），1mM苯基甲基磺基氟化物（PMSF），10%含0.3M蔗糖的甘油（每个肝3ml）。
匀浆前加入抑肽酶（10μg/ml），亮肽素（2μg/ml），胃蛋白酶抑制素（2μg/ml）和1mM原钒酸盐。将核置于含2M蔗糖的均浆缓冲液中匀浆后，用一个SW28  rotor（Hitachi）以27，000rpm在4℃离心30分钟分离核。
除去上清液后，将来自10个肝的核重悬于含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的1mM核提取缓冲液（50mM Tris（PH7.8），420mMKcl，5mM Mgcl2，0.1mM EDTA，2mM DTT，0.5mM PMSF）中。在4℃缓慢搅动30分钟后，用SW28 rotor以27，000rpm将混合物离心30分钟，然后使上清液在含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的透析缓冲液（20mM HEPES.（PH7.8），50mMKCl，12.5mM Mgcl2，1mM EDTA，1mM DTT，1mM PMSF，0.1 Nonidet P-40（BDH Laboratory），20%甘油）中透析。将提取物离心以除去不溶的沉淀。
（2）分离APRF
将在（1）中制备的核提取物（从3000个小鼠肝中得到的）在存在鲑精DNA（200μg/ml）的情况下，与含高亲和APRF结合位点寡核苷酸（5-biothinylated串连的回文APRF一致序列，2XCCTTCCGGGAATTC）的抗生蛋白链菌素共轭的顺磁珠（Dynabeads M-280抗生蛋白链菌素，Dynal）在4℃温育30分钟。
用洗涤溶液（20mM HEPES（PH7.9），1mM EDTA，5mM MgCl2，0.05% Np-40，10%甘油）粗略洗涤结合的蛋白质，然后用含1MKCl的洗涤溶液洗脱。立即用洗涤溶液稀释洗脱液，再与带APRF结合位点的磁珠一起温育。
三个循环的DNA亲和层析后，用SDS-PAGE分离洗涤物。纯化的产物含95kd多肽（主带），85kd和75kd多肽（次带）。所有蛋白质均在酪氨酸残基被磷酸化。在未用IL-6处理的细胞提取物中检测不到所述蛋白质。
从凝胶上洗脱95kd的磷蛋白带，用10%（v/v）三氯乙酸沉淀，用丙酮洗涤，并溶解于含8M脲和10mM Tris，PH9.0的缓冲液中。用赖氨酰基内肽酶将该蛋白质在37℃消化6小时。通过使用在1mm×25cm PP-300柱（Applied Biosystems提供）上的0.1%（V/V）三氟乙酸和乙腈梯度的反相高压液体层析分离所得的肽。
收集分离的肽并通过在Applied Biosystems Model 477A测序仪上的自动Edman降解定序。确定了所述肽的氨基酸序列。下文称该片段为肽3。
Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr
实施例2：APRF的CDNA克隆
用-来自肽3的简并寡核苷酸
5′-AC（AGCT）CA（AG）AT（ACT）CA（AG）TC（AGCT）GT-3′和-λgt11载体反引物，经PCR扩增来自小鼠肝λgt11 CDNA文库（CLML 1035b;Clontech）的一份噬菌体模板DNA，得到含特有DNA序列的PCR产物，所述序列编码肽3提取物的氨基酸序列。用94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为一循环，完成30个循环的PCR。
证实将上述扩增的CDNA亚克隆至PT7 Blue T载体（Novagen）中得到了具有正确肽3氨基酸序列的PCR产物。
用PCR产物为探针，经噬菌斑杂交分别筛选到约1.5×106个小鼠肝噬菌斑和巨噬细胞λgt 11 CDNA文库（受让于Dr.Shigekazu Nagata of Osaka Bioscience Laboratory）。
在添加了5×Denhardt′s溶液（0.1%Fico11，0.1%聚乙烯基吡咯烷酮和0.1%牛血清白蛋白）和0.5%SDS（十二烷基硫酸钠）的6×SSC中，于65℃杂交反应15小时。用含1%SDS的2×SSD，在65℃洗涤滤器二次，每次30分钟。
分离阳性克隆并进行序列分析。通过用双链的双脱氧链终止法分析CDNA的核苷酸序列。
所述阳性菌落经分析为具有2310bp（SEQ ID NO.6所示）开放阅读框架的小鼠APRF的全长CDNA克隆。
所述全长核苷酸序列示于SEQ ID NO.7。从开放阅读框架推测的氨基酸序列列于SEQ ID NO.5。
用相同的探针和相同的条件，通过筛选人胎盘CDNA文库（CLHL 1008b;Clontech）分离人APRF的CDNA。
全长核苷酸序列和开放阅读框架核苷酸序列分别列于SEQ ID NO.3和2。从开放阅读框架推测的氨基酸序列列于SEQ ID NO.1。
实施例3：Northern印迹分析
用氯化铯梯度法从小鼠组织制备总RNA。用Oligo-dT Latex（Oligotex-dT30，Roche）纯化Poly（A）+RNA。使3μg的poly（A）+RNA经琼脂糖凝胶电泳，然后将RNA转移到尼龙膜（HybondPlus;Amersham）上。对于人组织，从Clontech买-RNA印迹膜（Human Multiple Tissue Northern Blot）。
将膜与放射标记的DNA探针杂交，所述探针分别含小鼠样品小鼠APRF的核苷酸806-1200，人样品人APRF的核苷酸238-726。洗涤膜，然后干燥并放射自显影。作为内对照，用肌动蛋白探针再与膜杂交。
序列表
（1）一般资料
（ⅰ）申请人
（A）姓名：KISHIMOTO，TADAMITSU
（B）街道：3-5-31，Nakanocho
（C）城市：Tondabayashi-shi，
（D）州：Osaka
（E）国家：日本
（F）邮编（ZIP）：584
（ⅱ）发明名称：转录因子APRF
（ⅲ）序列数：8
（2）SEQ ID NO：1的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：770个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（C）链型：
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：1
Figure 951045903_IMG1
Figure 951045903_IMG2
Figure 951045903_IMG3
（2）SEQ ID NO：2的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：2310个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：mRNA的CDNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：2
Figure 951045903_IMG5
Figure 951045903_IMG6
（2）SEQ ID NO：3的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：2787个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：mRNA的CDNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：3
Figure 951045903_IMG7
Figure 951045903_IMG8
（2）SEQ ID NO：4的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：2787个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：mRNA的CDNA
（ⅵ）来源：
（A）生物体：Homo Sapiens
（F）组织类型：胎盘
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：221.2533
（C）鉴定方法：P
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：4
Figure 951045903_IMG9
Figure 951045903_IMG10
Figure 951045903_IMG11
Figure 951045903_IMG12
（2）SEQ ID NO：5的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：770个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（C）链型：
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：5
Figure 951045903_IMG13
Figure 951045903_IMG14
（2）SEQ ID NO：6的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：2310个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：mRNA的CDNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：6
Figure 951045903_IMG16
Figure 951045903_IMG17
（2）SEQ ID NO：7的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：2652个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：mRNA的CDNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：7
Figure 951045903_IMG18
Figure 951045903_IMG19
（2）SEQ ID NO：8的资料
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：2652个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：mRNA的CDNA
（ⅵ）来源：
（A）生物体：小鼠
（F）组织类型：肝
（ⅸ）特征
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：259..2571
（C）鉴别方法：P
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：8
Figure 951045903_IMG21
Figure 951045903_IMG22

Claims (24)

1、实质纯化形式的哺乳动物转录因子APRF。
2、根据权利要求1的APRF，它来自于人。
3、根据权利要求2的APRF，它选自含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽，其同系物和其片段。
4、根据权利要求3的APRF，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
5、编码权利要求1APRF的DNA。
6、根据权利要求5的DNA，它编码权利要求2，3或4的APRF。
7、根据权利要求5的DNA，它选自权利要求6所述具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA，以及能与SEQ ID NO.2杂交的DNA和其片段。
8、根据权利要求5的DNA，它选自权利要求6所述具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的DNA，以及能与SEQ ID NO.3杂交的DNA和其片段。
9、根据权利要求1的APRF，它来自小鼠。
10、根据权利要求9的APRF，它选自含有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的多肽，其同系物和其片段。
11、根据权利要求10的APRF，它具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
12、根据权利要求5的DNA，它编码权利要求9，10或11的APRF。
13、根据权利要求5的DNA，它选自权利要求12具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的DNA，以及能与SEQ ID NO.6杂交的DNA和其片段。
14、根据权利要求5的DNA，它选自权利要求12具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的DNA，以及能与所述DNA杂交的DNA和其片段。
15、一种含权利要求5到8和12到14任一项的DNA的复制或表达载体。
16、用权利要求15的复制或表达载体转化或转染的宿主细胞。
17、一种生产APRF的方法，包括在有效表达权利要求1到4和9到11的APRF的条件下，培养权利要求16的宿主细胞。
18、一种寻找对APRF的功能具有抑制活性的产物的筛选方法，包括使用权利要求1的APRF。
19、一种抑制药剂，含有作为活性成分的，对权利要求1APRF的功能具抑制活性的产物。
20、根据权利要求19的抑制药剂，其中所述产物是权利要求1的抗体。
21、根据权利要求20的抑制药剂，其中所述抗体来自用多肽免疫的哺乳动物，所述多肽含SEQ ID NO.1或5所示的氨基酸序列，其同系物或其片段。
22、根据权利要求19的抑制药剂，其中所述产物是能与权利要求1APRF结合的核酸或其衍生物。
23、根据权利要求19的抑制药剂，其中所述产物是权利要求1APRF的反义核酸或含所述反义核酸的表达载体。
24、根据权利要求19的抑制药剂，其中所述产物是能降解权利要求1的APRF的mRNA的核糖酶。
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