KR101868966B1 - 열 안정성을 증진시킨 사람 상피세포 성장인자의 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 열 안정화를 증진시킨 사람 상피세포 성장인자 (human epidermal growth factor, EGF) 용액의 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 사람 상피세포 성장인자의 열 안정화를 증진시키는 조성물의 사용을 통하여 유통 및 보관 과정 중에서 용액에 대한 열 안정성이 우수하고, 그 활성을 유지하는 화장품 및 의약품 조성물에 관한 것이다.

Description

열 안정성을 증진시킨 사람 상피세포 성장인자의 조성물{Composition of human epidermal growth factor improving a thermal stability}

본 발명은 온도 변화에 따른 열 안정성을 증진시킨 사람 상피세포 성장인자 (human Epidermal Growth Factor; EGF)를 포함하는 용액의 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 글리세린, 염화나트륨, 또는 산성계 완충용액에 의하여 열 안정성을 증진시킨 EGF의 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

제약산업은 크게 합성의약품과 바이오의약품 산업으로 분류되고 있으며, 바이오테크를 이용한 바이오의약품 산업이 성장 잠재력이 매우 크며 고 부가가치 산업으로 각광받고 있다. 이러한 바이오의약품의 주류는 단백질 의약품으로 유전자 조작을 통해 미생물과 동물세포를 이용하여 재조합단백질로 제조하고 있으며, 이러한 재조합 단백질 (native form, 자연형)들은 3차 구조와 생물학적 활성이 생체 유래 단백질과 동일하다.

이러한 재조합 (자연형) 단백질은 물리화학적으로 열에 매우 불안정하여 단백질 의약품의 생산, 유통, 보관에 어려움이 있어 왔다. 이를 해결하려는 분야가 바이오베터로서, 단백질의 열 안정성 증진과 효능의 극대화에 많은 투자와 연구가 진행되고 있다.

생체 유래 단백질의 하나로서, 사람 상피세포 성장인자 (EGF)는 3개의 이황화결합 (-S-S-결합)이 있는 53개 아미노산으로 구성되어 있는 6,0452 달톤 (dalton) 크기의 한 단백질이다. 생체 내에서 EGF는 세포의 유사분열 촉진, 세포성장 촉진, 위산분비 억제 등 생물학적 활성이 있어서 현재 상처치료, 위벽의 손상 치료 및 당뇨병 환자의 족부 궤양의 치료제로 사용되고 있다. 현재에는 상피 및 피부세포에 대한 생물학적 활성으로 인하여 미국 화장품협회 (CTFA)의 국제 화장품 원료집 (ICID)에 등제되었고 식품의약품안전처에서 화장품 원료로 승인하여 국내외에서 화장품 원료로도 사용되고 있다.

최근 유전공학적 기법을 이용하여 사람 EGF 유전자를 미생물에 형질전환시켜서 사람의 EGF와 동일한 단백질을 생산하게 하고 이를 분리정제 기술을 이용하여 순수한 사람 EGF만을 대량생산하는 것이 가능해졌다. 그러나 생산된 사람 EGF는 온도에 민감하여 상대적으로 높은 온도의 수용액에 함유되어 있을 때 급격한 3차 구조의 변화로 생물학적 활성을 빠르게 감소된다.

한편, 단백질은 온도, 압력, 산도 (pH) 및 이온 농도 등과 같은 미세한 환경 변화에 의하여 변성이 쉽게 일어난다. 단백질 변성에 영향을 주는 요인으로는 강산과 강알칼리에 의한 전하 변환, 환원제에 의한 S-S 결합 파괴, 염농도에 의한 단백질 응집, 온도 변화에 의한 단백질 분자 운동 증가에 따른 H-결합 및 정전기적 인력 등의 파괴, 기계적 스트레스에 의한 약한 결합력 파괴 등이 있다. 생물학적 활성이 있는 특정한 단백질의 구조를 유지하기 위해서는 이러한 다양한 환경에 대해서 안정화를 유지하여야 하기 때문에, 단백질의 열 안정화는 이들 단백질의 상용화에 매우 중요한 요인이다.

일반적으로 단백질을 안정화시키는 방법들로는 상기 요인에 따라 최적온도, 최적 이온농도 등을 스크리닝하여 설정하는 방법, 화학적으로 단백질을 변형 (modification)시키는 방법, 단백질 공학에 의한 방법, 고정화 방법 혹은 안정화제의 첨가 방법 등이 있다. 단백질의 열안정성을 증가시키는데 사용되는 안정화제로는 폴리올 (polyols), 덱스트란 (dextran), 소혈청 알부민 (bovine serum albumin), polyethylenimine, polyelectrolytes, organic osmolytes, organic solvents, 당류 (sugers)와 기타 물질들이 예시되고 있다.

이들 안정화제의 선택과 첨가 농도는 전적으로 열 안정화 대상이 되는 단백질 3차구조의 물리화학적 성질에 따라서 실험적으로 결정되어야만 하며, 한 종류의 단백질에서 결정된 안정화제의 종류 및 첨가 농도는 다른 종류의 단백질에도 범용적으로 적용되지 않는다.

따라서 사람 EGF를 의약품 치료제 및 화장품 원료로 사용하기 위해서는 저온을 포함한 상온 및 상대적으로 높은 온도에서도, 본래의 사람 EGF의 구조 및 활성을 유지시키는 기술이 절실히 필요한 실정이다. 따라서 인체에 영향을 주지 않는 물질들을 사람 EGF 수용액에 첨가하여 제조된 조성물을 활용하여 사람 EGF의 열 안정성을 증가시키는 조성물의 개발이 매우 중요한 실정이다.

사람 상피세포 성장인자의 열 안정화에 관한 선행기술로서, 한국특허공보 제10-1996-0013439호에는 안정한 상피세포 성장인자 조성물이 개시되어 있다. 여기서는 상피세포 성장인자에 페놀, 폴리에틸렌글리콜, 지방산, 등에서 선택된 첨가제를 부가함으로서 생물학적 활성이 유지되면서 생물학적, 물리학적, 화학적으로 안정한 EGF의 조성물을 점안제 및 외용 연고제 등으로 사용하는 것을 제시하고 있다. 그러나 여기서 사용되는 첨가제는 인체에 유해한 페놀 등에 의하여 그 순도에 따라 사용에 한계가 있어왔다.

또한, 한국특허 공개공보 제10-2010-0002388호에는 상피세포성장인자의 안정성을 증진시키는 계면활성형 펩타이드 및 그 용도가 개시되어 있다. 여기서 사용되는 계면활성형 펩타이드는 특정한 아미노산 서열로 이루어지기 때문에, 용이하게 제조하기 어려워 그 사용에 한계가 있어왔다.

더 나아가, 한국특허공보 제10-1519118호에는 고안정성 상피세포 성장인자 변이체에 대하여 개시되어 있다. 여기서는 유전공학 기법을 이용하여 EGF 내의 아미노산 서열 (단백질 1차 구조)을 변경한 EGF 변이체를 제작하여 열 안정성을 증진시키고 있기 때문에, 첨가제에 의한 열 안정성을 증진시키는 구성과는 구별되고 있다.

본원발명의 목적은 열 안정성을 증진시키는 첨가제로서 종래에 알려진 페놀, 폴리에틸렌글리콜, 지방산, 또는 계면활성형 펩타이드 등과 비교하여, 물리화학적 성질이 전혀 다르며 인체에 전혀 해가 없는 글리세롤, 염화나트륨 등에 의하여 열 안정성을 증진시킨 사람 EGF 조성물을 제공하고, 이를 이용한 화장품용 및 의약품용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본원 발명의 목적은 사람 상피세포 성장인자 (EGF)를 포함하는 용액에 EGF의 용액의 중량비(w/v)로 글리세롤을 10 % 내지 50 %로 첨가하여 열 안정성을 증가시킨 EGF의 조성물에 의하여 달성될 수 있다.

본 발명의 한 양태로서, 본 발명의 EGF 조성물을 포함하는 용액은 인산나트륨 용액이고, 상기 인산나트륨 용액 중의 EGF의 농도는 0.1 ug/ml 내지 1,000 ug/ml의 양으로 존재한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 EGF 조성물은 염화나트륨을 10 mM 내지 100 mM의 양으로 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 EGF 조성물은 조성물의 산도 (pH)를 4 내지 8로 조정하기 위한 산성계 완충용액을 10 mM 내지 100 mM 농도로 추가하여 포함한다. 여기서 사용되는 산성계 완충용액은 인산나트륨 용액 또는 구연산 용액이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상술한 EGF의 조성물의 화장품학적 유효량 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 EGF의 화장품용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상술한 EGF의 조성물의 약학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 EGF의 피부 상처치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 의하여 제조된 수용액 상태의 사람 EGF의 조성물은 4 ℃ 저온 및 30 ℃ 고온에서도 장기간 열 안정성을 유지시킬 수 있다. 이에 따라 본 발명의 사람 EGF 조성물을 이용한 EGF 제품은 유통과 보관 과정 중에도 안정하기 때문에, 자연형 EGF 활성을 유지하는 기능성 화장품과 의약품 생산을 가능하게 할 것이다.

도 1은 본 출원인((주) 뉴셀라이프)이 직접 제조한 사람 EGF의 순도와 구조를 HPLC와 SDS-PAGE로 분석한 것이다.
도 2는 제조한 사람 EGF의 생물학적 활성을 사람의 정상 피부세포 (HDF) 증식률로 연구용 사람 EGF와 비교분석한 것이다.
도 3은 글리세롤을 포함하는 EGF 조성물이 EGF 3차 구조의 열 안정화제로 탁월한 효과가 있음을 밝힌 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 염화나트륨을 포함하는 EGF 조성물이 사람 EGF를 안정화시키는 안정화제로서 기능이 있음을 밝힌 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 30 ℃에서 시간별로 사람 EGF의 3차 구조 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 4℃ 및 30℃의 온도와 시간에 따른 사람 EGF의 구조변경에 대한 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 7은 글리세롤과 염화나트률을 포함하는 EGF 조성물이 온도 및 시간별로 사람 EGF 3차 구조를 안정화시키는 열 안정화제로서의 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 30 ℃에서 144 시간 보관시 글리세롤 농도별로 EGF 3차구조 (빨간선 부분)의 변경 결과를 나타낸 HPLC 크로마토그램이다.

본 발명은 사람 상피세포 성장인자 (EGF)를 포함하는 용액에 EGF의 용액의 중량비(w/v)로 글리세롤을 10 % 내지 50 %로 첨가하여 열 안정성을 증가시킨 EGF의 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 EGF는 인산염 완충액에 용해된 상태이거나 동결건조된 분말상태로 취급되고 시판되고 있다. 동결건조된 분말 상태인 EFG는 열 안정성의 문제가 거의 발생하지 않고, 주로 완충액에 용해된 상태인 EGF 용액에서 열 안정성의 문제가 발생할 것이다. 상기 완충액으로 사용되는 인산나트륨 용액 중의 EGF의 농도는 0.1 ug/ml 내지 1,000 ug/ml의 양으로, 바람직하게는 0.1 ug/ml 내지 100 ug/ml의 양으로 존재한다.

또한, 시중에서 시판되는 EGF의 순도는 보통 약 95% 정도이지만, 본 발명에서 사용되는 EGF는 본 발명의 효과를 명확하게 확인하기 위하여, 추가의 정제 및 분리에 의하여 약 98% 정도의 순도를 유지하는 것을 사용할 것이다. 또한 EFG가 용해된 인산염 용매는 EGF의 화학적 성질을 변형시키지 않는 한 제한하지 않지만, 인산나트륨 용매가 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 EGF의 생물학적 활성은 연구용으로 시판되고 있는 사람 피부세포 (human dermal fibroblast; HDF)에 대한 증식활성을 말하며, EGF의 증식활성을 MTS assay로 정량적인 분석을 실시하였다. 일반적으로 EGF의 활성 분석은 생쥐 유래 NIH3T3 혹은 Balb/c 3T3 세포주인 형질전환된 세포를 사용하고 있으나, 본 발명에서는 사람 유래 정상 피부세포를 사용함으로서 인체에 적용할 수 있는 보다 정확한 EGF의 생물학적 활성을 분석할 수 있는 방법을 제공하였다.

본 발명에서 사용된 글리세롤은 글리세린이라고도 부르는 무색, 무취의 액체로서, 인체에 전혀 해가 없고 의약품 및 화장품에 일반적으로 사용되고 있다. 이는 지방산과 마찬가지로 유지 성분이며, 공업적으로도 유지를 분해함으로써 얻어진다. 글리세린은 무색의 끈기 있는 액체로 흡습성이 있으며 감미가 조금 있고, 일반적으로 시약급 연구용, 화장품 (보습제) 및 의약품 (관장제)에 사용된다. 하지만, 본 발명에서 사용되는 글리세롤은 이러한 일반적으로 알려진 용도와는 무관하게, EGF 열 안정화제로서 사용되는 것이다.

이러한 글리세롤은 본 발명에서 사용되는 EGF의 용액의 중량비(w/v)로 환산하여, 10 % 내지 50 % 범위에서 사용된다. 이러한 범위에서 10% 미만이면 열 안정성을 높이려는 사용목적에서 효과가 떨어지고, 50%가 초과되면, 사용 목적에서 50%와 동일한 효과를 보이고 있으며 글리세롤의 물리, 화학적 특성에 의하여 조성물 제조에 50% 일 때보다 용이하지 않다.

본 발명에서 사용된, “열 안정성”이란, 온도변화에 따른 EGF의 3차구조 변형에 관한 안정성을 의미하는 것으로, 생체내 (in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 4 ℃ 냉장 및 상온 저장 안정성)도 의미한다.

특히, 본 명세서에서 단백질 및 EGF의 “3차 구조”는 단백질 및 EGF를 구성하는 아미노산들의 서열 혹은 순서 (1차 구조)와 1차 구조에서 아미노산간 결합의 펩타이드 결합 간에 형성되는 수소결합 (2차 결합)과 아미노산 잔기 (R group)간 결합 (일 예로 -S-S-; 이황화 결합)을 포함하는 화학결합에 의하여 형성된 입체구조를 말한다. EGF를 포함하는 단백질의 3차 구조는 고유한 물리화학적 특성을 나타내고 있으며, 3차 구조의 변형이 일어나게 되면 친수성 등 고유한 물리화학적 특성이 변하게 되고 결과적으로 생물학적 활성이 저하 혹은 상실된다.

HPLC는 3차 구조의 변형에 따른 미세한 변화를 분석할 수 있어서, 본 발명에서는 3차 구조의 변형을 HPLC에서 정체시간(retention time; RT)의 변화로 분석하였다.

다른 양태로서, 본 발명의 EGF의 조성물은 염화나트륨을 추가로 포함할 수 있으며, 이의 양은 10 mM 내지 100 mM의 범위이고, 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM 범위이다. 이러한 범위에서 10 mM미만이면 열 안정성을 높이려는 사용 효과가 떨어지고, 100 mM 초과이면, 열 안정성을 높이려는 사용 효과가 떨어지는 문제가 발생한다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 EGF의 조성물은 산성계 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 완충용액의 사용으로 본 발명의 EGF의 조성물의 산도(pH)를 5.6 내지 7.0의 범위로 조절할 수 있다.

이러한 산도 조절을 위하여 사용되는 이의 양은 10 mM 내지 100 mM의 범위이고, 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM 범위이다. 이러한 범위에서 10 mM미만이면 열 안정성을 높이려는 사용 효과가 떨어지고, 100 mM 초과이면, 열 안정성을 높이려는 사용 효과가 떨어지는 문제가 발생한다.

본 발명에서 사용되는 산성계 완충용액은 화장품 또는 의약품 조성물에 일반적으로 사용되는 것을 사용할 수 있어 한정하지 않지만, 인산나트륨 용액 또는 구연산 용액이 바람직하다.

다른 양태로서, 본 발명은 EGF의 조성물의 화장품학적 유효량 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 EGF의 화장품용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장품용 조성물에 사용되는 담체는 상술한 제형에 따라 약간씩 차이가 있지만, 예를 들어 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 EGF의 조성물의 약학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 EGF의 피부 개선 또는 상처치료용 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 "약학적 유효량"은 본 발명의 조성물의 피부 개선 또는 상처치료 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물에 사용되는 담체도 다양한 제형에 따라 약간씩 차이가 있지만, 일반적인 제형에 따라 사용되는 담체가 사용될 것이다.

본 발명은 약학적 조성물은 피부 상태의 개선 또는 상처치료 효능 또는 활성을 가지는 것일 수 있다. 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의한 피부 상태의 개선 또는 상처치료는 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 여드름 치료, 상처제거 및 피부재생 효과이며, 가장 바람직하게는, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 상처제거 및 피부재생 효과이다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

(예비실시예) EGF의 배양·정제

사람 EGF 유전자로 형질전환시킨 대장균을 배양한 후, 9,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 대장균 상층액을 얻었다. 상층액에 황산암모늄이 30%가 되게 황산암모늄을 천천히 첨가하여 녹이고, 상온에서 30분간 반응시키고 4 ℃에서 9,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 상층액에 황산암모늄이 60%가 되게 황산암모늄을 천천히 첨가하여 녹이고, 상온에서 30분간 반응시킨 다음 4℃에서 9,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 펠렛을 취해서 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8)에 녹였다.

불용성 물질을 제거하기 위하여 4℃에서 12,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액을 Sephacryl HR200 칼럼을 이용하여 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8)로 1차 정제를 하였다. 1차 정제 EGF를 Bio-Scale Macro-Prep DEAE 칼럼을 이용하여 0 ~ 0.5 M NaCl이 함유된 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8)를 이용하여 2차 정제를 하였다. 정제된 EGF를 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8)에서 투석하고 0.2 um 필터로 필터링하여 제조하였다.

(실시예 1) 사람 EGF의 분석

본 출원인((주)뉴셀라이프)에서 제조한 사람 EGF가 함유된 20 mM 인산나트륨 용액을 Waters사 XBridge C18 컬럼으로 고성능 액체크로마트그라피 (HPLC)를 수행하여 순도를 분석하였다. 이때 분석 조건은 0.1 % 트리플루오로아세트산이 포함된 증류수 용액 A와 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토니트릴 용액 B를 1 ml/분의 속도로 0 % B에서 70 % B까지 직선 농도구배로 분석하였다.

도 1. 좌측 그림은 제조한 사람 EGF를 HPLC로 216 nm 파장으로 분석한 결과로 RT (retention time) 11.263분과 12.131분에 피크가 나타났음을 보여주며, 11.263분에 해당하는 피크 면적이 98.62 %로 이는 본 실시 예에 사용한 EGF의 순도가 98.62 %임을 보여주었다. 12.131분에 존재하는 미세한 피크 (1.38 %)는 열처리로 증가되는 반면, 11.263분에 해당하는 피크는 96.86 %, 77.21 %, 38.60 %로 감소되는 결과를 얻었다.

11.263분의 순도 96.86, 77.21%, 38.60 %에 해당하는 시료를 SDS-PAGE로 분석한 결과는 도 1의 P1, P2, P3에 나타내었으며, HPLC 결과에서 사람 EGF 순도 변화는 사람 EGF의 3차 구조가 변화된 결과이며 1차 구조에는 변화가 없는 것임을 보여주었다.

(실시예 2) 제조한 사람 EGF에 의한 사람 피부 섬유아세포 증식 검정

제조한 98.62 % 사람 EGF 단백질 농도는 Bradford 방법으로 분광광도계에서 측정하였다. 이때 단백질 정량의 표준시료로 1 mg/ml 농도의 BSA (Bovine Serum Albumin)를 사용하였다. 사람 EGF 표준시료는 Peprotech 회사 (USA)에서 구입한 연구용 EGF를 사용하여 세포증식 검정을 실시하였다. 제조한 EGF를 실제로 적용할 정상인 사람 피부 세포인 계대배양 3대 (passage 3) 사람 피부 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF)에서 증식 활성 검정을 수행하였다.

실험방법으로는 HDF cell을 10 % 열-불활성화된 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 units/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM/Low glucose complete 배지를 이용하였다. 24 웰 배양판에 2 X 10⁴ cells/well의 HDF 세포를 씨딩(seeding)하고 16시간 배양된 HDF 세포는 PBS로 세척 후에 0.1 % FBS가 포함된 DMEM/Low glucose 배지에 EGF 용액을 농도별로 처리하고 72시간 배양하였다. 배양 후 60 ul CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assy (Promega사, USA)를 첨가하고 4시간 반응시키고 배양액 200 ul를 취하여 490 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포증식 활성을 연구용 EGF와 비교분석하였다.

도 2. 좌측 사진은 EGF를 처리하지 않은 HDF (0.0 ng/ml)와 (주)뉴셀라이프 제조 EGF (NCL-EGF)를 2 ng/ml 농도로 처리한 HDF (2 ng/ml)의 증식 결과로 EGF를 2 ng/ml 농도로 처리한 HDG 세포가 증식율이 높아 세포 농도가 상대적으로 높은 결과를 사진으로 보여주었다. HDF의 증식률을 정량적으로 분석하기 위하여 MTS assay를 수행한 도 2. 우측 결과에서 보는 바와 같이, 연구용 EGF 2 ng/ml에서 HDF 증식 활성은 490 nm 파장에서 흡광도가 1.93이었으나 제조한 EGF는 같은 농도에서 2.44로 활성이 매우 우수한 HDF 세포 증식활성을 가지고 있는 것으로 나타났다.

본 실시예와 동일한 방법으로 실시예 1의 38.60 % 사람 EGF를 1 ng/ml을 처리하고 생물학적 활성을 분석한 결과는 제조사 0.25 ng/ml EGF의 활성과 유사한 증식활성 범위인 490 nm 파장에서 흡광도 1.70를 나타내었다. 따라서 실시예 1의 HPLC 결과에서 11.263분 RT의 순도에 해당하는 3차 구조가 사람 EGF의 생물학적 활성을 나타내는 구조인 것으로 나타났다.

(실시예 3) 사람 EGF의 열 안정화제로서 글리세롤 활성 검정

실시예 1에서 제조하여 냉동실에 보관된 EGF를 100 ppm (100 ug/ml) 농도로 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8)와 60 % 글리세롤이 첨가된 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8) 희석한 후, 1 ml씩 1.5 ml 튜브에 분주하여 4 ℃와 30 ℃에 보관하였다. 4 ℃와 30 ℃에 7일간 보관 후 글리세롤이 EGF 열 안정성에 미치는 영항을 HPLC로 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 본 실시예에 사용한 98.62 % EGF를 4 ℃에 7일간 보관 시, 글리세롤이 미 첨가시 순도는 91.94 %, 60 % 글리세롤이 첨가시 순도는 96.16 %로 각각 6.68 %와 1.46 %가 감소된 반면, 30 ℃에 7일간 보관 시, 글리세롤이 미 첨가시 순도는 22.07 %, 60 % 글리세롤이 첨가시 순도는 94.59 %로 각각 76.55 %와 4.03 %가 감소되었다. 본 실시예에서 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8) 용액에 60 % 글리세롤이 포함된 조성물은 30 ℃에서 EGF를 글리세롤이 포함되어 있는 않은 상태보다 72.52 %를 더 안정화시키는 결과를 나타내었다.

(실시예 4) 사람 EGF의 열 안정화제로서 NaCl 활성 검정

실시예 1에서 제조한 EGF를 100 ppm (100 ug/ml) 농도로 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8)와 20 mM NaCl이 첨가된 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8)로 희석한 후, 1 ml씩 1.5 ml 튜브에 분주하여 4 ℃에 보관하였다. 4 ℃에 보관된 시료들을 24시간 간격으로 NaCl이 EGF 열 안정성에 미치는 영항을 HPLC로 분석한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 표기된 PB는 100 ppm EGF가 20 mM 인산나트륨, pH 5.8에 Na-PB는 100 ppm EGF가 20 mM NaCl이 첨가된 20 mM 인산나트륨, pH 5.8에 희석된 시료를 말한다. 도 4의 결과에서 100 ppm EGF가 PB에 희석된 상태로 4 ℃에 144시간 (6일간)보관시 구조가 98.62 %에서 91.94 %로 6.68 % 변형된 반면, 20 mM NaCl이 첨가된 PB에서는 구조가 98.62 %에서 96.89 %로 1.73 % 변형된 것을 나타내었다. 따라서 동일 조건에서 EGF를 보관할 때 첨가된 20 mM NaCl이 EGF 구조를 약 3.86배 더 안정화시키는 안정화제로서 역할이 있음을 본 실시예에서 밝혔다.

(실시예 5) 30℃에서 사람 자연형 EGF의 열 안정성 분석

제조한 사람 자연형 EGF를 100 ppm (100 ug/ml) 농도로 20 mM 인산나트륨, pH 5.8와 20 mM NaCl이 첨가된 20 mM 인산나트륨, pH5.8로 희석한 후, 1 ml씩 1.5 ml 튜브에 분주하고 4 ℃와 30 ℃에 보관하고 24시간 간격으로 사람 EGF의 열 안정성을 HPLC로 분석하였다.

도 5는 온도와 시간에 따른 사람 EGF의 자연형 구조를 백분율 (%)로 나타낸 것이고, 도 6은 4 ℃와 30 ℃의 온도와 시간에 따른 사람 EGF의 구조변화에 대한 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 수용액 속에 사람 EGF 안정화제 20 mM NaCl이 포함되어 있어도 30℃에서 24시간 후에 사람 자연형 EGF는 98.62 %에서 77.21 %로, 48시간 후에 41.16%로 57.46 %가 급격하게 구조변형이 일어나고 있음을 알 수 있었다. 30℃에서 48시간 이후에는 사람 자연형 EGF의 구조가 48시간 이전보다 완만하게 진행되고 있음을 밝혔다. 본 실시 예에서 염화나트륨 조성물은 30 ℃같은 비교적 고온인 상태에서보다 저온상태에서 EGF 3차 구조를 안정화시키는 것으로 나타났다.

(실시예 6) 온도 및 시간 조건에 따른 사람 자연형 EGF의 구조 안정화제로서 글리세롤의 활성 검정

제조한 사람 야생형 EGF의 3차 구조에 대한 열 안정화제로서 글리세롤의 활성을 분석하기 위하여 제조한 98.62 % 사람 야생형 EGF를 글리세롤이 중량비 (w/v) 0, 10, 30, 50, 60 %가 함유된 20 mM NaCl/20 mM 인산나트륨, pH 5.8에 100 ppm (100 ug/ml) 농도로 희석하고 1.5 ml 튜브에 1 ml씩 소분하여 4 ℃와 30 ℃에 보관하고 24시간 간격으로 야생형 순도를 HPLC로 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.

글리세롤 30 % 이상 함유 시료의 HPLC 분석시 auto-scale로 분석된 결과들은 크게 약 1 % 범위의 오차를 보여주고 있었다. 144 시간동안 4 ℃에서 보관된 시료의 자연형 EGF 순도는 글리세롤이 함유되지 않은 시료 (96.89 %)보다 10 % 글리세롤이 함유된 시료 (45.98 %)에서 자연형 EGF의 3차 구조가 2배이상 변형되었다. 유사하게 144 시간동안 30 ℃에서 보관된 시료의 자연형 EGF 순도는 글리세롤이 함유되지 않은 시료 (32.99 %)보다 10 % 글리세롤이 함유된 시료 (24.55 %)에서 자연형 EGF의 3차 구조가 약 8 % 이상 더 변형되었다.

본 실시예에서 규명한 발명의 특징은 144 시간 동안 30 ℃에서 보관된 시료의 자연형 EGF 순도는 글리세롤이 함유되지 않은 시료 (32.99 %)에서 65.63 %가 감소된 반면 30 % 글리세롤이 함유된 시료에서 2.65 %가 감소되었고, 50% 이상 글리세롤이 함유된 시료에서 3차 구조의 변화가 일어나지 않았다. 상기 표 1의 특징적 결과로 4 ℃와 30 ℃에서 144 시간동안 보관된 사람 자연형 EGF가 글리세롤 농도에 의한 열 안정성을 비교 분석하여 도 7 및 도 8에 나타내었다.

도 7의 그래프는 각각의 온도 조건에서 144 시간동안 보관 후, HPLC 결과를 비교 분석한 결과이고, 도 8의 HPLC 크로마토그램은 30 ℃에서 144 시간 보관시 글리세롤 농도별로 EGF 3차구조 (빨간선 부분)의 변경 결과를 나타낸 것이다. 본 실시예의 결과로부터 20 mM 인산나트륨 (pH 5.8)/20 mM 염화나트륨에 글리세롤이 30 % 이상 포함된 조성물은 30 ℃에서 144 시간동안 사람 EGF 3차 구조를 98% 이상 안정화시켰고, 글리세롤이 50% 이상 포함된 조성물에서는 오차범위 내에서 사람 EGF 3차 구조를 온전하게 보존하는 열 안정화제로 작용하고 있는 것으로 나타났다.

Claims (7)

1. 사람 상피세포 성장인자 (EGF)의 열 안정성 증진용 조성물로서,
   상기 조성물은,
   글리세롤을 용액의 총 부피를 기준으로, 50%(w/v, g/ml)로 포함하고,
   상기 용액은 인산나트륨 용액이며, 상기 EGF는 0.1 ug/ml 내지 1,000 ug/ml로 포함되며,
   상기 조성물은 염화나트륨을 10~50mM로 포함하고,
   상기 조성물의 pH는 5.6~5.8인, 사람 상피세포 성장인자의 열 안정성 증진용 조성물.
   
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4. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 산성계 완충용액을 10 mM 내지 100 mM 농도로 더 포함하는 사람 상피세포 성장인자의 열 안정성 증진용 조성물.
   
5. 청구항 4에 있어서, 상기 산성계 완충용액은 인산나트륨 용액 또는 구연산 용액을 더 포함하는 사람 상피세포 성장인자의 열 안정성 증진용 조성물.
   
6. 청구항 1, 청구항 4 및 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 조성물의 화장품학적 유효량 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품용 조성물.
   
7. 청구항 1, 청구항 4 및 청구항 5 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 약학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 피부 상처치료용 조성물.
   

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